CN106139127B - 重组凝血因子ⅷ冻干制剂 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种重组凝血因子Ⅷ冻干制剂，该冻干制剂用水复溶后，包含有：重组凝血因子Ⅷ、缓冲液、纯度稳定剂、活性稳定剂、增溶剂、表面活性剂。本发明的重组凝血因子Ⅷ冻干制剂，不含白蛋白，在水中复溶迅速，且复溶后稳定性高。
Description
技术领域
本发明涉及生物制剂领域，特别是涉及一种稳定的、不含白蛋白的重组凝血因子Ⅷ冻干制剂。
背景技术
凝血因子Ⅷ(rFⅧ)是血液凝固过程中导致凝血的级联反应的辅助因子。通常凝血因子可以从人血浆中获得。通过重组DNA技术的方法制备凝血因子，可以避免与血液制品有关的可能污染，并使凝血因子Ⅷ的来源不再单一，可有效避免由于使用自愿捐献血浆作为原料而导致的供应能力限制。采用重组DNA技术制备的凝血因子Ⅷ冻干制剂，可以针对急性出血的治疗性给药，也可以作为预防内控性出血的经常性间隔给药。
重组DNA技术制备的凝血因子Ⅷ容易降解、聚集并失活，在贮存期间较为不稳定，为了改善其稳定性，通常需要在制剂处方中加入人血清白蛋白作为稳定剂。由于rFⅧ制品的优势之一是它不是提取自人血浆，因此可避免由人血浆原因引起的可能污染，但人血清白蛋白的添加使不含任何人血原料的重组技术方式制备的优势丧失了。
近年来，关于不含白蛋白的重组凝血因子Ⅷ的制剂处方研究已有描述。通常通过使用氨基酸(如甘氨酸、赖氨酸)和高浓度的糖(如甘露糖醇、蔗糖、麦芽糖)替代白蛋白以保证凝血因子Ⅷ制剂的等渗性和稳定性。
例如美国专利No.5399670描述了增加凝血因子Ⅷ冻干制剂溶解度的方法，需要在冻干前在制剂溶液中加入精氨酸。美国专利No.4440679和No.4623717描述了加入至少30％的糖与氨基酸，可以保证凝血因子Ⅷ液体制剂在60℃贮存10个小时的稳定性。
美国专利No.5565427中公开的一种不含白蛋白的凝血因子Ⅷ制剂，该制剂处方中包括赋形剂(如氯化钠和蔗糖)、氨基酸(如精氨酸和甘氨酸)、表面活性剂(如聚山梨酯80或聚山梨酯20)。该专利披露了溶液中稳定性不超过16小时的溶液1(包含0.75％蔗糖、0.4M甘氨酸、0.15M氯化钠)和溶液2(包含0.01M柠檬酸钠、0.08M甘氨酸、0.016M赖氨酸、0.0025M氯化钠、0.4M氯化钠)。
美国专利No.5763401公开了一种不含白蛋白的治疗用凝血因子Ⅷ制剂，该制剂处方中包括15-60mM蔗糖、最多50mM氯化钠、最多5mM氯化钙、65-400mM甘氨酸、最多50mM组氨酸。优选的两种特定制剂处方为：处方1包含：150mM氯化钠、2.5mM氯化钙、165mM甘露醇；处方2包含：1％蔗糖、30mM氯化钠、2.5mM氯化钙、20mM组氨酸、290mM甘氨酸。
美国专利No.5733873公开了一种含表面活性剂的凝血因子制剂，该专利公开的制剂中各赋形剂的范围为：至少0.01mg/ml的聚山梨酯20或80、至少0.1M氯化钠、至少0.5mM钙盐、至少1mM组氨酸。公开的实施例的处方为：处方1包含：组氨酸(14.7mM，50mM，65mM)、氯化钠(0.31M，0.6M)、氯化钙(4mM)、聚山梨酯80(0.001％，0.02％，0.025％)、PEG(0，0.1％)、蔗糖(0，19.9mM)；处方2包含：20mg/ml甘露醇、2.67mg/ml组氨酸、18mg/ml氯化钠、3.7mM氯化钙、0.23mg/ml聚山梨酯80。
专利WO 96/22107公开了含有海藻糖的制剂，该制剂的第一种配方包括：0.1M氯化钠、15mM氯化钙、15mM组氨酸、1.27M海藻糖；第二种配方包括：0.011％氯化钙、0.12％组氨酸、0.002％Tris、0.002％聚山梨酯80、0.004％PEG3350、7.5％海藻糖、0.13％或1.03％氯化钠。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种重组凝血因子Ⅷ冻干制剂，它不含白蛋白，在水中复溶快，且稳定性高。
为解决上述技术问题，本发明的重组凝血因子Ⅷ冻干制剂，用水复溶后，包含有：重组凝血因子Ⅷ、缓冲液、纯度稳定剂、活性稳定剂、增溶剂、表面活性剂。
各组分的较佳浓度为：重组凝血因子Ⅷ50-1500IU/mL，缓冲液5-50mM，纯度稳定剂5-100mM，活性稳定剂1-5mM，增溶剂150-350mM，表面活性剂0.005-0.05wt％。
所述缓冲液优选组氨酸缓冲液，浓度优选为10mM。
所述纯度稳定剂优选蔗糖或海藻糖，浓度优选为10mM。
所述活性稳定剂优选二价钙盐，例如氯化钙、葡萄糖酸钙、葡萄糖二酸钙等，浓度优选为2.5mM～5mM。
所述增溶剂优选氯化钠，浓度优选为300mM。
所述表面活性剂优选聚山梨酯80，浓度优选为0.01wt％。
较佳的，该冻干制剂用水复溶后，还包括有赋形剂(优选甘露醇)，赋形剂的浓度一般不超过150mM(优选110mM)。
所述冻干制剂中的水分含量为1-3wt％。在冻干过程中pH一般保持在6～8，优选6.5～7。
本发明的重组凝血因子Ⅷ冻干制剂，不含白蛋白，在水中可迅速复溶(30秒钟内)，且相比现有的重组凝血因子Ⅷ冻干制剂稳定性更高，在室温下以液体状态可保持至少达24小时的稳定。
附图说明
图1是本实施例的重组凝血因子Ⅷ复溶液体制剂纯度稳定性检测结果图。
图2是本实施例的重组凝血因子Ⅷ复溶液体制剂活性稳定性检测结果图。
具体实施方式
为对本发明的技术内容、特点与功效有更具体的了解，现结合具体实施例，对本发明作进一步详细的说明。实施例中所用辅料，如果没有特别说明，均为市售药用级别。
实施例1
本实施例的重组凝血因子Ⅷ的液体制剂的配方如下表1所示：
表1实施例1的重组凝血因子Ⅷ液体制剂配方
| 组分 | 用量 |
| 重组凝血因子Ⅷ | 1000IU/mL |
| 组氨酸缓冲液 | 10mM |
| 蔗糖 | 30mM |
| 氯化钠 | 300mM |
| 氯化钙 | 5mM |
| 甘露醇 | 110mM |
| 聚山梨酯80 | 0.01wt％ |
上述配方的重组凝血因子Ⅷ的冻干制剂的制备方法为：采用阴离子交换层析方法纯化，基于重组凝血因子与使用的缓冲介质中的带电离子的相互竞争作用，来获得重组凝血因子Ⅷ的原液。原液中重组凝血因子Ⅷ的浓度应在1000IU/mL以上。根据原液的体积计算所需的各类辅料的用量(参见表1)，并加入原液中。调整溶液中所有组分的浓度，获得半成品。将半成品无菌分装入西林瓶中，半加胶塞后进行冷冻干燥，获得重组凝血因子Ⅷ的冻干制剂成品。本实施例采用冷冻干燥机对重组凝血因子Ⅷ液体制剂进行冷冻干燥，冷冻干燥步骤包括：(1)将冻干机冻干室温度降至至少-45℃，保持2小时；(2)将冻干室的温度上升至-15℃～-35℃(优选-25℃)，保持1～3小时；(3)将冻干室温度降低至至少-45℃，保持2小时。在此冻结过程中，温度升降的速率优选为每分钟0.5℃～1.0℃。(4)冻干机压力降低至约0.1mBar后，将温度上升至-32℃～-35℃之间，进行一次干燥，该步骤最多约50小时；(5)一次干燥后，将温度上升至25℃，保持15小时，温度上升速率优选为0.2℃/分钟。
实施例2
本实施例的重组凝血因子Ⅷ的液体制剂的配方如下表2所示：
表2实施例2的重组凝血因子Ⅷ液体制剂的配方
| 组分 | 用量 |
| 重组凝血因子Ⅷ | 1000IU/mL |
| 组氨酸缓冲液 | 10mM |
| 蔗糖 | 10mM |
| 氯化钠 | 300mM |
| 氯化钙 | 2.5mM |
| 聚山梨酯80 | 0.01wt％ |
重组凝血因子Ⅷ的冻干制剂的制备方法同实施例1。
实施例3
本实施例的重组凝血因子Ⅷ的液体制剂的配方如下表3所示：
表3实施例3的重组凝血因子Ⅷ液体制剂的配方
| 组分 | 用量 |
| 重组凝血因子Ⅷ | 1000IU/mL |
| 组氨酸缓冲液 | 10mM |
| 海藻糖 | 10mM |
| 氯化钠 | 300mM |
| 氯化钙 | 2.5mM |
| 聚山梨酯80 | 0.01wt％ |
重组凝血因子Ⅷ的冻干制剂的制备方法同实施例1。
实验例4
对上述实施例1-3制备的重组凝血因子Ⅷ冻干制剂的水分含量、在水中的复溶时间以及复溶后的纯度稳定性和活性稳定性进行检测。其中，冻干制剂的水分含量由库伦法用Mettler Toledo C30D型卡尔费休水分仪测得；复溶后的纯度是使用凝胶过滤层析色谱仪来检测30天内的重组凝血因子Ⅷ主峰的纯度；活性稳定性是由发色底物法考察30天内重组凝血因子Ⅷ的活性。结果如表4及图1、2所示。
表4实施例1-3的重组凝血因子Ⅷ冻干制剂的水分含量及在水中复溶时间
| 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | |
| 水分含量(wt％) | 1.8 | 1.1 | 1.3 |
| 复溶时间(秒) | 11 | 16 | 12 |
Claims (5)
1.重组凝血因子Ⅷ冻干制剂，其特征在于，该冻干制剂用水复溶后，包含有：重组凝血因子Ⅷ、缓冲液、纯度稳定剂、活性稳定剂、增溶剂、表面活性剂；所述重组凝血因子Ⅷ的浓度为50-1500IU/mL；所述缓冲液包括组氨酸缓冲液，浓度为10mM；所述活性稳定剂包括二价钙盐，浓度为2.5mM～5mM；所述增溶剂包括氯化钠，浓度为300mM；所述表面活性剂包括聚山梨酯80，浓度为0.01wt％。
2.根据权利要求1所述的重组凝血因子Ⅷ冻干制剂，其特征在于，所述纯度稳定剂包括蔗糖或海藻糖，浓度为10mM。
3.根据权利要求1所述的重组凝血因子Ⅷ冻干制剂，其特征在于，还包括有赋形剂，浓度不超过150mM。
4.根据权利要求3所述的重组凝血因子Ⅷ冻干制剂，其特征在于，所述赋形剂包括甘露醇，浓度为110mM。
5.根据权利要求1所述的重组凝血因子Ⅷ冻干制剂，其特征在于，所述冻干制剂的水分含量为1-3wt％。
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