CN106176821A - 一种微生态阴道菌剂及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种微生态阴道菌剂，包括卷曲乳酸杆菌和詹森乳杆菌配伍发酵得到的发酵液。本发明还提供了微生态阴道菌剂的制备方法，将卷曲乳酸杆菌和詹森乳杆菌混株配伍，将混株菌液接种至富集培养上富集培养，得到富集培养液；将富集培养液接种至扩大培养基上扩大培养，得到扩大培养液；将所述扩大培养液接种到发酵培养基上发酵培养，得到的发酵液为微生态阴道菌剂。本发明提供的所述微生态阴道菌剂在制备预防和治疗复发性阴道炎或分泌物异常妇科疾病的药物中的应用。所述微生态阴道菌剂治愈率为88％～98％，有效率为92％～100％，3个月内复发率分别为0％～6％，不良反应发生率低，说明微生物复合菌剂治疗各种复发性阴道炎均有效。
Description
技术领域
本发明涉及预防和治疗阴道疾病的菌剂技术领域，具体涉及一种微生态阴道菌剂及其制备方法和应用。
背景技术
据权威部门统计，我国成年女性妇科疾病的患病率高达87.5％。老年妇女，因卵巢功能衰退，雌激素水平降低，阴道壁萎缩，黏膜变薄，上皮细胞内糖原含量减少，阴道内pH值上升，局部抵抗力降低，致病菌易入侵繁殖引起炎症。妇科炎症包括女性外阴炎、阴道炎、宫颈炎、盆腔炎等，如果不及时预防和治疗可能会引发其他病变，例如可影响精子的上行，妨碍精子与卵子的结合，或妨碍受精卵的着床发育，或导致不排卵等，进而便容易造成女性不孕。妊娠怀孕女性如果感染妇科炎症，则也可对妊娠造成不利影响，可能会发生宫内感染，以及流产、早产，胎儿智力低下等问题，不利于优生优育。
经常使用妇科洗液和抗生素的妇女与不使用妇科洗液和抗生素的妇女相比患妇科炎症的概率低73％，但是妇女连续使用一周抗生素不管是口服还是用于其它疾病，50％以上的妇女会患阴道炎。因此，使用妇科洗液是预防和治疗妇科炎症的有效方法。目前治疗妇科炎症的洗液种类繁多，有纯中药的黄蒲洁肤菌剂杀菌的作用来自于黄柏、黄连和蒲公英等多味中草药成分；还有中药和化学成分结合的菌剂，如：洁尔阴、妇炎洁、妇科千金洗液等等，利用化学成分的杀菌作用治标，利用中药成分治本。但是无论是纯中药还是中药和化学成分结合的菌剂，都会由于滥用这些杀菌物质严重破坏阴道自洁系统，直接导致阴道菌群紊乱，使妇科病易反复发作，治疗效果不理想。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于一种微生态阴道菌剂及其制备方法，通过调节女性阴道菌群，形成一个独特稳定而对人体无害的微生态系统，达到有效预防和治疗妇科疾病的目的。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种微生态阴道菌剂，包括卷曲乳酸杆菌和詹森乳杆菌配伍发酵得到的发酵液。
优选的，所述发酵液中卷曲乳酸杆菌的活菌数1～1.5亿CFU/ml；所述詹森乳杆菌的活菌数0.5～1亿CFU/ml。
本发明还提供了所述的微生态阴道菌剂的制备方法，包括以下步骤：
1)将卷曲乳酸杆菌和詹森乳杆菌混株配伍，将混株菌液接种至富集培养基上富集培养，得到富集培养液；
2)将所述步骤1)得到的富集培养液接种至扩大培养基上扩大培养，得到扩大培养液；
3)将所述步骤2)得到的扩大培养液接种到发酵培养基上发酵培养，得到的发酵液为微生态阴道菌剂。
优选的，所述步骤1)卷曲乳酸杆菌和詹森乳杆菌按照数量比为(1～2):(2～1)进行混株。
优选的，所述步骤1)混株菌液的接种量为5～10％。
优选的，所述步骤1)富集培养基包括以下组分：MgSO4·7H2O1.0～1.5g，KH2PO40.5～1.0g，K2HPO43.0～6g，NaCl 1.0～2g，CaCl215～25mg，FeSO43～8mg，MnCl2·4H2O 3～8mg，CuCl20.3～0.6mg，微量元素液5～8ml，浓度为15mg/L的MC-RR和13mg/L的MC-LR的MCs粗提液200～300ml；所述富集培养基的pH值≤4.5；所述微量元素液含有以下质量含量的组分：ZnSO40.29g/L，CaCl20.24g/L，CuSO40.25g/L，MgSO40.17g/L和FeSO40.28g/L。优选的，所述步骤1)中富集培养的时间为1～2天；所述步骤1)中富集培养的温度为28～30℃；所述步骤1)中富集培养在100rpm～140rpm的转速条件下进行。
优选的，所述步骤2)中扩大培养基包括以下组分含量：蛋白胨8～15g，酵母膏4～10g，NaCl3～8g，蒸馏水补充余量至1L；
优选的，所述扩大培养基的pH值≤4.5；
优选的，所述步骤2)中扩大培养的时间为3～5天；所述步骤2)中扩大培养的温度为28～30℃；
优选的，所述步骤2)中扩大培养在100rpm～140rpm的转速条件下进行；
优选的，所述步骤2)中扩大培养的接种量为5％～10％。
优选的，所述步骤3)中发酵培养基包括下列重量份的组分：2～3份的EM有益微生物菌群、2～3份的红糖、0.2～0.3份的L-抗坏血酸、0.05～0.2份的磷酸二氢钾、0.2～0.5份的蚯蚓抗菌肽溶液、0.3～0.8份的蜂蜜和48～52份的水；
优选的，所述步骤3)中发酵的接种量为1％～3％；
优选的，所述步骤3)中发酵的条件为在常温环境下；
优选的，所述步骤3)中发酵的时间为12～15天。
优选的，所述步骤3)中蚯蚓抗菌肽溶液的制备方法，包括以下步骤：
A将活蚯蚓与红糖按照质量为(4～6):(2～3.5)的比例混合，蚯蚓溶解后得到蚯蚓液；
B将所述步骤A得到的蚯蚓液分离，收集上清液；
C将所述步骤B得到的上清液进行沸水浴5～10min，分离，收集取上清液；
D将所述步骤C得到的上清液过滤收集滤液，得到蚯蚓抗菌肽溶液。
本发明提供所述的微生态阴道菌剂或本发明提供的方法制备的微生态阴道菌剂在制备预防和治疗复发性阴道炎或分泌物异常妇科疾病的药物中的应用。
技术效果
本发明提供的一种微生态阴道菌剂，为卷曲乳酸杆菌和詹森乳杆菌配伍发酵得到的发酵液，卷曲乳酸杆菌和詹森乳杆菌能产H2O2，为有益微生物，科学组合，混株配伍，利用这些微生物之间的共生关系，形成一个复杂而稳定的微生态系统，作用于患者的阴道内，使乳酸菌等有益菌同妇女阴道中的功能菌形成一道强有力的微生态群，牢牢地占据阴道中的生态位，在抑制其它各种致病菌的同时，保留妇女阴道中的有益菌，使阴道内微生态到达平衡pH值4～4.5之间，增强机体免疫力和阴道自洁功能，达到自然恢复的功效。本发明提供的微生态阴道菌剂治愈率在90％以上，有效率在92％以上，3个月内复发率分别为低于3％，不良反应发生率较低。微生物复合菌剂治疗各种复发性阴道炎均有效。
同时，本发明提供的一种微生态阴道洗剂是再生型微生物，pH值在3～4.5之间，是病原菌最惧怕的对手，它的治疗作用是靠控制有害菌不增殖，没有抗生物质全歼灭的性质，因而不会产生具有耐性菌那样的变异株，也就不会使机体产生耐药性，因而安全无不良反应。
本发明还提供了微生态阴道菌剂的制备方法，是卷曲乳酸杆菌和詹森乳杆菌有益微生物为有益菌，将EM有益微生物菌群、红糖、L-抗坏血酸、0.1份的磷酸二氢钾、蚯蚓抗菌肽溶液和蜂蜜螯合发酵，制备方法简单，成本低廉，重复性好。
具体实施方式
本发明提供了一种微生态阴道菌剂，包括卷曲乳酸杆菌和詹森乳杆菌配伍发酵得到的发酵液。
本发明提供的一种微生态阴道菌剂，用先进的生物工程技术和医学微生态学相结合，卷曲乳酸杆菌和詹森乳杆菌作为有益微生物，科学组合，混株配伍，利用这些微生物之间的共生关系，形成一个复杂而稳定的微生态系统，在抑制其它各种致病菌的同时，保留妇女阴道中的有益菌，使阴道内微生态到达平衡pH值4～4.5之间，增强机体免疫力和阴道自洁功能，达到自然恢复的功效。
本发明中，所述发酵液中卷曲乳酸杆菌的活菌数1～1.5亿CFU/ml；所述詹森乳杆菌的活菌数0.5～1亿CFU/ml。
本发明中，所述微生态阴道菌剂还优选包括医学上接受的辅料。在本发明中，所述的辅料优选包括多孔淀粉。所述多孔淀粉与发酵液的质量体积比优选为1.5～2.5：3(mg:mL)，更优选为2：3(mg:L)。
本发明还提供了所述的微生态阴道菌剂的制备方法，包括以下步骤：
1)将卷曲乳酸杆菌和詹森乳杆菌混株配伍后接种至富集培养基上富集培养，得到富集培养液；
2)将所述步骤1)得到的富集培养液接种至扩大培养基上扩大培养，得到扩大培养液；
3)将所述步骤2)得到的扩大培养液接种到发酵培养基上发酵培养，得到的发酵液为微生态阴道菌剂。
本发明提供的所述的微生态阴道菌剂的制备方法，方法简单，重复性好，成本低廉。
本发明将卷曲乳酸杆菌和詹森乳杆菌混株配伍后接种至富集培养基上富集培养，得到富集培养液。
本发明中，所述卷曲乳酸杆菌和詹森乳杆菌的种类没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的制备阴道菌剂的卷曲乳酸杆菌和詹森乳杆菌的种类即可。
本发明中，所述卷曲乳酸杆菌和詹森乳杆菌的来源是健康女性的阴道分泌物中筛选获得。所述筛选的方法包括根据细菌学分离方法分离出乳杆菌,再通过生长温度试验(15℃～45℃)、运动性试验、硝酸盐还原试验、明胶液化试验、吲哚(靛基质)试验、硫化氢试验将疑似株菌鉴定为乳杆菌属；再采用碳水化合物发酵产酸试验对乳杆菌进行种的鉴定，进一步筛选出产生过氧化氢的优势菌株，并运用16S rRNA序列分析方法进行基因型鉴定。本发明中，所述16S rRNA序列分析方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的16SrRNA序列分析方法。所述16S rRNA序列分析方法中使用的引物序列优选为本领域技术人员所熟知的细菌分子鉴定使用的16S rRNA引物正向序列5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3'，16SrRNA引物反向序列5'-TAGGGTTACCTTGTTACGACTT-3'。所述16S rRNA引物由上海生工合成。
本发明中，所述卷曲乳酸杆菌和詹森乳杆菌优选按照数量比为(1～2):(2～1)进行混株配伍，更优选为1:1。
所述卷曲乳酸杆菌和詹森乳杆菌的混株优选按照接种量为5～10％进行接种，更优选为8％。
本发明中，所述富集培养基优选包括以下组分：MgSO4·7H2O 1.0～1.5g，KH2PO40.5～1.0g，K2HPO43.0～6g，NaCl 1.0～2g，CaCl215～25mg，FeSO43～8mg，MnCl2·4H2O3～8mg，CuCl20.3～0.6mg，微量元素液5～8ml，浓度为15mg/L的MC-RR(藻毒素RR)和13mg/L的MC-LR(藻毒素LR)的MCs粗提液200～300ml，蒸馏水补充余量；所述富集培养基pH值≤4.5；更优选为MgSO4·7H2O 1.2g，KH2PO40.8g，K2HPO44g，NaCl 1.5g，CaCl220mg，FeSO45mg，MnCl2·4H2O 5mg，CuCl20.5mg。微量元素液6ml，浓度为15mg/L的MC-RR和13mg/L的MC-LR的MCs粗提液200～300ml，蒸馏水补充至1000ml。所述富集培养基的pH值更优选为4.0～4.4。所述富集培养基的pH值调整的方法采用体积浓度0.1％的HCl溶液和质量浓度为0.1％的NaOH溶液进行调整。
本发明中，所述微量元素液优选包括以下质量含量的组分：ZnSO40.29g/L，CaCl20.24g/L，CuSO40.25g/L，MgSO40.17g/L和FeSO40.28g/L；所述微量元素液中的溶剂为蒸馏水。
本发明对所述富集培养基的配制方法没有特殊限制采用本领域技术人员所熟知的培养基配制方法即可。
本发明中，所述MCs粗提液的制备方法优选包括以下步骤：
冻干小球藻粉用体积浓度为5％～10％的乙酸提取3～4次，得到的悬浊液离心取上清液，并通过预处理的活性炭吸附柱吸附，随后清洗活性炭吸附柱，用体积浓度为15％～20％甲醇洗一次，再用体积浓度为100％甲醇洗脱毒素；将体积浓度为100％甲醇洗脱液在旋转蒸发仪上蒸干，得到的干粉为粗微囊藻毒素。所述的预处理方法优选用体积浓度100％甲醇冲洗，后用去离子水冲洗。
本发明中，所述富集培养的时间优选为1～2天，更优选为1.5天。所述富集培养的温度优选为28～30℃，更优选为29℃。所述富集培养优选在转速为100rpm～140rpm的条件下进行，更优选为120rpm。
得到富集培养液后，本发明将所述富集培养液接种至扩大培养基上扩大培养，得到扩大培养液；
本发明中，所述扩大培养基优选包括以下质量含量的组分：蛋白胨8～15g/L，酵母膏4～10g/L，NaCl 3～8g/L；所述扩大培养基中的溶剂为蒸馏水；更优选为蛋白胨10g/L，酵母膏46g/L，NaCl 5g/L；所述扩大培养基pH≤4.5，更优选为4.0～4.4。所述pH值的调节方法优选采用体积浓度为0.1％的HCl溶液和质量浓度为0.1％的NaOH溶液调节。
本发明中，所述扩大培养的时间为3～5天，更优选为4天。所述扩大培养的温度为28～30℃，更优选为29℃。所述扩大培养优选在震荡培养条件下进行，所述震荡培养的转速为100rpm～140rpm；更优选为120rpm。所述扩大培养的接种量为5％～10％，更优选为8％。
得到扩大培养液后，本发明将所述扩大培养液接种到发酵培养基上发酵培养，得到的发酵液为微生态阴道菌剂。
本发明中，所述发酵培养基包括下列重量份的组分：2～3份的EM有益微生物菌群、2～3份的红糖、0.2～0.3份的L-抗坏血酸、0.05～0.2份的磷酸二氢钾、0.2～0.5份的蚯蚓抗菌肽溶液、0.3～0.8份的蜂蜜和48～52份的水，更优选为2.5份的EM有益微生物菌群、2.5份的红糖、0.25份的L-抗坏血酸、0.1份的磷酸二氢钾、0.3份的蚯蚓抗菌肽溶液、0.5份的蜂蜜和50份的水。本发明对所述水的种类没有特殊的限制，采用本领域技术人员熟知的培养基用水即可，具体的，所述水为凉开水。
在本发明中，所述发酵培养的接种量优选为1％～3％，更优选为2％；所述发酵培养优选在常温环境下进行；所述发酵培养的时间为12～15天，更优选为13～14天。
本发明中，所述EM有益微生物菌群的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的EM有益微生物菌群的来源即可。本发明实施例中所述EM有益微生物菌群的来源为从江西天意生物有限公司购买得到。
本发明中，所述蚯蚓抗菌肽溶液的制备方法优选包括以下步骤：
A将活蚯蚓与红糖按照质量为(4～6):(2～3.5)的比例混合，蚯蚓溶解后得到蚯蚓液；
B将所述步骤A得到的蚯蚓液分离，收集上清液；
C将所述步骤B得到的上清液进行沸水浴5～10min，分离，收集取上清液；
D将所述步骤C得到的上清液过滤收集滤液，得到蚯蚓抗菌肽溶液。
本发明将活蚯蚓与红糖按照质量为(4～6):(2～3.5)的比例混合，蚯蚓溶解后得到蚯蚓液；更优选为5：3的比例混合。
本发明中，所述混合没有特殊限制采用本领域技术人员所熟知的混合的技术方案即可。
本发明中，所述活蚯蚓优选在与红糖混合之前进行清洗干净。本发明中，所述活蚯蚓和红糖的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的活蚯蚓和红糖的来源即可。本发明中，所活蚯蚓在红糖的作用下会发生溶解，得到蚯蚓液。
得到蚯蚓液后，本发明将所述蚯蚓液分离，收集上清液。
本发明中，所述分离的方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所述之的分离的技术方案即可。本发明实施例中，所述分离的方案为离心。所述离心的转速优选为100rpm～140rpm；更优选为120rpm。所述离心的时间优选为5～8min；更优选为6～7min。所述离心的温度优选为18℃-35℃；更优选为30℃。
得到上清液后，本发明将所述上清液进行沸水浴5～10min，分离，收集取上清液。
本发明中，上清液进行沸水浴的时间5～10min，更优选为8min。所述上清液进行沸水浴之前优选用乙酸缓冲液稀释。所述乙酸缓冲液的浓度优选为30％～40％；更优选为36％。所述稀释的倍数优选为80～120倍，更优选为100倍。
本发明中，所述沸水浴优选在搅拌的条件下进行。本发明对所述搅拌的速度没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的沸水浴搅拌速度即可。
得到上清液后，本发明将所述上清液过滤收集滤液，得到蚯蚓抗菌肽溶液。
本发明中，所述过滤优选采用能通过分子量10000Da规格的超滤系统进行。
本发明中，所述发酵培养的过程具体优选包括以下步骤：
Ⅰ、将红糖、磷酸二氢钾与凉开水混合，充分搅拌至全部溶解；
Ⅱ、加入EM有益微生物菌群、所述扩大培养液和蚯蚓抗菌肽溶液，搅拌，在半密封状态下，在25～35℃、光照强度在100～550Lex的环境下发酵，每三天搅拌一次，每次搅拌1～2min；
Ⅲ、发酵进行到第3天时，水面会出现泡沫，加入蜂蜜以加快发酵速度，促进有益微生物的生成；第8天时，泡沫慢慢消失，水面浮起一片白色的悬浮物，加入L-抗坏血酸，以增强抗氧化能力，到第13天时，悬浮物形成沉淀物，pH值在4.5以下，固液分离，得到的发酵上清液为微生态阴道菌剂。
本发明中，所述半密封状态下优选发酵容器盖上盖的状态。
本发明中，所述发酵液优选采用多孔淀粉吸附，得到多孔淀粉吸附的复合菌剂，喷雾干燥后的产品分装成胶囊，制备得到微生态阴道菌胶囊剂。所述喷雾干燥的进风温度优选为150～180℃；更优选为170℃。所述喷雾干燥的出风温度优选为60～70℃；更优选为65℃。
本发明中，所述多孔淀粉与发酵上清液的质量体积比优选为1.5～2.5：3(mg:mL)，更优选为2：3(mg:L)。所述多孔淀粉的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的多孔淀粉即可。
基于上述微生态阴道菌剂的特点，本发明提供的微生态阴道菌剂在制备预防和治疗复发性阴道炎或分泌物异常妇科疾病的药物中的应用。
本发明中，所述微生态阴道菌剂在使用的过程中，优选连续用药5d～6d，每天1次，每次1粒胶囊。所述胶囊中盛装所述微生态阴道菌剂的活菌数优选为8～15亿CFU/g。
下面结合实施例对本发明提供的一种微生态阴道菌剂及其制备方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
将活用水洗净蚯蚓，以蚯蚓跟红糖5:3的比例，加入红糖(又名甘蔗糖)，等蚯蚓溶解后，将蚯蚓液离心分离，取上清液，用乙酸缓冲液稀释后，入沸水浴，边加热边搅动5min，然后离心分离，取上清液，用乙酸缓冲液稀释后，用能通过分子量10000Da规格的超滤系统过滤或高速离心机分离得到蚯蚓抗菌肽溶液。
实施例2
将活用水洗净蚯蚓，以蚯蚓跟红糖4：3.5的比例，加入红糖(又名甘蔗糖)，等蚯蚓溶解后，将蚯蚓液离心分离，取上清液，用乙酸缓冲液稀释后，入沸水浴，边加热边搅动8min，然后离心分离，取上清液，用乙酸缓冲液稀释后，用能通过分子量10000Da规格的超滤系统过滤或高速离心机分离得到蚯蚓抗菌肽溶液。
实施例3
将活用水洗净蚯蚓，以蚯蚓跟红糖6：2的比例，加入红糖(又名甘蔗糖)，等蚯蚓溶解后，将蚯蚓液离心分离，取上清液，用乙酸缓冲液稀释后，入沸水浴，边加热边搅动10min，然后离心分离，取上清液，用乙酸缓冲液稀释后，用能通过分子量10000Da规格的超滤系统过滤或高速离心机分离得到蚯蚓抗菌肽溶液。
实施例4
筛选出健康妇女阴道中卷曲乳酸杆菌和詹森乳杆菌有益菌，混株配伍，按照5％的接种量接种至富集培养基中，以120转/min，30℃下震荡培养1天，得到有益菌培养液，富集培养基培养基的组成为MgSO4·7H2O 1.0g，KH2PO41.0g，K2HPO43.0g，NaCl 2g，CaCl215mg，FeSO48mg，MnCl2·4H2O 3mg，CuCl20.6mg，微量元素液5ml，浓度为15mg/L的MC-RR和13mg/L的MC-LR的MCs粗提液200ml，蒸馏水补充至1000ml，调节pH为4.5，其中微量元素液为1L蒸馏水中含有ZnSO40.29g，CaCl20.24g，CuSO40.25g，MgSO40.17g和FeSO40.28g。将培养液按5％的接种量接种到扩大培养基上，以120rpm，30℃下继续培养5天，得到发酵液，筛选优良菌种，所述扩大培养基的组成为蛋白胨8g，酵母膏10g，NaCl 3g，蒸馏水补充至1000ml，调节pH为4.5。将得到的扩大培养液菌种按照接种量为1％的量接入含2kg EM菌种红糖，0.05kg磷酸二氢钾和实施例1制备得到的0.2份的的蚯蚓抗菌肽的溶液的50kg的水溶液，搅拌，在半密封状态下，室温在35℃、光照强度在100Lex的环境下发酵，每三天搅拌一次，每次搅拌2min；发酵进行到第3天时，水面会出现泡沫，需加入0.3kg蜂蜜以加快发酵速度，促进有益微生物的生成；第8天时，泡沫慢慢消失，水面浮起一片白色的悬浮物，需加入0.2kg L-抗坏血酸，以增强抗氧化能力，到第l3天时，悬浮物形成沉淀物，pH值在4.5，固液分离，收集发酵上清液，按照多孔淀粉与发酵上清液的质量体积比1.5：3(mg:mL)的比例添加多孔淀粉后进行喷雾干燥，得到微生态阴道菌剂干粉。将干粉分装至胶囊中，保证每胶囊中盛装的微生态阴道菌剂的活菌数为8亿CFU/g，即得到微生态阴道菌剂产品。
实施例5
筛选出健康妇女阴道中卷曲乳酸杆菌和詹森乳杆菌有益菌，混株配伍，按照10％的接种量接种至富集培养基中，以100转/min，28℃下震荡培养3天，得到有益菌培养液，富集培养基培养基的组成为MgSO4·7H2O 1.5g，KH2PO40.5g，K2HPO46g，NaCl 1.0g，CaCl225mg，FeSO43mg，MnCl2·4H2O3mg，CuCl20.3mg，微量元素液8ml，浓度为15mg/L的MC-RR和13mg/L的MC-LR的MCs粗提液200～300ml，蒸馏水800～1000ml，调节pH为4，其中微量元素液为1L蒸馏水中含有ZnSO40.29g，CaCl20.24g，CuSO40.25g，MgSO40.17g和FeSO40.28g。将培养液按8％的接种量接种到扩大培养基上，以140rpm，30℃下继续培养3天，得到发酵液，筛选优良菌种，所述扩大培养基的组成为蛋白胨15g，酵母膏4g，NaCl 8g，蒸馏水补充1L，调节pH为4。将得到的扩大培养液菌种按照接种量为1％的量接入含3kg EM菌种红糖，0.2kg磷酸二氢钾和实施例2制备得到的0.5份的蚯蚓抗菌肽的溶液的52kg的水溶液，搅拌，在半密封状态下，室温在25℃、光照强度在550Lex的环境下发酵，每三天搅拌一次，每次搅拌1min；发酵进行到第3天时，水面会出现泡沫，需加入0.8kg蜂蜜以加快发酵速度，促进有益微生物的生成；第8天时，泡沫慢慢消失，水面浮起一片白色的悬浮物，需加入0.3kg L-抗坏血酸，以增强抗氧化能力，到第l3天时，悬浮物形成沉淀物，pH值在4.2，固液分离，发酵上清液，按照多孔淀粉与发酵上清液的质量体积比2.5：3(mg:mL)的比例多孔淀粉后喷雾干燥，得到微生态阴道菌剂干粉。将干粉分装至胶囊中，保证每胶囊中盛装的微生态阴道菌剂的活菌数为15亿CFU/g，即得到微生态阴道菌剂产品。
实施例6
筛选出健康妇女阴道中卷曲乳酸杆菌和詹森乳杆菌有益菌，混株配伍，按照8％的接种量接种至富集培养基中，以140转/min，29℃下震荡培养2天，得到有益菌培养液，富集培养基培养基的组成为MgSO4·7H2O 1.2g，KH2PO40.8g，K2HPO44g，NaCl 1.5g，CaCl220mg，FeSO45mg，MnCl2·4H2O 5mg，CuCl20.5mg，微量元素液6ml，浓度为15mg/L的MC-RR和13mg/L的MC-LR的MCs粗提液200～300ml，蒸馏水补充至1000ml，调节pH为4.2，其中微量元素液为1L蒸馏水中含有ZnSO40.29g，CaCl20.24g，CuSO40.25g，MgSO40.17g和FeSO40.28g。将培养液按10％的接种量接种到扩大培养基上，以100rpm，30℃下继续培养4天，得到发酵液，筛选优良菌种，所述扩大培养基的组成为蛋白胨10g，酵母膏46g，NaCl 5g，蒸馏水补充1L，调节pH为4.2。将得到的扩大培养液菌种按照接种量为1％的量接入含2.5kg EM菌种红糖，0.1kg磷酸二氢钾和实施例3制备得到的0.3份的蚯蚓抗菌肽的溶液的48kg的水溶液，搅拌，在半密封状态下，室温在30℃、光照强度在300Lex的环境下发酵，每三天搅拌一次，每次搅拌1.5min；发酵进行到第3天时，水面会出现泡沫，需加入0.5kg蜂蜜以加快发酵速度，促进有益微生物的生成；第8天时，泡沫慢慢消失，水面浮起一片白色的悬浮物，需加入0.25kg L-抗坏血酸，以增强抗氧化能力，到第l3天时，悬浮物形成沉淀物，pH值在4.0，固液分离，发酵上清液，按照多孔淀粉与发酵上清液的质量体积比2：3(mg:mL)的比例多孔淀粉后喷雾干燥，得到微生态阴道菌剂干粉。将干粉分装至胶囊中，保证每胶囊中盛装的微生态阴道菌剂的活菌数为10亿CFU/g，即得到微生态阴道菌剂产品。
实施例7～10
将门诊200例复发性阴道炎患者按照优势菌及菌群密集度、多样性的不同、特殊菌群的检出、机体炎性反应及临床表现分为4组，每组50例。
A组：阴道炎治疗后仍有症状，阴道微生态表现无优势菌、密集度+、多样性+，给予重点恢复阴道酸性环境、补充乳酸杆菌，阴道用微生物复合菌剂5d，每晚1次。
B组：阴道炎治疗后仍有症状，阴道微生态表现革兰阳性球菌或革兰阴性杆菌为优势菌，密集度及多样性为给予恢复阴道酸性环境，分别应用针对革兰阳性球菌或针对革兰阴性杆菌为主的抗生素治疗1周，阴道用微生物复合菌剂5d，每晚1次。
C组：滴虫感染，镜下见滴虫，给予口服硝唑类治疗1周后，用微生物复合菌剂5d，每晚1次。
D组：假丝酵母菌性阴道炎复发，镜下看见菌丝或孢子，菌群失调，临床有外阴瘙痒症状，白带典型或不典型，口服氟康唑150mg(第1日)同时阴道用达克宁400mg，每晚1次，连用3d，停药后阴道用微生物复合菌剂5d，每晚1次。
评定疗效。结果：A、B、C、D 4组治愈率分别为98％，96％，96％，88％，有效率分别为100％，98％，98％，92％，3个月内复发率分别为0％，2％，2％，6％，不良反应发生率低。微生物复合菌剂治疗各种复发性阴道炎均有效。
实施例11～14
根据分泌物颜色、气味、pH值及阴道微生态诊断、线索细胞、特殊病原体分为4组。
A组：有临床症状，微生态检查所有细菌均少，表现为没有优势菌，密集度+、多样性+，治疗重点是恢复阴道酸性环境，3％硼酸坐浴，每日2次，乳酸杆菌活菌胶囊1枚置阴道深处，每晚1次，共5d。
B组：有临床症状，阴道微生态表现革兰阴性杆菌为优势菌，密集度及多样性为应用针对革兰阴性杆菌为主的抗生素环丙沙星500mg，每日2次，共治疗7d，如发现有线索细胞，氨试验阳性，阴道pH>4.5，阴道均质稀薄的分泌物诊断细菌性阴道病，给予甲硝唑400mg口服，每日2次，共7d。若阴道炎治疗后仍有症状，阴道微生态表现革兰阳性球菌，应用针对革兰阳性球菌的抗生素头孢拉定0.5g，每日4次，共7d。
C组：典型的黄绿色泡沫样白带，瘙痒、灼热、疼痛，分泌物悬滴法可见滴虫，治疗采用甲硝唑或替硝唑2g单次口服，局部用3％硼酸溶液冲洗，性伴同治，1周后乳杆菌活菌胶囊1枚置阴道深处，每晚1次，共5d。
D组：临床症状及体征典型或不典型，可见孢子或菌丝，口服氟康唑150mg(第1天)同时阴道用达克宁400mg，每晚1次，连用3d，停药后用乳酸杆菌活菌胶囊5d，每晚1次。
评定疗效。结果：A、B、C、D 4组治愈率分别为97％，95％，98％，90％，有效率分别为100％，98％，98％，92％，3个月内复发率分别为1％，1％，0％，3％，不良反应发生率低。微生物复合菌剂治疗各种复发性阴道炎均有效。
由以上实施例可知，本发明提供的一种微生态阴道菌剂，用先进的生物工程技术和医学微生态学相结合，卷曲乳酸杆菌和詹森乳杆菌作为有益微生物，科学组合，混株配伍，应用治疗妇科疾病，结果显示本发明提供的微生态阴道菌剂能有效预防和治疗多种妇科疾病，并且使用安全无不良反应。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种微生态阴道菌剂，其特征在于，包括卷曲乳酸杆菌和詹森乳杆菌配伍发酵得到的发酵液。
2.根据权利要求1所述的微生态阴道菌剂，其特征在于，所述发酵液中卷曲乳酸杆菌的活菌数1～1.5亿CFU/ml；所述詹森乳杆菌的活菌数0.5～1亿CFU/ml。
3.权利要求1或2所述的微生态阴道菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将卷曲乳酸杆菌和詹森乳杆菌混株配伍，将混株菌液接种至富集培养基上富集培养，得到富集培养液；
2)将所述步骤1)得到的富集培养液接种至扩大培养基上扩大培养，得到扩大培养液；
3)将所述步骤2)得到的扩大培养液接种到发酵培养基上发酵培养，得到的发酵液为微生态阴道菌剂。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1)卷曲乳酸杆菌和詹森乳杆菌按照数量比为(1～2)：(2～1)进行混株配伍。
5.根据权利要求3或4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1)混株菌液的接种量为5～10％。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1)富集培养基包括以下组分：MgSO4·7H2O1.0～1.5g，KH2PO4 0.5～1.0g，K2HPO4 3.0～6g，NaCl 1.0～2g，CaCl2 15～25mg，FeSO4 3～8mg，MnCl2·4H2O 3～8mg，CuCl2 0.3～0.6mg，微量元素液5～8mL，浓度为15mg/L的MC-RR和13mg/L的MC-LR的MCs粗提液200～300mL，蒸馏水补充余量至1L；
所述的富集培养基的pH值≤4.5；
所述微量元素液含有以下质量含量的组分：ZnSO4 0.29g/L，CaCl2 0.24g/L，CuSO40.25g/L，MgSO4 0.17g/L和FeSO4 0.28g/L；
所述步骤1)中富集培养的时间为1～2天；所述步骤1)中富集培养的温度为28～30℃；所述步骤1)中富集培养在100rpm～140rpm的转速条件下进行的。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中扩大培养基包括以下质量含量的组分：蛋白胨8～15g/L，酵母膏4～10g/L，NaCl 3～8g/L，所述扩大培养基的pH值≤4.5；
所述步骤2)中扩大培养的接种量为5％～10％；
所述步骤2)中扩大培养的时间为3～5天；所述步骤2)中所述扩大培养的温度为28～30℃；所述步骤2)中扩大培养在转速为100rpm～140rpm的条件下进行。
8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤3)中发酵培养基包括下列重量份的组分：2～3份的EM有益微生物菌群、2～3份的红糖、0.2～0.3份的L-抗坏血酸、0.05～0.2份的磷酸二氢钾、0.2～0.5份的蚯蚓抗菌肽溶液、0.3～0.8份的蜂蜜和48～52份的水；
所述步骤3)中发酵培养的接种量为1％～3％；
所述步骤3)中发酵的时间为12～15天。
9.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述步骤3)中蚯蚓抗菌肽溶液的制备方法，包括以下步骤：
A将活蚯蚓与红糖按照质量为(4～6):(2～3.5)的比例混合，蚯蚓溶解后得到蚯蚓液；
B将所述步骤A得到的蚯蚓液分离，收集上清液；
C将所述步骤B得到的上清液进行沸水浴5～10min，分离，收集取上清液；
D将所述步骤C得到的上清液过滤，得到的滤液为蚯蚓抗菌肽溶液。
10.权利要求1或2所述的微生态阴道菌剂或权利要求3～9任意一项所述的方法制备的微生态阴道菌剂在制备预防和治疗复发性阴道炎或分泌物异常妇科疾病的药物中的应用。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20161207 |
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |