CN106164289A

CN106164289A - 癌症对免疫疗法的反应的决定因素

Info

Publication number: CN106164289A
Application number: CN201480075287.2A
Authority: CN
Inventors: T·常; J·沃尔乔克; A·斯尼德查伦; V·马卡罗维
Original assignee: Memorial Sloan Kettering Cancer Center
Current assignee: Memorial Sloan Kettering Cancer Center
Priority date: 2014-01-02
Filing date: 2014-12-23
Publication date: 2016-11-23
Also published as: CL2016001708A1; MX2016008771A; PH12016501329A1; US20160326597A1; AU2014374020A1; RU2016131207A3; WO2015103037A3; WO2015103037A2; EP3090066A4; KR20160102314A; SG11201605432RA; EP3090066A2; BR112016015399A2; CA2935214A1; PE20161344A1; RU2016131207A; JP2017504324A; RU2707530C2; SG10201805674YA

Abstract

本发明描述了癌症对免疫疗法的反应的分子决定因素、以及用于鉴定和/或表征可能响应于免疫疗法的癌症的系统和工具。本发明涵盖以下发现：对癌症免疫疗法的有利反应的可能性可以被预测。本发明进一步包括以下发现：癌症细胞可具有导致新表位的体细胞突变，该新表位可由患者的免疫系统识别为非自身的。对癌症样品中的一个或多个新表位的鉴定可用于确定哪些癌症患者可能有利地响应于免疫疗法，具体地来说是使用免疫检查点调节剂的治疗。

Description

癌症对免疫疗法的反应的决定因素

相关申请的交叉引用

本专利申请要求2014年1月2日提交的美国临时专利申请序列号61/923,183、2014年10月20日提交的美国临时专利申请序列号62/066,034、以及2014年10月30日提交的美国临时专利申请序列号62/072,893中的每一个的优先权，这些临时专利申请中的每一个的全部内容以引用的方式并入本文。

背景

癌症免疫疗法涉及由患者的免疫系统进行的对癌症细胞的攻击。T淋巴细胞的调节和活化取决于由T细胞受体进行的信号传导并且还取决于递送正或负信号以用于活化的共信号传导受体。由T细胞进行的免疫应答受共刺激性和抑制性信号平衡(称为免疫检查点)控制。

使用免疫检查点抑制剂的免疫疗法是革命性的癌症疗法。例如，在某些黑色素瘤患者中，抗CTLA4和抗PD1抗体为转移性环境中的长期疾病控制提供非凡的机会。

概述

本发明涵盖以下发现：对癌症免疫疗法的有利反应的可能性可以被预测。本发明进一步包括以下发现：癌症细胞可具有导致新表位的体细胞突变，该新表位可由患者的免疫系统识别为非自身的。对癌症样品中的一个或多个新表位的鉴定可用于确定哪些癌症患者可能有利地响应于免疫疗法，具体地来说是使用免疫检查点调节剂的治疗。

在一些实施方案中，本发明提供用于将受试者鉴定为可能响应于使用免疫检查点调节剂的治疗的方法。

在一些实施方案中，方法包括以下步骤：在来自受试者的癌症样品中检测体细胞突变，以及将受试者鉴定为使用免疫检查点调节剂的治疗的候选者。在一些实施方案中，受试者被鉴定为可能有利地响应于使用免疫检查点调节剂的治疗。

在一些实施方案中，检测体细胞突变包括对来自癌症样品的一个或多个外显子组进行测序。在一些实施方案中，体细胞突变包括由T细胞识别的新表位。

在一些实施方案中，新表位与不具有突变的对应表位相比具有更大的对主要组织相容性复合体(MHC)分子的结合亲和力。

在一些实施方案中，体细胞突变包括新表位，所述新表位包含在不具有体细胞突变的相同细胞类型中不表达的四聚体。

在一些实施方案中，新表位与感染剂共享共有序列。在一些实施方案中，新表位与细菌共享共有序列。在一些实施方案中，新表位与病毒共享共有序列。

在一些实施方案中，体细胞突变包括包含表1的四聚体的新表位。

在一些实施方案中，癌症样品为或包括黑色素瘤。

在一些实施方案中，免疫检查点调节剂与以下的一种或多种相互作用：细胞毒性T-淋巴细胞抗原4(CTLA4)、程序性死亡1(PD-1)或其配体、淋巴细胞活化基因-3(LAG3)、B7同源物3(B7-H3),B7同源物4(B7-H4)、吲哚胺(2,3)-双加氧酶(IDO)、腺苷A2a受体、轴突素(neuritin)、B-淋巴细胞和T-淋巴细胞弱化子(BTLA)、杀伤免疫球蛋白样受体(KIR)、含T细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域的蛋白质3(TIM-3)、诱导型T细胞共刺激分子(ICOS)、CD27、CD28、CD40、CD137或其组合

在一些实施方案中，免疫检查点调节剂为或包括抗体或抗原结合片段。在一些实施方案中，免疫检查点调节剂为伊匹单抗。在一些实施方案中，免疫检查点调节剂为或包括替西木单抗。在一些实施方案中，免疫检查点调节剂为或包括纳武单抗。在一些实施方案中，免疫检查点调节剂为或包括拉姆单抗(lambrolizumab)。在一些实施方案中，免疫检查点调节剂为或包括派姆单抗。

在一些实施方案中，本发明提供用于将受试者鉴定为可能响应于使用免疫检查点调节剂的治疗的方法。在一些实施方案中，本发明提供用于将受试者鉴定为可能响应于使用免疫检查点调节剂的治疗的方法，其中受试者先前从未使用癌症免疫疗法治疗过。

在一些实施方案中，本发明提供用于在来自受试者的癌症样品中检测体细胞突变以及将受试者鉴定为使用免疫检查点调节剂的治疗的较差候选者的方法。

在一些实施方案中，本发明提供用于将受试者鉴定为如果施用免疫检查点调节剂，则可能遭受一种或多种自身免疫并发症的方法。

在一些实施方案中，自身免疫并发症为或包括小肠结肠炎、肝炎、皮炎(包括毒性表皮坏死溶解)、神经病和/或内分泌病。在一些实施方案中，自身免疫并发症为或包括甲状腺功能减退症。

在一些实施方案中，本发明提供用于确定受试者患有包含体细胞突变的癌症以及对于受试者选择包含免疫检查点调节剂的癌症治疗的方法，其中体细胞突变包括包含来自表1的四聚体的新表位。

在一些实施方案中，本发明提供用于使用免疫检查点调节剂治疗受试者的方法，其中受试者先前被鉴定为患有具有一个或多个体细胞突变的癌症，其中一个或多个体细胞突变包括由T细胞识别的新表位。

在一些实施方案中，本发明提供用于改进使用免疫检查点调节剂的癌症疗法的功效的方法，所述方法包括以下步骤：对于疗法接受选择被鉴定为患有具有一个或多个体细胞突变的癌症的受试者，所述一个或多个体细胞突变包括由T细胞识别的新表位。

在一些实施方案中，本发明提供通过施用免疫检查点调节剂治疗癌症的方法的改进，其中改进包括向被鉴定为患有具有一个或多个体细胞突变的癌症的受试者施用疗法，所述一个或多个体细胞突变包括由T细胞识别的新表位。在一些实施方案中，在CTLA-4阻断(例如，通过伊匹单抗或替西木单抗)治疗之后观察到长期临床益处。

在一些实施方案中，本发明提供用于治疗选自由癌瘤、肉瘤、骨髓瘤、白血病或淋巴瘤组成的组的癌症的方法，方法包括以下步骤：向被鉴定为患有具有一个或多个体细胞突变的癌症的受试者施用免疫检查点调节剂疗法，所述一个或多个体细胞突变包括由T细胞识别的新表位。在一些实施方案中，癌症为黑色素瘤。在一些实施方案中，癌症为非小细胞肺癌(NSCLC)。

附图简述

下列图仅为说明目的而给出，并且并非意在进行限制。

图1(由图1A至图1C组成)示出成对的治疗前和治疗后扫描，该扫描来自具有疗法的长期临床益处的患者(图1A，1/2/2011和8/26/2013)；(图1B，9/6/2011和1/14/2013)以及不具有益处/进行性疾病的患者(图1C，8/13/2009和1/9/2010)。

图2(由图2A至图2I组成)示出来自具有伊匹单抗治疗的不同临床益处的患者的肿瘤突变景观(mutational landscape)。图2A示出通过临床益处分类的突变负荷(mutational load)。图2B示出突变负荷与伊匹单抗益处之间的关系。LB，长期临床益处组；NB，最小益处或无益处组；p＝0.01(对于具有与不具有长期临床益处的患者之间的中值突变负荷差异比较中值的曼-惠特尼双尾t-检验)。图2C示出通过临床亚组得到的转换(Ti)和颠换(Tv)率。图2D示出发现组和验证组中的核苷酸变化。突变谱与先前黑色素瘤基因组研究一致。19图2E描绘发现组中具有大于或小于100个非同义编码突变/外显子组的患者的总存活率的Kaplan-Meier曲线(由对数秩检验得到p＝0.041)。图2F示出突变负荷与伊匹单抗益处之间的关系。LB，长期临床益处组；NB，最小益处或无益处组；p＝0.01(对于具有与不具有长期临床益处的患者之间的中值突变负荷差异比较中值的曼-惠特尼双尾t-检验)。图2G描绘发现组中具有大于或小于100个非同义编码突变/外显子组的患者的总存活率的Kaplan-Meier曲线(由对数秩检验得到p＝0.041)。图2H描绘验证组中具有大于或小于100个非同义编码突变/外显子组的患者的总存活率的Kaplan-Meier曲线(由对数秩检验得到p＝0.010)。图2I示出通过临床亚组得到的转换(Ti)和颠换(Tv)率。

图3(由图3A至图3H组成)示出新表位标记定义了伊匹单抗临床益处。候选新表位通过补充方法中所述的突变分析来鉴定。图3A示出由发现组(n＝25)中具有长期临床益处(LB)或具有最小临床益处或无临床益处(NB)的患者共享的候选四肽新表位的热图。每行表示一种新表位。红线指示与反应相关的四肽标记。精确的四肽、染色体基因座以及其中存在它们的野生型和突变型九聚体列于表4和图19中。图3B示出对于验证组(n＝15)的相同信息。图3C通过排除分离的未响应肿瘤的正新表位标记(蓝线)或负新表位标记(红线)示出发现组的Kaplan-Meier曲线。对于具有标记的患者与不具有标记的那些患者，由对数秩检验得到P<0.0001。图3D示出对于验证组的相同数据。由对数秩得到p＝0.049。图3E示出由发现组(n＝25)中具有长期临床益处(LB)或具有最小临床益处或无临床益处(NB)的患者共享的候选四肽新表位的热图。每行表示一种新表位。红线指示与反应相关的四肽标记。精确的四肽、染色体基因座以及其中存在它们的野生型和突变型九聚体列于表4和图19中。图3F示出对于验证组(n＝15)的相同信息。图3G通过排除分离的未响应肿瘤的正新表位标记(蓝线)或负新表位标记(红线)示出发现组的Kaplan-Meier曲线。对于具有标记的患者与不具有标记的那些患者，由对数秩检验得到P<0.0001。图3H示出对于验证组的相同数据。由对数秩得到p＝0.049。

图4(由图4A至图4F组成)示出活化来自伊匹单抗治疗的患者的T细胞的新表位。图4A示出作为基因组位置函数的新表位产生多样性。作为基因组位置函数对来自三个代表性LB患者的新表位进行作图。标记的候选新表位可通过不同基因来产生。沿着x轴对新表位的染色体位置进行作图。峰高指示发现组和验证组中有多少患者共享氨基酸序列。图4B示出刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)的实例四肽子串。在每种情况下，含有突变的九聚体被预测为结合患者特异性HLA并且由患者特异性HLA呈递。图4C示出对TESPFEQHI与野生型肽TKSPFEQHI的多功能T细胞应答。图4D示出对TESPFEQHI与野生型肽TKSPFEQHI的双重阳性(IFN-γ和TNF-α)CD8+T细胞应答以及随时间推移IFN-γ+T细胞的增加。图4E示出对GLEREGFTF与野生型肽GLERGGFTF的双重阳性(IFN-γ和TNF-α)CD8+T细胞应答，并且示出相对于基线，在开始用伊匹单抗治疗24周之后肽特异性T细胞的增加。图4F示出人巨细胞病毒立即早期表位的实例四肽子串。在每种情况下，含有突变的九聚体被预测为结合患者特异性HLA并且由患者特异性HLA呈递。

图5示出发现组的分析流程，其中排除了具有小于或等于10倍覆盖度的突变，并且使用整合基因组学查看器(IGV)手动查看具有小于35倍覆盖度的候选者。

图6(由图6A至图6D组成)示出每个临床亚组中最常见突变的基因的代表性列表。候选突变通过诸如Ion Torrent测序或MiSeq的正交测序方法来验证。图6A描绘发现组和验证组中反复突变的基因的代表性列表。图6B描绘发现组和验证组中的突变类型在整个样品中的分布。图6C描绘发现组和验证组中反复突变的基因的代表性列表。图6D描绘发现组和验证组中的突变类型在整个样品中的分布。

图7(由图7A至图7F组成)示出长期益处和最小益处或无益处患者的驱动物(driver)和突变负荷。图7A示出发现组中每个临床组肿瘤中的已知黑色素瘤驱动基因的突变发生。图7B描绘验证组中每个临床组肿瘤中的已知黑色素瘤驱动基因的突变。图7C示出验证组中每个样品的外显子错义突变数。图7D示出验证组中每个样品的中值外显子错义突变的比较。图7E描绘患者亚组的突变负荷，所述患者亚组为不具有放射照相疾病迹象(NED)、具有大于6个月的疾病控制(出现在所有患者而非一个患者中)、具有小于6个月的疾病控制以及不具有反应(NR)。对于具有NED的患者与不具有反应的那些患者之间的差异，P＝0.03(比较中值的曼-惠特尼双尾t-检验)。图7F描绘患者亚组的突变负荷，所述患者亚组为不具有放射照相疾病迹象(NED)、具有大于6个月的疾病控制(出现在所有患者而非一个患者中)、具有小于6个月的疾病控制以及不具有反应(NR)。对于具有NED的患者与不具有反应的那些患者之间的差异，P＝0.03(比较中值的曼-惠特尼双尾t-检验)。

图8示出新表位分析流程。针对预测的野生型和突变体执行所有步骤。MHC I类预测通过NetMHCv3.4和/或RANKPEP进行。通过掩盖HLA特异性氨基酸的IEDB程序进行T细胞免疫原性预测(http://tools.immunepitope.org/immunogenicity/)。

图9(由图9A至图9C组成)示出来自发现组治疗前和治疗后的患者的代表性扫描。图9A示出来自不具有放射照相疾病迹象的一个患者的两个部位(5/1/08和5/30/13)。图9B示出来自具有大于6个月临床益处的患者的扫描。上方是来自9/6/11和1/14/13。下方是来自9/19/07和1/15/09。图9C示出来自对疗法不具有反应的患者的扫描。上方是5/27/10和12/21/10。下方是3/3/11和11/18/11。

图10(由图10A至图10K组成)示出肽分析、发现和验证。图10A示出在发现组中的所有样品中，突变型肽与对应的野生型肽相比更可能结合MHC I类。图10B示出在验证组中的所有样品中，突变型肽与对应的野生型肽相比更可能结合MHC I类。图10C和图10D示出LB组和NB组中常见四肽中的氨基酸的频率。每个字母的高度反映在所述位置处的给定氨基酸的频率。在NB组中未看到位置3和位置4处的苯丙氨酸(F)。图10E示出通过临床组得到的包含子串的四肽的已知抗原。保守性四肽新表位包含在体外具有T细胞活化迹象的来自感染性病原体的抗原子串。图10F示出MART-1和EKLS子串。图10G示出在发现组中的所有样品中，突变型肽与对应的野生型肽相比更可能结合MHC I类。图10H示出在验证组中的所有样品中，突变型肽与对应的野生型肽相比更可能结合MHC I类。图10I和图10J示出LB组和NB组中常见四肽中的氨基酸的频率。每个字母的高度反映在所述位置处的给定氨基酸的频率。图10K示出通过临床组布置的包含子串的四肽的已知抗原。保守性四肽新表位包含在体外具有T细胞活化迹象的来自感染性病原体的抗原子串。

图11示出在第60周血液样品中在肽库A、B和C中检测到的多功能CD8T细胞应答。对来自患者CR1509、CR9699和CR9306的冷冻PBMC进行解冻并且分别使用方法中所述的肽库A、B和C重新刺激。使用以下条件在第10天进行细胞内细胞因子染色(ICS)：无刺激(阴性对照)、葡萄球菌肠毒素B(SEB，阳性对照)以及对应的肽库。CD8+IFN-γ+、CD8+IFN-γ+TNF-α+以及CD8+IFN-γ+CD107a+T细胞的代表性点状图示于图11A(对于患者CR1509的库A)、图11B(对于患者CR9699的库B)以及图11C(对于患者CR9306的库C)中。图11D示出与野生型GLERGGFTF相比，在用突变型肽GLEREGFTF刺激时CD8+IFN-γ、TNF-α、CD-107a以及MIP-1β双重阳性细胞的百分比。

图12描绘模拟的流程图，以便测试标记将由实际数据的排列或模拟数据集的不同数据集产生的这种无效假设。

图13证实突变型肽或野生型肽都没有在三个健康供体中引发CD8+IFN-γ反应。

图14证实新抗原产生可以是基因组位置的函数。作为基因组位置函数对来自三个代表性LB患者的新抗原进行作图。在不同基因中产生标记的候选新表位。沿着x轴对新表位的染色体位置进行作图。峰高指示发现组和验证组中有多少患者共享氨基酸序列。通过整个基因组中各种基因中的突变来编码四肽。

图15描绘针对验证组的外显子组分析流程。

图16描绘针对LCA(白细胞共同抗原)、CD8以及FOXP3染色的肿瘤活检物。根据图16A，与具有长期益处的那些患者(LB；F-J)相比，在不具有临床益处的那些患者(NB；A-E)中不存在用以下染色的细胞的百分比的显著差异：LCA(B、G，200倍放大，箭头尖端标记了阳性细胞)、CD8(C、H，200倍放大，箭头尖端标记了阳性细胞)或FOXP3(D、I，200倍放大，箭头尖端标记了阳性细胞)。来自NB患者和LB患者的肿瘤示出坏死(E、J，100倍放大)并且表现出坏死的肿瘤的百分比在组间(O)显著不同(P＝0.034)，然而，这个发现取决于包括单一离群值(不包括时P＝0.683)。根据图16B，与NB相比，在LB组中存在CD8:FOXP3比率(C)的显著增加(P＝0.028)。在LB组中LCA(白细胞共同抗原)看起来更高，但不是统计学显著的。

图17描绘验证组中的患者的详细特征。

图18描绘针对发现组和验证组的每种肿瘤的非同义外显子突变。

图19描绘反应标记的四肽的背景、基因以及基因座。

图20描绘存在于来自TCGARNA-seq数据集的反应标记中的引起四肽的编码突变的基因的表达。在排除不具有表达的肿瘤之后，针对每个基因显示平均SEM值。如果基因不在任何样品中表达，则显示零。

图21描绘每个患者样品的样品部位、样品大小以及活检物类型。

定义

为了更加容易地理解本发明，以下对某些术语进行定义。本领域技术人员将理解，对于某些术语的定义可提供在本说明书的其他地方和/或从上下文看将为清楚的。

施用：如本文所用，术语“施用”是指向受试者施用组合物。施用可以通过任何适当的途径。例如，在一些实施方案中，施用可以是支气管(包括通过支气管滴注)、经颊、肠内、真皮间、动脉内、真皮内、胃内、骨髓内、肌肉内、鼻内、腹膜内、鞘内、静脉内、心室内、经粘膜、经鼻、经口、直肠、皮下、舌下、局部、气管(包括通过气管内滴注)、经皮、阴道以及玻璃体施用。

亲和力：如本领域所知，“亲和力”是关于特定配体结合至其配合物的紧密性的量度。亲和力可以不同方式来测量。在一些实施方案中，通定量测定来测量亲和力。在一些此类实施方案中，结合配合物浓度可以被固定为超过配体浓度以便模拟生理条件。替代地或另外地，在一些实施方案中，结合配合物浓度和/或配体浓度可以改变。在一些此类实施方案中，可将亲和力与可比条件(浓度)下的参考进行比较。

氨基酸：如本文所用，术语“氨基酸”在其广义上来说，是指任何可以合并至多肽链中的化合物和/或物质。在一些实施方案中，氨基酸具有一般结构H2N-C(H)(R)-COOH。在一些实施方案中，氨基酸是天然存在的氨基酸。在一些实施方案中，氨基酸是合成氨基酸；在一些实施方案中，氨基酸是d-氨基酸；在一些实施方案中，氨基酸是l-氨基酸。“标准氨基酸”是指普遍地在天然存在的肽中发现的二十种标准l-氨基酸中的任何一种。“非标准氨基酸”是指除标准氨基酸以外的任何氨基酸，不管它是合成制备或是从天然来源获得。如本文所用，“合成氨基酸”涵盖化学修饰的氨基酸，包括但不限于盐、氨基酸衍生物(如酰胺)、和/或取代。包括肽中的羧基端和/或氨基端氨基酸在内的氨基酸可以通过甲基化、酰胺化、乙酰化、保护基和/或被可以改变肽的循环半衰期而不会不利地影响其活性的其他化学基团取代来修饰。氨基酸可以参与二硫键。氨基酸可包含一种或翻译后修饰，诸如与一个或多个化学实体(例如，甲基、醋酸根、乙酰基、磷酸根、甲酸基部分、类异戊二烯基团、硫酸根、聚乙二醇部分、脂质部分、碳水化合物部分、生物素部分等)相联。术语“氨基酸”可与“氨基酸残基”互换使用，并且可意指游离氨基酸和/或肽的氨基酸残基。从术语所使用的上下文显而易知它是指游离氨基酸还是肽的残基。

抗体试剂：如本文所用，术语“抗体试剂”是指特异性结合至特定抗原的试剂。在一些实施方案中，此术语涵盖具有足以赋予特异性结合的免疫球蛋白结构元件的任何多肽。合适的抗体试剂包括，但不限于人抗体、灵长类动物源化的抗体、嵌合抗体、双特异性抗体、人源化的抗体、轭合的抗体(即，轭合或融合至其他蛋白质、放射性标记、细胞毒素的抗体)、小型模块免疫药物(“SMIPs^TM”)、单链抗体、卵形抗体以及抗体片段。如本文所用，术语“抗体试剂”还包括完整单克隆抗体、多克隆抗体、单结构域抗体(例如，鲨单结构域抗体(例如，IgNAR或其片段))、由至少两个完整抗体形成的多特异性抗体(例如双特异性抗体)以及抗体片段，只要它们表现出希望的生物活性。在一些实施方案中，此术语涵盖订书肽。在一些实施方案中，此术语涵盖一种或多种抗体样结合肽模拟物。在一些实施方案中，此术语涵盖一种或多种抗体样结合支架蛋白。在一些实施方案中，此术语涵盖单体或adnectin。在许多实施方案中，抗体试剂为或包括其氨基酸序列包括由本领域技术人员识别为互补决定区(CDR)的一个或多个结构元件的多肽；在一些实施方案中，抗体试剂为或包括其氨基酸序列包括与参考抗体中所存在的CDR基本上相同的至少一个CDR(例如，至少一个重链CDR和/或至少一个轻链CDR)的多肽。在一些实施方案中，所包括的CDR与参考CDR基本上相同，其中与参考CDR相比，所包括的CDR在序列上相同或含有1-5之间的氨基酸取代。在一些实施方案中，所包括的CDR与参考CDR基本上相同，其中所述包括的CDR显示出与参考CDR的至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在一些实施方案中，所包括的CDR与参考CDR基本上相同，其中包括的CDR显示出与参考CDR的至少96％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在一些实施方案中，所包括的CDR与参考CDR基本上相同，其中与参考CDR相比，所包括的CDR内的至少一个氨基酸被缺失、添加或取代，但所包括的CDR具有以另外的方式与参考CDR的氨基酸序列相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所包括的CDR与参考CDR基本上相同，其中与参考CDR相比，所包括的CDR内的1-5个氨基酸被缺失、添加或取代，但所包括的CDR具有以另外的方式与参考CDR相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所包括的CDR与参考CDR基本上相同，其中与参考CDR相比，所包括的CDR内的至少一个氨基酸被取代，但所包括的CDR具有以另外的方式与参考CDR的氨基酸序列相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所包括的CDR与参考CDR基本上相同，其中与参考CDR相比，所包括的CDR内的1-5个氨基酸被缺失、添加或取代，但所包括的CDR具有以另外的方式与参考CDR相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体试剂为或包括其氨基酸序列包括由本领域技术人员识别为免疫球蛋白可变结构域的结构元件的多肽。在一些实施方案中，抗体试剂为具有结合结构域的多肽蛋白，所述结合结构域与免疫球蛋白结合结构域同源或很大程度上同源。

抗体多肽：如本文所用，可互换使用的术语“抗体多肽”或“抗体”或“其抗原结合片段”是指能够结合至表位的多肽。在一些实施方案中，抗体多肽为全长抗体，并且在一些实施方案中，为小于全长但包括至少一个结合位点(包含具有抗体“可变区”的结构的至少一个并且优选地至少两个序列)。在一些实施方案中，术语“抗体多肽”涵盖具有结合结构域的任何蛋白，所述结合结构域与免疫球蛋白结合结构域同源或很大程度上同源。在具体实施方案中，“抗体多肽”涵盖具有显示出与免疫球蛋白结合结构域至少99％同一性的结合结构域的多肽。在一些实施方案中，“抗体多肽”为具有结合结构域的任何蛋白，该结合结构域显示出与免疫球蛋白结合结构域(例如参考免疫球蛋白结合结构域)至少70％、80％、85％、90％或95％同一性。所包括的“抗体多肽”可具有与存在于天然来源中的抗体的氨基酸序列相同的氨基酸序列。根据本发明的抗体多肽可通过任何可用的手段来制备，这些手段包括例如从天然来源或抗体文库中分离、在宿主系统中或使用宿主系统重组产生、化学合成等或其组合。抗体多肽可为单克隆或多克隆的。抗体多肽可为任何免疫球蛋白类别的成员，包括任何人类别：IgG、IgM、IgA、IgD以及IgE。在某些实施方案中，抗体可为IgG免疫球蛋白类别的成员。如本文所用，术语“抗体多肽”或“抗体的特征部分”可互换使用并且是指拥有结合至感兴趣表位的能力的抗体的任何衍生物。在某些实施方案中，“抗体多肽”为保留至少绝大部分的全长抗体的特异性结合能力的抗体片段。抗体片段的实例包括，但不限于Fab、Fab’、F(ab’)₂、scFv、Fv、dsFv双抗体以及Fd片段。替代地或另外地，抗体片段可包含例如由二硫键连接在一起的多个链。在一些实施方案中，抗体多肽可为人抗体。在一些实施方案中，抗体多肽可为人源化的。人源化的抗体多肽包括含有最少来源于非人免疫球蛋白的序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或抗体多肽(诸如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或抗体的其他抗原结合子序列)。通常，人源化的抗体为人免疫球蛋白(接受者抗体)，其中来自接受者的互补决定区(CDR)的残基被来自诸如小鼠、大鼠或兔的非人物种(供体抗体)的CDR的具有希望特异性、亲和力和能力的残基置换。在具体实施方案中，根据本发明所使用的抗体多肽结合至免疫检查点分子上的特定表位。

抗原：“抗原”为抗体结合至其上的分子或实体。在一些实施方案中，抗原为或包括多肽或其部分。在一些实施方案中，抗原为由抗体识别的感染剂的一部分。在一些实施方案中，抗原为引发免疫应答的试剂；和/或(ii)由T细胞受体结合的试剂(例如，当由MHC分子呈递时)或在暴露于或施用至生物体时被结合至抗体(例如，由B细胞产生)的试剂。在一些实施方案中，抗原在生物体中引发体液应答(例如，包括产生抗原特异性抗体)；替代地或另外地，在一些实施方案中，抗原在生物体中引发细胞应答(例如，包括其受体特异性地与抗原相互作用的T细胞)。本领域技术人员将了解，特定抗原可在目标生物体的一个或若干个成员(例如，小鼠、兔、灵长类动物、人)中，但非目标生物体物种的所有成员中引发免疫应答。在一些实施方案中，抗原在目标生物体物种的至少约25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的成员中引发免疫应答。在一些实施方案中，抗原结合至抗体和/或T细胞受体，并且可以或可以不在生物体中诱导特定的生理反应。在一些实施方案中，例如，抗原可在体外结合至抗体和/或T细胞受体，无论这种相互作用是否在体内发生。通常，抗原可为或包括任何化学实体，诸如例如小分子、核酸、多肽、碳水化合物、脂质、聚合物(在一些实施方案中，除了生物聚合物以外(例如，除了核酸或氨基酸聚合物以外))等。在一些实施方案中，抗原为或包括多肽。在一些实施方案中，抗原为或包括聚糖。本领域技术人员将了解，通常，抗原可以分离或纯的形式提供，或替代地可以粗制形式提供(例如，连同其他材料一起，例如在诸如含抗原来源的细胞提取物或其他相对粗制的制品的提取物中)。在一些实施方案中，根据本发明利用的抗原以粗制的形式提供。在一些实施方案中，抗原为或包括重组抗原。

近似：如本文所用，当应用到一种或多种感兴趣的值时，术语“近似”或“约”是指类似于规定的参考值的值。在某些实施方案中，术语“近似”或“约”是指在所规定的参考值的任一方向上的(大于或小于)25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更小范围内的值范围，除非另外规定或以另外的方式从上下文显而易见(除了这样的数值将超过可能值的100％)。

组合疗法：如本文所用的术语“组合疗法”是指其中以重叠方案施用两种或更多种不同的药物试剂以使得受试者同时曝露于这两种试剂的那些情况。当用于组合疗法时，两种或更多种不同的试剂可被同时或分开地施用。这种组合施用可包括以相同剂型同时施用两种或更多种试剂，以分开的剂型同时施用以及分开施用。即，两种或更多种试剂可以相同剂型配制在一起并且同时施用。替代地，两种或更多种试剂可被同时施用，其中试剂存在于分开的制剂中。在另一个替代方案中，可在第一试剂施用之后立即施用一种或多种另外的试剂。在分开施用的方案中，两种或更多种试剂可相隔几分钟或几小时或几天施用。

可比：术语“可比”在本文中用于描述彼此足够类似以允许比较获得的结果或观察到的现象的两组(或更多组)条件、情况、个体或群体。在一些实施方案中，多组可比条件、情况、个体或群体的特征为多种大致上相同特征和一种或少数不同特征。本领域普通技术人员将了解，多组情况、个体或群体在特征为以下时是彼此可比的：足够数目和类型的大致上相同特征以保证得出以下合理结论：在不同组情况、个体或群体下或使用不同组情况、个体或群体获得的结果或观察到的现象的差异是由那些不同特征的变化引起或指示那些不同特征的变化。本领域技术人员将了解，本文使用的相对语言(例如，增强、活化、降低、抑制等)将通常是指在可比条件下进行的比较。

共有序列：如本文所用，术语“共有序列”是指引发或驱动生理现象(例如，免疫应答)的核心序列。本领域技术人员将理解，与感染剂的抗原共享“共有序列”的癌症细胞共享影响抗原与MHC分子的结合亲和力(直接地或变构地)和/或促进由T细胞受体进行的识别的氨基酸序列的一部分。在一些实施方案中，共有序列为四肽。在一些实施方案中，共有序列为九肽。在一些实施方案中，共有序列的长度为四个与九个氨基酸之间。在一些实施方案中，共有序列的长度为大于九个氨基酸。

诊断信息：如本文所用，诊断信息或用于诊断的信息为有用于以下的任何信息：确定患者是否患有疾病或病状和/或将疾病或病状分类到表型范围或任何具有关于疾病或病状的预后或可能对疾病或病状的治疗(一般治疗或任何特定治疗)有反应的显著性的范围中。类似地，诊断是指提供任何类型的诊断信息，包括但不限于，受试者是否可能患有疾病或病状(诸如癌症)、如在受试者中表现出的疾病或病状的状态、阶段或特征、关于肿瘤的性质或分类的信息、关于预后的信息和/或有用于选择适当治疗的信息。治疗的选择可包括特定治疗剂(例如，化疗剂)或其他治疗形式诸如外科手术、放射等的选择、关于是否拒绝或递送疗法的选择、关于给药方案(例如，特定治疗剂或治疗剂组合的一种或多种剂量的频率或水平)的选择等。

给药方案：如本文所用的术语“给药方案”(或“治疗方案”)为通常按时间周期分开而单独向受试者施用的一组单位剂量(通常多于一个)。在一些实施方案中，给定治疗剂具有可涉及一个或多个剂量的推荐给药方案。在一些实施方案中，给药方案包括多个剂量，其各自彼此相隔时长相同的时期；在一些实施方案中，给药方案包括多个剂量，并且个别剂量相隔至少两种不同时期。在一些实施方案中，在整个患者群体中施用时，给药方案为或与希望的治疗结果相关。

有利反应：如本文所用，术语有利反应是指症状减少、全部或部分消退或疾病生理学的其他改进。当特定疾病、病症或病状的一种或多种症状在幅度(例如，强度、严重性等)和/或频率上减少时，症状减少。出于清楚的目的，延迟特定症状的发作被认为是降低所述症状的频率的一种形式。许多具有较小肿瘤的癌症患者不具有症状。并非意在本发明仅限于其中症状消除的情况。本发明确切地涵盖使得一种或多种症状减少(并且因此受试者的病状“改进”)，虽然没有完全消除的治疗。在一些实施方案中，当特定治疗方案在整个相关群体中施用时显示出统计学显著的作用时建立有利反应；可以不需要特定个体中的具体结果展示。因此，在一些实施方案中，当特定治疗方案的施用与相关希望的作用相关时，认为特定治疗方案具有有利反应。

同源性：如本文所用，术语“同源性”是指聚合物分子之间例如核酸分子(例如，DNA分子和/或RNA分子)之间和/或多肽分子之间的总体相关性。在一些实施方案中，如果聚合物分子的序列为至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％相同，则认为它们是彼此“同源的”。在一些实施方案中，如果聚合物分子的序列为至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％相似，则认为它们是彼此“同源的”。

同一性：如本文所用，术语“同一性”是指聚合物分子之间例如核酸分子(例如，DNA分子和/或RNA分子)之间和/或多肽分子之间的总体相关性。两个核酸序列的同一性百分比的计算例如可通过出于最佳比对目的对准两个序列来进行(例如，为了最佳对准可在第一核酸序列和第二核酸序列中的一个或两个中引入间隙并且出于比对目的可忽视不相同的序列)。在某些实施方案中，出于比对目的对准的序列的长度为参照序列长度的至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或基本上100％。然后比较对应核苷酸位置上的核苷酸。当第一序列中的位置被与第二序列中的对应位置相同的核苷酸占据时，则分子在所述位置上相同。两个序列之间的同一性百分比为将出于两个序列最佳对准而需要引入的间隙的数目和每个间隙的长度考虑在内，序列共有的相同位置数的函数。可使用数学算法来完成序列比对和两个序列之间同一性百分比的确定。例如，可以使用并入ALIGN程序(版本2.0)中的Meyers和Miller的算法(CABIOS,1989,4:11-17)，使用PAM120权重残基表、12的空位长度罚分以及4的空位罚分来确定两个核苷酸序列之间的同一性百分比。或者可使用GCG软件包中的GAP程序、使用NWSgapdna.CMP矩阵确定两个核苷酸序列之间的同一性百分比。

免疫检查点调节剂：如本文所用，术语“免疫检查点调节剂”是指直接或间接地与免疫检查点相互作用的试剂。在一些实施方案中，免疫检查点调节剂例如通过刺激用于T细胞活化的正信号来增加免疫效应子应答(例如，细胞毒性T细胞应答)。在一些实施方案中，免疫检查点调节剂例如通过抑制用于T细胞活化的负信号(例如去抑制)来增加免疫效应子应答(例如，细胞毒性T细胞应答)。在一些实施方案中，免疫检查点调节剂与用于T细胞无反应性的信号相互作用。在一些实施方案中，免疫检查点调节剂降低、去除或防止对一种或多种抗原的免疫耐受性。

长期益处：通常，术语“长期益处”是指例如在施用感兴趣的特定治疗或疗法之后观察到的、维持临床相关的时间周期的希望的临床结果。仅为了给出一个实例，在一些实施方案中，癌症疗法的长期益处为或包括(1)没有疾病迹象(“NED”，例如在放射照相评估后)和/或(2)疾病体积稳定或减小。在一些实施方案中，临床相关的时间周期为至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月或更多。在一些实施方案中，临床相关的时间周期为至少6个月。在一些实施方案中，临床相关的时间周期为至少1年。

标记物：如本文所用的标记物是指其存在或水平为特定肿瘤或其转移性疾病的特征的试剂。例如，在一些实施方案中，所述术语是指作为特定肿瘤、肿瘤子类、肿瘤阶段等的特征的基因表达产物。替代地或另外地，在一些实施方案中，特定标记物的存在或水平与例如可为特定肿瘤类别的特征的特定信号传导途径的活性(或活性水平)相关。标记物的存在或不存在的统计学显著性可取决于特定标记物而变化。在一些实施方案中，标记物的检测是高度特异性的，因为它反映了具有特定子类的肿瘤的高可能性。此种特异性可以敏感性为代价得到(即，即使肿瘤为预期表达标记物的肿瘤，也可出现阴性结果)。相反地，具有高度敏感性的标记物与具有较低敏感性的那些标记物相比特异性较差。根据本发明，有用的标记物不需要100％准确区分特定子类的肿瘤。

调节剂：术语“调节剂”用于指存在于系统中的实体，在所述系统中，与在调节剂不存在时的另外可比条件下观察到的活性的水平和/或性质相比，观察到感兴趣的活性与所述活性的水平和/或性质的变化相关。在一些实施方案中，调节剂为活化剂，其中与在调节剂不存在时的另外可比条件下观察到的活性相比，在调节剂存在下活性增加。在一些实施方案中，调节剂为抑制剂，其中与在调节剂不存在时的另外可比条件相比，在调节剂存在下活性降低。在一些实施方案中，调节剂直接地与其活性为感兴趣的目标实体相互作用。在一些实施方案中，调节剂间接地(即，直接使用与目标实体相互作用的中间体试剂)与其活性为感兴趣的目标实体相互作用。在一些实施方案中，调节剂影响感兴趣的目标实体的水平；替代地或另外地，在一些实施方案中，调节剂影响感兴趣的目标实体的活性而不影响目标实体的水平。在一些实施方案中，调节剂影响感兴趣的目标实体的水平和活性，以使得观察到的活性差异不完全由观察到的水平差异解释或与观察到的水平差异一致。

新表位：“新表位”在本领域中被理解成是指在暴露于或发生特定事件(例如，特定疾病、病症或病状的发展或进展，例如感染、癌症、癌症阶段等)之后在受试者中出现或形成的表位。如本文所用，新表位为其存在和/或水平与暴露于或发生事件相关的新表位。在一些实施方案中，新表位为针对表达所述新表位(例如，在相关水平下)的细胞触发免疫应答的新表位。在一些实施方案中，新表位为触发杀死或以另外的方式破坏表达该新表位(例如，在相关水平下)的细胞的免疫应答的新表位。在一些实施方案中，触发新表位的相关事件为或包括细胞中的体细胞突变。在一些实施方案中，新表位并没有在非癌症细胞中表达至一定水平和/或以触发和/或支持免疫应答(例如，足以靶向表达新表位的癌症细胞的免疫应答)的方式在非癌症细胞中表达。

无益处：如本文所用，短语“无益处”用于指不存在可检测的临床益处(例如，响应于感兴趣的特定疗法或治疗的施用)。在一些实施方案中，不存在临床益处是指不存在统计学显著的特定疾病、病症或病状的任何特定症状或特征的变化。在一些实施方案中，不存在临床益处是指持续仅短时间周期诸如例如小于约6个月、小于约5个月、小于约4个月、小于约3个月、小于约2个月、小于约1个月或更少的疾病、病症或病状的一种或多种症状或特征的变化。

患者：如本文所用，术语“患者”或“受试者”是指例如出于实验、诊断、预防、美容和/或治疗目的向其施用或可施用提供的组合物的任何生物体。通常的患者包括动物(例如，哺乳动物诸如小鼠、大鼠、兔、非人灵长类动物和/或人)。在一些实施方案中，患者为人。在一些实施方案中，患者遭受或易感一种或多种病症或病状。在一些实施方案中，患者表现出病症或病状的一种或多种症状。在一些实施方案中，患者经诊断患有一种或多种病症或病状。在一些实施方案中，病症或病状为或包括癌症或存在一种或多种肿瘤。在一些实施方案中，病症或病状为转移性癌症。

多肽：如本文所用，“多肽”，一般来说，为通过肽键彼此连接的至少两个氨基酸的串。在一些实施方案中，多肽可包括至少3-5个氨基酸，所述氨基酸各自经由至少一个肽键来连接至其他氨基酸。本领域普通技术人员将了解，多肽有时包括“非天然”氨基酸或仍然能够任选地合并至多肽链中的其他实体。

预后和预测信息：如本文所用，术语预后和预测信息可互换使用来指可用于指示不存在或存在治疗中的疾病或病状进程的任何方面的任何信息。此种信息可包括但不限于，患者的平均寿命预期、患者将幸存给定时间量(例如，6个月、1年、5年等)的可能性、患者将治愈疾病的可能性、患者的疾病将响应于特定疗法的可能性(其中反应可以任何各种方式进行定义)。预后和预测信息包括在诊断信息的宽范围之内。

蛋白质：如本文所用，术语“蛋白质”是指多肽(即通过肽键彼此连接的至少两个氨基酸的串)。蛋白质可包含除了氨基酸以外的部分(例如，可为糖蛋白、蛋白聚糖等)，和/或可以另外的方式加工或修饰。本领域的普通技术人员将了解，“蛋白质”可为由细胞产生的完整多肽链(具有或不具有信号序列)，或可为其特征部分。本领域普通技术人员将了解，蛋白质有时可包括例如由一个或多个二硫键连接或通过其他方式相联的大于一个多肽链。多肽可含有L-氨基酸、D-氨基酸或两者并且可含有在本领域中已知的任何各种氨基酸修饰或类似物。有用的修饰包括，例如末端乙酰化、酰胺化、甲基化等。在一些实施方案中，蛋白质可包含天然氨基酸、非天然氨基酸、合成氨基酸以及其组合。术语“肽”通常用于指长度小于约100个氨基酸、小于约50个氨基酸、小于20个氨基酸或小于10个氨基酸的多肽。

参考样品：如本文所用，参考样品可包括但不限于以下的任何或所有：一个细胞或多个细胞、组织的一部分、血液、血清、腹水、尿液、唾液以及其他体液、分泌物或排泄物。术语“样品”还包括通过加工这样一种样品衍生的任何材料。衍生的样品可包括从样品中提取或通过使样品受到诸如mRNA的扩增或逆转录的技术获得的核苷酸分子或多肽。

反应：如本文所用，对治疗的反应可指由于治疗或与治疗相关而发生的受试者的病状的任何有益改变。此种改变可包括稳定病状(例如，预防将在不存在治疗的情况下发生的恶化)、改善病状的症状和/或改进用于治愈病状的前景等。所述改变可指患者的反应或肿瘤的反应。肿瘤或患者反应可根据各种各样的标准(包括临床标准和客观标准)来测量。用于评估反应的技术包括但不限于：临床检查、正电子发射断层摄影术、胸部X-射线CT扫描、MRI、超声、内窥镜检查、腹腔镜检查、获自受试者的样品中肿瘤标记物的存在或水平、细胞学和/或组织学。许多这些技术尝试确定肿瘤的大小或以另外的方式确定总肿瘤负担。用于评估对治疗的反应的方法和准则讨论于Therasse等,“New guidelines to evaluatethe response to treatment in solid tumors”,欧洲癌症研究和治疗组织、美国国家癌症研究所、加拿大国家癌症研究所，美国国立癌症研究所杂志(J.Natl.Cancer Inst.),2000,92(3):205-216中。可以任何适当方式选择精确的反应标准，条件是当比较肿瘤和/或患者组时，基于用于确定反应速率的相同或可比标准评估待比较的组。本领域普通技术人员将能够选择适当标准。

样品：如本文所用，获自受试者的样品可包括但不限于以下的任何或所有：一个细胞或多个细胞、组织的一部分、血液、血清、腹水、尿液、唾液以及其他体液、分泌物或排泄物。术语“样品”还包括通过加工这样一种样品衍生的任何材料。衍生的样品可包括从样品中提取或通过使样品受到诸如mRNA的扩增或逆转录的技术获得的核苷酸分子或多肽。

特异性结合：如本文所用，术语“特异性结合”或“对......有特异性”或“特异于”是指目标实体(例如，目标蛋白质或多肽)与结合剂(例如，抗体，诸如提供的抗体)之间的相互作用(通常非共价的)。如普通技术人员将理解，如果在替代相互作用存在下相互作用是有利的，则认为相互作用是“特异性的”。在许多实施方案中，相互作用通常取决于存在目标分子诸如由结合分子识别的抗原决定簇或表位的特定结构特征。例如，如果抗体对表位A是特异性的，则在含有游离的标记的A和其上的抗体的反应中，含有表位A的多肽的存在或游离的未标记的A的存在将会降低结合至抗体的标记的A的量。应理解，特异性不需要是绝对的。例如，本领域众所周知的是许多抗体与除了目标分子中存在的那些以外的其他表位交叉反应。取决于待使用抗体的应用，此种交叉反应性可以是可接受的。在具体实施方案中，对受体酪氨酸激酶有特异性的抗体具有小于10％的与结合至蛋白酶抑制剂(例如，ACT)的受体酪氨酸激酶的交叉反应性。本领域普通技术人员将能够选择具有足够程度的特异性的抗体来在任何给定的应用(例如，用于检测目标分子，用于治疗目的等)中适当地执行。可在另外的因素的背景下对特异性进行评价，诸如结合分子对目标分子的亲和力与结合分子对其他目标(例如，竞争者)的亲和力。如果结合分子对目标分子表现出高亲和力，

癌症的阶段:如本文所用，术语“癌症的阶段”是指癌症推进的水平的定性或定量评估。用于确定癌症的阶段的标准包括但不限于肿瘤的大小和转移(例如，局部或远处)的程度。

受试者：如本文所用，术语“受试者”或“患者”是指例如出于实验、诊断、预防和/或治疗目的基于其可使用或施用本发明的实施方案的任何生物体。通常的受试者包括动物(例如哺乳动物，诸如小鼠、大鼠、兔、非人灵长类动物和人；昆虫；蠕虫等)。

基本上：如本文所用，术语“基本上”是指展现总体或接近总体范围或程度的感兴趣特征或性质的定性情况。生物领域普通技术人员将理解，生物和化学现象很少(如果曾发生)达到完全和/或进行至完全或达成或避免绝对结果。因此，本文使用术语“基本上”来获得在许多生物现象和化学现象中固有的潜在完全性缺乏。

遭受：“遭受”疾病、病症或病状(例如，癌症)的个体已诊断具有和/或表现出疾病、病症或病状的一种或多种症状。在一些实施方案中，遭受癌症的个体患有癌症，但没有展现出癌症的任何症状和/或尚未被诊断具有癌症。

易感：“易感”疾病、病症或病状(例如，癌症)的个体处于发展疾病、病症或病状的危险。在一些实施方案中，易感疾病、病症或病状的个体没有展现出疾病、病症或病状的任何症状。在一些实施方案中，易感疾病、病症或病状的个体尚未被诊断具有疾病、病症和/或病状。在一些实施方案中，易感疾病、病症或病状的个体为展现出与疾病、病症或病状的发展相关的病状的个体。在一些实施方案中，发展疾病、病症和/或病状的危险为基于群体的危险。

目标细胞或目标组织：如本文所用，术语“目标细胞”或“目标组织”是指受本文描述的并且待治疗的病状影响的任何细胞、组织或生物体，或其中表达包括在本文描述的病状中的蛋白质的任何细胞、组织或生物体。在一些实施方案中，目标细胞、目标组织或目标生物体包括其中存在可检测量的免疫检查点信号传导和/或活性的那些细胞、组织或生物体。在一些实施方案中，目标细胞、目标组织或目标生物体包括其中展现出疾病相关的病理学、症状或特征的那些细胞、组织或生物体。

治疗方案：如本文所用，术语“治疗方案”是指用于部分或完全减轻、改善、缓和、抑制、预防特定疾病、病症和/或病状、延迟其发作、减少其严重性和/或降低其一种或多种症状或特征的发生率的任何方法。所述治疗方案包括被设计成达到特定作用，例如减少或消除有害病状或疾病诸如癌症的一种治疗或一系列治疗。治疗可包括同时、依次或在不同时间下，例如相同或不同时间量下施用一种或多种组合物。替代地或另外地，治疗可包括暴露于放射、化疗剂、激素疗法或外科手术。另外，“治疗方案”可包括遗传方法，诸如基因疗法、基因消融或其他已知减少特定基因的表达或基因衍生的mRNA的翻译的方法。

治疗剂：如本文所用，短语“治疗剂”是指当向受试者施用时具有治疗作用和/或引发希望的生物和/或药理学作用的任何试剂。

治疗有效量：如本文所使用，术语“治疗有效量”是指在适用于任何医学治疗的合理益处/风险比下，对经过治疗的受试者给予治疗作用的试剂(例如，免疫检查点调节剂)的量。治疗作用可以是客观的(即，通过一些测试或标记物可测量的)或主观的(即，受试者给出作用的指示或感觉作用)。具体地来说，“治疗有效量”是指有效于治疗、改善或预防希望的疾病或病状，或诸如通过改善与疾病相关的症状、预防或延迟疾病的发作和/或还减轻疾病的症状的严重性或频率来展现出可检测的治疗作用或预防作用的治疗剂或组合物的量。治疗有效量通常是以可包括多个单位剂量的给药方案来施用。对于任何特定治疗剂，治疗有效量(和/或有效给药方案内的适当单位剂量)可例如取决于施用途径、与其他药剂的组合而变化。另外，用于任何特定患者的具体治疗有效量(和/或单位剂量)可取决于各种因素，所述因素包括所治疗的病症和病症的严重性；所用具体药剂的活性；所用具体组合物；受试者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；施用时间、施用途径和/或所用具体融合蛋白质的排泄或代谢速率；治疗持续时间以及如医学领域中所众所周知的类似因素。

治疗：如本文所用，术语“治疗(treatment)”(还有“治疗(treat)”或“治疗(treating)”)是指对部分或完全减轻、改善、缓解、抑制特定疾病、病症和/或疾状(例如，癌症)、延迟其发作、减少其严重性和/或降低其一种或多种症状、特征和/或病因的发生率的物质(例如，提供的组合物)的任何施用。这种治疗可以用于未显示相关疾病、病症和/或病症的体征的受试者，和/或仅表现出疾病、病症和/或病症的早期体征的受试者。替代地或另外地，这种治疗可以用于显示相关疾病、病症和/或病症的一种或多种已确立体征的受试者。在一些实施方案中，治疗可针对已经诊断为患有相关疾病、病症和/或疾患的受试者。在一些实施方案中，治疗可针对受试者已知具有与患上相关疾病、病症和/或疾患的风险增加统计相关的一个或多个易感性因素。

野生型：如本文所用，术语“野生型”具有它的在本领域中理解的含义，是指具有如在自然界中见于“正常”(与突变、患病、改变等相反)状态或背景下的结构和/或活性的实体。本领域普通技术人员将了解，野生型基因和多肽常以多种不同形式(例如等位基因)存在。

某些实施方案的详述

本发明涵盖以下发现：由肿瘤突变形成的高突变负荷和体细胞新表位有助于免疫检查点调节剂的抗肿瘤免疫应答。

此外，本公开确切地证实了癌症细胞中的新表位与对MHC I类分子的结合亲和力增加和/或由细胞毒性T细胞进行的识别改进相关联。

此外，本发明提供了用于检测存在于癌症细胞中的体细胞新表位和/或建立此类新表位与对免疫疗法的反应性之间或之中的关联的方法。在一些实施方案中，本发明提供了用于鉴定可能有利地响应于使用免疫疗法(例如，使用免疫检查点治疗剂)的治疗的癌症患者和/或用于选择患者接受此种免疫疗法的方法和/或试剂。替代地或另外地，本发明提供了用于使用免疫检查点调节剂治疗患者的方法和/或试剂，所述患者已被鉴定为患有具有体细胞新表位的癌症。

体细胞突变

体细胞突变包括非种系细胞中的DNA改变并且通常发生在癌症细胞中。本文已发现，癌症细胞中的某些体细胞突变引起新表位的表达，在一些实施方案中，氨基酸链从识别为“自身”转换至“非自身”。根据本发明，具有“非自身”抗原的癌症细胞可能引发针对癌症细胞的免疫应答。针对癌症细胞的免疫应答可通过免疫检查点调节剂来增强。本发明教导了表达新表位的癌症可以对使用免疫检查点调节剂的疗法更有反应。此外，本发明提供了用于通过容许鉴定和/或选择特定患者接受(或避免)疗法来改进癌症疗法的策略。本发明还提供了用于定义其存在指示特定的感兴趣临床结果(例如，对例如使用特定免疫检查点调节剂的疗法的反应性和/或发展疗法的特定不希望的副作用的危险)的新表位或其组的技术。本发明定义和/或容许定义与对免疫检查点调节剂疗法具有有益(或不希望)的反应相关联的一个或多个新表位“标记”。

在一些实施方案中，体细胞突变引起新抗原或新表位。此外，本公开证实了由体细胞突变引起的新表位的存在，其存在与对免疫检查点调节剂疗法有特定反应相关联。在一些实施方案中，新表位为或包括四肽，该四肽有助于增加的对MHC I类分子的结合亲和力和/或由免疫系统的细胞(即T细胞)识别为“非自身”。在一些实施方案中，体细胞突变引起包含表1中列出的四肽的新表位。在一些实施方案中，新表位与来自感染剂的抗原共享共有序列。

在一些实施方案中，根据本发明感兴趣的新表位标记为或包括其在肿瘤样品中的存在与特定临床结果相关的新表位或其组。本公开证实了这样一种新表位标记的有效定义。在一些实施方案中，有用标记为或包括在表1中找到的共有四肽体细胞新表位的一个或多个；在一些实施方案中，有用标记为或包括在表2中加下划线的四肽体细胞新表位的一个或多个；在一些实施方案中，有用标记为或包括在表2中找到的九聚体肽的一个或多个。在一些实施方案中，有用标记为或包括至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、7-、71、72、73、74、75或更多个新表位。在一些实施方案中，本公开提供了用于定义和/或检测新表位标记的技术，并且具体地与免疫检查点调节剂疗法相关的那些技术。

此外，本公开证实了与免疫检查点调节剂疗法的特定反应或反应特征(例如，对疗法的反应性或副作用的危险)相关联的新表位和新表位标记的定义。在本文提出的具体实施例中，此种定义通过将来自第一多个肿瘤样品的遗传序列信息与获自第二多个肿瘤样品的遗传序列信息进行比较来实现，所述第一多个含有共享对免疫检查点调节剂疗法的共同反应特征的样品，所述第二多个含有不共享共同反应特征但以另外的方式与第一组的那些可比较的样品，这样使得比较定义了其存在与共同反应特征相关联或相关的遗传序列元件。本公开确切地证实了增加的突变负担可与反应特征相关(例如，与对疗法的反应性相关)，但也证实了这种单独的突变负担增加可能不足以预测反应特征。本公开证实了，当此类体细胞突变产生新表位时，可定义与反应特征相关联的有用新表位标记。本公开提供了用于定义和利用此类标记的具体技术。

在一些实施方案中，包含新表位的癌症细胞选自癌瘤、肉瘤、黑色素瘤、骨髓瘤、白血病或淋巴瘤。在一些实施方案中，包含新表位的癌症细胞为黑色素瘤。在一些实施方案中，包含新表位的癌症细胞为非小细胞肺癌。

表1.黑色素瘤中的示例性共有四肽体细胞新表位

表2.与对CTLA-4阻断(例如，通过伊匹单抗治疗)的反应相关联的新表位组。

每个九聚体中的四肽新表位加下划线表示。

免疫检查点调节

免疫检查点是指负责维持自身耐受性并且调节生理免疫应答的持续时间和幅度的免疫系统抑制性途径。

某些癌症细胞通过利用免疫检查点途径作为免疫抗性(具体地关于对肿瘤抗原有特异性的T细胞)的主要机制来旺盛生长。例如，某些癌症细胞可过表达负责抑制细胞毒性T细胞应答的一种或多种免疫检查点蛋白质。因此，可施用免疫检查点调节剂以克服抑制性信号并且容许和/或加强针对癌症细胞的免疫攻击。免疫检查点调节剂可通过减少、抑制或消除由阴性免疫应答调节剂(例如CTLA4)剂进行的信号传导来促进针对癌症细胞的免疫细胞应答，或可刺激或增强免疫应答的阳性调节剂(例如CD28)的信号传导。

可施用靶向免疫检查点调节剂的免疫疗法试剂以便促进靶向癌症细胞的免疫攻击。免疫疗法试剂可以是或包括靶向免疫检查点调节剂(例如，对免疫检查点调节剂有特异性)的抗体试剂。免疫疗法试剂的实例包括靶向以下的一个或多个的抗体试剂：CTLA-4、PD-1、PD-L1、GITR、OX40、LAG-3、KIR、TIM-3、CD28、CD40以及CD137。

抗体试剂的具体实例可包括单克隆抗体。靶向免疫检查点调节剂的某些单克隆抗体是可用的。例如，伊匹单抗靶向CTLA-4；替西木单抗靶向CTLA-4；派姆单抗靶向PD-1等。

新表位的检测

可使用任何各种已知的技术对癌症进行筛选以检测新表位。在一些实施方案中，在核酸水平上(例如，在DNA或RNA中)检测新表位或其表达。在一些实施方案中，在蛋白质水平上(例如，在包含来自癌症细胞的多肽的样品中，所述样品可以是或包含多肽复合体或其他更高级的结构，此结构包括但不限于细胞、组织或器官)检测新表位或其表达。

在一些具体实施方案中，通过全外显子组测序来检测一个或多个新表位。在一些实施方案中，通过免疫测定来检测一个或多个新表位。在一些实施方案中，通过微阵列来检测一个或多个新表位。在一些实施方案中，可使用大规模并行的外显子组测序测序来检测一个或多个新表位。在一些实施方案中，可通过基因组测序来检测一个或多个新表位。在一些实施方案中，可通过RNA测序来检测一个或多个新表位。在一些实施方案中，可通过标准DNA或RNA测序来检测一个或多个新表位。在一些实施方案中，可通过质谱法来检测一个或多个新表位。

在一些实施方案中，可使用下一代测序在核酸水平上(DNA和/或RNA)检测一个或多个新表位。在一些实施方案中，可使用基因组测序、基因组重新测序、靶向测序板、转录组记录(RNA-Seq)、DNA-蛋白质相互作用(ChIP-测序)和/或表观基因组表征来检测下一新表位或其表达。在一些实施方案中，可例如利用对患者的基因组的重新测序来检测基因组变化。

在一些实施方案中，可使用诸如ELISA、蛋白质转移(Western Tranfer)、免疫测定、质谱法、微阵列分析等的技术来检测一个或多个新表位。

除非另外定义，否则本文中所用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域普通技术人员通常所理解含义相同的含义。尽管在实践或测试本发明时可以使用与本文所述的那些方法和材料类似或等效的方法和材料，但本文描述了合适的方法和材料。

治疗方法

在一些实施方案中，本发明提供了用于鉴定可能有利地响应于使用免疫检查点调节剂的治疗的癌症患者的方法。在一些实施方案中，本发明提供了用于鉴定可能有利地响应于使用免疫检查点调节剂的治疗的癌症患者并且使用免疫检查点调节剂治疗患者的方法。在一些实施方案中，本发明提供了使用免疫检查点调节剂治疗先前已被鉴定为可能有利地响应于使用免疫检查点调节剂的治疗的癌症患者的方法。在一些实施方案中，本发明提供了用于鉴定不可能有利地响应于使用免疫检查点调节剂的治疗的癌症患者并且不使用免疫检查点调节剂治疗患者的方法。在一些实施方案中，本发明提供了用于鉴定如果施用免疫检查点调节剂，则可能遭受一种或多种自身免疫并发症的癌症患者的方法。在一些实施方案中，本发明提供了用于使用免疫抑制剂治疗先前已被鉴定为如果使用免疫检查点调节剂来治疗，则可能遭受一种或多种自身免疫并发症的癌症患者的方法。在一些实施方案中，在免疫检查点调节剂之前或同时向患者施用免疫抑制剂。

免疫检查点调节剂的施用

根据本发明的某些方法，免疫检查点调节剂被或已被施用至个体。在一些实施方案中，使用免疫检查点调节剂的治疗被用作单一治疗。在一些实施方案中，使用免疫检查点调节剂的治疗与一种或多种其他疗法组合使用。

本领域普通技术人员将了解，通常由政府管理机构诸如美国食品及药物管理局来分析和批准适当的制剂、适应症以及给药方案。例如，实施例5提出了伊匹单抗、抗CTL-4抗体的某些批准的给药信息。在许多实施方案中，根据本发明根据这样一种批准的方案来施用免疫检查点调节剂。然而，本公开提供了用于鉴定、表征和/或选择可希望被施用免疫检查点调节剂的特定患者的某些技术。在一些实施方案中，相对于基于群体研究所推荐或批准的频率和/或个体剂量，由本公开提供的观点容许更高频率和/或更大个体剂量给药给定免疫检查点调节剂(例如，由于对不希望作用的易感性降低和/或不希望作用的发生率或强度降低)，该群体研究包括如本文所述鉴定(例如，表达新表位)的个体和其他个体。在一些实施方案中，相对于基于群体研究所推荐或批准的频率和/或个体剂量，由本公开提供的观点容许降低的频率和/或降低的个体剂量给药给定免疫检查点调节剂(例如，由于反应性增加)，该群体研究包括如本文所述鉴定(例如，表达新表位)的个体和其他个体。

在一些实施方案中，以药物组合物施用免疫系统调节剂，该药物组合物还包含生理学上可接受的载体或赋形剂。在一些实施方案中，药物组合物为无菌的。在许多实施方案中，配制药物组合物用于特定模式的施用。

合适的药学上可接受的载剂包括但不限于水、盐溶液(例如，NaCl)、盐水、缓冲盐水、醇、甘油、乙醇、阿拉伯胶、植物油、苄醇、聚乙二醇、明胶、碳水化合物(诸如乳糖、直链淀粉或淀粉)、糖(诸如甘露醇、蔗糖或其他)、右旋糖、硬脂酸镁、滑石、硅酸、粘性石蜡、芳香油、脂肪酸酯、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等，以及其组合。必要时，药物制剂可包含一种或多种辅助剂(例如，润滑剂、防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、影响渗透压的盐、缓冲剂、着色剂、调味剂和/或芳香物质等)，该助剂不会与活性化合物产生有害反应或干扰其活性。在一些实施方案中，使用适于静脉内施用的水溶性载剂。

在一些实施方案中，必要时，药物组合物或药剂可含有一定量(通常少量)的润湿剂或乳化剂和/或pH缓冲剂。在一些实施方案中，药物组合物可以是液体溶液、悬浮液、乳液、片剂、药丸、胶囊、持续释放制剂或散剂。在一些实施方案中，药物组合物可用传统粘合剂和载剂(诸如甘油三酯)配制为栓剂。经口制剂可包括标准载剂诸如医药级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。

在一些实施方案中，药物组合物可根据常规程序配制为适用于施用至人类的药物组合物。例如，在一些实施方案中，用于静脉内施用的组合物通常为无菌等渗水性缓冲液中的溶液。必要时，组合物还可包含增溶剂和局部麻醉剂以减轻注射部位的疼痛。通常，成分被分开供应或以单位剂型混合在一起，例如呈在气密性密封容器诸如指示活性剂的量的安瓿或药囊中的干燥冻干粉末或无水浓缩物的形式。当组合物待通过输注施用时，它可以用含有无菌药用级水、盐水或右旋糖/水的输注瓶来分配。在组合物通过注射施用时，可以提供注射用无菌水或盐水的安瓿以使得成分可以在施用之前混合。

在一些实施方案中，可以中性形式配制免疫检查点调节剂；在一些实施方案中，可以盐形式配制免疫检查点调节剂。药学上可接受的盐包括由游离氨基形成的那些，诸如源自盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的那些，以及由游离羧基形成的那些，诸如源自氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等的那些。

根据本发明使用的药物组合物可通过任何适当途径来施用。在一些实施方案中，静脉内施用药物组合物。在一些实施方案中，皮下施用药物组合物。在一些实施方案中，通过直接施用至目标组织诸如心脏或肌肉(例如，肌肉内)或神经系统(例如，直接注入脑中；心室内；鞘内)来施用药物组合物。替代地或另外地，在一些实施方案中，胃肠外、经皮或经粘膜(例如，经口或经鼻)施用药物组合物。必要时，可同时使用多于一种途径。

免疫检查点调节剂(或含有免疫检查点调节剂的组合物或药剂可单独施用或与其他免疫检查点调节剂结合施用。术语“与......结合”指示在另一种免疫检查点调节剂之前、大约同时或之后施用第一免疫检查点调节剂。例如，可将第一免疫检查点调节剂混合到含有一种或多种不同免疫检查点调节剂的组合物中，并且因此同时施用；替代地，可在没有混合的情况下同时施用试剂(例如，通过在静脉管线上“搭载”递送试剂，通过所述递送还施用免疫检查点调节剂或反之亦然)。在另一个实例中，可分开(例如，不混合)施用免疫检查点调节剂，但在施用免疫检查点调节剂的短时间范围内(例如，24小时内)。

在一些实施方案中，向使用免疫检查点调节剂治疗的受试者施用一种或多种免疫抑制剂。在一些实施方案中，施用一种或多种免疫抑制剂来减少、抑制或防止不希望的自身免疫应答(例如，小肠结膜炎、肝炎、皮炎(包括毒性表皮坏死溶解)、神经病和/或内分泌病)，例如，甲状腺功能减退症。示例性免疫抑制剂包括类固醇、抗体、免疫球蛋白融合蛋白等。在一些实施方案中，免疫抑制剂抑制B细胞活性(例如利妥昔单抗)。在一些实施方案中，免疫抑制剂为诱饵多肽抗原。

在一些实施方案中，以治疗有效量(例如，给药量和/或根据在向相关群体施用时示出足以治疗癌症的给药方案，所述治疗诸如通过改善与癌症相关的症状、预防或延迟癌症的发作和/或还减轻癌症症状的严重性或频率来实现)施用免疫检查点调节剂(或含有免疫检查点调节剂的组合物或药剂)。在一些实施方案中，在使用免疫检查点调节剂(包括例如，CTLA-4阻断剂诸如伊匹单抗或替西木单抗和/或其他试剂)治疗之后观察到长期临床益处。本领域普通技术人员将了解，将在治疗上有效于给定患者中的癌症治疗的剂量可至少一定程度取决于癌症的性质和程度，并且可通过标准临床技术来确定。在一些实施方案中，可任选采用一种或多种体外或体内测定来帮助鉴定最佳剂量范围。在一些实施方案中，在治疗给定个体中待采用的特定剂量可取决于施用途径、癌症程度和/或鉴于患者的情况在医师的判断中认为相关的一种或多种其他因素。在一些实施方案中，可从来源于体外或动物模型测试系统的剂量-反应曲线中推出有效剂量(例如，由美国卫生和人类服务部、食品及药物管理局以及药品评价与研究中心在“Guidance for Industry:Estimating MaximumSafe Starting Dose in Initial Clinical Trials for Therapeutics in AdultHealthy Volunteers”,Pharmacology and Toxicology,July 2005中所述。

在一些实施方案中，免疫检查点调节剂的治疗有效量可为例如大于约0.01mg/kg、大于约0.05mg/kg、大于约0.1mg/kg、大于约0.5mg/kg、大于约1.0mg/kg、大于约1.5mg/kg、大于约2.0mg/kg、大于约2.5mg/kg、大于约5.0mg/kg、大于约7.5mg/kg、大于约10mg/kg、大于约12.5mg/kg、大于约15mg/kg、大于约17.5mg/kg、大于约20mg/kg、大于约22.5mg/kg或大于约25mg/kg体重。在一些实施方案中，治疗有效量可为约0.01-25mg/kg、约0.01-20mg/kg、约0.01-15mg/kg、约0.01-10mg/kg、约0.01-7.5mg/kg、约0.01-5mg/kg、约0.01-4mg/kg、约0.01-3mg/kg、约0.01-2mg/kg、约0.01-1.5mg/kg、约0.01-1.0mg/kg、约0.01-0.5mg/kg、约0.01-0.1mg/kg、约1-20mg/kg、约4-20mg/kg、约5-15mg/kg、约5-10mg/kg体重。在一些实施方案中，治疗有效量为约0.01mg/kg、约0.05mg/kg、约0.1mg/kg、约0.2mg/kg、约0.3mg/kg、约0.4mg/kg、约0.5mg/kg、约0.6mg/kg、约0.7mg/kg、约0.8mg/kg、约0.9mg/kg、约1.0mg/kg、约1.1mg/kg、约1.2mg/kg、约1.3mg/kg、约1.4mg/kg、约1.5mg/kg、约1.6mg/kg、约1.7mg/kg、约1.8mg/kg、约1.9mg/kg、约2.0mg/kg、约2.5mg/kg、约3.0mg/kg、约4.0mg/kg、约5.0mg/kg、约6.0mg/kg、约7.0mg/kg、约8.0mg/kg、约9.0mg/kg、约10.0mg/kg、约11.0mg/kg、约12.0mg/kg、约13.0mg/kg、约14.0mg/kg、约15.0mg/kg、约16.0mg/kg、约17.0mg/kg、约18.0mg/kg、约19.0mg/kg、约20.0mg/kg体重或更多。在一些实施方案中，治疗有效量不大于约30mg/kg、不大于约20mg/kg、不大于约15mg/kg、不大于约10mg/kg、不大于约7.5mg/kg、不大于约5mg/kg、不大于约4mg/kg、不大于约3mg/kg、不大于约2mg/kg或不大于约1mg/kg体重或更少。

在一些实施方案中，对于特定个体施用的剂量取决于个体的需要随时间推移而变化(例如，增加或减少)。

在又另一个实施方案中，可在疗程开始时给予治疗组合物的负荷剂量(例如，初始较高的剂量)，接着施用减少的维持剂量(例如，后续较低剂量)的治疗组合物。

不希望受任何理论约束，考虑到负荷剂量可清除掉组织中(例如，肝脏中)不希望的材料(例如，脂肪材料和/或肿瘤细胞等)的初始(和在一些情况下大块的)积累，并且维持给药可延迟、减少或防止初始清除之后脂肪材料的聚积。

将了解，可通过任何可用的方法诸如本文所举例说明的那些和本领域已知的那些来确定负荷剂量和维持剂量的量、间隔和治疗持续时间。在一些实施方案中，负荷剂量的量为约0.01-1mg/kg、约0.01-5mg/kg、约0.01-10mg/kg、约0.1-10mg/kg、约0.1-20mg/kg、约0.1-25mg/kg、约0.1-30mg/kg、约0.1-5mg/kg、约0.1-2mg/kg、约0.1-1mg/kg或约0.1-0.5mg/kg体重。在一些实施方案中，维持剂量的量为约0-10mg/kg、约0-5mg/kg、约0-2mg/kg、约0-1mg/kg、约0-0.5mg/kg、约0-0.4mg/kg、约0-0.3mg/kg、约0-0.2mg/kg、约0-0.1mg/kg体重。在一些实施方案中，以常规间隔向个体施用负荷剂量，持续给定时间周期(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个月)和/或给定剂量数(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30或更多次剂量)，接着是维持给药。在一些实施方案中，维持剂量在0-2mg/kg、约0-1.5mg/kg、约0-1.0mg/kg、约0-0.75mg/kg、约0-0.5mg/kg、约0-0.4mg/kg、约0-0.3mg/kg、约0-0.2mg/kg或约0-0.1mg/kg体重的范围内。在一些实施方案中，维持剂量为约0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8或2.0mg/kg体重。在一些实施方案中，施用维持给药持续1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个月。在一些实施方案中，施用维持给药持续1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多年。在一些实施方案中，无限地施用维持给药(例如，持续生命期)。

取决于癌症的性质和程度并且取决于正在进行的工作，可作为一次剂量施用或以每隔一段时间施用治疗有效量的免疫检查点调节剂。如本文所用，在“间隔”下施用指示周期性地(如与一次剂量区别)施用治疗有效量。可通过标准临床技术来确定间隔。在一些实施方案中，两月一次、每月一次、每月两次、三周一次、两周一次、每周一次、每周两次、每周三次或每日一次施用免疫检查点调节剂。对于单个个体的施用间隔不必是固定的间隔，但可取决于个体的需要和恢复速率随时间推移而变化。

如本文所用，术语“两月一次”意指每两个月施用一次(即，每两个月一次)；术语“每月一次”意指每个月施用一次；术语“三周一次”意指每三周施用一次(即，每三周一次)；术语“两周一次”意指每两周施用一次(即，每两周一次)；术语“每周一次”意指每周施用一次；并且术语“每日一次”意指每天施用一次。

本发明另外地涉及药物组合物，该药物组合物包含处于具有标签的容器(例如，用于静脉内施用的小瓶、瓶、袋、注射器等)中的如本文所述的免疫检查点调节剂，该标签含有用于施用组合物以用于治疗癌症的说明书。

实施例

提供以下实施例以便对本领域普通技术人员描述如何做出和使用本发明的方法与组合物，并且不意图限制发明人就其发明所认为的范围。

综述

免疫检查点阻断为新的治疗范例，其在患有转移性黑色素瘤、非小细胞肺癌以及其他肿瘤类型的患者中引起双重抗肿瘤作用，但是什么决定患者将是否响应仍不清楚。^1-5这是癌症免疫疗法领域中最关键的未解答的问题之一。完全人单克隆抗体伊匹单抗和替西木单抗阻断细胞毒性T-淋巴细胞抗原4(CTLA-4)，从而引起T细胞活化。^4,6派姆单抗为靶向编程性细胞死亡1(PD-1)受体作为转移性黑色素瘤的治疗的药物。许多研究已确立了伊匹单抗结果与外周血液淋巴细胞计数、抗原特异性免疫、T细胞活化的标记物、^7,8“炎性”微环境^9-12以及高频率TCR克隆型维持之间的相关性。⁶⁹

然而，未知的是，肿瘤的遗传图谱是否指出对CTLA-4阻断(例如，通过伊匹单抗)的反应。肿瘤遗传景观、突变负荷以及来自治疗的益处之间和之中的关系是研究的主题。由非同义黑色素瘤突变引起的免疫原性在小鼠模型中示出，¹³并且对人黑色素瘤肿瘤的抗原多样性进行计算机建模。¹⁴效应子和辅助T细胞功能以及调节性T细胞缺失是抗CTLA-4功效所必要的，^15-17如已观察到调节性T细胞缺失¹⁸但在特异性HLA类型与临床益处之间未观察到关联那样。²⁶黑色素瘤与任何实体瘤相比具有最大的突变负担(每兆碱基0.5至大于100个突变)。^19-20研究表明体细胞突变可引起新表位^21,22，并且这些可充当临床前模型中和患者中的新抗原。^23-25伊匹单抗反应通过肿瘤细胞基因组来指出的假设是相关的。先前研究证实了特异性HLA类型与伊匹单抗反应之间缺少关联。²⁶这个研究调查研究了肿瘤的遗传景观是否决定对CTLA-4阻断(例如，通过使用诸如伊匹单抗或替西木单抗的试剂的治疗)的临床反应。¹⁸

为了探究这个假设，对于发现组，我们对来自25个伊匹单抗治疗的患者的肿瘤和匹配正常血液的DNA进行全外显子组测序(表3)，接着另外的39种肿瘤作为验证，该患者中的五个用替西木单抗治疗。我们发现较高的突变负担与来自CTLA-4阻断(例如，通过伊匹单抗或替西木单抗)的强临床益处相关，但单独地不足以预测强临床益处。相反，具有来自CTLA-4阻断的临床益处的患者的肿瘤中的突变含有共享的体细胞新表位。这里，我们证实了对免疫检查点抑制的临床反应的遗传基础并且定义了基于对疗法反应的新表位景观。

阅读本公开，本领域技术人员将了解，本文包括的特定实例是代表性的并非限制性的。例如，查看如下详细提供的黑色素瘤中的伊匹单抗反应的数据，本领域技术人员表示出概念证据并且确立了新表位突变标记可预测对免疫检查点调节剂的反应。阅读本公开，本领域普通技术人员将了解并且理解，方法在整个癌症和免疫检查点调节剂疗法中是广泛适用的。

实施例1.具有对伊匹单抗的多样临床结果的来自患者的黑色素瘤的突变景观

本实施例说明了癌症遗传景观的分析，并且证实了其在定义有利地或较差地响应于免疫检查点调节剂的患者的有用标志中的有效性。实施例特别举例说明了使用CTLA-4阻断(例如伊匹单抗)治疗的黑色素瘤患者的分析，并且定义了此类患者中的示例性遗传特征。

使用CTLA-4阻断剂治疗的黑色素瘤患者展示了总存活率优势和多样的反应。^1,27-29基线患者特征描述于表3中。

表3.发现组和验证组中的患者的临床特征

在这个研究中包括具有或不具有长期临床益处的患者。这里，我们将长期临床益处定义为(1)患者无放射照相疾病(NED)(来自单独的CTLA-4阻断剂或使用切除分离的稳定或未响应病灶)；或(2)患者具有持续>6个月的稳定或减小的疾病体积的迹象。我们将不存在临床益处定义为在开始治疗之后在每次扫描时肿瘤生长(无益处或反应)，或持续<6个月的暂时临床益处或反应(最小益处)(代表性扫描，图1A-1C和图9A-9C)。

为了确定来自CTLA-4阻断剂的反应的遗传景观，我们使用全外显子组测序分析了肿瘤和匹配血液DNA。在发现组中，我们产生6.4GB的映射序列，其中超过90％的目标序列覆盖至至少10倍深度并且平均外显子组覆盖率为103倍(图5)。验证组的结果描绘于图15中。样品之中的宽范围突变负担(图2A和图2B)和频发突变和驱动突变(图6A和图6C)与文献一致。^30-34

在发现组和验证组中，存在类似的转换与颠换比率(图2C、图2I)、以及突变类型和核苷酸变化(图2D以及图6B和图6D)。¹⁹在整个得到益处的响应者或患者中没有基因被普遍突变。在每个组中观察到已知的、频发的黑色素瘤驱动基因中的突变(图7A和图7B)，并且在具有驱动突变多样性的黑色素瘤中看到反应。³⁵

实施例2.与治疗功效相关联的体细胞新表位

本实施例证实了体细胞新表位与使用免疫检查点调节剂的治疗功效相关联，并且此外定义了与对特定示例性调节剂(即，伊匹单抗)的反应相关的新表位标记。

突变负担与临床益处相关，但单独不足以预测结果

我们假设，转移性黑素瘤样品中的突变负担增加可与对CTLA-4阻断(例如，对使用诸如伊匹单抗、替西木单抗等的试剂的治疗)的反应相关。在发现组中，在从CTLA-4阻断剂中具有长期临床益处(LB)的患者与具有最小临床益处或无临床益处(NB)的患者之间存在突变负荷的显著差异(图2B，曼惠特尼检验，p＝0.013)，并且在验证组中也存在显著差异(图7C和图7D，曼惠特尼检验，p＝0.009)。在发现组中，突变负荷与改进的总存活率相关(图2E，对数秩检验，p＝0.041)，并且在验证组中，趋向于改进的存活率(图2E和图2H)。后面的组包括从以另外的方式实现全身性疾病控制的患者中切除的八个未响应肿瘤，这可混淆突变负荷与存活率之间的关系。另外的细分成四个临床范围表明了发现组中的剂量-反应(图7E)。这些数据表明高突变负荷与来自CTLA-4阻断剂(例如，伊匹单抗)的临床益处相关，但单独不足以赋予临床反应，因为存在不响应的具有高突变负担的肿瘤。

响应的肿瘤共同的体细胞新表位与抗CTLA-4功效相关联

伊匹单抗活性需要MHC I类呈递和细胞毒性T细胞识别。¹⁵因为单独突变负荷不能解释对伊匹单抗的临床反应，我们假设特定肿瘤新抗原的存在可能解释改变的治疗反应。为了鉴定此类新表位，结合MHC I类结合预测、T细胞受体结合建模、患者特异性HLA类型以及表位同源性分析开发了现有技术生物信息流程(图8和方法)。

由MHC I类进行的肿瘤抗原呈递是由T细胞进行的识别的关键。^36,37我们创建了计算机算法来将所有非同义错义突变翻译成突变型肽和野生型肽(NASeek，方法和图8)。我们使用患者特异性HLA类型，检查了体细胞新表位子集将是否改变肽-MHC结合的强度。我们首先比较了所有突变型肽与野生型肽的总抗原性趋势。有趣的是，总的来说预测突变型肽比对应的野生型肽以更高的亲和力结合MHC I类(图10A和图10B，图10F和图10G)。

使用预测结合至MHC I类的仅有肽串(IC50≤500nM)，我们搜索了集中在四肽上的由多种肿瘤共享的保守性氨基酸段。这些被用于建模基因组系统发生中，因为它们相对不频繁地发生在蛋白质中并且通常反映功能。³⁸我们使用标准机器学习、等级聚类以及标记衍生方法来鉴定共有序列。我们鉴定了许多由响应者共享的，但在未响应者中完全不存在的四肽序列。(图3A和图3B)。在最近公开的里程碑论文中，显示短氨基酸子串在由T细胞受体(TCR)识别的抗原上包含保守区。³⁹通过共有四肽驱动表位的TCR识别，并且交叉反应的TCR表位内的四肽是必需的并且足以驱动抗原性和T细胞增殖。这有力证明了这种多肽长度足以驱动由TCR进行的识别。^40-42

四肽可形成由MHC I类分子呈递至T细胞的九肽的核心，或可被横向定位。⁴³四肽被用于建模基因组系统发生中，因为它们相对不频繁地发生在蛋白质中并且通常反映功能。我们使用发现组来从候选新表位中产生预测性标记。每个组共同的四肽(候选新表位)包括在发现组中具有临床益处的101个排他共享的患者之中。在验证组中也独立地观察到这个结果(图3A、图3B、图3E和图3F以及图12)。这个组定义了与来自CTLA-4阻断(例如，通过伊匹单抗)的益处相关的新表位标记(图3A和图3B，红线)，这是高度统计学显著的(p<0.001，费歇尔精确检验)。

重要地，共享的四肽新表位并非简单地由更高的突变负荷产生。例如，在发现组中，具有最大突变数的NB患者(未响应者)(具有1028个突变的SD7357)不共享任何四肽标记(图3A)。这个观点再次在验证组中进行了说明，其中甚至具有大于1000个突变的肿瘤(NR9521和NR4631)不能响应(图3B和图7C)。使用五种不同模型的模拟测试证实了我们的标记是高度统计学显著的，并且不可能单独由偶然得到(对于方法a-d，p<0.001并且对于方法e，p+0.002)(图12)。高突变负荷看起来增加了可能性，但不保证形成与益处相关联的新表位。共有分析揭示新表位不是随机的。在受益组中构成四肽的氨基酸频率与在未受益组中观察到的那些不同(图10C、图10D、图10I和图10J)。

来源于发现组的新表位标记与验证组中的存活率强烈相关(图3C和图3D，p<0.0001)，并且在区分结果方面比突变负荷更有效(图2D、图2B、图2E、图2H)。我们分析了使用伊匹单抗治疗的一个独立群组的黑色素瘤患者(n＝15)，对于所述患者我们得到组织和匹配血液并且在这个独立组中验证了标记(图3D)。

这些四肽由整个基因组中的多样基因中的突变编码(图4A、图14、图19以及表4)。使用来自The Cancer Genome Atlas(TCGA)的RNASeq数据，我们证实了具有我们体细胞新表位的基因被广泛地表达在黑色素瘤中。在一些情况下，由体细胞突变引起的氨基酸变化导致四肽其自身的变化。在其他情况下，如所述的，突变氨基酸独立于四肽和改变的MHC结合。^38,40,44-46

另外，使用免疫表位数据库(IEDB)分析了每个临床组共同的候选新表位。这是实验验证、公开并且精选的抗原的最全面数据库，并且被用来开发算法以便以高准确度鉴定抗原。²³我们发现，相比于其他临床组，受益者共同的候选新表位对应于多更多的IEDB中的病毒抗原和细菌抗原(图10E、图10K)。

表4：反应标记中四肽的背景、基因以及基因座

4聚体＝常见四肽氨基酸序列。Mut＝突变位置。WTSeq＝预测的野生型9氨基酸肽。MTSeq＝预测的突变型9氨基酸肽。

例如，表5和图21中呈现的分析证实了四肽子串ESSA由受益组中的患者共享(还参见图4F)并且对应于人巨细胞病毒立即早期表位(MESSAKRKMDPDNPD)。另外，四肽子串LLKK可由LB组中的患者共享；这个子串对应于刚地弓形虫颗粒抗原的精确抗原性部分(RSFKDLLKK，图4B)。^47,48这些数据表明具有来自CTLA-4阻断的强临床益处的患者(例如，具有对伊匹单抗和替西木单抗的强反应的患者)中的新表位可类似于来自T细胞适合识别的病原体的表位。

使用全外显子组测序方法，我们表征了整个预测的抗原肽空间(参见方法)。如我们研究所进一步验证，我们“重新发现”了由T细胞识别的黑色素瘤抗原(MART-1，又称为MelanA)，一种实验验证的黑色素细胞抗原(图10F)。^37,49-51EKLS由完全和长期响应者共享，构成MART-1MHC II类表位的核心氨基酸，并且磷酸丝氨酸部分对于T细胞受体(TCR)识别是关键的。^51,52

表5.样品部位、大小以及类型

实施例3.免疫原性肽的体外分析

本实施例证实了免疫原性肽的体外验证。

即使在专家手中，将下一代测序变换成肽预测的体外验证也被证明是具有挑战性的，其中公开的验证率很低。²⁴体外测定受到以下阻碍：患者材料缺乏、保存细胞对冷冻/解冻过程的敏感性、患者材料内抗新抗原T细胞的频率低以及在不存在复杂体内免疫原性微环境的情况下T细胞体外的敏感性非常低。

我们的系统尝试通过整合多种高通量方法来优化预测(图8)。基于我们的预测算法，我们产生了肽库并且对于我们得到足够淋巴细胞的患者进行了T细胞活化测定(参见方法)。对于5个患者中的3个，观察到阳性库(图11A-11C)。我们对于具有适当外周血单核细胞(PBMC)的患者鉴定了精确的肽。与其野生型对应部分TKSPFEQHI相比，我们通过患者CR9306发现对肽TESPFEQHI的多功能T细胞应答(图4C)。在开始治疗之后60周，这个应答达到顶峰(图4D)。在健康供体中不存在T细胞应答(图13)。与对于TKSPFEQHI的18323nM相比，这种肽对于B4402具有472nM的预测MHC I类亲和力。ESPF为存在于反应标记中的常见四肽，并且为丁型肝炎病毒大Δ表位p27(PESPFA和ESPFAR)的子串(位置176-179)。^53,54TESPFEQHI由FAM3C(c.A577G；p.K193E)中的突变引起，一种在黑色素瘤中高度表达的基因。

我们还发现，与野生型GLERGGFTF相比，肽GLEREGFTF在患者CR0095中引发多功能T细胞应答(图4E和图11D)。在治疗后24周，这个应答达到顶峰(图4E)。GLEREGFTF由CSMD1(c.G10337A；p.G3446E)中的突变产生，其也在黑色素瘤中高度表达并且与已知类鼻疽杆菌抗原(IEDB参考ID:1027043)具有80％同源性。重要地，T细胞活化的缺乏可以不排除给定新抗原，因为体外测定全部限于如上所述的敏感性。

实施例4.用于实施例1-3的材料和方法

本实施例提供了在实施例1-3中用于本文提出的工作的详细材料和方法。

我们从使用伊匹单抗治疗的黑色素瘤患者中获得肿瘤组织。这些样品来自经历长期益处(LB)或最小益处/无益处(NB)的经过伊匹单抗治疗的患者。对这些肿瘤和匹配正常血液进行全外显子组测序。鉴定并且表征了体细胞突变和从这些突变中产生的候选体细胞新抗原。

患者数据

通过两个研究人员独立地查看图表来分配临床亚组和对于发现组和验证组的其他参数。将总存活率计算为死亡或责难日与抗CTLA4疗法(在发现组中为伊匹单抗或在验证组中为伊匹单抗或替西木单抗)的第一剂量之间的差异。发现组中的所有患者都具有阶段IV黑色素瘤并且在2006与2012年之间被治疗；在2007与2012年之间收集样品。验证组中的患者在2006至2013年被治疗；并且在2005与2013年之间收集样品。使用商用伊匹单抗(Yervoy)或临床试验治疗患者，包括NCT00796991、NCT00495066、NCT00920907、NCT00324155、NCT00162123、NCT0140045、NCT00289640；NCT00495066、NCT00636168、NCT01515189、NCT00086489以及NCT00471887。患者以3或10mg/kg接受伊匹单抗的不同剂量和方案，并且2个患者使用达卡巴嗪或维罗非尼共同治疗(参见图17)。验证组中的四个患者使用10mg/kgx6剂量(1个患者)或15mg/kgx4剂量(3个患者)下的替西木单抗治疗。这4个患者中有3个具有阶段IIIC疾病；所包括的所有其他患者具有阶段M1a-c。包括具有分离自冷冻组织以用于分析的DNA的患者，患者接受至少2次剂量的伊匹单抗并且在第一次治疗之后至少12周时具有一种放射照相评估。LB组中的两个患者具有被切除的分离的病灶，以便使他们称为无疾病的。在训练组中对一种进展的病灶(CR7623)进行测序。在验证组中，8种肿瘤代表来自以另外的方式具有长期益处的患者的未响应病灶。这些包括CRNR4941、LSDNR1650、CRNR2472、LSDNR1120、CRNR0244、LSDNR9298、LSDNR3086以及PR03803。进展的所有肿瘤都作为“无益处”肿瘤经历分子分析。

在研究中产生的患者数据被组装成一系列表格，所述表格详细描述了以下内容：验证组中的患者的临床特征；发现组中的患者的详细临床特征；发现组突变列表；对于由突变产生的预测的肽通过NetMHCv3.4具有小于500nm的结合亲和力的基因座；用于标记的TCGA RNASeq；对于反应标记中的四肽的背景、基因以及基因座；验证组突变列表；发现组和验证组的HLA类型；以及样品部位、大小以及类型。

DNA分离和全外显子组测序

使用每种批准的机构审查委员会(IRB)方案的书面知情同意书来获得原发性肿瘤样品和匹配正常样本(外周血)。所有样本都是清楚可见病灶的切除活检物或切除物。所有样品都含有高肿瘤细胞性质。在外科手术切除或活检之后将样本急速冷冻在液氮中，并且在-80℃下储存。制备用苏木精和曙红染色的节段，并且通过皮肤病学者来证实诊断。使用QIAamp DNA微型试剂盒和QIAamp DNA血液微型试剂盒(Qiagen)来提取DNA。

使用SureSelect Human All Exon 50MB试剂盒(Agilent)进行外显子捕获。在HiSeq 2000平台(Illumina)上对富集的外显子组文库进行测序至>100X覆盖率(MSKCCGenomics Core and Broad Institute,Cambridge,MA)。进行比对、基本质量分数重新校准以及重复读取除去，排除种系变体、注释突变并且如先前所述评价插入/缺失(图9A)。⁷⁰排除具有肿瘤覆盖率≤10X的样品。使用整合基因组学查看器(IGV)v2.1手动查看中值置信度读取(11-34X)。⁷¹对于候选突变的测序的验证率为10X及以上覆盖率的97％。⁷⁰使用费歇尔检验来比较临床组之间的中值突变数。

通过RSEM和对于表达所述基因的肿瘤所计算的平均表达来归一化TCGA RNASeq基因表达(参见图18)。

HLA分型

在MSKCC HLA分型实验室或纽约血液中心中，通过低至中间分辨率聚合酶链式反应-序列特异性引物(PCR-SSP)方法或通过高分辨率基于SeCore HLA序列的分型方法(HLA-SBT)(Invitrogen)来进行HLA分型。ATHLATES(http://www.braodinstitute.org/ scientific-community/science/projects/viral-genomics/athlates)⁷²也用于HLA分型和确认。

免疫原性分析

创建了称为NAseek的生物信息工具。这个程序执行两个功能：翻译每个突变周围的段以及比较所得的肽之间的同源性。首先，NAseek翻译外显子组中的所有突变，所以对于预测的野生型和突变型产生17个氨基酸的串，其中氨基酸由位于中心的突变产生。为了评价MHC I类结合，使用滑动窗口方法将含有完全响应者共同的四肽的野生型和突变型九聚体输入到患者特异性HLA类型的NetMHC v3.4(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHC/)或RANK PEP(http://imed.med.ucm.es/Tools/rankpep.html)中。我们使用了滑动窗口方法以及九肽中的改变的氨基酸的位置。这些程序得到预测的MHC I类结合强度。然后对于彼此的相似性评估预测为由患者特异性MHC I类呈递的九聚体。使用具有缺省参数的Weblogo(http://weblogo.berkeley.edu/logo.cgi)执行氨基酸频率的对数作图。字母的高度反映在所述位置处的对应氨基酸的相对频率。为了进一步缩小用于体外测试的预测的九聚体，还使用具有患者特异性HLA类型的IEDB免疫原性预测物评价了九聚体对T细胞受体的假定结合(http://tools.immuneepitope.org/immunogenicity/)或CTLPred(http://www.imtech.res.in/raghava/ctlpred/)。

为了评价T细胞活化和对已知病原体的抗原的同源性，使用免疫表位数据库(www.iedb.org)来分析保守性四肽并且对于智人宿主中的阳性T细胞应答被评估为数据库中免疫原的子串。我们排除了不具有预测的T细胞应答或排他性地抗自身或变应原性质的肽。从含有具有长期益处的患者共同的肽的九聚体中产生“新抗原标记”(参见表4和图19)。相对于NB组，对于LB组进行共享四肽的总数的卡方检验。使用非监督的等级聚类接着是逻辑回归的标准标记衍生方法被用于确定仅基于发现组数据的预测模型。模型基于所有四肽必须在发现组中存在至少两次的核心规则，并且存在小于三次的任何四肽必须包含在体外示出引发T细胞应答的已知抗原的共同子串。然后将最佳拟合标记应用至验证组。

我们进行了严格的模拟/排列测试来证实新抗原标记高度不可能由偶然产生。为了评估所发现的标记是由于偶然产生的无效假设，评价了5个相异的模拟模型，三个模型具有新数据集并且两个模型使用我们数据集的排列。使用以下来执行模拟：(a)从SwissProt数据库中抽取的九聚体、(b)来自TCGA黑色素瘤数据集的突变、(c)随机产生的九聚体、(d)在我们数据中发现的突变的重新分布以及(e)预测为在我们数据集中呈现的每种九聚体内的9个氨基酸的重新排序。在每个模拟中，随机分布九聚体，并且与我们的数据成比例(例如，如果实际样品具有预测为结合MHC I类的150个九聚体，则“虚拟”样品被分配150个九聚体)。然后通过应用在应用至这个虚拟数据集的实际数据上使用的相同迭代模型，并且重复这个过程1,000次、记录大于实际标记的标记频率以确定p值来进行模拟测试。P值被计算为具有正确分类的临床群组分离的更大标记的迭代除以1,000次迭代的比例。

细胞内细胞因子染色(ICS)

在IRB批准的机构协议下，在多个时间点下收集来自5个使用伊匹单抗治疗的黑色素瘤患者的外周血单核细胞(PBMC)。合成从全外显子组/转录物组分析中鉴定的对于这些患者的候选新抗原肽(GenScript Piscataway,NJ)。将2.5x10⁶个患者PBMC样品与2.5x10⁶个辐照的自体PBMC加上30至50个肽的库一起培养，每个库处于补充有细胞因子IL-15(10ng/ml)和IL-2(10IU/ml)的10％人血清库(PHS)RPMI 1640培养基中。每隔一天置换培养基并且在第10天收获细胞。⁷³在布雷菲德菌素A和莫能菌素(BD Bioscience)存在下，通过添加新抗原肽来重新刺激细胞持续6小时。然后使用以下抗体对细胞进行染色：Pacific Blue-CD3(克隆OKT3)、APC-AF750-CD8(克隆SK1,eBioscience)以及ECD-CD4(克隆SFC12T4D11,Beckman Coulter)。在后续洗涤和透化时，使用以下抗体对细胞进行染色：PE-Cy5-CD107a(克隆H4A3)、APC-IL-2(克隆MQ1-17H12)、PE-MIP-1β(克隆D21-1351)、FITC-IFN-γ(克隆B27)(BD Pharmingen)以及PE-Cy7-TNF-α(克隆MAB11eBioscience)。使用CYAN流式细胞分析仪和Summit软件(Dako Cytomation California Inc.,Carpinteria,CA)来获取数据。使用FlowJo软件v9.7.5(TreeStar,Inc.)来进行流式分析。当可行时，将相对于无刺激对照而引起诱导细胞因子应答的库去卷积成其组分单个肽。对于单个肽重复以上过程并且与对应预测的野生型九聚体进行比较。葡萄球菌肠毒素B(SEB)充当T细胞应答的阳性对照。

免疫组织化学

使用Aperio载片扫描仪扫描免疫组织化学的和苏木精与曙红染色的载片。在鉴定包含在载片商的所有坏死区域之后，使用Aperio成像软件确定肿瘤坏死百分比。使用对于每种情况手动校准和验证的Aperio图像分析算法(细胞核和细胞质v9)，由皮肤病学者在不知情的情况下定量免疫染色的载片。对代表三个代表区总和的每种情况最小3000个细胞进行计数，其中结果被报道为使用限于肿瘤区域的计数所计数的免疫染色阳性细胞/总细胞。使用以下抗体对节段进行染色：LCA(1ng/μl,DAKO,克隆2B11+PD7/26)、CD8(0.5ng/μl,DAKO,克隆C8/144B)以及Foxp3(2.5ng/μl,Abcam,克隆236A/E7)。

统计方法

使用曼-惠特尼检验来比较临床组(分别为发现组和验证组中的LB和NB)之间的非同义外显子突变负担。使用对数秩检验来比较发现组和验证组中总存活率的Kaplan-Meier曲线。如上所述，在以下无效假设的情况下使用模拟测试：所有四肽等同地有助于临床益处以便确定我们发现的大小的标记是否由偶然发生。

实施例5.使用伊匹单抗治疗

本实施例提供了使用抗体免疫疗法(伊匹单抗)治疗癌症(黑色素瘤)的说明书，如由美国食品及药物管理局对于转移性黑色素瘤的治疗所批准。在一些实施方案中，在伊匹单抗治疗之后观察到长期临床益处。根据本发明，在本实施例中列出的方案在一些实施方案中可被希望地施用至一个或多个被鉴定为具有体细胞突变的受试者。

YERVOY^TM(伊匹单抗)注射液，静脉内输注初始美国批准：2011

警告：免疫介导的不良反应

参见完整盒装警告的全部处方信息。

YERVOY可由于T细胞活化和增殖而导致严重和致命的免疫介导的不良反应。这些免疫介导的反应可涉及任何器官系统；然而，最常见的严重免疫介导的不良反应为小肠结肠炎、肝炎、皮炎(包括毒性表皮坏死溶解)、神经病以及内分泌病。大部分这些免疫介导的反应最初在治疗过程中表现；然而，小部分在施用YERVOY的几周至几个月后发生。

对于严重的免疫介导的反应永久停止YERVOY并且开始全身性高剂量皮质类固醇疗法。(2.2)

对于小肠结肠炎、皮炎、神经病以及内分泌病的体征和症状评估患者并且评价临床化学性质，包括在基线时和在每次剂量前的肝脏功能测试和甲状腺功能测试。(5.1,5.2,5.3,5.4,5.5)

---------------------------适应症和用法---------------------------

YERVOY为指定用于治疗不可切除或转移性黑色素瘤的人细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA-4)阻断抗体。(1)

------------------------剂量和施用-------------------------------

每3周经过90分钟静脉内施用YERVOY 3mg/kg，持续总共四次剂量。(2.1)

对于严重的不良反应永久停止。(2.2)

全部处方信息

警告：免疫介导的不良反应

对于严重的免疫介导的反应永久停止YERVOY并且开始全身性高剂量皮质类固醇疗法。[参见剂量和施用(2.2)]

对于小肠结肠炎、皮炎、神经病以及内分泌病的体征和症状评估患者并且评价临床化学性质，包括在基线时和在每次剂量前的肝脏功能测试和甲状腺功能测试。[参见警告和预防措施(5.1,5.2,5.3,5.4,5.5)]

1适应症和用法

YERVOY(伊匹单抗)被指定用于治疗不可切除或转移性黑色素瘤。

2剂量和施用

2.1推荐给药

YERVOY的推荐剂量为每3周经过90分钟静脉内施用的3mg/kg，持续总共四次剂量。

2.2推荐剂量变更

对于任何中等的免疫介导的不良反应或对于症状性内分泌病拒绝安排剂量的YERVOY。对于全部或部分解决不良反应(等级0-1)的患者以及每天接受小于7.5mg强的松或等效物的患者，每3周以3mg/kg的剂量恢复YERVOY直到施用所有4个计划的剂量或从第一次剂量开始16周为止，无论哪个先发生。

对于任何以下情况，永久停止YERVOY：

·持续的中等不良反应或不能将皮质类固醇剂量降低至每天7.5mg强的松或等效物。

·在从第一次剂量施用开始16周内不能完成全部的疗程。

·严重或威胁生命的不良反应，包括任何以下情况：

具有腹痛、发热、肠梗阻或腹膜体征的结肠炎；解便频率增加(在基线上7次或更多次)、粪便失禁、大于24小时的静脉内补水需要、胃肠道出血以及胃肠道穿孔

天冬氨酸转氨酶(AST)或丙氨酸转氨酶(ALT)>5倍正常值上限或总胆红素>3倍正常值上限

斯-约二氏综合症、毒性表皮坏死溶解、或由全厚度皮肤溃疡并发的皮疹、或坏死性、大疱性或出血性表现

严重的运动和感觉神经病、格-巴综合症或重症肌无力

涉及任何器官系统的严重的免疫介导的反应(例如，肾炎、肺炎、胰腺炎、非感染性心肌炎)

对局部免疫抑制疗法没有反应的免疫介导的眼病

2.3制备和施用

·不要摇晃产品。

·在施用前对于颗粒物和变色视觉上检查胃肠外药物产品。丢弃如果溶液为浑浊的、存在明显变色(溶液可能具有浅黄色)或存在除了半透明接近白的无定形颗粒以外的外来颗粒物的小瓶。

溶液的制备

·在制备输注液之前允许小瓶在室温下静置约5分钟。

·取出需要体积的YERVOY并且转移到静脉内袋中。

·使用0.9％氯化钠注射液USP或5％葡萄糖注射液USP进行稀释来制备具有在1mg/mL至2mg/mL范围内最终浓度的稀释溶液。通过轻微倒置来混合稀释溶液。

·在冷藏(2℃至8℃，36℉至46℉)下或在室温(20℃至25℃，68℉至77℉)下，储存稀释溶液不大于24小时。

·丢弃YERVOY的部分使用过的小瓶或空小瓶。

施用说明书

·不要将YERVOY与其他医药产品混合或作为具有其他医药产品的输注液施用。

·在每次剂量之后，使用0.9％氯化钠注射液USP或0.5％葡萄糖注射液USP冲洗静脉管线。

·通过含有无菌、无热原、低蛋白质结合在线过滤器的静脉管线，在90分钟内施用稀释溶液。

3剂型和优势

50mg/10mL(5mg/mL)。200mg/40mL(5mg/mL)。

4禁忌症

无。

5警告和预防措施

YERVOY可由于T细胞活化和增殖而导致严重和致命的免疫介导的反应。

等同性

应理解，虽然本发明已结合其发明详述进行了描述，但以上描述意图说明且并非限制本发明的范围，本发明的范围是由所附权利要求书来限定。其他方面、优势和改进在以下权利要求书范围内。

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Claims

1.一种方法，其包括以下步骤：

在来自受试者的癌症样品中检测体细胞突变；以及

将所述受试者鉴定为使用免疫检查点调节剂的治疗的候选者。

2.如权利要求1所述的方法，其中检测步骤包括对来自所述癌症样品的一个或多个外显子组进行测序。

3.如权利要求1所述的方法，其中所述体细胞突变包括由T细胞识别的新表位。

4.如权利要求2所述的方法，其中所述新表位与不具有突变的对应表位相比具有更大的对主要组织相容性复合体(MHC)分子的结合亲和力。

5.如权利要求1所述的方法，其中所述体细胞突变包括新表位，所述新表位包含在不具有体细胞突变的相同细胞类型中不表达的四聚体。

6.如权利要求5所述的方法，其中所述新表位与感染剂共享共有序列。

7.如权利要求5所述的方法，其中所述四聚体为选自在表1中呈现的那些的序列。

8.如权利要求1所述的方法，其中所述癌症为或包括黑色素瘤。

9.如权利要求1所述的方法，其中所述免疫检查点调节剂与以下相互作用：细胞毒性T-淋巴细胞抗原4(CTLA4)、程序性死亡1(PD-1)或其配体、淋巴细胞活化基因-3(LAG3)、B7同源物3(B7-H3)、B7同源物4(B7-H4)、吲哚胺(2,3)-双加氧酶(IDO)、腺苷A2a受体、轴突素、B-淋巴细胞和T-淋巴细胞弱化子(BTLA)、杀伤免疫球蛋白样受体(KIR)、含T细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域的蛋白质3(TIM-3)、诱导型T细胞共刺激分子(ICOS)、CD27、CD28、CD40、CD137或其组合。

10.如权利要求1所述的方法，其中所述免疫检查点调节剂为抗体试剂。

11.如权利要求10所述的方法，其中所述抗体试剂为或包括单克隆抗体或其抗原结合片段。

12.如权利要求11所述的方法，其中所述抗体为伊匹单抗。

13.如权利要求1所述的方法，其中所述受试者先前尚未被癌症治疗剂治疗过。

14.如权利要求1所述的方法，其中所述受试者先前尚未被癌症免疫治疗剂治疗过。

15.如权利要求12所述的方法，其进一步包括向所述受试者施用伊匹单抗的步骤。

16.一种方法，其包括以下步骤：

在来自受试者的癌症样品中检测体细胞突变；以及

将所述受试者鉴定为使用免疫检查点调节剂的治疗的较差候选者。

17.如权利要求16所述的方法，其中所述受试者被鉴定为如果施用免疫检查点调节剂，则可能遭受一种或多种自身免疫并发症。

18.如权利要求17所述的方法，其中所述自身免疫并发症为甲状腺功能减退症。

19.一种方法，其包括以下步骤：

确定受试者患有包含体细胞突变的癌症，其中所述体细胞突变包括包含来自表1的四聚体的新表位，以及

对于所述受试者选择包含免疫检查点调节剂的癌症治疗。

20.如权利要求19所述的方法，其中所述癌症包括黑色素瘤。

21.如权利要求19所述的方法，其中所述免疫检查点调节剂与以下相互作用：细胞毒性T-淋巴细胞抗原4(CTLA4)、程序性死亡1(PD-1)或其配体、淋巴细胞活化基因-3(LAG3)、B7同源物3(B7-H3)、B7同源物4(B7-H4)、吲哚胺(2,3)-双加氧酶(IDO)、腺苷A2a受体、轴突素、B-淋巴细胞和T-淋巴细胞弱化子(BTLA)、杀伤免疫球蛋白样受体(KIR)、含T细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域的蛋白质3(TIM-3)、诱导型T细胞共刺激分子(ICOS)、CD27、CD28、CD40、CD137或其组合。

22.如权利要求21所述的方法，其中所述免疫检查点调节剂为抗体试剂。

23.如权利要求22所述的方法，其中所述抗体试剂为或包括单克隆抗体或其抗原结合片段。

24.如权利要求23所述的方法，其中所述抗体为伊匹单抗。

25.如权利要求19所述的方法，其中所述受试者先前尚未被癌症治疗剂治疗过。

26.如权利要求19所述的方法，其中所述受试者先前尚未被癌症免疫治疗剂治疗过。

27.一种使用免疫检查点调节剂治疗受试者的方法，其中所述受试者先前被鉴定为患有具有一个或多个体细胞突变的癌症，其中所述一个或多个体细胞突变包括由T细胞识别的新表位。

28.如权利要求27所述的方法，其中所述癌症包括黑色素瘤。

29.如权利要求27所述的方法，其中所述免疫检查点调节剂与以下相互作用：细胞毒性T-淋巴细胞抗原4(CTLA4)、程序性死亡1(PD-1)或其配体、淋巴细胞活化基因-3(LAG3)、B7同源物3(B7-H3)、B7同源物4(B7-H4)、吲哚胺(2,3)-双加氧酶(IDO)、腺苷A2a受体、轴突素、B-淋巴细胞和T-淋巴细胞弱化子(BTLA)、杀伤免疫球蛋白样受体(KIR)、含T细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域的蛋白质3(TIM-3)、诱导型T细胞共刺激分子(ICOS)、CD27、CD28、CD40、CD137或其组合。

30.如权利要求27所述的方法，其中所述免疫检查点调节剂为抗体试剂。

31.如权利要求30所述的方法，其中所述抗体试剂为或包括单克隆抗体或其抗原结合片段。

32.如权利要求31所述的方法，其中所述抗体为伊匹单抗。

33.如权利要求27所述的方法，其中所述受试者先前尚未被癌症治疗剂治疗过。

34.如权利要求27所述的方法，其中所述受试者先前尚未被癌症免疫治疗剂治疗过。

35.一种改进使用免疫检查点调节剂的癌症疗法的功效的方法，所述方法包括以下步骤：

对于所述疗法接受选择被鉴定为患有具有一个或多个体细胞突变的癌症的受试者，所述一个或多个体细胞突变包括由T细胞识别的新表位。

36.在一种通过施用免疫检查点调节剂疗法治疗癌症的方法中，所述改进包括：

向被鉴定为患有具有一个或多个体细胞突变的癌症的受试者施用所述疗法，所述一个或多个体细胞突变包括由T细胞识别的新表位。

37.一种治疗选自由癌瘤、肉瘤、骨髓瘤、白血病或淋巴瘤组成的组的癌症的方法，所述方法包括以下步骤：

向被鉴定为患有具有一个或多个体细胞突变的癌症的受试者施用免疫检查点调节剂疗法，所述一个或多个体细胞突变包括由T细胞识别的新表位。

38.如权利要求37所述的方法，其中所述癌症为或包括黑色素瘤。

39.一种定义免疫检查点调节剂疗法的反应标记的方法，所述方法包括以下步骤：

将来自第一多个肿瘤样品的遗传序列信息与获自第二多个肿瘤样品的遗传序列信息进行比较，所述第一多个含有共享对免疫检查点调节剂疗法的共同反应特征的样品，所述第二多个含有不共享所述共同反应特征但以另外的方式与所述第一组的那些可比较的样品，这样使得所述比较定义了其存在与所述共同反应特征相关联或相关的遗传序列元件；以及

确定何种所述定义的遗传序列元件产生新表位；以及

定义为所述新表位的所述共同反应特征存在的标记。

40.如权利要求39所述的方法，其进一步包括以下步骤：

确定何种所述新表位改变肽-MHC结合强度，

其中定义为所述共同反应特征的标记的步骤包括定义为被确定为改变肽-MHC结合强度的所述新表位的至少一个的标记。

41.如权利要求40所述的方法，其中定义为所述共同反应特征的标记的步骤包括定义为被确定为改变肽-MHC结合强度的所述新表位组的标记。

42.如权利要求39-41中任一项所述的方法，其中所述新表位为或包含四聚体。

43.如权利要求42所述的方法，其中所述新表位为或包含在表1中列出的四聚体。

44.如权利要求44所述的方法，其中所述新表位组包括在表1中列出的多个新表位或由其组成。

不共享共同反应特征，分析多个肿瘤样品以使得我们使用全外显子组测序分析肿瘤和匹配血液DNA。在发现组中，我们产生6.4GB的映射序列，其中超过90％的目标序列覆盖至至少10倍深度并且平均外显子组覆盖率为103倍(图5)。样品之中的宽范围突变负担(图2A和图2B)和频发突变(图6A)与文献一致。

我们使用患者特异性HLA类型，检查了体细胞新表位子集将是否改变肽-MHC结合的强度。我们首先比较了所有突变型肽与野生型肽的总抗原性趋势。有趣的是，总的来说预测突变型肽比对应的野生型肽以更高的亲和力结合MHC I类(图10A和图10B)。