CN106139137A

CN106139137A - 一种疫苗组合物及其应用

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Publication number: CN106139137A
Application number: CN201510145428.XA
Authority: CN
Inventors: 张许科; 孙进忠; 廖永洪; 王莹; 田克恭
Original assignee: Pulaike Biological Engineering Co Ltd
Current assignee: Pulaike Biological Engineering Co Ltd
Priority date: 2015-03-30
Filing date: 2015-03-30
Publication date: 2016-11-23

Abstract

本发明提供了一种猪支原体肺炎疫苗组合物，所述疫苗组合物包括猪肺炎支原体全菌抗原和免疫原性蛋白，还包括兽医学上可接受的载体，其中免疫原性蛋白包括XylF、P78蛋白中的至少一种。本发明还公开了含所述疫苗组合物在制备预防和/或治疗猪支原体肺炎的药物中的应用。所述疫苗组合物比单独使用全菌疫苗或亚单位疫苗免疫时，全菌抗原或免疫原性蛋白的含量明显降低，且免疫效果增强；其中的蛋白部分可通过基因工程手段进行大量重组表达，不仅耗时短，还可便于大规模生产。另，所述疫苗组合物免疫动物时对其所含的猪肺炎支原体抗原对其它抗原的免疫效果无影响。

Description

一种疫苗组合物及其应用

技术领域

本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及猪支原体肺炎疫苗组合物及其应用。

背景技术

猪支原体肺炎(Mycoplasmal pneumonia of swine,MPS)又称猪喘气病或猪地方性流行性肺炎(李彦明,张映.猪肺炎支原体生物学研究进展,动物医学进展,2003,24(3):25-27)，是由猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp)所引起的一种猪接触性慢性呼吸道疾病，分布十分广泛，以慢性、接触性、高度传染性、高发病率以及低死亡率等为特点，主要表现为咳嗽和呼吸困难，解剖可见肺组织呈肉变或大理石样病变。该病还可导致猪只生长迟缓，饲料转化率低，严重危害着养猪业的发展。

衣阿华大学Ross研究发现：Mhp感染后淋巴细胞产生抗体的能力下降，细胞免疫力下降，肺泡巨噬细胞对病原的吞噬和清除能力亦下降，抑制性T细胞的活动增强，导致呼吸道免疫力减弱，抗病力下降，从而使其他病原体更容易侵入，可继发感染猪繁殖与呼吸综合征、猪圆环等，从而导致多种疫苗接种失败。Mhp可经空气传播，易与其他细菌性疾病如猪肺疫、传染性胸膜肺炎等并发(王茂文,猪肺炎支原体病的特点及其防制措施.畜禽业,2008(2):16-17；Dee S,Otake S,Oliveira S,et al.Evidence of long distance airborne transport of porcinereproductive and respiratory syndrome virus and Mycoplasmahyopneumoniae.Veterinary research,2009,40(4):39)，对养猪业造成重大的经济损失，是当前最常发生、最广流行、最难净化的重要疫病之一。

目前，对于猪支原体肺炎的防治主要是使用药物、疫苗接种。其中，药物主要是抗生素，虽有一定的效果，但国家对抗生素的滥用日益重视、管理严格。应用的疫苗主要是弱毒疫苗、灭活疫苗，弱毒疫苗需要胸腔注射，对动物刺激大，易引起应激甚至死亡，导致推广困难；灭活疫苗虽通过肌肉注射、操作便易，但会出现一过性体温升高以及短暂性精神沉郁、食欲减退、过敏等副反应，而且主要以辉瑞、海博莱、勃林格为首的国外公司垄断，疫苗价格昂贵致使防疫成本变高。另外，目前商品化的疫苗是通过在含血清的培养基上生长所得的支原体生物体制备而成，但是引起了对于免疫物质中存在的血清组分(如免疫复合物或非免疫原性特异性蛋白)诱导副反应发生(见中国专利CN104334186A)。

近年来，人们开始尝试利用现代分子生物学手段从研究Mhp的致病机理和主要抗原蛋白入手，利用外源表达载体获得大量Mhp相关的抗原蛋白，同时使其他相关刺激因子重组表达而制备成新型猪支原体肺炎亚单位疫苗。这种新型的猪支原体肺炎亚单位疫苗不含全菌疫苗的核酸，不仅不存在灭活不彻底造成的安全隐患，而且由于其不含全菌的所有抗原，有利于疾病的净化。但目前猪支原体肺炎亚单位疫苗免疫效果不佳，不能给猪提供完全的保护(Fagan PK,Djordievic SP.Chin J,et al.Oral immunization of mice with attenuated Salmonellatyphimurium aroA expressing a recombinant Mycoplasma hyopeumoniaeantigen(NrdF).Infection and immunity,1997,65:2502-2507)。

发明内容

为了解决现有技术的不足，本发明提供了一种猪支原体肺炎疫苗组合物及其应用。

本发明的第一方面在于提供一种猪支原体肺炎疫苗组合物，所述猪支原体肺炎疫苗组合物包括猪肺炎支原体免疫原性蛋白XylF蛋白和/或P78蛋白。

术语“猪支原体肺炎”在临床上的症状包括(但不限于)：呼吸症状(严重急性临床肺炎、咳嗽、呼吸困难、呼吸速迫)、发热、高度传染性、高发病率、低死亡率、坏死性细胞支气管炎及继发性细菌性呼吸道感染增加。

术语“猪支原体肺炎疫苗组合物”是指能够用于预防和/或治疗由猪肺炎支原体感染所知病症或疾病的疫苗，该疫苗组合物可包括任何能够有效预防和/或治疗猪肺炎支原体感染的疫苗，能够用于猪支原体肺炎疫苗组合物包括(但不限于)完全或部分猪支原体肺炎细胞制剂、上清液、灭活或改良活体疫苗、亚单位疫苗。所述灭活疫苗是指含有不再能够复制或生长的感染性生物体或病原体的疫苗组合物，病原体可以通过各种方法包括冻融、化学处理(例如，用硫柳汞或福尔马林处理)、声处理、照射、热或任何其它足以阻止生物体复制或生长的常用方法来实现灭活而维持其免疫原性。所述改良活体疫苗是指在人工条件下促使其变异，失去致病性但保留免疫原性、繁衍能力和剩余毒力的疫苗，接种后在动物体内有一定程度的繁殖或复制，但不会导致发病。所述“亚单位疫苗”包含一个或多个猪肺炎支原体衍生的多肽或蛋白质，或所述多肽或蛋白质的免疫原性片段，或编码所述一个或多个猪肺炎支原体衍生多肽或蛋白质，或所述多肽或蛋白质免疫原性片段的一个或多个猪肺炎支原体基因或核酸，且所述基因或核酸能在猪体内进行表达。猪肺炎支原体多肽、蛋白质、所述多肽和蛋白质的免疫原性片段、或猪肺炎支原体基因或核酸可用于本领域公知技术合成或重组制备。

术语“预防和/或治疗”在涉及猪肺炎支原体感染时是指抑制猪肺炎支原体细菌的复制、抑制猪肺炎支原体的传播或防止猪肺炎支原体在其宿主体内定居，以及减轻猪肺炎支原体感染所之疾病或病症的症状。若细菌荷载量减少、肺部感染减轻和/或摄食量和/或生长增加，那么就可以认为所述治疗达到了治疗效果。

术语“猪”是指任何属于猪科(Suidae)成员的动物，即小猪(piglets)，swine，pigs，porcine，大母猪(sows)，小母猪(gilts)，barrows，公猪(boars)以及猪科的成员。

术语“免疫原性蛋白”包括免疫活性的全蛋白和/或蛋白质片段，施用于宿主后，能够引起针对蛋白质的体液和/或细胞类型的免疫应答。优选地，蛋白质片段使得它具有与全蛋白基本相同的免疫活性，具体为至少一个表位或抗原决定簇，或基本上由至少一个表位或抗原决定簇组成，或由至少一个表位或抗原决定簇组成。术语“表位”涉及能够诱导体液类型(B细胞)和/或细胞类型(T细胞)的免疫应答的蛋白质位点。

术语“免疫原性蛋白”进一步考虑了对序列的缺失、添加和置换，特别优选地置换一般在性质上是保守的，即在氨基酸家族内发生的那些置换，如氨基酸一般分成4个家族：(1)酸性-天冬氨酸和谷氨酸，(2)碱性-赖氨酸、精氨酸、组氨酸，(3)非极性-丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有时分类为芳香族氨基酸。可合理地预测用异亮氨酸或缬氨酸分别替换亮氨酸，或反之亦然；用谷氨酸替换天冬氨酸，或反之亦然；或氨基酸用结构上相关的氨基酸的相似保守替换，对生物活性将没有主要影响。

术语“XylF蛋白”为ABC转运木糖结合脂蛋白(ABC transporterxylose-binding lipoprotein)的免疫原性片段，约446AA组成。

术语“P78蛋白”为脂蛋白(lipoprotein)的免疫原性片段，约691AA组成。

所述XylF蛋白、P78蛋白的氨基酸序列为J株(NCBI登录号为AE017243.1)、168株(NCBI登录号为CP002274.1)、168-L株(NCBI登录号为CP003131.1)、7448株(NCBI登录号为AE017244.1)、232株(NCBI登录号为AE017332.1)、7422株(NCBI登录号为CP003802.1)任一毒株相应蛋白的氨基酸序列。

优选地，所述XylF蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.2或SEQ ID NO.3，所述P78蛋白的序列为SEQ ID NO.4、SEQ IDNO.5或SEQ ID NO.6。

在本发明的一个优选实施方式中，所述猪支原体肺炎疫苗组合物还包括猪肺炎支原体全菌抗原。

术语“猪肺炎支原体全菌抗原”是指包含至少一种对猪接种后诱导、刺激或增强抵抗猪肺炎支原体感染的免疫应答的全菌抗原的任何组合物。所述猪肺炎支原体全菌抗原是完整的猪肺炎支原体，不仅包括本领域技术人员熟知的临床分离的野毒株，还包括灭活的、改良的活的或减毒的猪肺炎支原体，或猪肺炎支原体上清液。优选为灭活形式的猪肺炎支原体或猪肺炎支原体上清液，更优选为灭活形式的猪肺炎支原体HN0613株(保藏号为CCTCC No.M2012230，保藏日期为2012年6月13日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，该毒株已经在专利申请CN103083655A中公开)或J株(购自美国典型培养物保藏中心ATCC，ATCC编号为25934)。猪肺炎支原体全菌抗原还可以包含以下组合物的任一种抗原，如：猪肺炎支原体如哈药集团公司的瑞倍适Respisure和瑞倍适-旺RespisureOne、英特威公司的安百克M+PAC、勃林格殷格翰公司的美国普泰克公司的MycoGard、美国辉瑞公司的RespiFend MH、硕腾(上海)动物保健品有限公司的瑞富特-旺Suvaxyn MH-one、梅里亚动物保健公司的猪克喘SprintVac、海博莱公司的喜宜丰Mypravac Suis、国内生产的Z株活疫苗、168株活疫苗和RM48株活疫苗。

在本发明的一个优选实施方式中，所述猪支原体肺炎疫苗组合物还包括兽医学上可接受的载体，优选为佐剂。

术语“兽医学上可接受的载体”又称“兽医学上可接受的媒介物”，指可以被注射到宿主中且没有副作用的包含疫苗抗原的液体媒介物。本领域已知的合适的兽医学上可接受的载体包括但不限于无菌水、盐水、葡萄糖、右旋糖或缓冲液。载体可以包括助剂，包括但不限于稀释剂、稳定剂(即糖和氨基酸)、防腐剂、湿润剂、乳化剂、pH缓冲剂、粘度增强添加剂、染料等。

术语“佐剂”可包括铝胶佐剂；皂苷(saponin)，如Quil A、QS-21(Cambridge Biotech Incorporation,Cambridge MA)、GPI-0100(Galenica Pharmaceuticals Incorporation，Birmingham AL)；油包水乳剂；水包油乳剂；水包油包水乳剂；丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物；顺丁烯二酸酐和链烯基(alkenyl)衍生物的共聚物选出的化合物。

术语“乳剂”可尤其基于轻液体石蜡油(European Pharmacopea类型)；因烯烃寡聚产生的类异戊二烯油(isoprenoid oil)，如角鲨烷(squalane)或角鲨烯油(squalene oil)，尤其异丁烯或葵烯；酸或醇的含线性烷基的酯，更尤其植物油、油酸乙酯、丙二醇二-(辛酸酯/葵酸酯)、甘油三-(辛酸酯/葵酸酯)或丙二醇二油酸酯；支链脂肪酸或醇的酯，尤其异硬脂酸酯。油与乳化剂组合使用以便形成乳剂。乳化剂优选非离子表面活性剂，尤其山梨聚糖的酯、二缩甘露醇(mannide)的酯(如无水甘露醇油酸酯)、脂肪族二元醇(glycol)的酯、聚甘油(polyglycerol)的酯、丙二醇的酯以及油酸的酯、异硬脂酸的酯、蓖麻油酸的酯或羟基硬脂酸的酯，它们任选乙氧基化，还有聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物，尤其Pluronic产品，特别是L121。参见Hunter等编写的《The theory and practical application ofadjuvants》(Ed.by DES Stewart-Tull,John Wiley and Sons,New York,1995:51-94)和Todd等编写的《Vaccine》(1997,15:564-570)。例如，可使用Powell M和Newman M编写的《Vaccine design,the Subunitand adiuvant approach》(Plenum Press,1995)第147页描述的SPT乳剂及第183页描述的MF59乳剂。

术语“丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物”优选为交联的丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物，尤其是与糖(sugar)的聚链烯基醚或聚醇交联，这些化合物已知被称为卡波姆(Carbomer，商品名Carbopol)(Phameuropa,1996,8(2))。本领域技术人员还可参见美国专利US2909462，其描述了这类丙烯酸聚合物，其与聚羟基化的化合物交联，所述化合物具有至少3个羟基，优选不超过8个，其中至少3个羟基的氢原子被具有至少2个碳原子的不饱和脂烃基(aliphatic radical)取代。优选的基团是那些含有2-4个碳原子的基团，例如乙烯基、烯丙基和其它烯属不饱和基团(ethylenically unsaturated group)。所述不饱和基团自身可包含其它取代基，如甲基。这些产品以卡波普的名义出售，(BFGoodrich,Ohio,USA)特别合适。它们与烯丙基蔗糖或与烯丙基季戊四醇(allyl pentaerythritol)交联。这其中可提及卡波普974P、934P和971P，最优选使用卡波普971P。

术语“顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的共聚物”也可考虑顺丁烯二酸酐与乙烯的共聚物EMA(Monsanto)，这些聚合物在水中溶解产生酸性溶液，经中和，优选中和至生理pH，以便产生佐剂溶液，能向其中掺入免疫原性、致免疫性或疫苗性组合物本身。

术语“佐剂”还包括，但不限于，RIBI佐剂系统(RibiIncorporation)、Block co-polymer(CytRx,Atlanta GA)、SAF-M(Chiron,Emeryville CA)、单磷酰脂质A(monophosphoryl lipid A)、Avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素(重组或其它)、霍乱毒素、IMS 1314、胞壁酰二肽、Gel佐剂等。

优选地，所述佐剂为铝胶佐剂、皂苷、油包水乳剂、水包油乳剂、水包油包水乳剂、丙烯酸、甲基丙烯酸的聚合物、顺丁烯二酸酐和链烯基(alkenyl)衍生物的共聚物、RIBI佐剂系统、Block co-polymer、SAF-M、单磷酰脂质A、Avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素、霍乱毒素、IMS 1314、胞壁酰二肽或Gel佐剂中的一种或几种。

更优选地，所述佐剂在所述猪支原体肺炎疫苗组合物中的体积比为5％-30％。

本发明的第二方面在于提供一种疫苗组合物，所述疫苗组合物包括所述猪支原体肺炎疫苗组合物和其他抗原，所述其他抗原包括猪圆环病毒抗原、猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原、副猪嗜血杆菌抗原、猪细小病毒抗原、大叶性肺炎放线杆菌抗原、大肠杆菌抗原、猪萎缩性鼻炎抗原、猪伪狂犬病毒抗原、猪霍乱病原抗原、猪流感病毒抗原中的一种或多种；优选地，所述其他抗原为猪圆环病毒抗原。

本发明第三方面在于提供所述疫苗组合物在制备预防和/或治疗猪支原体肺炎的药物中的应用。

本发明所用缩略语为：AA，氨基酸；bp，碱基对。

本发明具有以下突出的优点：

(1)疫苗组合物含猪肺炎支原体全菌抗原和免疫原性蛋白，比单独使用全菌抗原或免疫原性蛋白免疫时，猪肺炎支原体全菌抗原或免疫原性蛋白的含量明显降低，且免疫效果增强；

(2)疫苗组合物中的免疫原性蛋白可通过基因工程手段对疫苗组合物的组分进行大量重组表达，不仅耗时短，还可便于大规模生产；

(3)含猪肺炎支原体抗原和其他抗原的疫苗组合物免疫动物时对该疫苗组合物之其他抗原的免疫效果无影响。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

本发明实施例中所用的猪肺炎支原体XylF蛋白的序列，来源于已报道的J株(NCBI登录号为AE017243.1)、7448株(NCBI登录号为AE017244.1)，P78蛋白的序列来源于已报道的J株(NCBI登录号为AE017243.1)、232株(NCBI登录号为AE017332.1)，但该实施方式无论在任何情况下均不构成对本发明的限定。

本发明实施例中，以大肠杆菌表达载体为例进行表达，通过基因工程手段获得猪肺炎支原体XylF蛋白、P78蛋白，但该实施方式无论在任何情况下均不构成对本发明的限定。

本发明实施例以Montanide^TM Gel 01(法国SCIPPIC公司)作为佐剂，并以体积比为10％的佐剂，制备猪支原体肺炎疫苗组合物为例进行阐述，但该实施方式无论在任何情况下均不构成对本发明的限定。

本发明实施例中所采用猪肺炎支原体HN0613株，保藏号为CCTCC No.M2012230，保藏日期为2012年6月13日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，该毒株已经在专利申请CN103083655A中公开。

本发明实施例中所采用的攻毒毒株为猪肺炎支原体CVCC354株，该毒株的保藏号为CVCC 354，保藏单位为国家兽医微生物菌种保藏管理中心。

本发明实施例中肺病变指数采用28分法进行评判。所述28分法是根据猪支原体肺炎的典型肺部眼观病变，对发病程度进行量化判定，包括肺尖叶、心叶、膈叶、中间叶出现的实质样病变，如“肉样变”、“胰样变”。肺炎病变评分标准为：2个尖叶、2个心叶、2个膈叶、1个中间叶共计7个肺叶，每个肺叶满分为4分，共计28分。根据发生实质病变的肺叶面积所占该叶的比例，分别对每个肺叶进行打分。无肺炎病变记为0分；病变面积比例为1％-25％，记为1分；病变面积比例26％-50％，记为2分；病变面积比例为51％-75％，记为3分；病变面积比例为76％-100％，记为4分。如肺叶正反两面均有病变，以病变面积大的一面进行记分。各个肺叶打分总和即为该发病株的肺炎病变得分。分别对免疫组猪和对照组猪进行记分后，按照以下公式计算免疫组猪的肺叶病变减少率：

本发明实施例统计分析方法为：统计7个肺叶的肺病变指数，确定病变程度。用SPSS计算机软件进行ANOVA分析，比较各组间差异，确定病变差异的有效性。

本发明中所用的pH7.2PBS液配方为：1000mL蒸馏水中加入NaCl9g、Na₂HPO₄·12H₂O 6g、NaH₂PO₄·2H₂O 0.4g，本发明中所用到的化学试剂均为分析纯，购自国药集团。

本发明中所制备的含猪肺炎支原体抗原和其他抗原的疫苗组合物免疫动物后对所述疫苗组合物之其他抗原免疫效果的影响试验中，以猪圆环病毒抗原为例，但该实施方式无论在任何情况下均不构成对本发明的限定。

为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于本发明而不用于限制本发明的范围。本发明所述的实验方法，若无特殊说明，均为常规方法；所述的生物材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1猪肺炎支原体全菌抗原的制备

将猪肺炎支原体HN0613株冻干菌种用液体培养基稀释，划线接种于固体培养基平皿上，置37℃培养7天，选择生长良好的菌落，接种于固体培养基斜面上，37℃培养7天，作为一级种子。

取少量液体培养基洗一级种子的斜面培养物，接种于液体培养基大管中，置37℃培养7天，经检验纯粹后作为二级种子。

将液体培养基培养的二级种子液按体积比10％(V/V)接种于液体培养基中。37℃下培养3-6天，带颜色变黄，pH值下降至6.8-7.0时收获菌液，纯粹检验合格后，再以同样的方式扩大培养(继代次不超过6代)。培养物经纯粹检验合格后置2-8℃保存备用。

对收获的菌液取样，用Friis培养基进行10倍系列稀释法进行活菌计数，37℃培养20天，观察培养基颜色变化，以最高稀释倍数为样品的CCU滴度样品。设置2个重复取平均值，即为最终的CCU值(5.5×10⁹CCU/mL)。

将上述培养物加入1％的硫柳汞，使其终浓度为0.01％，4℃灭活12小时，使之灭活完全。

实施例2猪肺炎支原体免疫原性蛋白的表达、鉴定与纯化

根据NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中报道的猪肺炎支原体J株(登录号：AE017243.1)、7448株(登录号：AE017244.1)中的XylF蛋白核苷酸序列，以及J株(登录号：AE017243.1)、232株(登录号：AE017332.1)中的P78蛋白核苷酸序列，采用人工合成的方法，由上海生物工程有限公司合成，所合成的基因片段全长分别为XylF-I1341bp、XylF-II 1341bp、P78-I 2076bp、P78-II 2076bp。在此人工合成XylF-I、XylF-II、P78-I、P78-II基因片段的基础上分别制备XylF-I、XylF-II、P78-I、P78-II蛋白的模板。

以前一步骤所合成的基因片段分别用做PCR反应的模板，并用Primer Premier 5软件分别设计XylF-I、XylF-II、P78-I、P78-II蛋白的引物及定点突变用引物序列，按照专利TW201431873A中大肠杆菌表达的方法分别制备XylF-I、XylF-II、P78-I、P78-II蛋白，并对其进行鉴定、纯化。

其中，定点突变是由于猪肺炎支原体免疫原性蛋白中XylF-I、XylF-II、P78-I、P78-II中带有TGA密码子，TGA密码子在猪肺炎支原体中被编码为色氨酸(Tryptophan)，但在大肠杆菌表达中则被视为终止密码子。为了使免疫原性蛋白的基因在大肠杆菌中正常表达，将TGA处的基因定点突变成TGG。

结果：PCR扩增产物经电泳后，分别在1341bp左右、1341bp左右、2076bp左右、2076bp左右出现目的条带，与预期大小相符；将PCR产物回收后，连接至原核表达载体并测序，测序结果表明，重组质粒已经完全突变正确。将重组质粒导入大肠杆菌进行表达，将表达后的蛋白分别使用亲和层析柱进行纯化，纯化产物经SDS-PAGE电泳，目的蛋白片段与预期大小均相符。将纯化蛋白透析后进行浓缩，浓缩后XylF-I、XylF-II、P78-I、P78-II蛋白的含量均为1mg/mL，并冻存于-20℃。

实施例3猪支原体肺炎疫苗组合物的制备

将实施例1制备的猪肺炎支原体全菌抗原、实施例2制备的猪肺炎支原体免疫原性蛋白，使用pH7.2PBS溶液稀释，将稀释后的各蛋白溶液与Montanide^TM Gel 01佐剂按表1中猪支原体肺炎疫苗组合物所含组分及比例混合在一起，以500-800r/min的转速搅拌10-15min，在终止搅拌前加入1％(体积比)硫柳汞溶液，使其终浓度不超过万分之一，充分振荡混匀，分装后2-8℃保存备用。

表1猪支原体肺炎疫苗组合物所含组分及比例

实施例4不同组分的猪支原体肺炎疫苗组合物效力试验

将实施例3所制备的疫苗组合物，分别免疫14-21日龄仔猪75头(排除猪繁殖与呼吸综合征、猪圆环2型和猪瘟)，5头/组，2mL/头，同时设置J株参考疫苗对照、现有技术对照、攻毒对照，共15组。免疫接种后观察体温、副反应至28日，并于28日对所有猪气管注射猪肺炎支原体济南系强毒CVCC354株，100MID₅₀/头，观察28天后解剖，并观察肺部病变，按照28分法对肺部病变进行评分。攻毒前后，分别对试验组仔猪进行称重，并计算平均日增重。

攻毒后大约10天左右，攻毒对照组猪只(其中4只)陆续出现咳嗽、气喘等症状，皮毛不光滑；第10、12、13组各有一头猪出现了咳嗽的症状；其他组别没有猪只出现气喘病的类似症状。攻毒前后，各试验组猪只的肺炎病变平均得分和平均日增重结果见表2。

表2猪支原体肺炎疫苗组合物免疫后观察结果及效力试验结果

注1：第11组为灭活疫苗对照组，所选用的疫苗为现有产品中的猪支原体肺炎灭活疫苗(J株)，即安百克(M+PAC)，按厂家说明书进行免疫；第12-14组均为现有技术对照组，其中第12-14组所免疫组分分别为PdhA+P78组合物、XylF+Mhp145组合物(参照专利文献TW201431873A中描述的方法制备而成)，第14组所免疫组分为HN0613+P46II-NrdF组合物(参照专利CN104248753A中描述的方法制备而成)。

注2：体温“无”表明未发生一过性体温升高，“有”表明发生一过性体温升高，其中一过性体温升高是指于二免疫后第1-2天体温会短暂呈现40.5度，并于第3天恢复正常体温。

注3：副反应“无”表明未发生过副反应，“有”表明发生过副反应，其中副反应是指出现过短暂性精神沉郁、食欲减退、过敏反应中的至少一种。

注4：差异性统计分析中，组间比较，字母相同者表示差异不显著，字母不同者表示差异显著(p＜0.05)。

由表2可知：

(1)第1-4组(即免疫疫苗1-4组)分别使用猪肺炎支原体HN0613株与免疫原性蛋白XylF、P78中的任一蛋白(每种蛋白每头40μg/mL)组成的疫苗组合物对动物进行免疫，之后进行攻毒，结果显示：免疫猪只未发生一过性体温升高，也未出现副反应，并且肺炎病变减少率均＞71％、平均日增重为0.0425-0.0429kg，各组之间差异不显著(p＞0.05)；与第11组(即现有技术对照组，免疫组分含HN0613+P46II-NrdF，且每种蛋白每头为250μg/mL)相比，差异均不显著(p＞0.05)，但第1-4组在所含蛋白含量较小的情况下仍具有较第14组(肺炎病变减少率为69.51％，平均日增重为0.0415kg)好的免疫效果；与第10组(即免疫组分仅含猪肺炎支原体HN0613株抗原)、与第11组(即安百克)相比，差异均显著(p＜0.05)；与第12-14组(现有技术对照组，免疫组分仅含亚单位抗原)比较，差异均显著(p＜0.05)；与攻毒对照组相比，差异均显著(p＜0.05)。

(2)第5-6组(即免疫疫苗5-6组)分别使用猪肺炎支原体HN0613株与免疫原性蛋白XylF、P78两种蛋白(每种蛋白每头40μg/mL)组合而成的疫苗组合物对动物进行免疫，之后进行攻毒，结果显示：免疫猪只未发生一过性体温升高，也未出现副反应，并且肺炎病变减少率均＞80％、平均日增重为0.0521-0.0524kg，第5-6组各组之间差异不显著(p＞0.05)，但与第1-4组相比差异显著(p＜0.05)；与第14组(即现有技术对照组，免疫组分含HN0613+P46II-NrdF，且每种蛋白每头为250μg/mL)相比，在第5-6组所含蛋白含量较小的情况下差异仍显著(p＜0.05)；与第10组(即免疫组分仅含猪肺炎支原体HN0613株抗原)、第11组(即安百克)相比，差异均显著(p＜0.05)；与第12-13组(现有技术对照组，免疫组分仅含亚单位抗原)比较，差异均显著(p＜0.05)；与攻毒对照组相比，差异均显著(p＜0.05)。

(3)第7-9组(即免疫疫苗7-9组)分别使用猪肺炎支原体免疫原性蛋白XylF、P78中的至少以一种蛋白(每种蛋白每头40μg/mL)制备而成的疫苗组合物对动物进行免疫，之后进行攻毒，结果显示：免疫猪只未发生一过性体温升高，也未出现副反应，肺炎病变减少率均＞60％、平均日增重为0.0415-0.0419kg，能使猪只获得完全保护，且各组之间差异不显著(p＞0.05)；与第10组(即免疫组分仅含猪肺炎支原体HN0613株抗原)、第11组(即安百克)相比，效果相当，差异均不显著(p＞0.05)；但与第1-6组、第14组(即现有技术对照组，免疫组分含HN0613+P46II-NrdF，且每种蛋白每头为250μg/mL)相比，效果稍差，差异均显著(p＜0.05)；与第12-13组(现有技术对照组，免疫组分仅含亚单位抗原)比较，效果稍好，差异均显著(p＜0.05)；与攻毒对照组相比，差异均显著(p＜0.05)。

实施例5疫苗组合物之猪肺炎支原体抗原对其他抗原免疫效果试验

5.1疫苗组合物的制备

将实施例1制备的猪肺炎支原体全菌抗原、实施例2制备的猪肺炎支原体免疫原性蛋白以及猪圆环病毒抗原(按照中国专利CN103083655A制备并对抗原液进行浓缩)使用pH7.2PBS溶液稀释，将稀释后的各蛋白溶液与Montanide^TM Gel 01佐剂按表3中疫苗组合物所含组分及比例混合在一起，以500-800r/min的转速搅拌10-15min，在终止搅拌前加入1％(体积比)硫柳汞溶液，使其终浓度不超过万分之一，充分振荡混匀，分装后2-8℃保存备用。

表3疫苗组合物所含组分及比例

注：所选用的猪圆环病毒2型(Porcine Circovirus Type 2，PCV2)毒株为SH株，已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏日期:2008年3月4日，保藏号为CGMCC No.2389。该毒株公开于中国专利CN101240264A中。

5.2免疫效果试验

将实施例5.1所制备的疫苗11-16以及PCV2疫苗(由普莱柯生物工程股份有限公司生产)分别免疫14-21日龄仔猪40头(排除猪繁殖与呼吸综合征、猪圆环2型和猪瘟)，5头/组，2mL/头，同时设置对照，共5组。免疫接种后14天、21天、35天、60天对每头猪采血，收集血清，保存在-20℃直到测试。

按照血清学方法对猪圆环病毒抗原部分的免疫效果进行评价，具体为：

(1)ELISA抗体检测用大肠杆菌表达的PCV2 ORF2蛋白(按照中国专利CN101101296A制备)作为抗原，通过方阵滴定试验确定抗原的最佳包被浓度。将抗原稀释到最佳包被浓度后包被酶标板，100μl/孔，后4℃包被过夜；洗涤3次，每次3-5min；每孔加200μl的0.15％(M/V)BSA封闭液封闭板子，37℃作用2h；洗涤；将待检血清用PBS倍比稀释，每个样品一行，每孔加100μ1，37℃作用1h；洗涤；然后加入酶标的SPA(1:10000倍稀释)，100μl/孔，37℃作用1h；洗涤；加底物液TMB显色，最后用2mol/L的H₂SO₄终止反应。结果判定：待检血清OD₄₅₀值/阴性血清OD₄₅₀值≥2.1为阳性。

(2)血清中和试验采用固定病毒稀释血清法。待检血清56℃加热30min，10000rpm离心5min，小心吸出上清，做1:2稀释后进行倍比稀释；分别与等量PCV2病毒液混合，37℃1h,接种于含单层PK15细胞的96孔板内，100μ1/孔，每一稀释度接种4孔，同时设细胞对照和病毒对照孔。37℃培养12h，用300mmol/L的D-氨基葡萄糖处理，37℃继续培养48h，80％丙酮固定细胞，用间接免疫荧光法测定每个稀释度含有荧光的孔数。以能够抑制50％特异性荧光细胞数的细胞孔的血清最大稀释度作为待检血清的中和效价，并计算每组平均值。

血清学评价结果见表4。

表4疫苗组合物之猪肺炎支原体抗原对其他抗原免疫效果试验结果

由表4结果可知：所制备的含猪肺炎支原体抗原和猪圆环病毒抗原的疫苗组合物免疫动物后，所产生的抗体与PCV2单苗所产生的抗体基本一致，并能持续到60天，表明疫苗11-16分别免疫动物后能刺激机体产生PCV2特异性抵抗力，效果确实，并且疫苗11-16之猪肺炎支原体抗原对其他抗原免疫效果无影响。

综上所述：

(1)含猪肺炎支原体全菌抗原和一种免疫原性蛋白(XylF、P78蛋白中的任一种)组分的疫苗组合物免疫猪只，虽其中的免疫原性蛋白用量较小，但均可获得免疫保护，均未发生一过性体温升高以及短暂性精神沉郁、食欲减退、过敏等副反应，且均略优于现有技术中的HN0613+P46-NrdF的免疫效果；其免疫效果显著优于现有疫苗产品安百克的，也显著优于现有技术对照组中的仅含猪肺炎支原体全菌抗原或亚单位抗原的猪支原体肺炎疫苗组合物的免疫效果(包括肺炎病变减少率、平均日增重、副反应)。

(2)含猪肺炎支原体全菌抗原和免疫原性蛋白(XylF、P78)中两种组分的疫苗组合物免疫猪只，均可获得免疫保护，均未发生一过性体温升高以及短暂性精神沉郁、食欲减退、过敏等副反应，且显著优于含猪肺炎支原体全菌抗原和XylF或P78蛋白的疫苗组合物的，且肺炎病变减少率高出7％，平均日增重也有所升高；显著优于现有技术中含HN0613+P46-NrdF免疫组分、仅含猪肺炎支原体HN0613株抗原、仅含亚单位抗原、安百克的。

(3)含猪肺炎支原体免疫原性蛋白的疫苗组合物免疫猪只后，均获得免疫保护，均未发生一过性体温升高以及短暂性精神沉郁、食欲减退、过敏等副反应，虽逊色于含猪肺炎支原体全菌抗原和免疫原性蛋白的疫苗组合物，但与含猪肺炎支原体HN0613株抗原或现有产品安百克的相当。

另外，本发明所制备的疫苗组合物免疫动物时，该疫苗组合物之猪肺炎支原体抗原不影响其他抗原的免疫效果。

以上所述仅是本发明的优选实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，虽然本发明已以优选实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims

1.一种猪支原体肺炎疫苗组合物，所述疫苗组合物包括猪肺炎支原体免疫原性蛋白XylF蛋白和/或P78蛋白。

2.根据权利要求1所述疫苗组合物，其特征在于，所述XylF蛋白、P78蛋白的氨基酸序列为J株(NCBI登录号为AE017243.1)、168株(NCBI登录号为CP002274.1)、168-L株(NCBI登录号为CP003131.1)、7448株(NCBI登录号为AE017244.1)、232株(NCBI登录号为AE017332.1)、7422株(NCBI登录号为CP003802.1)中任一毒株相应蛋白的氨基酸序列。

3.根据权利要求1所述疫苗组合物，其特征在于，所述XylF蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3，所述P78蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5或SEQ IDNO.6。

4.根据权利要求1所述疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物还包括猪肺炎支原体全菌抗原。

5.根据权利要求4所述疫苗组合物，其特征在于，所述猪肺炎支原体全菌抗原为灭活的、改良的活的或减毒的猪肺炎支原体，或猪肺炎支原体上清液。

6.根据权利要求5所述疫苗组合物，其特征在于，所述猪肺炎支原体全菌抗原为灭活的猪肺炎支原体或猪肺炎支原体上清液，优选为灭活的猪肺炎支原体HN0613株或J株。

7.根据权利要求1-6任一项所述疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物还包括兽医学上可接受的载体。

8.根据权利要求7所述疫苗组合物，其特征在于，所述载体为佐剂，所述佐剂为铝胶佐剂、皂苷、油包水乳剂、水包油乳剂、水包油包水乳剂、丙烯酸、甲基丙烯酸的聚合物、顺丁烯二酸酐和链烯基(alkenyl)衍生物的共聚物、RIBI佐剂系统、Block co-polymer、SAF-M、单磷酰脂质A、Avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素、霍乱毒素、IMS 1314、胞壁酰二肽或Gel佐剂中的一种或几种；优选地，所述佐剂为Gel佐剂。

9.一种疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物包括权利要求1-8任一项所述疫苗组合物和其他抗原，所述其他抗原包括猪圆环病毒抗原、猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原、副猪嗜血杆菌抗原、猪细小病毒抗原、大叶性肺炎放线杆菌抗原、大肠杆菌抗原、猪萎缩性鼻炎抗原、猪伪狂犬病毒抗原、猪霍乱病原抗原、猪流感病毒抗原中的一种或多种；优选地，所述其他抗原为猪圆环病毒抗原。

10.权利要求1-9任一项所述疫苗组合物在制备预防和/或治疗猪支原体肺炎的药物中的应用。