CN106226516B - 一种双曲线定标定量免疫层析检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物医疗检测技术领域，具体而言，涉及一种双曲线定标定量免疫层析检测方法，包括：将待检物样品与梯度稀释后的待检物标准品分别与等量反应物进行反应并测定表征反应强度的信号值；以待检物浓度为横坐标、信号值强度为纵坐标建立坐标系，将不同浓度的待检物标准品对应的信号值代入并绘制拟合曲线，并于曲线拐点处将所述拟合曲线分为两段，对应较低待检物浓度的为前定标曲线，对应较高待检物浓度的为后定标曲线；根据对照线上的信号强度对待检物样品含量进行预估，再将其对应的信号值代入不同的曲线即可得知其确切的蛋白浓度。该方法在无需稀释待检物样品的前提下对待检物样品进行定量分析检测，适用于珍贵样品或大批量样品的检测。

Description

一种双曲线定标定量免疫层析检测方法

技术领域

本发明涉及生物医疗检测技术领域，具体而言，涉及一种双曲线定标定量免疫层析检测方法。

背景技术

钩状效应即HOCK效应，是指由于抗原抗体比例不合适而导致假阴性的现象，抗体过量叫做前带效应，抗原过量叫做后带效应，统称HOCK效应。

抗原抗体特异性反应时，生成结合物的量与反应物的浓度有关。无论在一定量的抗体中加入不同量的抗原，或是在一定量的抗原中加入不同量的抗体，均可发现只有在两者分子比例合适时才出生现最强的反应。通过在一定量的抗体中加入递增量的相应抗原，根据所形成的沉淀物及抗原抗体的比例关系可绘制出反应曲线。曲线的高峰部分是抗原抗体分子比例合适的范围，称为抗原抗体反应的等价带(zone of equivalence)。在等价带前后分别为抗体过剩则无沉淀物形成，这种现象称为带现象(zone phenomenon)。出现在抗体过量时，称为前带(prezone)，抗体过剩就叫做前带效应；出现在抗原过剩时，称为后带(postzone)，在反应中，抗原过剩就叫做后带效应。

在免疫反应相关项目的检测中，如C反应蛋白，人绒毛膜促性腺激素，甲胎蛋白，乙肝表面抗原等，由于样本中待测抗原的浓度可能极高，因此极容易产生钩状效应，导致高浓待测物出现弱阳性或假阴性结果，进而造成漏检，对临床诊断和研究带来很大的危害。

目前解决这类项目检测的钩状效应问题的方法，一般采用稀释待测物或者两步法检测。现有检测技术需要将高浓度样本稀释到一定倍数后检测，由于各项目的性质不同，需要稀释的倍数不确定，需要尝试不同稀释比例方可确定最佳的稀释倍数方可进行准确的定量检测，过程也更为复杂。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种双曲线定标定量免疫层析检测方法，所述方法不需要对待测物进行稀释即可直接定量，操作简单，易于掌握。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

一种双曲线定标定量免疫层析检测方法，包括：

将不同浓度的待检物的标准品分别与等量反应物进行反应并测定表征反应强度的信号值；

以待检物浓度为横坐标、信号值强度为纵坐标建立坐标系，将不同浓度的待检物标准品对应的信号值代入并绘制拟合曲线，并于曲线拐点处将所述拟合曲线分为两段，对应较低待检物浓度的为前定标曲线，对应较高待检物浓度的为后定标曲线；

判断待检物样品含量与反应物含量之间的关系并将待检物样品与等量反应物进行反应；

当待检物样品含量小于反应物含量时，将所述待检物样品对应的表征反应强度的信号值代入前定标曲线计算所述待检物样品浓度；

当待检物样品含量大于反应物含量时，将所述待检物样品对应的表征反应强度的信号值代入后定标曲线计算所述待检物样品浓度。

本发明通过使用待检物标准品绘制出出现前带效应和后带效应时对应的双曲线，在具体应用中，同一批次的试纸条仅需要做一次双曲线即可实现能够在无需稀释待检物样品的前提下对待检物样品进行定量分析检测，克服了现有技术中的需要将待检物样品梯度稀释并寻找等价带的方法，在进行大批量样品检测时，本发明的优势尤其突出。

其中，曲线拐点处可认为是等价带中抗原与抗体量相等的点。所述前定标曲线对应的即为出现前带效应时的检物浓度-信号值强度曲线；所述后定标曲线对应的即为出现后带效应时的检物浓度-信号值强度曲线。

优选的，如上所述的双曲线定标定量免疫层析检测方法，所述不同浓度的待检物的标准品由标准品母液梯度稀释得到，且拐点处对应的标准品浓度位于最高浓度和最低浓度的待检物的标准品之间。

实际上，拐点处对应的标准品浓度最好位于浓度梯度的中位数附近，以保证前定标曲线和后定标曲线中的数值都足够多。为保证这一点，拟合曲线可能需要做两次实验以确定最佳的设置浓度梯度的方式，特别是在反应物的量未知的情况下。

优选的，如上所述的双曲线定标定量免疫层析检测方法，当于曲线拐点处将所述拟合曲线分为两段得到前定标曲线和后定标曲线后，还包括：

对所述前定标曲线和后定标曲线重新进行拟合。

由于对所有数据点所绘制的拟合曲线进行拟合时需要照顾到所有相关数据的偏差，因而其精确程度不如将前定标曲线和后定标曲线重新进行拟合的精度。

进一步优选的，在对所述前定标曲线和后定标曲线重新进行拟合时：

拟合得到的曲线的线性相关系数大于等于0.990。

优选的，如上所述的双曲线定标定量免疫层析检测方法，当所述待检物为抗原时，所述反应物为所述待检物对应的抗体；

当所述待检物为抗体时，所述反应物为所述待检物对应的抗原或抗体。

优选的，如上所述的双曲线定标定量免疫层析检测方法，所述反应物预先包被在试纸条上；

所述试纸条上还设置有结合垫、检测线和对照线。

使用试纸条进行检测，方便且利于操作。但本领域技术人员也可以用其他方法实现相同的检测目的，例如使用典型的ELISA方法在96孔板中进行检测等等。

进一步优选的，如上所述的双曲线定标定量免疫层析检测方法，当待检物为抗原时：

所述结合垫上包被有能与所述待检物结合的第一抗体，且所述第一抗体标记有胶体金或荧光标记物；

所述检测线上固定包被有第二抗体，且所述第二抗体与所述第一抗体结合的抗原表位不同；

所述对照线上固定包被有待检物。

其中，第一抗体即为本申请所述的反应物。反应的原理为将样品滴加在试纸条的样品孔或者样品垫上，在层析的作用下，样品会依次流过结合垫、检测线及对照线。

当样品流经结合垫时，样品中的待测物，即抗原物质会与结合垫中标记了胶体金或荧光标记物的第一抗体结合形成第一抗体-抗原复合物；

第一抗体-抗原复合物流经检测线时，会与固定于其上的第二抗体结合，通过相关仪器检测胶体金或荧光标记物强度即可得到所述的表征反应强度的信号值。而过量的第一抗体或过量的待测物会继续流向对照线。

第一抗体和第二抗体实质上是一对配对抗体。

进一步优选的，如上所述的双曲线定标定量免疫层析检测方法，当待检物为抗体时：

所述结合垫上包被有能与所述待检物结合的抗体，且所述抗体标记有胶体金或荧光标记物；

所述检测线上固定包被有能与所述待检物结合的抗原；

所述对照线上固定包被有待检物；

或；

所述结合垫上包被有能与所述待检物结合的抗原，且所述抗原标记有胶体金或荧光标记物；

所述检测线上固定包被有能与所述待检物结合的抗体；

所述对照线上固定包被待检物。

其中，结合垫上包被的标记了胶体金或荧光标记物的抗体或抗原即为所述的反应物，其原理与上述大致相同。

能与所述待检物结合的抗体一般结合在待测物的Fc段，即不影响待测物与其抗原的结合。

结合垫上包被的物质由于要随反应溶液一起层析流动，因而并没有固定包被在结合垫上，而检测线和对照线上包被的物质是不能随反应溶液流动的。

优选的，如上所述的双曲线定标定量免疫层析检测方法，除测定表征反应强度的信号值外，还包括测定对照线上的信号值。

表征反应强度的信号值实质上即为检测线上的信号值

进一步优选的，进行双曲线应用之前，还包括以对照线上的信号值为参考判断出现钩状效应的类型，判断方法为：

若当待检物样品对应的对照线上的信号值大于等于拐点浓度对应的对照线上的信号值，则代表反应物过量；

若当待检物样品对应的对照线上的信号值小于拐点浓度对应的对照线上的信号值，则代表待检物样品过量。

如果待测物为抗原物质，则当待测物中的抗原物质少，而反应物，即第一抗体过量时，过量的第一抗体会与对照线上的待检物结合并产生信号，此信号值会随待测物中抗原物质的增多而逐渐减弱。若记录拐点浓度对应的对照线上的信号值，并将当待检物样品对应的对照线的信号值与其比较，即可精确判断当待检物样品中抗原的量到底是大于第一抗体的量还是小于第一抗体的量，进而确定应该选取哪一条曲线进行定量计算。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

1)、同一批次的试纸条仅需要做一次双曲线即可实现能够在无需稀释待检物样品的前提下对待检物样品进行定量分析检测，克服了现有技术中的需要将待检物样品梯度稀释并寻找等价带的方法，在进行大批量样品检测时，本发明的优势尤其突出，可大为节约操作，提升检测效率。

2)、对于珍贵样品的检测尤为适合。由于样品有效含量本来就少，无法再通过梯度稀释确定与其对应的合适的抗体/抗原浓度，用本申请的方法可解决此问题。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为实施例1中C反应蛋白前定标曲线；x轴为C反应蛋白的蛋白浓度，y轴为检测线反应值；

图2为实施例1中C反应蛋白后定标曲线；x轴为C反应蛋白的蛋白浓度，y轴为检测线反应值；

图3为实施例2中乙肝表面抗体前定标曲线；x轴为乙肝表面抗体浓度，y轴为检测线反应值；

图4为实施例1中乙肝表面抗体后定标曲线；x轴为乙肝表面抗体浓度，y轴为检测线反应值。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1

C反应蛋白双曲线定标定量

将纯的C反应蛋白标准版进行梯度稀释，得到以下浓度：

0mg/L、0.5mg/L、1mg/L、2.5mg/L、10mg/L、25mg/L、50mg/L、100mg/L、110mg/L、110mg/L、125mg/L、150mg/L、175mg/L、200mg/L。

待测C反应蛋白浓度未知。

将不同浓度的C反应蛋白与待测C反应蛋白取等量分别滴加在试纸条上。

所述试纸条上设置有结合垫、检测线和对照线。

所述结合垫上包被有标记了荧光标记物的且能与C反应蛋白结合的第一抗体；

所述检测线上包被有与所述第一抗体结合的抗原表位不同的、固定在检测线上的第二抗体；

所述对照线上包被有固定在对照线上的C反应蛋白。

读取检测线和对照线上的应该强度数据如下：

表1 C反应蛋白标准品对应的检测数值

以表1中对应的校准品浓度值为x轴，检测线反应值为y轴做拟合曲线(图略)，计算得知拐点处的坐标与100mg/L的数值非常接近，故而近似地以(100，1268)作为拐点做定标曲线。

(1)钩状效应前定标曲线(如图1所示)：

四参数Logistic曲线拟合，得到如下方程

方程1:y＝(A-D)/[1+(x/C)^B]+D

A＝1526.92150

B＝-0.82907

C＝15.33445

D＝-13.98420

r²＝0.99808

(2)钩状效应前定标曲线(如图2所示)：

四参数Logistic曲线拟合

方程2:y＝(A-D)/[1+(x/C)^B]+D

A＝1184.42102

B＝8.99328

C＝202.20974

D＝-781.82774

r²＝0.99949

其中，两个待测C反应蛋白对应的检测线反应值和对照线反应值分别为：

其中，编号1的对照线反应值238>225，所以将y＝836代入方程1，计算得到其浓度x＝19.7mg/L；

编号1的对照线反应值144<225，所以将y＝812代入方程2，计算得到其浓度x＝172.0mg/L。

实施例2

乙肝表面抗体双曲线定标定量

将纯的乙肝表面抗体标准版进行梯度稀释，得到以下浓度：

0mIU/ml、50mIU/ml、100mIU/ml、250mIU/ml、500mIU/ml、1000mIU/ml、2500mIU/ml、5000mIU/ml、7500mIU/ml、10000mIU/ml、15000mIU/ml、20000mIU/ml、25000mIU/ml。

待测乙肝表面抗体浓度未知。

将不同浓度的乙肝表面抗体与待测乙肝表面抗体取等量分别滴加在试纸条上。

所述试纸条上设置有结合垫、检测线和对照线。

所述结合垫上包被有标记了荧光标记物的且能与乙肝表面抗体结合的第一抗原；

所述检测线上包被有与所述第一抗原表位不同的、固定在检测线上的第二抗原；

所述对照线上包被有固定在对照线上的乙肝表面抗体。

读取检测线和对照线上的应该强度数据如下：

表2乙肝表面抗体标准品对应的检测数值

以表3中对应的校准品浓度值为x轴，检测线反应值为y轴做拟合曲线(图略)，计算得知拐点处的坐标与5000mIU/ml的数值非常接近，故而近似地以(5000，2472)作为拐点做定标曲线。

(1)钩状效应前定标曲线(如图3所示)：

四参数Logistic曲线拟合，得到如下方程

方程1:y＝(A-D)/[1+(x/C)^B]+D

A＝2466.1754

B＝-1.56997

C＝520.6785

D＝27.30171

r²＝0.99209

(2)钩状效应前定标曲线(如图4所示)：

四参数Logistic曲线拟合

方程2:y＝(A-D)/[1+(x/C)^B]+D

A＝-4840.91265

B＝-4.0352

C＝32993.29545

D＝2375.02911

r²＝0.99375

其中，两个待测乙肝表面抗体对应的检测线反应值和对照线反应值分别为：

样品编号	检测线反应值	对照线反应值
			1	1252	336
2	1298	190

其中，编号1的对照线反应值336>330，所以将y＝1252代入方程1，计算得到其浓度x＝523.6mIU/ml；

编号1的对照线反应值190<330，所以将y＝1298代入方程2，计算得到其浓度x＝21434.1mIU/ml。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (2)

1.一种双曲线定标定量免疫层析检测方法，其特征在于，包括：

将不同浓度的待检物的标准品分别与等量反应物进行反应并测定表征反应强度的信号值；

以待检物浓度为横坐标、信号值强度为纵坐标建立坐标系，将不同浓度的待检物标准品对应的信号值代入并绘制拟合曲线，并于曲线拐点处将所述拟合曲线分为两段，对应较低待检物浓度的为前定标曲线，对应较高待检物浓度的为后定标曲线；

当于曲线拐点处将所述拟合曲线分为两段得到前定标曲线和后定标曲线后，还包括：

对所述前定标曲线和后定标曲线重新进行拟合；拟合得到的曲线的线性相关系数大于等于0.990；

判断待检物样品含量与反应物含量之间的关系并将待检物样品与等量反应物进行反应；

所述反应物预先包被在试纸条上；

所述试纸条上还设置有结合垫、检测线和对照线；

当待检物为抗原时：

所述结合垫上包被有能与所述待检物结合的第一抗体，且所述第一抗体标记有胶体金或荧光标记物；

所述检测线上固定包被有第二抗体，且所述第二抗体与所述第一抗体结合的抗原表位不同；

所述对照线上固定包被有待检物；

当待检物为抗体时：

所述结合垫上包被有能与所述待检物结合的抗体，且所述抗体标记有胶体金或荧光标记物；

所述检测线上固定包被有能与所述待检物结合的抗原；

所述对照线上固定包被有待检物；

或；

所述结合垫上包被有能与所述待检物结合的抗原，且所述抗原标记有胶体金或荧光标记物；

所述检测线上固定包被有能与所述待检物结合的抗体；

所述对照线上固定包被待检物；

除测定表征反应强度的信号值外，所述方法还包括测定对照线上的信号值；

进行双曲线应用之前，还包括以对照线上的信号值为参考判断出现钩状效应的类型，判断方法为：

若当待检物样品对应的对照线上的信号值大于等于拐点浓度对应的对照线上的信号值，则代表反应物过量；

若当待检物样品对应的对照线上的信号值小于拐点浓度对应的对照线上的信号值，则代表待检物样品过量；

当待检物样品含量小于反应物含量时，将所述待检物样品对应的表征反应强度的信号值代入前定标曲线计算所述待检物样品浓度；

当待检物样品含量大于反应物含量时，将所述待检物样品对应的表征反应强度的信号值代入后定标曲线计算所述待检物样品浓度。

2.如权利要求1所述的双曲线定标定量免疫层析检测方法，其特征在于，所述不同浓度的待检物的标准品由标准品母液梯度稀释得到，且拐点处对应的标准品浓度位于最高浓度和最低浓度的待检物的标准品之间。