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CN106119219A - 酶活性提高的葡萄糖氧化酶突变体及其表达载体和应用 - Google Patents

酶活性提高的葡萄糖氧化酶突变体及其表达载体和应用 Download PDF

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CN106119219A
CN106119219A CN201610528933.7A CN201610528933A CN106119219A CN 106119219 A CN106119219 A CN 106119219A CN 201610528933 A CN201610528933 A CN 201610528933A CN 106119219 A CN106119219 A CN 106119219A
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CN
China
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ala
gly
leu
thr
val
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Application number
CN201610528933.7A
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肖志壮
张稳
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Qingdao Red Cherry Biotechnology Co Ltd
Original Assignee
Qingdao Red Cherry Biotechnology Co Ltd
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/03—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with a oxygen as acceptor (1.1.3)
    • C12Y101/03004—Glucose oxidase (1.1.3.4)

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Abstract

本发明提供了酶活性提高的葡萄糖氧化酶突变体及其表达载体和应用。本发明以根据巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）的密码子偏好性进行过优化的葡萄糖氧化酶为基础，使用易错PCR 方法对该酶基因进行突变，再通过高通量筛选方法挑选出正突变，经过两轮易错PCR和之后的理性设计，最终获得4个酶活显著提高的突变体，分别为GOD‑M01、GOD‑M02、GOD‑M03和GOD‑M04，其酶活与原始基因相比，分别提高了47%、55%、83%和117%。

Description

酶活性提高的葡萄糖氧化酶突变体及其表达载体和应用
技术领域
本发明属于基因工程和酶工程领域，具体内容涉及酶活性提高的葡萄糖氧化酶突变体及其表达载体和应用。
背景技术
葡萄糖氧化酶(glucose oxidase,E.C.1.1.3.4,GOD)有氧条件下能专一性地催化β-D-葡萄糖生成葡萄糖酸和过氧化氢，在工业领域具有重要的应用价值，目前已经在食品工业、畜牧养殖和医疗检测等领域中得到广泛应用。葡萄糖氧化酶广泛分布于动植物和微生物体内，微生物是其主要来源，主要生产菌株为黑曲霉和青霉。产自特异青霉和黑曲霉的葡萄糖氧化酶已被列入农业部《饲料添加剂品种目录(2013)》第4大类酶制剂。随着葡萄糖氧化酶越来越多的被应用于各个领域，工业上尤其是饲料工业对其现有性能有了越来越高的要求，其中葡萄糖氧化酶的催化效率决定了其应用成本，只有具有较高的酶活的葡萄糖氧化酶才能有效控制成本，从而适应大规模工业化生产的要求，实现产品市场化和商业化。筛选高酶活的天然葡萄糖氧化酶是一条重要途径，而使用蛋白质工程手段对天然葡萄糖氧化酶的人工改造也越来越广泛地被应用。
易错PCR(error-prone PCR)技术是在利用Taq酶进行PCR扩增目的基因时，通过调整反应条件(如提高酶离子浓度，改变体系中4种dNTP的浓度等)，改变Taq酶的突变频率，从而向目的基因中以一定频率引入突变，构建突变库，然后选择或筛选需要的突变体。为了获得更好的突变效果，可以使用连续易错PCR(sequential error prone PCR)策略，即将一次PCR扩增得到的正突变基因作为下一次PCR扩增的模板，连续反复地进行随机诱变，使每一次扩增得到的正向突变累积而产生重要的有益突变。
发明内容
本发明的目的是提供了酶活性提高的葡萄糖氧化酶突变体及其表达载体和应用。本发明通过对来源于黑曲霉(Aspergillus niger)的葡萄糖氧化酶进行蛋白质工程改造，使用易错PCR方法对葡萄糖氧化酶糖酶GOD-1基因进行突变，再通过高通量筛选方法将正突变检出，获得了突变体蛋白，与野生型相比，突变体的酶活性得到显著提高，从而有利于实现其在工业化生产中降低生产成本，提高使用效果。
为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
本发明提供了一种酶活性提高的葡萄糖氧化酶突变体GOD-M02，所述的葡萄糖氧化酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示，所述的葡萄糖氧化酶突变体GOD-M02由氨基酸序列为SEQ ID NO：1的葡萄糖氧化酶的第288位氨基酸由谷氨酸变为赖氨酸获得。
本发明提供了所述的葡萄糖氧化酶突变体GOD-M02的葡萄糖氧化酶编码基因。
本发明提供了含有所述的葡萄糖氧化酶编码基因的重组菌株。
本发明提供了一种酶活性提高的葡萄糖氧化酶突变体GOD-M03，所述的葡萄糖氧化酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示，所述的葡萄糖氧化酶突变体GOD-M03由氨基酸序列为SEQ ID NO：1的葡萄糖氧化酶的第207位氨基酸由赖氨酸变为谷氨酰胺、第288位氨基酸由谷氨酸变为赖氨酸获得。
本发明提供了所述的葡萄糖氧化酶突变体GOD-M03的葡萄糖氧化酶编码基因。
本发明提供了含有所述的葡萄糖氧化酶编码基因的重组菌株。
本发明提供了一种酶活性提高的葡萄糖氧化酶突变体GOD-M04，所述的葡萄糖氧化酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示，所述的葡萄糖氧化酶突变体GOD-M04由氨基酸序列为SEQ ID NO：1的葡萄糖氧化酶的第173位氨基酸由苏氨酸变为缬氨酸、第207位氨基酸由赖氨酸变为谷氨酰胺、第288位氨基酸由谷氨酸变为赖氨酸获得。
本发明提供了所述的葡萄糖氧化酶突变体GOD-M04的葡萄糖氧化酶编码基因。
本发明提供了含有所述的葡萄糖氧化酶编码基因的重组菌株。
本发明还提供了葡萄糖氧化酶突变体GOD-M02、GOD-M03、GOD-M04在用于制备动物饲料添加剂中的应用。
本发明的优点和技术效果是：本发明首先合成了葡萄糖氧化酶GOD-1全基因序列，同时根据巴斯德毕赤酵母密码子偏好性对其DNA序列进行优化，获得了优化的葡萄糖氧化酶基因序列，并采用易错PCR方法对其进行随机突变，以pET 28a(+)载体构建高效突变库，再将含有突变基因的质粒转入表达宿主E.coli BL21-DE3中，挑选单克隆表达蛋白，同时每个孔板接种野生型基因表达菌株作为对照。离心重悬后，取部分菌液测定酶活性。活性高于对照的菌株转接到新的培养板中，进行重复筛选。将筛选得到的酶活性高于对照的菌株，送基因测序公司测序，获得突变体DNA序列。
然后以第一轮获得的突变体DNA序列为模板，对其进行第二轮易错PCR，从构建的突变体库中继续筛选正突变的突变体。将两轮筛选获得的突变位点进行叠加，获得4个酶活力提高的突变体，分别为GOD-M01、GOD-M02、GOD-M03、GOD-M04序列信息见SEQ IDNO：3、SEQIDNO：4、SEQ IDNO：5和SEQ ID NO：6，相比野生型葡萄糖氧化酶糖酶GOD-1，本发明的4个突变体的酶活分别提高了47％、55％、83％和117％。
附图说明
图1为葡萄糖氧化酶突变体GOD-M01与野生型氨基酸序列比较结果；
图2为葡萄糖氧化酶突变体GOD-M02与野生型氨基酸序列比较结果；
图3为葡萄糖氧化酶突变体GOD-M03与野生型氨基酸序列比较结果；
图4为葡萄糖氧化酶突变体GOD-M04与野生型氨基酸序列比较结果；
图5为葡萄糖氧化酶突变体GOD-M01、GOD-M02、GOD-M03、GOD-M04与野生型的酶活比较测定结果。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细的说明。以下结合实施实例对本发明做进一步说明，需要指出的是，本实施例仅用于解释本发明，而非对本发明范围的限制。
实施例1：易错PCR(error–prone PCR)方法构建葡萄糖氧化酶GOD-1突变文库
来源于黑曲霉的葡萄糖氧化酶GOD-1由589个氨基酸组成(见SEQ ID NO：1)。为迅速得到GOD-1全基因序列以利于对GOD-1酶分子的改造，根据已报道的GOD-1基因序列信息，采用全基因合成方法合成了葡萄糖氧化酶GOD-1全基因序列(如Genbank ID KJ774107.1所示)，合成的基因两端还带有EcoR I和Not I酶切位点。同时根据巴斯德毕赤酵母密码子偏好性对其DNA序列进行优化，采用以优化后的GOD-1(见SEQ ID NO：2)为模板扩增葡萄糖氧化酶糖酶GOD-1基因，使用GeneMorph II随机突变PCR试剂盒(Stratagene)随机引入突变。
所用引物为：
5′-GCGCGAATTCTTGCCACATTACATTAGATCCAACGGTAT-3′(SEQ ID No:7)，5′-TAAAGCGGCCGCTTATTGCATAGAAGCGTAATCTTCCAAAATAGC-3′(SEQ ID No:8)
下划线处分别为EcoR I和Not I酶切位点。
反应条件为：94℃预变性10min，94℃变性60s，58℃退火60s和72℃延伸2min，共30个循环，1％琼脂糖电泳，试剂盒回收目的基因片段。
将目的片段用EcoR I和Not I双酶切消化后，与经过相同酶切的pET 21a(+)载体(氨苄抗性基因)用Ligase进行连接反应。将连接好的片段转化至大肠杆菌BL21-DE3，涂布含有氨苄青霉素的LB平板，37℃倒置培养，待平板上出现转化子后，挑取单克隆至96孔板，每孔中含有150uL LB培养基(含有1mM IPTG，50ng/mL氨苄青霉素)，同时每个孔板接种野生型基因表达菌株作为对照，30℃220rpm震荡培养12h，将孔板置于-20℃，反复冻融破壁，获得含有葡萄糖氧化酶的粗酶液。取出5uL粗酶液至新的96孔板，加入含有邻联茴香胺甲醇缓冲液、葡萄糖缓冲液、辣根过氧化物酶溶液的显色液共145uL，37℃反应3min后加入100uL2M硫酸终止反应，根据显色反应测定酶活。
取酶活力比野生型GOD-1高的菌株到新的96孔培养板中，进行重复筛选。筛选到2个突变体，分别为GOD-M01和GOD-M02，酶活力是野生型对照的1-2倍，分别挑取单克隆送基因测序公司测序。
测序结果显示，如图1和图2所示，本轮易错PCR获得了一个含T173V单点突变的突变体GOD-M01(其氨基酸序列为SEQ ID NO：3)以及一个含E288K单点突变的突变体GOD-M02(其氨基酸序列为SEQ ID NO：4)。
GOD-M01：Mutation:173T→V(第173位氨基酸由苏氨酸变为缬氨酸，其对应的DNA序列由ACT变为GTT)，
GOD-M02：Mutation:288E→K(第288位氨基酸由谷氨酸变为赖氨酸，其对应的DNA序列由GAA变为AAG)。
实施例2：第二轮易错PCR突变文库的构建和筛选突变文库的构建
将第一轮易错PCR方法筛选到的两个突变体GOD-M01和GOD-M02分别提取质粒作第二轮易错PCR的模板，突变文库的构建过程，使用的引物，PCR反应条件，同实施例1。通过以上过程，同样获得了大量的突变体基因片段。将构建得到的突变体转入大肠杆菌表达菌株BL21-DE3，筛选高活性正突变时以GOD-M01和GOD-M02为对照，其余操作与实施例2相同，取活性比突变型GOD-M01和GOD-M02高的菌株到新的96孔培养板中，进行重复筛选。筛选到1个酶活性提高的突变体，命名为GOD-M03。挑取单克隆送基因测序公司测序。
测序结果显示，如图3所示，本轮易错PCR获得了一个K207Q和E288K两点突变的突变体GOD-M03，其氨基酸序列为SEQ ID NO：5。
GOD-M03：Mutation:207K→Q(第207位氨基酸由赖氨酸变为谷氨酰胺，其对应的DNA序列由AAG变为CAA)；
Mutation:288E→K(第288位氨基酸由谷氨酸变为赖氨酸，其对应的DNA序列由GAA变为AAG)。
实施例3：突变位点叠加构建新突变体
根据实施例1和实施例2获得的突变体序列，将两轮突变获得的正突变位点进行叠加，具体是将突变体GOD-M03的173位的苏氨酸(Thr)突变为缬氨酸(Val)，构建一个含T173V、K207Q和E288K三点突变的突变体，如图4所示。此突变体序列直接交由基因合成公司合成。合成的基因两端带有EcoR I和Not I位点。该突变体命名为GOD-M04，其氨基酸序列为SEQ ID NO：6。
GOD-M04：173T→V(第173位氨基酸由苏氨酸变为缬氨酸，其对应的DNA序列由ACT变为GTT)；
Mutation:207K→Q(第207位氨基酸由赖氨酸变为谷氨酰胺，其对应的DNA序列由AAG变为CAA)；
Mutation:288E→K(第288位氨基酸由谷氨酸变为赖氨酸，其对应的DNA序列由GAA变为AAG)。
将构建得到的突变体转入大肠杆菌表达菌株BL21-DE3，评估其表达酶活时以GOD-M03为对照，其余操作与实施例2相同，最终证明此突变体GOD-M04与GOD-M03相比，酶活有了进一步提高。
实施例4：毕赤酵母工程菌株的构建
使用实施例1中所述引物，以实施例1和实施例2获得的突变体作为模板进行PCR扩增，得到了3条两端带有EcoR I和Not I酶切位点的葡萄糖氧化酶突变体基因。PCR反应条件为：94℃变性5min；94℃变性30s，56℃复性30s，72℃延伸2min，30个循环，72℃延伸10min。
将上述克隆得到的葡萄糖氧化酶突变体基因片段、实施例3中直接合成的突变体基因片段和原始葡萄糖氧化糖酶基因GOD-1基因片段经限制性内切酶EcoR I和Not I双酶切，和同样经过双酶切的pPIC9k载体相连接，构建表达载体pPIC9K-GOD-M01、pPIC9K-GOD-M02、pPIC9K-GOD-M03、pPIC9K-GOD-M04和pPIC9K-GOD-1。
将以上表达载体用SalI进行线性化，线性化片段用片段纯化试剂盒(TaKaRaMiniBEST DNA Fragment Purifibation Kit)纯化收集后，通过电转化方法转化毕赤酵母GS115，涂布MD平板。将在MD平板上生长出的菌落涂布到浓度依次逐渐升高(1mg/mL，2mg/mL，4mg/mL，8mg/mL)的遗传霉素的YPD平板上筛选多拷贝的阳性转化子，得到毕赤酵母重组菌株。
将5个基因的转化子分别命名为毕赤酵母GOD-M01(Pichia pastoris GOD-M01)、毕赤酵母GOD-M02(Pichia pastoris GOD-M02)、毕赤酵母GOD-M03(Pichia pastoris GOD-M03)、毕赤酵母GOD-M04(Pichia pastoris GOD-M04)和毕赤酵母GOD-1(Pichia pastorisGOD-1)，分别挑取每个基因的转化子转接于BMGY培养基中，30℃，220rpm振荡培养18h后，离心获得菌体，将适量菌体转入BMMY培养基中，使菌体浓度达到OD600＝1，30℃，220rpm继续振荡培养，每24h添加培养体积1％的甲醇。诱导表达4d后，将培养液离心获得上清，将上清液进行葡萄糖氧化酶活力测定。
葡萄糖氧化酶酶活力检测方法：
取邻联茴香胺缓冲液2.5mL(0.1mL1％邻联茴香胺甲醇储备液加入到12mL 0.1MpH6.0磷酸缓冲液配成)，18％葡萄糖溶液0.3mL，0.03％过氧化物酶溶液0.1mL，加入到比色管中37℃保温5min，再加入0.1mL葡萄糖氧化酶酶液(空白管加入0.1mL蒸馏水)，反应3min后，加入2M硫酸2mL，混匀以终止反应。以标准空白样为空白对照，在540nm波长处测定空白(A0)和试样溶液(A1)的吸光值。得出ΔA＝A1-A0
试样酶活力计算：
X＝(ΔA×n×3)/(11.3×t×0.1)
T—测定时间，min
0.1—样品体积，mL
11.3—消光系数
N—稀释倍数
3—反应液体积，mL
酶活单位与定义：在pH5.5、37℃的条件下，每分钟能把1.0μmol的β-D-葡萄糖氧化成葡萄糖酸和H2O2的酶量为一个单位。
酶活测定结果：如图5所示。按照上述方法测定得到毕赤酵母GOD-1发酵上清液的酶活为53U/mL，而毕赤酵母GOD-M01、毕赤酵母GOD-M02、毕赤酵母GOD-M03和毕赤酵母GOD-M04发酵上清液的酶活分别为78U/mL，82U/mL，97U/mL和115U/mL，酶活水平分别提高了47％、55％、83％和117％。
实施例5：葡萄糖氧化酶的养殖应用实验
5.1实验设计
黄羽肉鸡苗购自山东某种禽厂，采用完全随机实验设计，将1000只0日龄黄羽肉雏鸡分为5个处理，每个处理4个重复，每个重复50只，其中实验组分四组，分别编号为实验1组、实验2组、实验3组和实验4组，分别对应在基础日粮中添加GOD-M01、GOD-M02、GOD-M03和GOD-M04葡萄糖氧化酶制剂，添加量均为0.2U/g日粮，剩余一个处理为对照组。实验为期70天，其中预饲期2天，正式期68天。
5.2生产性能测定
分别在实验开始第1、35、70天对各组鸡空腹称重，记录初始重和末重。饲养过程中，观察记录各组鸡的健康状况，并记录每周每笼采食量，统计实验期内的平均日增重、平均日采食量和料重比。
5.3实验统计与分析
35日龄时，各组葡萄糖氧化酶对其日采食量、日增重和料重比均无显著影响(P＞0.05)。70日龄时，与对照组相比，各组的葡萄糖氧化酶制剂对鸡的日采食量均有升高的趋势，分别升高了3.2％、4.1％、6.4％和2.0％，但各组间差异不显著(P＞0.05)。各实验组的日增重显著高于对照组(P＜0.05)，分别提高了12.4％、13.0％、25.3％和7.3％。各实验组料重比显著低于对照组(P＜0.05)，分别降低了9.7％、13.3％、16.5％和6.2％。
从以上实验结果可以看出，添加了葡萄糖氧化酶的各实验组与对照组相比，在采食量一致的情况下，平均日增重都有所增加，而料重比有所下降，在日粮中添加葡萄糖氧化酶的情况下，可以有效提高饲料转化率，增加养殖效益。
本实施例5为了便于体现本发明所述的葡萄糖氧化酶的应用，并不限于肉鸡的应用，因为所述的葡萄糖氧化酶可以添加到基础日粮中，可以用于其他畜禽类的饲喂。通常可以在猪、兔和奶牛等养殖过程中在其配合饲料中添加。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 青岛红樱桃生物技术有限公司
<120> 酶活性提高的葡萄糖氧化酶糖酶突变体及其表达载体和应用
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
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<211> 589
<212> PRT
<213> 黑曲霉
<400> 1
Leu Pro His Tyr Ile Arg Ser Asn Gly Ile Glu Ala Ser Leu Leu Thr
1 5 10 15
Asp Pro Lys Asp Val Ser Gly Arg Thr Val Asp Tyr Ile Ile Ala Gly
20 25 30
Gly Gly Leu Thr Gly Leu Thr Thr Ala Ala Arg Leu Thr Glu Asn Pro
35 40 45
Asn Ile Ser Val Leu Val Ile Glu Ser Gly Ser Tyr Glu Ser Asp Arg
50 55 60
Gly Pro Ile Ile Glu Asp Leu Asn Ala Tyr Gly Asp Ile Phe Gly Ser
65 70 75 80
Ser Val Asp His Ala Tyr Glu Thr Val Glu Leu Ala Thr Asn Asn Gln
85 90 95
Thr Ala Leu Ile Arg Ser Gly Asn Gly Leu Gly Gly Ser Thr Leu Val
100 105 110
Asn Gly Gly Thr Trp Thr Arg Pro His Lys Ala Gln Val Asp Ser Trp
115 120 125
Glu Thr Val Phe Gly Asn Glu Gly Trp Asn Trp Asp Asn Val Ala Ala
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Tyr Ser Leu Gln Ala Glu Arg Ala Arg Ala Pro Asn Ala Lys Gln Ile
145 150 155 160
Ala Ala Gly His Tyr Phe Asn Ala Ser Cys His Gly Thr Asn Gly Thr
165 170 175
Val His Ala Gly Pro Arg Asp Thr Gly Asp Asp Tyr Ser Pro Ile Val
180 185 190
Lys Ala Leu Met Ser Ala Val Glu Asp Arg Gly Val Pro Thr Lys Lys
195 200 205
Asp Phe Gly Cys Gly Asp Pro His Gly Val Ser Met Phe Pro Asn Thr
210 215 220
Leu His Glu Asp Gln Val Arg Ser Asp Ala Ala Arg Glu Trp Leu Leu
225 230 235 240
Pro Asn Tyr Gln Arg Pro Asn Leu Gln Val Leu Thr Gly Gln Tyr Val
245 250 255
Gly Lys Val Leu Leu Ser Gln Asn Gly Thr Thr Pro Arg Ala Val Gly
260 265 270
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275 280 285
His Glu Val Leu Leu Ala Ala Gly Ser Ala Val Ser Pro Thr Ile Leu
290 295 300
Glu Tyr Ser Gly Ile Gly Met Lys Ser Ile Leu Glu Pro Leu Gly Ile
305 310 315 320
Asp Thr Val Val Asp Leu Pro Val Gly Leu Asn Leu Gln Asp Gln Thr
325 330 335
Thr Ala Thr Val Arg Ser Arg Ile Thr Ser Ala Gly Ala Gly Gln Gly
340 345 350
Gln Ala Ala Trp Phe Ala Thr Phe Asn Glu Thr Phe Gly Asp Tyr Ser
355 360 365
Glu Lys Ala His Glu Leu Leu Asn Thr Lys Leu Glu Gln Trp Ala Glu
370 375 380
Glu Ala Val Ala Arg Gly Gly Phe His Asn Thr Thr Ala Leu Leu Ile
385 390 395 400
Gln Tyr Glu Asn Tyr Arg Asp Trp Ile Val Asn His Asn Val Ala Tyr
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Asp Leu Leu Pro Phe Thr Arg Gly Tyr Val His Ile Leu Asp Lys Asp
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Pro Tyr Leu His His Phe Ala Tyr Asp Pro Gln Tyr Phe Leu Asn Glu
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Leu Asp Leu Leu Gly Gln Ala Ala Ala Thr Gln Leu Ala Arg Asn Ile
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ccaagagata ctggagacga ttactcccca attgttaagg ctttgatgtc cgctgttgaa 600
gataggggtg ttccaactaa gaaggatttt ggatgtggcg acccacatgg agtttctatg 660
tttccaaaca ctttgcatga agatcaagtt agatccgatg ctgctagaga atggttgttg 720
cctaactacc aaagacctaa cttgcaagtt ttgactggtc aatacgttgg taaagttttg 780
ttgtcacaaa acggaactac tcctagagct gttggagttg aatttggtac tcataagggt 840
aacactcata acgtttacgc tgaacatgaa gttttgttgg ctgctggttc cgctgtttca 900
ccaactattt tggaatactc cggtattggt atgaagtcta ttttggaacc attgggtatt 960
gatactgttg ttgatttgcc agttggattg aacttgcaag atcaaactac tgctactgtt 1020
agatccagaa ttacttccgc tggagctgga caaggacaag ctgcttggtt tgctactttt 1080
aacgaaactt ttggagatta ctccgaaaag gctcatgaat tgttgaacac taagttggaa 1140
caatgggctg aagaagctgt tgctagaggt ggttttcata acactactgc tttgttgatt 1200
caatacgaaa actacagaga ttggattgtt aaccataacg ttgcttactc agaattgttt 1260
ttggatactg ctggagttgc ttcctttgat gtttgggatt tgttgccctt cactagagga 1320
tacgttcata ttttggataa agacccatac ttgcatcatt ttgcttacga tccacaatac 1380
tttttgaacg aattggattt gttgggacaa gctgctgcta ctcaattggc tagaaacatt 1440
tctaactcgg gtgctatgca aacttacttt gctggagaaa ctattccagg tgacaacttg 1500
gcttacgatg ctgatttgtc cgcttggact gaatacattc cataccattt tagacctaac 1560
taccacggag ttggtacttg ttctatgatg ccaaaggaaa tgggaggtgt tgttgataac 1620
gctgctagag tttacggagt tcaaggattg agagttattg atggttcaat tccaccaact 1680
caaatgtctt cacatgttat gactgtgttt tacgctatgg ctttgaagat ttcagatgct 1740
attttggaag attacgcttc tatgcaataa 1770
<210> 3
<211> 589
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Leu Pro His Tyr Ile Arg Ser Asn Gly Ile Glu Ala Ser Leu Leu Thr
1 5 10 15
Asp Pro Lys Asp Val Ser Gly Arg Thr Val Asp Tyr Ile Ile Ala Gly
20 25 30
Gly Gly Leu Thr Gly Leu Thr Thr Ala Ala Arg Leu Thr Glu Asn Pro
35 40 45
Asn Ile Ser Val Leu Val Ile Glu Ser Gly Ser Tyr Glu Ser Asp Arg
50 55 60
Gly Pro Ile Ile Glu Asp Leu Asn Ala Tyr Gly Asp Ile Phe Gly Ser
65 70 75 80
Ser Val Asp His Ala Tyr Glu Thr Val Glu Leu Ala Thr Asn Asn Gln
85 90 95
Thr Ala Leu Ile Arg Ser Gly Asn Gly Leu Gly Gly Ser Thr Leu Val
100 105 110
Asn Gly Gly Thr Trp Thr Arg Pro His Lys Ala Gln Val Asp Ser Trp
115 120 125
Glu Thr Val Phe Gly Asn Glu Gly Trp Asn Trp Asp Asn Val Ala Ala
130 135 140
Tyr Ser Leu Gln Ala Glu Arg Ala Arg Ala Pro Asn Ala Lys Gln Ile
145 150 155 160
Ala Ala Gly His Tyr Phe Asn Ala Ser Cys His Gly Val Asn Gly Thr
165 170 175
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180 185 190
Lys Ala Leu Met Ser Ala Val Glu Asp Arg Gly Val Pro Thr Lys Lys
195 200 205
Asp Phe Gly Cys Gly Asp Pro His Gly Val Ser Met Phe Pro Asn Thr
210 215 220
Leu His Glu Asp Gln Val Arg Ser Asp Ala Ala Arg Glu Trp Leu Leu
225 230 235 240
Pro Asn Tyr Gln Arg Pro Asn Leu Gln Val Leu Thr Gly Gln Tyr Val
245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
His Glu Val Leu Leu Ala Ala Gly Ser Ala Val Ser Pro Thr Ile Leu
290 295 300
Glu Tyr Ser Gly Ile Gly Met Lys Ser Ile Leu Glu Pro Leu Gly Ile
305 310 315 320
Asp Thr Val Val Asp Leu Pro Val Gly Leu Asn Leu Gln Asp Gln Thr
325 330 335
Thr Ala Thr Val Arg Ser Arg Ile Thr Ser Ala Gly Ala Gly Gln Gly
340 345 350
Gln Ala Ala Trp Phe Ala Thr Phe Asn Glu Thr Phe Gly Asp Tyr Ser
355 360 365
Glu Lys Ala His Glu Leu Leu Asn Thr Lys Leu Glu Gln Trp Ala Glu
370 375 380
Glu Ala Val Ala Arg Gly Gly Phe His Asn Thr Thr Ala Leu Leu Ile
385 390 395 400
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405 410 415
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420 425 430
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435 440 445
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465 470 475 480
Ser Asn Ser Gly Ala Met Gln Thr Tyr Phe Ala Gly Glu Thr Ile Pro
485 490 495
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500 505 510
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515 520 525
Met Met Pro Lys Glu Met Gly Gly Val Val Asp Asn Ala Ala Arg Val
530 535 540
Tyr Gly Val Gln Gly Leu Arg Val Ile Asp Gly Ser Ile Pro Pro Thr
545 550 555 560
Gln Met Ser Ser His Val Met Thr Val Phe Tyr Ala Met Ala Leu Lys
565 570 575
Ile Ser Asp Ala Ile Leu Glu Asp Tyr Ala Ser Met Gln
580 585
<210> 4
<211> 589
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
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1 5 10 15
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20 25 30
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35 40 45
Asn Ile Ser Val Leu Val Ile Glu Ser Gly Ser Tyr Glu Ser Asp Arg
50 55 60
Gly Pro Ile Ile Glu Asp Leu Asn Ala Tyr Gly Asp Ile Phe Gly Ser
65 70 75 80
Ser Val Asp His Ala Tyr Glu Thr Val Glu Leu Ala Thr Asn Asn Gln
85 90 95
Thr Ala Leu Ile Arg Ser Gly Asn Gly Leu Gly Gly Ser Thr Leu Val
100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
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165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
Leu His Glu Asp Gln Val Arg Ser Asp Ala Ala Arg Glu Trp Leu Leu
225 230 235 240
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245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
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Glu Tyr Ser Gly Ile Gly Met Lys Ser Ile Leu Glu Pro Leu Gly Ile
305 310 315 320
Asp Thr Val Val Asp Leu Pro Val Gly Leu Asn Leu Gln Asp Gln Thr
325 330 335
Thr Ala Thr Val Arg Ser Arg Ile Thr Ser Ala Gly Ala Gly Gln Gly
340 345 350
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355 360 365
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370 375 380
Glu Ala Val Ala Arg Gly Gly Phe His Asn Thr Thr Ala Leu Leu Ile
385 390 395 400
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405 410 415
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420 425 430
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435 440 445
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450 455 460
Leu Asp Leu Leu Gly Gln Ala Ala Ala Thr Gln Leu Ala Arg Asn Ile
465 470 475 480
Ser Asn Ser Gly Ala Met Gln Thr Tyr Phe Ala Gly Glu Thr Ile Pro
485 490 495
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500 505 510
Ile Pro Tyr His Phe Arg Pro Asn Tyr His Gly Val Gly Thr Cys Ser
515 520 525
Met Met Pro Lys Glu Met Gly Gly Val Val Asp Asn Ala Ala Arg Val
530 535 540
Tyr Gly Val Gln Gly Leu Arg Val Ile Asp Gly Ser Ile Pro Pro Thr
545 550 555 560
Gln Met Ser Ser His Val Met Thr Val Phe Tyr Ala Met Ala Leu Lys
565 570 575
Ile Ser Asp Ala Ile Leu Glu Asp Tyr Ala Ser Met Gln
580 585
<210> 5
<211> 589
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 5
Leu Pro His Tyr Ile Arg Ser Asn Gly Ile Glu Ala Ser Leu Leu Thr
1 5 10 15
Asp Pro Lys Asp Val Ser Gly Arg Thr Val Asp Tyr Ile Ile Ala Gly
20 25 30
Gly Gly Leu Thr Gly Leu Thr Thr Ala Ala Arg Leu Thr Glu Asn Pro
35 40 45
Asn Ile Ser Val Leu Val Ile Glu Ser Gly Ser Tyr Glu Ser Asp Arg
50 55 60
Gly Pro Ile Ile Glu Asp Leu Asn Ala Tyr Gly Asp Ile Phe Gly Ser
65 70 75 80
Ser Val Asp His Ala Tyr Glu Thr Val Glu Leu Ala Thr Asn Asn Gln
85 90 95
Thr Ala Leu Ile Arg Ser Gly Asn Gly Leu Gly Gly Ser Thr Leu Val
100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
Tyr Ser Leu Gln Ala Glu Arg Ala Arg Ala Pro Asn Ala Lys Gln Ile
145 150 155 160
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165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
Leu His Glu Asp Gln Val Arg Ser Asp Ala Ala Arg Glu Trp Leu Leu
225 230 235 240
Pro Asn Tyr Gln Arg Pro Asn Leu Gln Val Leu Thr Gly Gln Tyr Val
245 250 255
Gly Lys Val Leu Leu Ser Gln Asn Gly Thr Thr Pro Arg Ala Val Gly
260 265 270
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275 280 285
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290 295 300
Glu Tyr Ser Gly Ile Gly Met Lys Ser Ile Leu Glu Pro Leu Gly Ile
305 310 315 320
Asp Thr Val Val Asp Leu Pro Val Gly Leu Asn Leu Gln Asp Gln Thr
325 330 335
Thr Ala Thr Val Arg Ser Arg Ile Thr Ser Ala Gly Ala Gly Gln Gly
340 345 350
Gln Ala Ala Trp Phe Ala Thr Phe Asn Glu Thr Phe Gly Asp Tyr Ser
355 360 365
Glu Lys Ala His Glu Leu Leu Asn Thr Lys Leu Glu Gln Trp Ala Glu
370 375 380
Glu Ala Val Ala Arg Gly Gly Phe His Asn Thr Thr Ala Leu Leu Ile
385 390 395 400
Gln Tyr Glu Asn Tyr Arg Asp Trp Ile Val Asn His Asn Val Ala Tyr
405 410 415
Ser Glu Leu Phe Leu Asp Thr Ala Gly Val Ala Ser Phe Asp Val Trp
420 425 430
Asp Leu Leu Pro Phe Thr Arg Gly Tyr Val His Ile Leu Asp Lys Asp
435 440 445
Pro Tyr Leu His His Phe Ala Tyr Asp Pro Gln Tyr Phe Leu Asn Glu
450 455 460
Leu Asp Leu Leu Gly Gln Ala Ala Ala Thr Gln Leu Ala Arg Asn Ile
465 470 475 480
Ser Asn Ser Gly Ala Met Gln Thr Tyr Phe Ala Gly Glu Thr Ile Pro
485 490 495
Gly Asp Asn Leu Ala Tyr Asp Ala Asp Leu Ser Ala Trp Thr Glu Tyr
500 505 510
Ile Pro Tyr His Phe Arg Pro Asn Tyr His Gly Val Gly Thr Cys Ser
515 520 525
Met Met Pro Lys Glu Met Gly Gly Val Val Asp Asn Ala Ala Arg Val
530 535 540
Tyr Gly Val Gln Gly Leu Arg Val Ile Asp Gly Ser Ile Pro Pro Thr
545 550 555 560
Gln Met Ser Ser His Val Met Thr Val Phe Tyr Ala Met Ala Leu Lys
565 570 575
Ile Ser Asp Ala Ile Leu Glu Asp Tyr Ala Ser Met Gln
580 585
<210> 6
<211> 589
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 6
Leu Pro His Tyr Ile Arg Ser Asn Gly Ile Glu Ala Ser Leu Leu Thr
1 5 10 15
Asp Pro Lys Asp Val Ser Gly Arg Thr Val Asp Tyr Ile Ile Ala Gly
20 25 30
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35 40 45
Asn Ile Ser Val Leu Val Ile Glu Ser Gly Ser Tyr Glu Ser Asp Arg
50 55 60
Gly Pro Ile Ile Glu Asp Leu Asn Ala Tyr Gly Asp Ile Phe Gly Ser
65 70 75 80
Ser Val Asp His Ala Tyr Glu Thr Val Glu Leu Ala Thr Asn Asn Gln
85 90 95
Thr Ala Leu Ile Arg Ser Gly Asn Gly Leu Gly Gly Ser Thr Leu Val
100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
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165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
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275 280 285
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450 455 460
Leu Asp Leu Leu Gly Gln Ala Ala Ala Thr Gln Leu Ala Arg Asn Ile
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
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<210> 8
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
taaagcggcc gcttattgca tagaagcgta atcttccaaa atagc 45

Claims (10)

1.一种酶活性提高的葡萄糖氧化酶突变体GOD-M02，其特征在于，所述的葡萄糖氧化酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示，所述的葡萄糖氧化酶突变体GOD-M02由氨基酸序列为SEQ ID NO：1的葡萄糖氧化酶的第288位氨基酸由谷氨酸变为赖氨酸获得。
2.权利要求1所述的葡萄糖氧化酶突变体GOD-M02的葡萄糖氧化酶编码基因。
3.含有权利要求2所述的葡萄糖氧化酶编码基因的重组菌株。
4.一种酶活性提高的葡萄糖氧化酶突变体GOD-M03，其特征在于，所述的葡萄糖氧化酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示，所述的葡萄糖氧化酶突变体GOD-M03由氨基酸序列为SEQ ID NO：1的葡萄糖氧化酶的第207位氨基酸由赖氨酸变为谷氨酰胺、第288位氨基酸由谷氨酸变为赖氨酸获得。
5.权利要求4所述的葡萄糖氧化酶突变体GOD-M03的葡萄糖氧化酶编码基因。
6.含有权利要求5所述的葡萄糖氧化酶编码基因的重组菌株。
7.一种酶活性提高的葡萄糖氧化酶突变体GOD-M04，其特征在于，所述的葡萄糖氧化酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示，所述的葡萄糖氧化酶突变体GOD-M04由氨基酸序列为SEQ ID NO：1的葡萄糖氧化酶的第173位氨基酸由苏氨酸变为缬氨酸、第207位氨基酸由赖氨酸变为谷氨酰胺、第288位氨基酸由谷氨酸变为赖氨酸获得。
8.权利要求7所述的葡萄糖氧化酶突变体GOD-M04的葡萄糖氧化酶编码基因。
9.含有权利要求8所述的葡萄糖氧化酶编码基因的重组菌株。
10.葡萄糖氧化酶突变体GOD-M02、GOD-M03、GOD-M04在用于制备动物饲料添加剂中的应用。
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