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CN106132434A - 抗‑cd19抗体和抗体‑药物偶联物的稳定制剂 - Google Patents

抗‑cd19抗体和抗体‑药物偶联物的稳定制剂 Download PDF

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CN106132434A
CN106132434A CN201580017717.XA CN201580017717A CN106132434A CN 106132434 A CN106132434 A CN 106132434A CN 201580017717 A CN201580017717 A CN 201580017717A CN 106132434 A CN106132434 A CN 106132434A
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CN
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antibody
stabilization formulations
formulations
phosphate buffer
concentration
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Application number
CN201580017717.XA
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K·安斯贝里
S·蒋
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Seagen Inc
Original Assignee
Seattle Genetics Inc
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Publication date
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Abstract

本发明涉及CD19抗体和抗体‑药物偶联物(ADC)的优化制剂。

Description

抗-CD19抗体和抗体-药物偶联物的稳定制剂
相关申请的交叉参考
本申请还要求2014年4月7日提交的美国临时专利申请号61/976,313的权益和优先权。
序列表
名称为0019-00311PC_ST25.txt的3KB的序列表于2015年4月1日生成，其通过引用纳入本文。
技术领域
本发明涉及CD19抗体和抗体-药物偶联物(ADC)的优化制剂。
发明背景
CD19是免疫球蛋白超家族成员。参见例如，Tedder和Isaacs，J Immunol，143：712-717(1989)以及Del Nagro等，Immunol Res，31：119-131(2005)。其是未知由B谱系以外的任何细胞表达的B细胞特异性标记物。CD19表达在恶性转化后维持，因此，CD19发现于大多数B-细胞白血病或非霍奇金淋巴瘤患者的恶性细胞上。参见例如，Nadler等，J Immunol，131：244-250(1983)；Anderson等，Blood，63：1424-1433(1984)；以及Scheuermann和Racila，Leuk Lymphoma，18：385-397(1995)。
SGN-CD19A是一种由三种组分组成的CD19-引导的抗体-药物偶联物(ADC)：1)人源化抗体hBU12，其特异性结合人CD19蛋白，2)微管破坏剂单甲基澳瑞他汀F(MMAF)，和3)稳定的接头，马来酰亚胺己酰基，其将MMAF共价接合至hBU12。提出的作用机理(MOA)是由SGN-CD19A结合至细胞表面上的CD19引发，之后是ADC的内化。在转运至溶酶体之后，递送的药物(cysmcMMAF)通过抗体运载体的蛋白水解降解释放。释放的药物结合至微管蛋白破坏了微管网络，导致细胞周期阻滞和凋亡。
需要能提供分子稳定性，并且因此允许药物在制备后运输和储存的SGN-CD19A制剂。本发明解决了这些和其他需求。
发明内容
本发明提供了抗-CD19抗体的稳定制剂，包含磷酸盐缓冲剂。抗-CD19抗体具有SEQID NO：1的轻链可变区和SEQ ID NO：2的重链可变区，并且磷酸盐缓冲剂具有5.0-7.0的pH值。磷酸盐缓冲剂降低了在光存在下抗体氧化的发生。在一个实施方式中，磷酸盐缓冲剂是磷酸钠缓冲剂。在另一个实施方式中，磷酸盐缓冲剂是磷酸钾缓冲剂。在优选的实施方式中，磷酸盐缓冲剂的pH为5.5-6.5。在另一个实施方式中，抗-CD19抗体制剂包含pH为约6.0的磷酸盐缓冲剂。在另一个实施方式中，制剂的磷酸盐缓冲剂的pH为6.0。
在一个实施方式中，本发明提供了在包含磷酸盐缓冲剂的稳定制剂中具有SEQ IDNO：1的轻链可变区和SEQ ID NO：2的重链可变区的抗-CD19抗体。在另一个实施方式中，抗-CD19抗体偶联至细胞毒剂。细胞毒剂可以是澳瑞他汀并且优选的澳瑞他汀是单甲基澳瑞他汀F(MMAF)。MMAF可通过马来酰亚胺己酰基(mc)接头偶联至抗体。
在一个实施方式中，本发明提供了在包含磷酸盐缓冲剂和表面活性剂的稳定制剂中具有SEQ ID NO：1的轻链可变区和SEQ ID NO：2的重链可变区的抗-CD19抗体。优选的表面活性剂是聚山梨酯80。聚山梨酯80可以0.01％至0.05％重量/体积的浓度存在。在一个实施方式中，聚山梨酯80的浓度是约0.02％。在一个优选的实施方式中，聚山梨酯80的浓度是0.02％。
在一个实施方式中，本发明提供了在包含磷酸盐缓冲剂和膨胀剂(例如糖)的稳定制剂中具有SEQ ID NO：1的轻链可变区和SEQ ID NO：2的重链可变区的抗-CD19抗体。可用的糖的示例包括蔗糖和海藻糖。在一些实施方式中，糖浓度为10mg/ml至75mg/ml。在一个实施方式中，糖是蔗糖。在另一个实施方式中，蔗糖浓度是约60mg/ml。在一个优选的实施方式中，蔗糖浓度是60mg/ml。
在一个实施方式中，本发明提供了在包含约pH 6.0的磷酸钾、约0.02％聚山梨酯80和约60mg/ml蔗糖的稳定制剂中的具有SEQ ID NO：1的轻链可变区和SEQ ID NO：2的重链可变区的抗-CD19抗体。在另一个实施方式中，抗-CD19抗体偶联至细胞毒剂。优选的细胞毒剂是药物-接头mcMMAF。抗-CD19抗体的稳定制剂可在储存之前冻干。可使用药瓶来储存稳定冻干的抗-CD19抗体制剂。然后冻干的抗-CD19抗体制剂在给予患者之前在无菌液体中重建。在其他实施方式中，冻干的制剂在25℃下稳定长达18个月。在另一个实施方式中，抗-CD19抗体的稳定制剂是液体制剂并且以液态储存。液体制剂以适合给予患者的量储存在药瓶中。在其他实施方式中，液体制剂在5℃下稳定长达18个月。
在一个实施方式中，本发明提供了在包含pH 6.0的磷酸钾、0.02％聚山梨酯80和60mg/ml蔗糖的稳定制剂中的具有SEQ ID NO：1的轻链可变区和SEQ ID NO：2的重链可变区的抗-CD19抗体。在另一个实施方式中，抗-CD19抗体偶联至细胞毒剂。优选的细胞毒剂是药物-接头mcMMAF。抗-CD19抗体的稳定制剂可在储存之前冻干。可使用药瓶来储存稳定冻干的抗-CD19抗体制剂。然后冻干的抗-CD19抗体制剂在给予患者之前在无菌液体中重建。.在其他实施方式中，冻干的制剂在25℃下稳定长达18个月。在另一个实施方式中，抗-CD19抗体的稳定制剂是液体制剂并且以液态储存。液体制剂以适合给予患者的量储存在药瓶中。在其他实施方式中，液体制剂在5℃下稳定长达18个月。
定义
在本文所述的抗体-药物偶联物制剂或分离的抗体制剂的内容中，术语“稳定化”或“稳定”是指其中的抗体或抗体-药物偶联物在储存后基本保留其物理和化学相同性和完整性。本领域中可使用多种测定蛋白稳定性的分析技术(参见例如《肽和蛋白质药物递送》(Peptide and Protein Drug Delivery)，247-301，Vincent Lee编，MC公司(MarcelDekker，Inc.)，纽约州纽约出版(1991)和Jones，A.Adv.Drug Delivery Rev.10：29-90，1993)。本文也描述了用于测定蛋白稳定性的示例性技术(参见下面的实施例)。可以在所选温度下储存所选时间，以测定稳定性。对于快速测量，该制剂可保持在较高或“加速”的温度下，例如，40℃保持1周至1个月或更长时间，其间测量稳定性。在示例性实施方式中，该制剂难以形成组分抗体蛋白的副产物，例如，高分子量聚集产物、低分子量聚集产物或片段化产物、酸性物质、化学降解产物或其混合物。术语“稳定性”是指分子物质如抗体保留其原始化学特性(例如，一级、二级和/或三级结构)的时间长度。
本文使用的短语“药学上可接受的盐”指化合物的药学上可接受的有机或无机盐。该化合物可含有至少一个氨基，并且因此可与氨基形成酸加成盐。示例性的盐包括但不限于：硫酸盐、三氟乙酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、草酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、硝酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、酸性磷酸盐、异烟酸盐、乳酸盐、水杨酸盐、酸性柠檬酸盐、酒石酸盐、油酸盐、丹宁酸盐、泛酸盐、酒石酸氢盐、抗坏血酸盐、琥珀酸盐、马来酸盐、龙胆酸盐、延胡索酸盐、葡糖酸盐、葡糖醛酸盐、糖酸盐、甲酸盐、苯甲酸盐、谷氨酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐和扑酸盐(即1，1’-亚甲基-双(2-羟基-3-萘甲酸盐))。药学上可接受的盐可以包含例如乙酸根离子、琥珀酸根离子、或其他抗衡离子的另一个分子。该抗衡离子可以是稳定母体化合物上电荷的任何有机或无机部分。另外，药学上可接受的盐可在结构中具有超过一个的带电原子。其中多个带电原子是药学上可接受的盐的一部分的示例能有多个抗衡离子。因此，药学上可接受的盐可具有一个或多个带电原子和/或一个或多个抗衡离子。
“多肽”或“多肽链”是氨基酸残基通过肽键连接而成的聚合物，可为天然或合成产生。少于约10个氨基酸残基的多肽通常称作“肽”。
“蛋白质”是包含一条或多条多肽链的大分子。蛋白还可包含非肽组分，如碳水化合物基团。碳水化合物和其它非肽取代基可由产生蛋白的细胞加入到蛋白中，其会随细胞类型而变化。本文在其氨基酸主链结构方面限定蛋白；取代基(例如碳水化合物基团)通常未指定，但是可以存在。
本文使用的术语“氨基末端”和“羧基末端”指多肽中的位置。上下文允许时，这些术语根据多肽特定序列或部分使用以表示附近或相对位点。例如，多肽中相对参照序列位于羧基末端的某些序列位于参照序列的羧基末端附近，但并不必需在完整多肽的羧基末端。
本文所用术语“抗体”指因抗原存在产生应答而由身体生产且结合该抗原的免疫球蛋白，以及其抗原结合片段和经工程改造的变体。因此，术语“抗体”包括例如包含全长免疫球蛋白重链和轻链的完整单克隆抗体(如使用杂交瘤技术产生的抗体)和结合抗原的抗体片段(如F(ab′)2和Fab片段)。还包括遗传工程改造的完整抗体和片段，如嵌合抗体、人源化抗体、单链Fv片段、单链抗体、双抗体、小抗体、线性抗体、多价或多特异性(如双特异性)杂交抗体等。因此，术语“抗体”广义地用于包括含有抗体的抗原结合位点且能够特异性结合其抗原的任何蛋白。
术语“遗传工程改造的抗体”指其中氨基酸序列不同于天然抗体的抗体。由于抗体生成中重组DNA技术的相关性，无需限制于天然抗体中发现的氨基酸的序列；可以重新设计抗体以获得所需的特性。可能的变化形式有很多且范围为从改变仅一个或一些氨基酸到完全重新设计例如可变区或恒定区。通常进行恒定区中的变化以改进或改变诸如补体固定、与细胞相互作用和其他效应功能的特性。通常，进行可变区中的变化以改进抗原结合特性、改进可变区稳定性或降低免疫原性的风险。
“抗体的抗原结合位点”是足以结合其抗原的抗体的一部分。最小的这类区域通常是可变结构域或其遗传改造的变体。单结构域结合位点可来自驼科动物抗体(参见Muyldermans和Lauwereys，J.Mol.Recog.12：131-140，1999；Nguyen等，EMBO J.19：921-930，2000)或来自其他物种的VH结构域以生成单结构域抗体(“dAb”；参见Ward等，Nature341：544-546，1989；Winter等的美国专利号6,248,516)。在某些变化形式中，抗原结合位点是具有天然或非天然(如诱变)产生的重链可变结构域或轻链可变结构域或其组合的仅2个互补决定区(CDR)的多肽区域(参见例如Pessi等，Nature 362：367-369，1993；Qiu等，Nature Biotechnol.25：921-929，2007)。更常见的，抗体的抗原结合位点包含与共同表位结合的重链可变(VH)结构域和轻链可变(VL)结构域。在本发明的上下文内，抗体除抗原结合位点外还可包含一种或多种组分，例如抗体的第二抗原结合位点(其可结合相同或不同的表位或者相同或不同的抗原)、肽接头、免疫球蛋白恒定区、免疫球蛋白铰链、两亲螺旋(参见Pack和Pluckthun，Biochem.31：1579-1584，1992)、非肽接头、寡核苷酸(参见Chaudri等，FEBS Letters 450：23-26，1999)、细胞生长抑制性药物或细胞毒性药物等，且可以是单亚基或多亚基蛋白。包含抗体的抗原结合位点的分子的示例是本领域已知的且包括例如Fv、单链Fv(scFv)、Fab、Fab′、F(ab′)2、F(ab)c、双抗体、dAbs，小抗体、纳米抗体、Fab-scFv融合体、双特异性(scFv)4-IgG和双特异性(scFv)2-Fab(参见例如Hu等，Cancer Res.56：3055-3061，1996；Atwell等，Molecular Immunology 33：1301-1312，1996；Carter和Merchant，Curr.Opin.Biotechnol.8：449-454，1997；Zuo等，Protein Engineering 13：361-367，2000；以及Lu等，J.Immunol.Methods 267：213-226，2002)。
本文所用术语“免疫球蛋白”指由一种或多种多肽组成的蛋白，所述一种或多种多肽基本由免疫球蛋白基因编码。免疫球蛋白的一种形式构成了脊椎动物中天然(即自然)抗体的基本结构单元。该形式是四聚体且由两个相同的免疫球蛋白链的对组成，各对具有一条轻链和一条重链。在各对中，轻链和重链可变区(VL和VH)共同主要负责结合抗原，且恒定区主要负责抗体效应功能。在较高等的脊椎动物中已鉴定到了五种类别的免疫球蛋白(IgG、IgA、IgM、IgD和IgE)。IgG是主要类别；其通常以血浆中发现的第二丰富蛋白的形式存在。人中，IgG由四个称为IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的亚类组成。IgG类的重链恒定区被鉴定为希腊字母γ。例如，IgG1亚类的免疫球蛋白含有γ1重链恒定区。各免疫球蛋白重链都具有由恒定区蛋白结构域(CH1、铰链、CH2和CH3；IgG3还含有CH4结构域)组成的恒定区，所述恒定区蛋白结构域对于某物种中给定的亚类而言基本不变。编码人和非人免疫球蛋白链的DNA序列为本领域熟知。(参见例如Ellison等，DNA 1：11-18，1981；Ellison等，NucleicAcids Res.10：4071-4079，1982；Kenten等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79：6661-6665，1982；Seno等，Nuc.Acids Res.11：719-726，1983；Riechmann等，Nature 332：323-327，1988；Amster等，Nuc.Acids Res.8：2055-2065，1980；Rusconi和Kohler，Nature 314：330-334，1985；Boss等，Nuc.Acids Res.12：3791-3806，1984；Bothwell等，Nature 298：380-382，1982；van der Loo等，Immunogenetics 42：333-341，1995；Karlin等，J.Mol.Evol.22：195-208，1985；Kindsvogel等，DNA 1：335-343，1982；Breiner等，Gene 18：165-174，1982；Kondo等，Eur.J.Immunol.23：245-249，1993；以及GenBank登录号J00228)。对于免疫球蛋白结构和功能的综述，参见Putnam，The Plasma Proteins(《血浆蛋白质》)，卷V，学术出版社公司(Academic Press，Inc.)，49-140，1987；以及Padlan，Mol.Immunol.31：169-217，1994。术语“免疫球蛋白”在本文中以其常用含义使用，指完整的抗体、其组成链或链的片段(取决于上下文)。
全长免疫球蛋白“轻链”(约25kDa或214个氨基酸)在氨基末端处由可变区基因编码(编码约110个氨基酸)且在羧基末端处由κ或λ恒定区基因编码。全长免疫球蛋白“重链”(约50Kd或446个氨基酸)由可变区基因(编码约116个氨基酸)和γ、μ、α、δ或ε恒定区基因(编码约330个氨基酸)编码，后者分别将抗体的同种型限定为IgG、IgM、IgA、IgD或IgE。在轻链和重链内，可变区和恒定区通过约12个或更多个氨基酸的“J”区连接，重链也包括约10个或更多个氨基酸的“D”区。(一般参见，Fundamental Immunology(《基础免疫学》)(Paul编，纽约拉文出版社，第2版，1989)第7章)。
免疫球蛋白轻链或重链可变区(在本文中也分别称为“轻链可变结构域”(“VL结构域”)或“重链可变结构域”(“VH结构域”))由被三个高变区(也称为“互补决定区”或“CDR”)间断的“框架”区组成。框架区的功能是将用于特异性结合的CDR与抗原的表位对齐。因此，术语“高变区”或“CDR”指主要负责抗原结合的抗体的氨基酸残基。从氨基末端至羧基末端，VL和VH结构域都包含以下框架区(FR)和CDR区：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。各结构域氨基酸的分配与Kabat，Sequences of Proteins of Immunological Interest(《免疫学感兴趣蛋白的序列》)(马里兰州贝塞斯达的国立卫生研究院(National Institutes ofHealth)(1987和1991))或Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196：901-917(1987)；Chothia等，Nature 342：878-883(1989)的定义一致。Kabat还提供了广泛使用的编号惯例(Kabat编号)，其中为不同重链之间或不同轻链之间相应的残基分配了相同的编号。VL结构域的CDR1、2和3在本文中还分别称作CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；VH结构域的CDR1、2和3在本文中还分别称作CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3。
除非上下文另有说明，否则本文所用术语“单克隆抗体”不限于通过杂交瘤技术产生的抗体。术语“单克隆抗体”指衍生自单个克隆，包括真核、原核或噬菌体克隆的抗体，而非其产生方法。
术语“嵌合抗体”是指具有衍生自第一物种的可变结构域和衍生自第二物种的恒定区的抗体。例如，可通过遗传工程由属于不同物种的免疫球蛋白基因片段构建嵌合免疫球蛋白或抗体。下文定义的术语“人源化抗体”并不旨在包括嵌合抗体。如本文所述，虽然人源化抗体在其构建中是嵌合的(即，包含来自超过一个物种的蛋白的区域)，但是它们包括其他未在嵌合免疫球蛋白或抗体中发现的特征(即，包括供体CDR残基和受体框架残基的可变区)。
术语人源化“VH结构域”或“人源化VL结构域”指包含完全或基本来自非人供体免疫球蛋白(如小鼠或大鼠)的一些或全部CDR和完全或基本来自人免疫球蛋白序列的可变区框架序列的免疫球蛋白VH或VL结构域。提供CDR的非人免疫球蛋白称作“供体”且提供框架区的人免疫球蛋白称作“受体”。在一些情况下，人源化抗体会保留人可变结构域框架区内的一些非人残基以增强适当的结合特性(例如，当抗体是人源化的时候，需要框架区中的突变以保留结合亲和力)。
“人源化抗体”是包含人源化VH结构域和人源化VL结构域之一或全部两个的抗体。无需存在免疫球蛋白恒定区，但如果存在，其完全或基本来自于人免疫球蛋白恒定区。
人源化抗体中CDR“基本来自”非人抗体中相应CDR的前提是至少60％、至少85％、至少90％、至少95％或100％的相应残基(由Kabat所定义)在各CDR之间相同。在其中各CDR基本都来自非人免疫球蛋白的人源化VH或VL结构域的特定变化形式中，相对于相应非人VH或VL CDR，人源化VH或VL结构域的CDR在全部三个CDR中具有不超过六个(例如不超过五个、不超过四个、不超过三个、不超过两个或不超过一个)氨基酸取代。抗体VH或VL结构域的可变区框架序列或免疫球蛋白恒定区的序列(如果存在)分别“基本来自”人VH或VL框架区序列或人恒定区的前提是至少85％、至少90％、至少95％或100％的相应残基(由Kabat所定义)是相同的。因此，可能除CDR外，人源化抗体的所有部分都全部或基本来自天然人免疫球蛋白序列的相应部分。
抗体与其目标抗原的特异性结合指亲和力为至少106、107、108、109或1010M-1。特异性结合在幅度上可检测地高于与至少一个不相关靶标之间的非特异性结合并可与之区分。特异性结合可以是特定空间拟合(如锁和钥匙类型)或特定官能团之间键形成的结果，而非特异性结合通常是范德华力的结果。然而，特异性结合并不必然表示单克隆抗体结合一个且仅结合一个靶标。
关于本文所述的蛋白，与SEQ ID NO所指定氨基酸残基对应的氨基酸残基包括这类残基的翻译后修饰。
术语“抗-CD19抗体”是指特异性结合至人CD19蛋白的抗体。在一个优选的实施方式中，抗-CD19抗体包含SEQ ID NO：1的轻链可变区的CDR和SEQ ID NO：2的重链可变区的CDR。在另一个优选的实施方式中，抗-CD19抗体包含SEQ ID NO：1的轻链可变区和SEQ IDNO：2的重链可变区。在其他优选的实施方式中，抗-CD19抗体包含人恒定区并且是IgG1抗体。
术语“副产物”包括不需要的产物，其降低或减少给定制剂中治疗性抗体-药物偶联物的比例。一般的副产物包括抗体-药物偶联物的聚集体、抗体-药物偶联物的片段(例如，由药物-接头的脱酰胺、或水解或化学降解和片段化导致的抗体蛋白的降解产生)、抗体-药物偶联物的酸性变体或其混合物。
抗体-药物偶联物(ADC)是一般通过接头与细胞毒性药物偶联的抗体。接头可包括可切割单元或者可能是不可切割的。可切割单元包括，例如含有可通过二硫交换切割的接头的二硫化物，可在酸性pH下切割的对酸不稳定接头，和可由水解酶、酯酶、肽酶和葡萄糖醛酸苷酶(例如，肽接头和葡萄糖醛酸苷接头)切割的接头。不可切割接头被认为通过蛋白水解抗体降解机制释放药物。
术语“高分子量聚集体”包括抗体-药物偶联物(ADC)的聚集体，以及包含ADC片段的聚集体(例如，由多肽的降解所产生，例如通过水解)以及包含ADC和这类片段的混合物的聚集体。可通过例如尺寸排阻色谱(SEC)确定高分子量聚集体的存在。一般地，高分子量聚集体是分子量超过治疗性单体ADC的复合物。对于其中抗体组分是由2对相同的免疫球蛋白链组成的四聚体的ADC(各对具有一条轻链和一条重链(例如，IgG同种型的))，这类聚集体超过约150kD。然而，对于其中抗体组分的分子量大于或小于一般的单特异性、四聚体抗体蛋白(由2条免疫球蛋白轻链和2条免疫球蛋白重链组成(例如，单链抗体或双特异性抗体))的ADC，这类聚集体的大小可相应变化。
术语“低分子量降解产物”包括，例如，抗体-药物偶联物(ADC)的片段，诸如由脱酰胺或水解生成的片段。可通过例如尺寸排阻色谱(SEC)确定低分子量降解产物的存在。一般而言，低分子量降解产物的分子量低于治疗性单体ADC。对于其中抗体组分是由2对相同的免疫球蛋白链组成的四聚体(各对具有一条轻链和一条重链(例如，IgG同种型的))的ADC，这类降解产物低于约150kD。然而，对于其中抗体组分的分子量大于或小于一般的单特异性、四聚体抗体蛋白(由2条免疫球蛋白轻链和2条免疫球蛋白重链组成(例如，单链抗体或双特异性抗体))的ADC，这类降解产物的大小可相应变化。
感兴趣的抗体-药物偶联物(ADC)的“酸性变体”是比ADC的实验性PI更偏酸性的ADC变体。可通过例如阳离子交换色谱或成像毛细管IEF(icIEF)确定酸性变体的存在。酸性变体的示例是脱酰胺的变体。蛋白分子的脱酰胺变体中一个或多个中性酰胺侧链被转化为具有整体酸性特征的残基(例如，原始多肽的一个或多个天冬酰胺残基被转化成天冬氨酸)。
本文使用的术语“稀释剂”是指适用于改变或达到本文所述的示例性或合适浓度的溶液。
术语“容器”是指其中可放置或包含物体或液体例如用于储存的东西(例如，盛放器、容器、器皿等)。
术语“给药途径”包括用于递送治疗性蛋白的本领域公认的给药途径，例如，胃肠外、静脉内、肌内或皮下。对于用于治疗癌症的ADC的给药，可能需要通过静脉内或皮下给药来向全身循环中给药。对于由实体瘤表征的癌症的治疗，如果需要，可直接对肿瘤进行局部给药。
术语“治疗”是指向患病的患者给予治疗剂，目的在于治愈、愈合、缓解、延缓、释放、改变、补救、减轻、改善或影响疾病。
术语“患者”包括接受预防性或治疗性治疗的人和其他哺乳动物对象。
术语“有效量”或“有效剂量”是指足以实现或至少部分实现所需效果的量，即足以抑制疾病或病症的一种或多种症状的出现或使其缓解的量。以“有效方案”给予有效量的药物组合物。术语“有效方案”指适于实现对疾病的预防性或治疗性治疗的剂量频率和给予的组合物量的组合。
本文所用的术语“剂量单位形式”(或“单位剂型”)是指对于待治疗的患者而言适合用作单一剂量的物理离散单位，各单位含有预定量的活性化合物(本发明所述的ADC)，其经计算产生与所需的药物运载体、稀释剂或赋形剂关联的所需治疗效果。本发明中剂量单位形式的规格取决于或直接依赖于活性化合物的独特特性和待实现的具体治疗效果，以及复合这种活性化合物用于治疗患者的领域中的固有限制。
可改变本发明的制剂中ADC的实际剂量水平，从而获得就具体患者、组合物与给药方式有效实现所需治疗应答且对患者无毒性的ADC的量。所选剂量水平取决于多种药代动力学因素，包括所用的本发明特定组合物的活性，给药途径，给药时间，所用特定化合物的排泄率，治疗持续时间，与所用特定组合物联用的其他药物、化合物和/或材料，所治疗病人的年龄、性别、体重、病症、整体健康状况、先前病史以及医学领域熟知的类似因素。
“细胞毒性作用”指靶标细胞的缺失、消除和/或死亡。“细胞毒剂”指对细胞有细胞毒性效果的试剂。
“细胞生长抑制作用”指细胞增殖的抑制。“细胞生长抑制剂”指对细胞具有细胞生长抑制效果，从而抑制细胞的特定子集生长和/或扩增的试剂。
如果以最大对应性进行比对时两种氨基酸序列的氨基酸残基是相同的，则这两种氨基酸序列具有“100％氨基酸序列相同性”。可使用标准软件程序(如DNASTAR公司(威斯康星州麦迪逊)生产的LASERGENE生物信息学计算套件中包括的那些)来进行序列比较。用于通过确定最佳比对来比较两种核苷酸或氨基酸序列的其他方法是本领域技术人员熟知的。(参见例如Peruski和Peruski，The Internet and the New Biology：Tools for Genomicand Molecular Research(《因特网和新生物学：用于基因组和分子研究的工具》)(ASM出版社公司，1997)；Wu等(编)，“Information Superhighway and Computer Databases ofNucleic Acids and Proteins(《核酸和蛋白质的信息超高速公路和计算机数据库》)”刊于Methods in Gene Biotechnology(《基因生物技术方法》)123-151(CRC出版社公司，1997)；Bishop(编)，Guide to Human Genome Computing(《人基因组计算指南》)(第2版，学术出版社公司，1998)。)如果两条氨基酸序列相对彼此至少80％、至少85％、至少90％或至少95％相同，则认为这两条序列具有“大体序列相同性”。
通过Kabat编号惯例对抗体序列进行最大程度的比对以确定序列相同性百分比。比对后，如果比较的是对象抗体区域(如重链或轻链的整个可变结构域)与参考抗体的相同区域，则对象和参考抗体区域之间的序列相同性百分比为对象和参考抗体区域中被相同氨基酸所占据的位置数目除以两个区域经排列位置的总数，不计算缺口，乘以100以转化为百分数。
术语“药物制剂”指此类形式的制剂：所述制剂允许其中所含活性成分的生物学活性有效(当给予对象时)，并且不含对于待给予该制剂的对象而言具有不可接受毒性的额外成分。这类制剂是无菌的。
“包含”一种或多种所列元素的组合物或方法可包含未特别列出的其他元素。
本文中涉及数值范围(例如，“X至Y”或“从X至Y”)包括限定范围的端点和落入该范围的所有值。
本文所用术语“约”表示具体值加减10％的大致范围。例如，表述“约20％”包括18-22％的范围。本文所用的约也包括准确量。因此“约20％”表示“约20％”和“20％”。
附图的简要说明
图1A提供了对多个pH值下各种缓冲剂中人源化的抗-CD19抗体hBU12的稳定性的评价。
图1B提供了对多个pH值下各种缓冲剂中偶联至MMAF的人源化的抗-CD19抗体hBU12，SGN-CD19A的稳定性的评价。
图2提供了pH对偶联至MMAF的人源化抗-CD19抗体hBU12，SGN-CD19A的化学稳定性影响的评价。
图3A证明了冻/融对不含聚山梨酯80的hBU12制剂中在显微镜下才能看到的颗粒的影响(0和1次冻/融循环)。
图3B证明了冻融对不含聚山梨酯80的hBU12制剂中在显微镜下才能看到的颗粒的影响(2和3次冻/融循环)。
图4证明了冻融对含0.01％聚山梨酯80的hBU12制剂中在显微镜下才能看到的颗粒的影响(0、1、2和3次冻/融循环)。
图5证明了冻融对含0.02％聚山梨酯80的hBU12制剂中在显微镜下才能看到的颗粒的影响(0、1、2和3次冻/融循环)。
图6证明了冻融对含0.03％聚山梨酯80的hBU12制剂中在显微镜下才能看到的颗粒的影响(0、1、2和3次冻/融循环)。
图7总结了2种糖，蔗糖和海藻糖对CD19 ADC冻干制剂的稳定性的影响的数据。
图8提供了包含mcMMAF药物接头和人源化抗体hBU12的CD19抗体药物偶联物(ADC)SGN-CD19A的结构。
发明详述
本发明提供了抗-CD19抗体的稳定制剂和包含抗-CD19抗体的ADC的稳定制剂。制剂包含磷酸盐缓冲剂、糖和聚山梨酯80。制剂在液体和冻干实施方式中向抗-CD19抗体和包含抗-CD19抗体的ADC提供了稳定性。
在优选的实施方式中，本发明提供了人源化的抗-CD19抗体hBU12的稳定制剂，如下所述。虽然使用hBU12抗体，已经发现hBU12抗体在光存在下意外地不稳定并氧化。在光存在下孵育抗体之后检测到氧化的杂质。已经测试了许多制剂在光存在下改善抗体稳定性并降低氧化的杂质的量的能力。然而，氧化的杂质的最大减少来自在制剂中使用磷酸盐缓冲剂。在未偶联的hBU12抗体，以及与细胞毒剂，例如mcMMAF偶联的hBU12抗体的制剂中看到与光相关的氧化减少。
还公开了可改善抗体或抗体药物偶联物稳定性的hBU12制剂的其他方面。优化的方面包括，例如，缓冲剂pH，添加糖，和添加表面活性剂。
抗-CD19抗体，ADC，和制剂
本发明的药物制剂包含人源化抗体，或抗体药物偶联物，其特异性结合至人CD19蛋白。本文所用术语“CD19”表示人CD19蛋白，或分化19蛋白的簇。人CD19的氨基酸序列是已知的并且公开于，例如，NCBI参考序列：NP_001171569.1。CD19蛋白是B-细胞发育的标记物并且在B细胞发育的许多阶段中在B细胞上表达。
在优选的实施方式中，本发明的制剂是SGN-19A治疗剂的稳定制剂。通过将药物-接头中间体马来酰亚胺己酰基单甲基澳瑞他汀F(MMAF)偶联至人源化抗体hBU12来产生SGN-CD19A(图8)。接合点是通过还原链间二硫键产生的半胱氨酸。SGN-CD19A具有平均四个药物/抗体分子。
在例如美国专利号7,968,687中公开了制备hBU12抗体的方法。hBU12的轻链可变区的氨基酸序列在本文中以SEQ ID NO：1提供。hBU12的重链可变区的氨基酸序列在本文中以SEQ ID NO：2提供。hBU12是IgG1抗体并且可变区连接至人重链和轻链恒定区。美国专利号7,968,687也提供了合成mcMMAF及将其偶联至hBU12的方法。
因此，SGN-CD19A是将mcMMAF递送至CD19-阳性细胞的抗体-药物偶联物(ADC)。mcMMAF是微管蛋白-结合分子。SGN-CD19A具有提出的多步作用机制，其由结合至细胞表面上的靶标和随后的内化引发。在细胞表面结合、内化、和SGN-CD19A通过内吞作用通路转运之后，溶酶体中hBU12的蛋白水解降解以cys-mcMMAF的形式释放药物接头的半胱氨酸加合物，其然后变得可被微管蛋白结合。参见例如，Doronina等，Nat Biotechnol 21：778-84(2003)和Doronina等，Bioconjug Chem 17：114-24(2006)。cys-mcMMAF和mcMMAF在本文中互换使用。释放的药物与微管蛋白的结合破坏了细胞微管网络，导致G2/M期细胞周期阻滞和随后在靶细胞中发生凋亡。
SGN-CD19A的抗体组分可在光存在下降解。本文公开的制剂提供了SGN-CD19A的改善稳定性。此外，本文公开的制剂允许根据使用者的需要选择液体或冻干制剂。
一般制剂和赋形剂
赋形剂是赋予或增强药物产物(例如，抗体或ADC)的稳定性和递送的添加剂。无论其包含的原因，赋形剂是制剂的内部组分并且因此需要是安全的并且被患者良好耐受。对于蛋白药物，赋形剂的选择是特别重要的，因为它们可同时影响药物的功效和免疫原性。因此，蛋白质制剂需要与产生合适稳定性、安全性和适销性的适当选择赋形剂一起开发。
开发蛋白质制剂的主要挑战在于使产品针对制造、运输和储存应激稳定。制剂赋形剂的作用是提供针对这些应激的稳定化。也采用赋形剂来降低高浓度蛋白质制剂的粘度以使其能够被递送并增强患者便利性。一般而言，赋形剂可基于其使蛋白质针对各种化学和物理应激稳定化的机制分类。使用一些赋形剂来缓解特定应激的影响或者调节特定蛋白的具体易感性。其他赋形剂对蛋白质的物理和共价稳定性有一般性影响。本文所述的赋形剂通过其化学类型或其在制剂中的功能作用进行组织。当讨论各种赋形剂类型时，提供了对稳定化模式的简单说明。
考虑到本文提供的启示和指导，本领域技术人员将知晓那些量或范围的赋形剂可包含在任何特定制剂中以显示本发明的生物药物制剂，其促进了抗体或ADC的稳定性保留。例如，可基于最终溶液所需的渗透压(即，等渗、低渗或高渗)以及待包含在制剂中的其他组分的量和渗透压来选择待在本发明的生物药物制剂中包含的盐的量和类型。
此外，在以分子浓度报告特定赋形剂的情况中，本领域技术人员将认识到还考虑溶液的等效百分比(％)w/v(例如，(溶液样品中物质克数/mL溶液)X 100％)。
药物活性蛋白质制剂的稳定性通常观察到在狭窄的pH范围内最大。最优稳定性的pH范围需要在配制前研究的早期鉴定。多种方法，如加速稳定性研究和比色筛选研究可用于这种努力。参见例如，Remmele R.L.Jr.等，Biochemistry，38(16)：5241-7(1999)。一旦制剂完成，蛋白质必须在其保质期中生产并保持。因此，几乎总是采用缓冲剂来控制制剂的pH。如上所述，与其他缓冲剂相比，hBU12抗体在磷酸盐缓冲剂存在下显示出改善的光稳定性。研究了对稳定性而言最优的pH值并且发现在5.5-6.5的pH值之间的范围内。在优选的实施方式中，pH值是约6.0。在其他实施方式中，pH值是6.0。
磷酸盐缓冲化合物可以任意合适的量存在以将制剂的pH维持在预定水平上。在一个实施方式中，pH缓冲浓度为0.1mM至500mM(1M)。例如，考虑磷酸盐缓冲剂为至少0.1、0.5、0.7、0.80.9、1.0、1.2、1.5、1.7、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、200、或500mM。
在本发明的药物制剂的一个方面中，加入稳定剂(或稳定剂组合)以防止或减少储存诱导的聚集和化学降解。重建有模糊或混浊的溶液表示蛋白质已经沉淀或者至少聚集。术语“稳定剂“表示能够在水性状态下防止聚集或物理降解，包括化学降解(例如，自溶、脱酰胺、氧化等)的赋形剂。考虑的稳定剂包括但不限于，蔗糖、海藻糖、甘露糖、麦芽糖、乳糖、葡萄糖、棉子糖、纤维二糖、龙胆二糖、异麦芽糖、阿拉伯糖、葡糖胺、果糖、甘露醇、山梨醇、甘氨酸、精氨酸HCL、多羟基化合物包括多糖如葡聚糖、淀粉、羟乙基淀粉、环糊精、N-甲基吡咯烷酮、纤维素和透明质酸、氯化钠。参见例如，Carpenter等，Develop.Biol.Standard 74：225，(1991)。在本发明的制剂中，稳定剂以约0.1、0.5、0.7、0.8、0.9、1.0、1.2、1.5、1.7、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100、或200mg/ml的浓度纳入。在本发明的某些实施方式中，蔗糖和海藻糖用作稳定剂。
如果需要，制剂还包括合适量的填充剂和渗透调节剂。填充剂包括，例如且不限于，甘露醇、甘氨酸、蔗糖、聚合物如葡聚糖、聚乙烯基吡咯烷酮、羧甲基纤维素、乳糖、山梨醇、海藻糖或木糖醇。在一个实施方式中，填充剂是蔗糖。填充剂以约0.1、0.5、0.7、0.8、0.9、1.0、1.2、1.5、1.7、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100、或200mg/ml的浓度纳入。
蛋白质制剂中常用表面活性剂来防止表面诱导的降解。表面活性剂是两亲性分子，其具有与蛋白质竞争界面位置的能力。表面活性剂的疏水性部分占据了界面位置(例如，空气/液体)，同时分子的亲水性部分仍然朝向主体溶剂。在充足的浓度下(一般在洗涤剂的临界胶束浓度左右)，表面活性剂分子的表面层用于防止蛋白质分子在界面处吸附。由此，表面诱导的降解最小化。本文中考虑的表面活性剂包括，但不限于，聚乙氧基化去水山梨糖醇的脂肪酸酯，即，聚山梨酯20和聚山梨酯80。两者的差别仅在于赋予分子疏水性特性的脂肪链的长度，分别是C-12和C-18。因此，聚山梨酯-80是比聚山梨酯-20更有表面活性并且有较低的临界胶束浓度。
在本发明的制剂中，表面活性剂以约0.01至约0.5g/L的浓度纳入。在提供的制剂中，表面活性剂的浓度是0.005、0.01、0.02、0.03、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1.0g/L(也称为％重量/体积)。优选的表面活性剂是聚山梨酯-80。
示例性制剂
本文所述的抗体和ADC制剂适用于液体和冻干制剂。即，例如，SGN-CD19A的抗体和ADC制剂可以公开的浓度制备并且以液体制剂储存直至给予患者。或者，可以公开的浓度制备例如SGN-CD19A的液体制剂，然后以此冻干并储存，直至重建并给予患者。
在某些实施方式中，稳定制剂包含浓度为5至25mg/ml的抗-CD19抗体。在其他实施方式中，包含10至20mg/ml的抗-CD19抗体。在其他实施方式中，包含浓度为12.5至17.5mg/ml的抗-CD19抗体。在其他实施方式中，包含浓度为14至16mg/ml的抗-CD19抗体。在其他实施方式中，包含浓度为约15mg/ml的抗-CD19抗体。在其他实施方式中，包含浓度为15mg/ml的抗-CD19抗体。
在某些实施方式中，稳定制剂包含浓度为5至25mg/ml的与细胞毒剂偶联的抗-CD19抗体。在其他实施方式中，包含10至20mg/ml的与细胞毒剂偶联的抗-CD19抗体。在其他实施方式中，包含浓度为12.5至17.5mg/ml的与细胞毒剂偶联的抗-CD19抗体。在其他实施方式中，包含浓度为14至16mg/ml的与细胞毒剂偶联的抗-CD19抗体。在其他实施方式中，包含浓度为约15mg/ml的与细胞毒剂偶联的抗-CD19抗体。在其他实施方式中，包含浓度为15mg/ml的与细胞毒剂偶联的抗-CD19抗体。
在某些实施方式中，稳定制剂包含浓度为5至25mg/ml的与澳瑞他汀偶联的抗-CD19抗体。在其他实施方式中，包含10至20mg/ml的与澳瑞他汀偶联的抗-CD19抗体。在其他实施方式中，包含浓度为12.5至17.5mg/ml的与澳瑞他汀偶联的抗-CD19抗体。在其他实施方式中，包含浓度为14至16mg/ml的与澳瑞他汀偶联的抗-CD19抗体。在其他实施方式中，包含浓度为约15mg/ml的与澳瑞他汀偶联的抗-CD19抗体。在其他实施方式中，包含浓度为15mg/ml的与澳瑞他汀偶联的抗-CD19抗体。
在某些实施方式中，稳定制剂包含浓度为5至25mg/ml的与MMAF偶联的抗-CD19抗体。在其他实施方式中，包含10至20mg/ml的与MMAF偶联的抗-CD19抗体。在其他实施方式中，包含浓度为12.5至17.5mg/ml的与MMAF偶联的抗-CD19抗体。在其他实施方式中，包含浓度为14至16mg/ml的与MMAF偶联的抗-CD19抗体。在其他实施方式中，包含浓度为约15mg/ml的与MMAF偶联的抗-CD19抗体。在其他实施方式中，包含浓度为15mg/ml的与MMAF偶联的抗-CD19抗体。
在某些实施方式中，稳定制剂包含浓度为5至25mg/ml的与MMAF偶联的含有SEQ IDNO：1的轻链可变区和SEQ ID NO：2的重链可变区的抗-CD19抗体。在其他实施方式中，包含10至20mg/ml的与MMAF偶联的含有SEQ ID NO：1的轻链可变区和SEQ ID NO：2的重链可变区的抗-CD19抗体。在其他实施方式中，包含浓度为12.5至17.5mg/ml的与MMAF偶联的含有SEQID NO：1的轻链可变区和SEQ ID NO：2的重链可变区的抗-CD19抗体。在其他实施方式中，包含浓度为14至16mg/ml的与MMAF偶联的含有SEQ ID NO：1的轻链可变区和SEQ ID NO：2的重链可变区的抗-CD19抗体。在其他实施方式中，包含浓度为约15mg/ml的与MMAF偶联的含有SEQ ID NO：1的轻链可变区和SEQ ID NO：2的重链可变区的抗-CD19抗体。在其他实施方式中，包含浓度为15mg/ml的与MMAF偶联的含有SEQ ID NO：1的轻链可变区和SEQ ID NO：2的重链可变区的抗-CD19抗体。
在某些实施方式中，稳定制剂包含pH值为5.0至7.0的磷酸盐缓冲剂。在其他实施方式中，稳定制剂包含pH值为5.5至6.5的磷酸盐缓冲剂。在其他实施方式中，稳定制剂包含pH值为5.8至6.2的磷酸盐缓冲剂。在其他实施方式中，稳定制剂包含pH值为5.9至6.1的磷酸盐缓冲剂。在其他实施方式中，稳定制剂包含pH值为约6.0的磷酸盐缓冲剂。在其他实施方式中，稳定制剂包含pH值为6.0的磷酸盐缓冲剂。
在某些实施方式中，稳定制剂包含0.0％至1％(W/V)聚山梨酯80。在其他实施方式中，稳定制剂包含0.05％至0.5％(W/V)聚山梨酯80。在其他实施方式中，稳定制剂包含0.1％至0.3％(W/V)聚山梨酯80。在其他实施方式中，稳定制剂包含约0.2％(W/V)聚山梨酯80。在其他实施方式中，稳定制剂包含0.2％(W/V)聚山梨酯80。
在某些实施方式中，稳定制剂包含20至100mg/ml蔗糖。在其他实施方式中，稳定制剂包含30至90mg/ml蔗糖。在其他实施方式中，稳定制剂包含40至80mg/ml蔗糖。在其他实施方式中，稳定制剂包含50至70mg/ml蔗糖。在其他实施方式中，稳定制剂包含55至65mg/ml蔗糖。在其他实施方式中，稳定制剂包含约60mg/ml蔗糖。在其他实施方式中，稳定制剂包含60mg/ml蔗糖。
在一个实施方式中，稳定制剂在10mM磷酸钾，pH约6.0，和约0.02％w/v聚山梨酯80，和约60mg/ml蔗糖中包含浓度为约15mg/ml的抗-CD19抗体。
在另一个实施方式中，稳定制剂在10mM磷酸钾，pH为6.0，和0.02％w/v聚山梨酯80，和60mg/ml蔗糖中包含浓度为15mg/ml的抗-CD19抗体。
在一个实施方式中，稳定制剂在10mM磷酸钾，pH约6.0，和约0.02％w/v聚山梨酯80，和约60mg/ml蔗糖中包含浓度为约15mg/ml的偶联至细胞毒剂的抗-CDl9抗体。
在另一个实施方式中，稳定制剂在10mM磷酸钾，pH为6.0，和0.02％w/v聚山梨酯80，和60mg/ml蔗糖中包含浓度为15mg/ml的偶联至细胞毒剂的抗-CD19抗体。
在一个实施方式中，稳定制剂在10mM磷酸钾，pH约6.0，和约0.02％w/v聚山梨酯80，和约60mg/ml蔗糖中包含浓度为约15mg/ml的偶联至澳瑞他汀的抗-CD19抗体。
在另一个实施方式中，稳定制剂在10mM磷酸钾，pH为6.0，和0.02％w/v聚山梨酯80，和60mg/ml蔗糖中包含浓度为15mg/ml的偶联至澳瑞他汀的抗-CD19抗体。
在一个实施方式中，稳定制剂在10mM磷酸钾，pH约6.0，和约0.02％w/v聚山梨酯80，和约60mg/ml蔗糖中包含浓度为约15mg/ml的偶联至mcMMAF的抗-CD19抗体。
在另一个实施方式中，稳定制剂在10mM磷酸钾，pH为6.0，和0.02％w/v聚山梨酯80，和60mg/ml蔗糖中包含浓度为15mg/ml的偶联至mcMMAF的抗-CD19抗体。
在一个实施方式中，稳定制剂在10mM磷酸钾，pH为约6.0，和约0.02％w/v聚山梨酯80，和约60mg/ml蔗糖中包含浓度为约15mg/ml的偶联至mcMMAF的抗-CD19抗体，该抗-CD19抗体包含SEQ ID NO：1的轻链可变区和SEQ ID NO：2的重链可变区。
在另一个实施方式中，稳定制剂在10mM磷酸钾，pH为6.0，和0.02％w/v聚山梨酯80，和60mg/ml蔗糖中包含浓度为15mg/ml的偶联至mcMMAF的抗-CD19抗体，该抗-CD19抗体包含SEQ ID NO：1的轻链可变区和SEQ ID NO：2的重链可变区。
制备方法
可以液体或冻干制备物制备CD19抗体或ADC的稳定制剂。如本文所述，该制剂的液体和冻干版本随着时间是稳定的。一旦制备液体制剂，其可在之前储存。优选地，液体版本的储存将发生在4℃或约4℃下。
对于稳定制剂的冻干版本，使用本领域常用技术来进行冻干。参见例如，Tang等，Pharm Res.21：191-200，(2004)和Chang等，Pharm Res.13：243-9(1996)。在一个方面中，冻干循环由三个步骤组成：冷冻、初步干燥和二次干燥。参见例如，A.P.Mackenzie，PhilTrans R Soc London，Ser B，Biol 278：167(1977)。在冷冻步骤中，冷却溶液以引发冰形成。此外，该步骤诱导填充剂结晶。冰在初步干燥阶段中升华，其通过将室压力降低至冰的蒸气压以下，使用真空并传热来促进升华来进行。最后，吸收或结合的水在降低的室压和升高的搁板温度下在二次干燥阶段中被去除。该过程产生称为冻干饼的物质。此后，该饼可用无菌水或合适的注射用稀释剂重建。
冻干物质的标准重建实施是加回一定体积的纯水或无菌注射用水(WFI)(一般等于在冻干期间去除的体积)，虽然抗菌剂的稀释溶液有时用于生产用于胃肠外给药的药物。参见例如，Chen，Drug Development and Industrial Pharmacy，18：1311-1354(1992)。因此，提供了制备重建的稳定制剂的方法，包括向冻干的CD19 ADC制剂加入稀释剂的步骤。
冻干的物质可以水溶液重建。多种水性运载体，例如，无菌注射用水，或含合适量表面活性剂的水(例如，含有活性化合物与适于制备水性悬浮液的赋形剂的水性悬浮液)。
本文所述的稳定CD19 ADC制剂给予需要治疗的患者，例如，患有表达胞外CD19的癌症例如非霍奇金淋巴瘤或急性淋巴细胞性白血病的患者，或者患有响应CD19 ADC治疗的自身免疫疾病的患者。一般而言，静脉内给予液体或重建的冻干制剂的CD19制剂。
用由主治医师选择的剂量水平和模式进行组合物的单次或多次给药。对于预防或治疗疾病，合适剂量将取决于待治疗的疾病类型，如上所述，疾病的严重程度和疾病病程、该药物是否给予用于预防性或治疗性目的、先前治疗、患者的临床史和对所述药物的响应，以及主治医师的判断。
另一个方面，本发明包括包含一种或多种以便于它们向对象给药的方式包装的液体或冻干组合物的试剂盒。在一个实施方式中，这样的试剂盒包含本文所述的稳定药物制剂(例如，包含CD19 ADC的组合物，如SGN-CD19A)，其包装在容器如密封瓶或器皿中，容器上固定或包装中包含描述化合物或组合物在实施方法中的用途的标签。在一个实施方式中，将药物制剂包装在容器中，使得容器中顶部空间的量(例如，液体制剂和容器顶部之间空气的量)非常小。优选地，顶部空间的量是可忽略的(即，几乎没有)。在一个实施方式汇总，试剂盒含有具有冻干的稳定CD19 ADC制剂，如SGN-CD19A的第一容器，和具有对于组合物生理上可接受的重建溶液的第二容器。在一个方面中，药物制剂以单位剂型包装。该试剂盒还可包含适用于以特定给药途径给予该药物组合物的装置。优选地，该试剂盒含有描述药物制剂用途的标签。
以下实施例并不旨在显示，而仅仅是本发明的具体实施方式的示例。
实施例
提供以下实施例用于说明而非限制本发明所要求的权利。
实施例1：抗体光稳定性的优化
观察到抗体hBU12在光存在下不稳定。制剂研究表明，缓冲剂组合物可能影响hBU12的光氧化程度。在强光下测试了以下缓冲剂对hBU12的光稳定性的影响：10mM磷酸钠，pH 6.5；10mM柠檬酸盐，pH 6.5；和10mM组氨酸，pH 6.5。各制剂具有约7mg/mL的hBU12浓度。样品保持在光室中并且在24小时期间接触强光。hBU12的光氧化导致氧化的Fab增加。表1的数据显示各制剂在一段时间和光暴露期间的氧化Fab。数据表明，磷酸钠制剂与柠檬酸盐和组氨酸缓冲剂相比显示出优越的稳定性。
表1：在强光下，缓冲剂对抗体光稳定性的影响。
下一个研究研究了强光和环境光暴露对另一组制剂的影响。测试了以下缓冲剂对hBU12光稳定性的影响：10mM组氨酸，pH 6.0；10mM磷酸钾，pH 6.0；10mM乙酸盐，pH 6.0；和10mM琥珀酸盐，pH 6.0。各制剂中hBU12的浓度约为4mg/mL。
结果示于表2和3。当在强光中测试时，在pH 6.0的磷酸盐缓冲剂中配制的hBU12抗体比在组氨酸、乙酸盐或琥珀酸盐缓冲剂中配制的相同抗体的光稳定性更强。参见例如，表2。表3提供了环境光中的结果。同样，当在pH 6.0的磷酸盐缓冲剂中配制的hBU12抗体比在组氨酸、乙酸盐或琥珀酸盐缓冲剂中配制的相同抗体的光稳定性更强。
表2：在强光下，缓冲剂对抗体光稳定性的影响。
表3：在环境光下，缓冲剂对抗体光稳定性的影响。
对两种hBU12抗体制剂进行另一项光稳定性研究。对于该研究，在约6mg/mL的hBU12浓度下，在10mM组氨酸，pH 6.0中配制的hBU12抗体的光稳定性与10mM磷酸钾，pH 6.0比较。制剂经受强光并且氧化结果示于表4。
表4中所示的结果显示，在pH 6.0的磷酸钾缓冲剂中配制的hBU12抗体比在组氨酸缓冲剂中配制的相同抗体的光稳定性更好。
表4：强光中磷酸钾和组氨酸制剂的光稳定性
使用马来酰亚胺己酰基(me)接头将hBU12抗体偶联至澳瑞他汀单甲基澳瑞他汀F(MMAF)。mc-MMAF药物接头的结果，其制备方法，和将药物接头偶联至hBU12抗体的方法描述于，例如，McDonagh等，WO2009/052431。
在环境光暴露下研究缓冲剂类型和pH对hBU12 mAb光稳定性的影响。在pH 5.0(H5)、pH 6.0(H6)、和pH 7.0(H7)的10mM组氨酸缓冲剂，以及pH 6.0(P6)和pH 7.0(P7)的10mM磷酸钾缓冲剂中制备制剂。在环境光暴露的0、3和7天时测量hBU12抗体的光稳定性。单克隆抗体结果见图1A。如预期那样，单克隆抗体在pH 6.0(P6)的磷酸盐缓冲剂中最稳定。
磷酸盐缓冲剂也可在光存在下使hBU12 ADC稳定化。用范围为5.0至7.0的pH值下的磷酸盐和组氨酸缓冲剂进行评价。在pH 5.0(H5)、pH 6.0(H6)、和pH 7.0(H7)的10mM组氨酸缓冲剂，以及pH 6.0(P6)和pH 7.0(P7)的10mM磷酸钾缓冲剂中制备制剂。在环境光暴露的0和7天时测量包含hBU12和MMAF的CD19-ADC的光稳定性。如上所述，通过测量各种条件下产生的氧化的Fab或ADC的量来评价光稳定性。图1B显示包含hBU12和MMAF的CD19 ADC在pH6.0的磷酸盐缓冲剂(P6)中光稳定性最好。
确定了pH对包含hBU12和MMAF的CD19 ADC的化学稳定性的影响。图2提供结果。在pH 5、6和7下配制CD19 ADC并且在14天的40℃储存期间测试这些制剂。最明显的分子变化是形成高分子量(HMW)物质、低分子量物质(LMW)、酸性变体(AV)和碱性变体(BV)。图2显示了在40℃下14天后各降解物质与初始的变化百分比。图2显示一些降解物在高pH下增加更快，而其他在低pH下增加更快。总之，包含hBU12和MMAF的CD19 ADC在pH 6.0时最稳定。
实施例2：液体和冻干制剂的开发
研究了聚山梨酯80对hBU12制剂的物理稳定性的影响。图3-6显示了加入聚山梨酯80改善了hBU12在冻/融应激期间的物理稳定性。图3A和3B表明在没有聚山梨酯80的情况中，在冻/融期间，那些在显微镜下才能看到的颗粒的尺寸和数量在hBU12制剂中显著增加。图4-6显示以0.01％、0.02％和0.03％的水平加入聚山梨酯80显著降低了在相同的冻/融应激条件下形成的在显微镜下才能看到的颗粒的量。
评价了糖对包含hBU12和MMAF的CD19 ADC的冻干制剂稳定性的影响。图7总结了2种糖，蔗糖和海藻糖对CD19 ADC冻干制剂的稳定性的影响的数据。数据表明两种糖均赋予CD19 ADC稳定性。较高水平的两种糖均赋予较大的稳定性，并且在相同水平下，蔗糖比海藻糖更有效。
表5和6证明在应激条件，即54℃下，在两周时间期间蔗糖对包含hBU12和MMAF的CD19 ADC的冻干制剂中聚集体和片段形成的影响。在存在60mg/ml(6％w/v)蔗糖的情况下，在两周后看到最低水平的聚集体和片段(最大稳定性)。
表5：蔗糖对冻干稳定性的影响-聚集体测量
表6：蔗糖对冻干稳定性的影响-片段测量
基于开发研究的结果，选择10mM磷酸盐，6％w/v蔗糖，0.02％w/v聚山梨酯80中15mg/mL的CD19A ADC的配制溶液用于进一步开发。已经在液体和冻干状态下检验了该制剂的稳定性。对于液体药物产品，将配制的溶液直接装入瓶中并以液体长期储存。对于冻干药物产品，将配制的溶液直接装入瓶中并以冻干产生固体产品用于长期储存。
如表7所示，液体药物产品的长期稳定性是出色的。液体药物产品的大部分产品质量属性在5℃下储存18或36个月之后并不显著变化。具体地，ADC的生物试验和药物分布没有变化。稍有变化的属性是高分子量(HMW)物质、低分子量(LMW)物质和酸性变体(AV)。表7中总结了2个液体药物产品批次在5℃下储存18个月之后这些属性相对初始的变化，以及药物批次DEVGLY-1储存36个月之后的结果。
表7.5℃下储存18个月之后液体药物产品的HMW、LMW和AV变化
如表8所示，冻干药物产品的长期稳定性是出色的。冻干药物产品的大部分产品质量属性在25℃下储存18、30或36个月以及在40℃下储存12个月之后没有显著变化。具体地，ADC的生物试验和药物产品分布没有变化。40℃下的应激储存显示在一些产品属性上的轻微变化，包括高分子量(HMW)物质、低分子量(LMW)物质和碱性变体(BV)。在25℃下的长期储存下，HMW有轻微变化并且没有其他变化。在25℃下储存18、30或36个月和40℃下储存12个月之后这些属性相对于初始的变化总结于表8。
表8.在25℃下储存18、30或36个月和40℃下储存12个月之后冻干药物产品的HMW、LMW和BV变化
应理解，本文所述的实施例和实施方式仅用于说明目的，本领域技术人员应了解据此作出的各种修饰或改变，且它们包括在本申请的主旨和权益以及所附权利要求书的范围内。本文引用的所有发表物、专利和专利申请通过引用全文纳入本文以用于所有目的。
非正式序列表
hBU12轻链可变区
SEQ ID NO：1
eivltqspatlslspgeratlscsasssvsymhwyqqkpgqaprlliydtsklasgiparfsgsgsgtdftltisslepedvavyycfqgsvypftfgqgtkleikr
hBU12重链可变区
SEQ ID NO：2
qvqlqesgpglvkpsqtlsltctvsggsistsgmgvgwirqhpgkglewighiwwdddkrynpalksrvtisvdtsknqfslklssvtaadtavyycarmelwsyyfdywgqgtlvtvss

Claims (24)

1.一种包含磷酸盐缓冲剂的抗-CD19抗体的稳定制剂，其特征在于，所述抗-CD19抗体包含SEQ ID NO：1的轻链可变区和SEQ ID NO：2的重链可变区，其中所述磷酸盐缓冲剂的pH值为5.0至7.0。
2.如权利要求1所述的稳定制剂，其特征在于，所述磷酸盐缓冲剂是磷酸钠缓冲剂。
3.如权利要求1所述的稳定制剂，其特征在于，所述磷酸盐缓冲剂是磷酸钾缓冲剂。
4.如权利要求1所述的稳定制剂，其特征在于，所述磷酸盐缓冲剂的pH为5.5至6.5。
5.如权利要求1所述的稳定制剂，其特征在于，所述磷酸盐缓冲剂的pH为约6.0。
6.如权利要求1所述的稳定制剂，其特征在于，所述抗-CD19抗体偶联至细胞毒剂。
7.如权利要求6所述的稳定制剂，其特征在于，所述细胞毒剂是澳瑞他汀。
8.如权利要求7所述的稳定制剂，其特征在于，所述细胞毒剂是单甲基澳瑞他汀F(MMAF)。
9.如权利要求1所述的稳定制剂，还包含表面活性剂。
10.如权利要求6-8所述的稳定制剂，还包含表面活性剂。
11.如权利要求10所述的稳定制剂，其特征在于，所述表面活性剂是聚山梨酯80。
12.如权利要求11所述的稳定制剂，其特征在于，聚山梨酯80的浓度为0.01％重量/体积至0.05％重量/体积。
13.如权利要求12所述的稳定制剂，其特征在于，聚山梨酯80的浓度为约0.02％。
14.如权利要求10所述的稳定制剂，其特征在于，还包含填充剂。
15.如权利要求14所述的稳定制剂，其特征在于，所述填充剂是糖。
16.如权利要求15所述的稳定制剂，其特征在于，所述填充剂选自蔗糖和海藻糖。
17.如权利要求15所述的稳定制剂，其特征在于，糖浓度为10mg/ml至75mg/ml。
18.如权利要求16所述的稳定制剂，其特征在于，所述糖是蔗糖。
19.如权利要求18所述的稳定制剂，其特征在于，蔗糖浓度为约60mg/ml。
20.如权利要求8所述的稳定制剂，其特征在于，所述磷酸盐缓冲剂是pH为约6.0的磷酸钾缓冲剂；
所述稳定制剂还包含浓度为约0.02％的聚山梨酯80和约60mg/ml的蔗糖。
21.一种通过冻干权利要求20所述的制剂制备的稳定的冻干抗-CD19抗体制剂。
22.一种包含某一量的权利要求21所述的稳定的冻干抗-CD19抗体制剂的药瓶，所述量用于给予对此制剂有需求的患者。
23.一种稳定的液体的权利要求20所述的抗-CD19抗体制剂。
24.一种包含某一量的权利要求23所述的稳定的液体抗-CD19抗体制剂的药瓶，所述量用于给予对此制剂有需求的患者。
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