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CN106117322A - 重组流感病毒血凝素(ha)抗原蛋白和含其的疫苗 - Google Patents

重组流感病毒血凝素(ha)抗原蛋白和含其的疫苗 Download PDF

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Abstract

本发明提供了重组的血凝素抗原蛋白，病毒样颗粒和重组流感病毒。本发明进一步提供了一种疫苗，它含有重组血凝素抗原蛋白质，病毒样颗粒或重组流感病毒。

Description

重组流感病毒血凝素(HA)抗原蛋白和含其的疫苗
本发明专利申请是基于2011年10月27日提交的发明名称为“重组流感病毒血凝素(HA)抗原蛋白和含其的疫苗”的中国专利申请201180052182.1号的分案申请。
技术领域
本发明涉及重组流感病毒血凝素蛋白和包含重组血凝素蛋白的疫苗。
背景技术
甲型流感病毒造成上个世纪流感大流行，并且是引起每年暴发的流感疫情的病原体。据世界卫生组织估计，流感疫情每年影响约5-15％的全球人口，每年造成3-500万重症病人和50万人死亡。世卫组织流感情况表211。世界卫生组织，日内瓦，瑞士(2003年)。
甲型流感病毒是正粘病毒家族的成员，具有广泛的寄主范围，包括人，马，狗，鸟和猪。它是一种有包膜的，负链RNA病毒，由一组8个RNA片段(缩写为PB2，PBL，PA，HA，NP，NA，M和NS)组成，编码至少10个病毒蛋白。HA片段编码血凝素蛋白(HA)。NA片段编码神经氨酸酶(NA)。根据血清学分类，迄今已经确定16个HA亚型(标记为HI-HI6)和9个NA亚型(标记为N1-N9)。目前全球在人群中传播的甲型流感的亚型包括H1N1，H1N2，和H3N2病毒；H5N1和H9N2在鸟类如鸡中传播；H1N1和H3N2病毒在猪群中传播。
目前流感灭活疫苗是三价的，含15微克来自两个甲型流感(H1N1和H3N2)亚型和一个B型流感毒株的HA。从他们在20世纪40年代引入临床应用，疫苗生产的基本技术和原则仍然是基本相同的。传统的智慧都集中在优化生产过程，以生产含有最大量HA蛋白的常规的病毒制备。另外，流感疫苗的标准化完全基于HA含量。
随着同一亚型内的传播病毒和为疫苗选择的病毒之间的抗原关联变得更遥远，疫苗的功效下降。流感病毒经历两种类型的抗原变异，“抗原漂移(antigenic drift)”和“抗原移位(antigenic shift)”。抗原漂移是新的流感病毒株的持续发生的部分原因，通过在HA和NA基因的突变而与他们的祖先不同。变化的量可能是细微或显着的。抗原变异的第二类型是“抗原移位”。当两种不同的流感病毒共感染同一宿主，交换完整基因组片段时，遗传移位可能发生。这可能会导致“重组”病毒，具有一个全新的基因组成，因此具有新特性。在一个病毒亚型直接跨越物种屏障的而没有在中间宿主重组的情况下，遗传变异也可能发生。流感病毒的抗原变异成为每年的流感疫情的发生和不定期的流行病的主要基础，使疫苗成分需要不断的进化。对流感疫苗而言，世卫组织现在每年两次选择三种病毒株，用于包含在季节性流感疫苗。虽然选定的毒株通常与流行株的抗原性接近，但是在一些年，他们却不接近。此外，在近几年H5N1型禽流感病毒和猪HlNl病毒引起了流感大流行的担忧。因此，有需要拥有会产生广谱的保护免疫力的疫苗。
发明内容
本发明的一个方面提供了重组HA抗原蛋白。在一个实施例中,该重组HA抗原蛋白包括含主要抗原性表位的胞外域,和长螺旋(LH)；其中所述长螺旋中存在至少一个选自CxxC(SEQ ID NO：3)，CxxxC(SEQ ID NO：4)或CxxxxC(SEQ ID NO：5)的2-半胱氨酸微域，，其x代表任意氨基酸；由此，当该重组HA抗原蛋白形成三聚体，所述在LH中的两个半胱氨酸形成串联二硫键带，共价地使该三聚体收紧。
在另一个实施例中，所述重组HA抗原蛋白进一步包括近膜螺旋(MPH)，跨膜区(TMD)；和胞质区(CPD)，其中所述LH，MPH，或TMD中存在至少一个选自CxxC(SEQ ID NO：3)，CxxxC(SEQ ID NO：4)或CxxxxC(SEQ ID NO：5)2的-半胱氨酸微域，，并且如果CxxxC(SEQ IDNO 4)在TMD存在，其中CFLLC被排除，由此，当所述重组HA抗原蛋白形成三聚体，在LH，MPH，或TMD中的两个半胱氨酸形成串联二硫键带，共价地使该三聚体收紧。
在另一个实施例中，重组HA抗原蛋白中的CPD或TMD来自一个HA蛋白，与提供胞外域和LH的HA蛋白是不一样的。
在另一个实施例中，重组HA抗原蛋白的TMD或CPD是人工合成肽或来自在其自然构象时形成三聚体的非HA蛋白。
在另一个实施例中，重组HA抗原蛋白是由DNA序列所编码的，该DNA序列被克隆到一个的体内表达载体；使重组HA表达载体被用作针对流感病毒感染的DNA疫苗。
在另一个实施例中，重组HA抗原蛋白被用作针对流感病毒感染的疫苗。
本发明的另一个方面提供了病毒样颗粒。在一个实施例中，所述病毒样颗粒包括重组HA抗原蛋白，其中所述重组HA抗原蛋白包括含有主要抗原表位的胞外域；长螺旋(LH)；近膜螺旋(MPH)，跨膜区(TMD)；和胞质区(CPD)；其中所述LH，MPH，或TMD中存在至少一个选自CxxC(SEQ ID NO：3)，CxxxC(SEQ ID NO：4)或CxxxxC(SEQ ID NO：5)的2-半胱氨酸微域，，其x代表任意氨基酸；并且如果CxxxC(SEQ ID NO 4)在TMD存在，其中CFLLC被排除；由此，当所述重组HA抗原蛋白形成三聚体，在LH，MPH，或TMD中的两个半胱氨酸形成串联二硫键带，共价地使该三聚体收紧。
在病毒样颗粒的另一个实施例中，所述CPD或TMD来自一个HA蛋白，与提供胞外域和LH的HA蛋白是不一样的。
在病毒样颗粒的另一个实施例中，所述TMD或CPD是人工合成肽或来自在其自然构象时形成三聚体的非HA蛋白。
在病毒样颗粒的另一个实施例中，所述病毒样颗粒被用作针对流感病毒感染的疫苗。
本发明的另一个方面提供了重组流感病毒，在一个实施例中，所述重组流感病毒包括重组HA抗原蛋白，其中所述重组HA抗原蛋白包括含有主要抗原表位的胞外域；长螺旋(LH)；近膜螺旋(MPH)，跨膜区(TMD)；和胞质区(CPD)；其中所述LH，MPH，或TMD中存在至少一个选自CxxC(SEQ ID NO：3)，CxxxC(SEQ ID NO：4)或CxxxxC(SEQ ID NO：5)的2-半胱氨酸微域，其x代表任意氨基酸；并且如果CxxxC(SEQ ID NO 4)在TMD存在，其中CFLLC被排除；由此，当所述重组HA抗原蛋白形成三聚体，在LH，MPH，或TMD中的两个半胱氨酸形成串联二硫键带，共价地使该三聚体收紧。
在重组流感病毒的另一个实施例中，所述CPD或TMD来自一个HA蛋白，与提供胞外结构域和LH的HA蛋白是不一样的。
在重组流感病毒的另一个实施例中，所述TMD或CPD是人工合成肽或来自在其自然构象时形成三聚体的非HA蛋白质。
在另一个实施例中，所述重组流感病毒被用作针对流感病毒感染的疫苗。
在进一步的实施例中，该疫苗是由减毒的重组流感病毒组成。在又一实施例中，该疫苗是由灭活病毒颗粒组成，来自所述重组流感病毒的病毒制备。
本发明的目标和优点从下面的详细描述的优选实施例与附图中变得显而易见。
附图说明
根据本发明的优选实施例现在将参照附图加以描述，其中相同的参考标号表示相同的元件。
图1是HA蛋白的一个功能域的域框图，其中标记的为有关功能域。
具体实施方式
可以通过引用以下的本发明的某些实施例的详细描述而更容易地理解本发明。
在本申请中，为了更充分地描述本发明所涉及领域状态，当出版物被引用，这些出版物的公开内容的全部经引用而并入本申请。
除非另有说明，在本发明的实践将采用分子生物学(包括重组技术)，微生物学，细胞生物学，生物化学，核酸化学和免疫学的现有技术，这些是在本领域的技能之内。这些技术在文献中已有完全解释，如分子克隆：实验室说明书，第三版(Sambrook和Russel，2001年)；动物细胞培养(RI Freshmey主编，1987年版)；分子生物学当代程序(FM Ausubel等主编，1987年，包括补充至2001年)；免疫学当代程序(JE Coligan等主编，1991年)；免疫分析手册“(D.Wild主编，斯托克顿出版社，纽约，1994年)；免疫学分析方法(R.Masseyeff，WHAlbert和NA Staines等主编，Weinheim：VCH VERLAGS GESELLSCHAFT MBH，1993年)。
流感病毒的表面有两种抗原，血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)，其中HA被认为是主要抗原。HA具有16个亚型(HI-HI 6)，它们的编码序列和氨基酸序列是多种多样的。在这里，一个示例性的HA(H3)，示于SEQ ID NO：1(编码序列)和SEQ ID NO 2(氨基酸序列)，其中示于SEQ ID NO 2的氨基酸序列包含17个氨基酸的信号肽，因此，所有下面的描述所采用的编号系统中，氨基酸18被编号为1。
HA最初翻译成一个单分子HA0，然后H0由蛋白酶裂解成HA1区(氨基酸1-328)和HA2(329-549)，其中HA1和HA2由一个链间二硫键而共价相连。
HA1包含了大部分的，如果不是全部的，抗原表位，HA2包含融合肽，长螺旋(LH)(氨基酸405-458)，近膜螺旋(MPH)(氨基酸492-511)，跨膜区(TMD)(AA 512-538)和胞质区(CPD)(AA 539-549)。在HA分子上的功能域图如图1所示，其中只标注相关结构域包括HA1，LH，MPH，TMD，CPD的标记。虽然它们的DNA序列各不相同，但是其结构有着相似的域。HA具有三聚体结构，像纤突样突出在病毒表面。普遍认为，LH，MPH，和TMD负责HA三聚体结构的形成和稳定。另外，LH参与形成稳定三聚体的三重链盘绕的线圈；它可以解释为什么在被删除跨膜和胞质区后，HA保持其三聚体构象。应当注意的是，尽管裂解对病毒感染是关键的，但是HA1和HA2可以作为一个没有裂解的单一的多肽，被用作疫苗中的抗原或其他功能。
以往的研究表明，从自然感染的患者或免疫小鼠得到的单克隆抗体，可以与不同亚型的流感病毒交叉反应；例如，从一个免疫了季节性流感疫苗的人得到的单克隆抗体能与HI，H5和H9交叉反应。大部分的交叉反应的单克隆抗体是针对HA的茎干区的，但在2011年，临时申请提交后，一个单克隆抗体显示结合到HA的受体结合区域。所有这些研究提示，三聚体HA确实包含一些抗原表位，被大部分甚至是所有A型流感病毒所共享；不幸的是，通过用目前季节性疫苗免疫或自然感染所产生的针对共享的抗原表位的交叉反应抗体太低，不能针对抗原变异株提供任何有意义的保护，更遑论大流行毒株。如果流感疫苗能够诱导足够的针对共享抗原表位的交叉反应抗体，它会提供针对亚型间的(inter-subtypic)或亚型内的(intra-subtypic)的变异株的交叉保护(通用疫苗)。然而，面临的挑战是我们如何可以操纵(即HA抗原)来实现这一目标。本发明假设，在免疫或感染的主体中的交叉反应抗体的缺乏可能是在目前的疫苗中或感染过程中，只有较少的共享抗原表位存在；更进一步地，在目前疫苗中存在较少共享抗原表位的原因是，自然HA结构，特别是H1,H5和H9，没有提供足够的稳定性，来维持共享抗原表位。因此，如果HA结构的稳定性可以提高，合理的期望是共享抗原表位的存在的增加。然而，面临的挑战是如何稳定HA结构。
在我们的日常生活中，一束平行的材料如竹子和干草被腰带收紧。现在的问题是HA是否包含任何并行结构束，进一步是如果此结构束是存在的，任何腰带是否可以引入到HA的并行结构束。对于第一个问题，本发明分析如上所述的HA结构。HA2包含至少三个螺旋(即，LH，MPH和TMD)；多肽螺旋具有圆柱形的构象，因此，在LH，MPH和TMD的每一个螺旋在HA三聚体内形成三个平行螺旋的束；它提供了物理基础，用于引入一个或多个腰带，共价地连接所有三个HA单体。对于第二个问题，本发明记得，两个多肽之间可以形成由两个半胱氨酸形成的二硫键(S-S)；例如，HA1和HA2通过二硫键共价连接，IgG是一个由多个肽间的二硫键连接的同型二聚体。然而，一个半胱氨酸出现在HA三聚体中三个单体的每一个单体的对应的位置上，将允许形成一个二硫键，但剩下一个自由的SH基团。更关键的是，没有环形腰带围绕三个HA单体形成。为了形成一个环形腰带，本发明探讨它是否可行的去引入一对半胱氨酸到每一单体，因此在三个单体之间形成串联的三个二硫键。如已知的，在一个螺旋中的每匝包含3.6个氨基酸，其中的间距(每匝前进)是0.54nm，而上升(每个氨基酸残基前进)是0.15nm。对于一个由两个半胱氨酸形成的二硫键，中心之间的距离是0.849nm(2个c-c键(每键0.154nm)，1个c-s键(每键0.17nm)，和一个s-s键(0.201nm))。0.849nm的距离大约是1.57倍间距或5.66个氨基酸；这意味着，如果两个半胱氨酸没有由4个以上的氨基酸隔开，二硫键可以在两个螺旋之间形成。本发明发现，引入至少一对半胱氨酸到HA的LH，MPH和/或TMD能增加交叉反应的免疫应答；做出的引入是基于这样的假定，半胱氨酸对可能围绕三聚体的HA结构形成二硫键带，更紧地抓住HA三聚体。尽管由于缺乏手段，稳定性的改变并没有被实际测量，但是增加交叉反应免疫应答的最终结果证明了这个假定的正确性。
本发明提供了引入至少一对半胱氨酸到HA的螺旋区域(LH，MPH和TMD)，形成三个2-半胱氨酸微域之一((CxxC(SEQ ID NO：3)；CxxxC(SEQ ID NO：4)；CxxxxC(SEQ ID NO：5)，使在三个单体之间形成一个串联二硫键带，其中在微域的'x'是任何氨基酸，只要他们不打破螺旋结构，优选地在人工创造的微域中是A，L，M，F，E，Q，H，K和R。说明性地，三种单体之间的三个二硫键(单体1有1C1和1C2，单体2有2C1和2C2，单体3有3C1和3C2)是1C1-2C2，2C1-3C2，和3C1-1C2。此串联二硫键带紧紧地把三个单体抓在一起，形成一个高度稳定的三聚体。此发现是具有重要的意义，因为任何由HA代表的三聚体蛋白质可被改变，以包括至少一个2-半胱氨酸微域，因此三聚体结构通过共价键带被稳定。当此类HA以重组蛋白，VLP或病毒的形式作为抗原被用于疫苗，该疫苗将诱导增强的亚型内的(intra-subtypic)或亚型间的(inter-subtypic)免疫应答。这是令人惊讶地注意到，在NCBI的蛋白数据库中搜索任何2-半胱氨酸微域的存在发现一个2-半胱氨酸微域(CFLLC)，属于CxxxC(SEQ ID NO：4)，出现在H3HA的TMD。H1-H5和H7-H16不包含任何2-半胱氨酸微域。保守的HI-HI 6的TMD的氨基酸序列由SEQ ID NO 6-21分别代表，并总结在表1中，其中半胱氨酸被突出显示。表1。H 1-H16的TM和CP域的示例性序列
在H3HA的TMD中存在属于CxxxC(SEQ ID NO 4)的2-半胱氨酸微域(CFLLC)，提供了对本发明实用性的支持。我们进一步进行文献检索，发现没有特定地研究该独特微域的功能。有趣的是，在研究亚型间交叉免疫应答的浩瀚的文献中，一些研究报告称，H3N2病毒灭活疫苗的粘膜免疫确实显示对HlNl或H5N1的部分亚型间的交叉保护，但所有这些报告得出的结论是，引起的亚型间的交叉保护是由于独特的免疫途径(即，粘膜免疫)，教育研究者远离探索H3N2病毒是否有可能是为所取得的交叉保护负责的任何特殊的结构特征，更不用说CFFLC微域。引入一个串联二硫键带到重组HA蛋白可以通过使用任何合适的分子生物学方法来达到，例如，点突变，插入或取代；它们在本领域中是成熟和已知的。
生产重组HA蛋白的示例性实施例包括：(1)在任何HA螺旋(LH，MPH或TMD)中突变两个氨基酸残基成半胱氨酸，以形成一个2-半胱氨酸微域，具有一个选自CxxC(SEQ ID NO：3)，CxxxC(SEQ ID NO：4)，或CxxxxC(SEQ ID NO：5)的序列；如表1所示，H3TMD(SEQ ID NO：8)包含一个2-半胱氨酸微域CFLLC(属于SEQ ID NO 4)，位于12和16(TMD的氨基酸的编号是从1-27)，这将是本发明的一个例外；另外，如果一个半胱氨酸已经存在(例如，H4TMD(SEQID NO：9))，一个氨基酸的突变是需要的；(2)插入2-半胱氨酸微域到任何HA螺旋(LH，MPH或TMD)，只要插入不破坏螺旋结构；(3)用一个含有一个2-半胱氨酸微域的合成多肽来取代任何的HA螺旋(LH，MPH或TMD)中一段相应氨基酸；(4)用来自一个含有2-半胱氨酸微域例如H3TMD CFFLC的天然分子的一段氨基酸，来取代任何的HA螺旋(LH，MPH或TMD)中一段相应氨基酸；(5)融合HA的胞外域到另一种蛋白的跨膜区和胞质区，其中所融合的跨膜区包含至少一个2-半胱氨酸微域，例如，H1-H2和H4-H16的胞外域可融合到H3的跨膜/胞质区。
在一些实施例中，HA的LH和MPH可以被改变，因此包含至少一个2-半胱氨酸微域，使在三聚体中形成串联二硫键带。这将允许表达可溶形式的三聚体，以共价键稳定。在某些实施例中，两个或更多的2-半胱氨酸微域可以被引入一个HA重组蛋白。
本发明的一个实施例提供了重组HA抗原蛋白，其包含含有主要抗原表位的胞外域，长螺旋(LH)，近膜螺旋(MPH)，跨膜区(TMD)和胞质区(CPD)，其中在LH，MPH或TMD中存在至少一个选自CxxC(SEQ ID NO：3)，CxxxC(SEQ ID NO：4)，或CxxxxC(SEQ ID NO：5)的2-半胱氨酸微域。在一些实施例中，来自HA蛋白的天然TMD或CPD被修改，以包含一个或多个2-半胱氨酸微域。在一些实施例中，TMD或CPD来自其他例如HIV包膜分子的三聚体分子。在一些实施例中，TMD或CPD可以是人工合成的。重组HA抗原蛋白可以在任何合适的系统中表达，只要表达系统生产用于疫苗使用的有效重组HA抗原蛋白，例如，酵母，昆虫细胞或哺乳动物细胞表达系统是适合的。
本发明的另一个实施例提供了可溶性重组HA抗原蛋白，其包括含有主要抗原表位的HA蛋白的胞外域，和LH，但没有跨膜区(TMD)和胞质区(CPD)，其中，在LH指存在至少一个选自CxxC(SEQ ID NO：3)，CxxxC(SEQ ID NO：4)或CxxxxC(SEQ ID NO：5)的2-半胱氨酸微域。可溶性重组HA抗原蛋白可以在任何合适的系统中表达，只要表达系统生产用于疫苗使用的有效重组HA抗原蛋白，例如，酵母，昆虫细胞或哺乳动物细胞表达系统是适合的。
本发明的另一个实施例提供了体内表达载体，包括编码重组HA抗原蛋白的编码序列，其中重组HA抗原蛋白包括含有主要抗原表位的胞外域，长螺旋(LH)，近膜螺旋(MPH)，跨膜区(TMD)，和胞质区(CPD)，其中在LH，PMH或TMD中存在至少一个选自CxxC(SEQ ID NO 3)，CxxxC(SEQ ID NO 4)或CxxxxC的(SEQ ID NO 5)的2-半胱氨酸微域。在一些实施例中，来自HA蛋白的天然TMD或CPD被改变，以包含一个或多个2-半胱氨酸微域。
在一些实施例中，TMD或CPD来自其他例如HIV包膜分子的三聚体分子。在一些实施例中，TMD或CPD可以是人工合成的。表达载体被用作DNA疫苗；示例性的表达载体包括慢病毒表达载体，腺病毒表达载体，腺相关病毒表达载体或其它哺乳动物表达载体。例如，HA重组蛋白的编码序列被克隆到一个CMV/R表达载体，用于在哺乳动物细胞中的高效表达。
本发明的另一个实施例提供了病毒样颗粒，包含重组HA抗原蛋白，其包括含有主要抗原表位的胞外域，长螺旋(LH)，近膜螺旋(MPH)，跨膜区(TMD)和胞质区(CPD)，其中在LH，MPH或TMD中存在至少一个选自CxxC(SEQ ID NO：3)，CxxxC(SEQ ID NO：4)，或CxxxxC(SEQ ID NO：5)的2-半胱氨酸微域。在一些实施例中，来自HA蛋白的天然TMD或CPD被改变，以包含一个或多个2-半胱氨酸微域。在一些实施例中，TMD或CPD来自其他例如HIV包膜分子的三聚体分子。在一些实施例中，TMD或CPD可以是人工合成的。流感病毒样颗粒是可以通过任何合适的方法产生的。在一些实施例中，流感VLP的产生是通过共表达重组HA抗原蛋白，流感病毒NA和M蛋白。VLP可以通过本领域中成熟和已知的任何合适的方法产生。
本发明的另一个实施例提供了一种重组流感病毒，含有如上所述的重组HA抗原蛋白质。重组流感病毒可以是通过任何已知的方法例如反向遗传产生的。在使用重组流感病毒生产疫苗过程中，病毒制备可以遵循另一个题为“病毒疫苗以及其制备工艺”(WO 2012/058492 A2)的相伴专利申请的教导，在其中感染性病毒颗粒亚群在病毒制备中的比例是优化的。
本发明的主要目标是提供一种流感病毒疫苗，其能诱导间亚型间的和/或亚型内的交叉反应的免疫应答。因此，重组HA，编码重组HA的体内表达载体，病毒样颗粒和重组流感病毒都可以被用于疫苗。在同一时间，它们也可以被用在许多其他方式例如以产生交叉反应的单克隆抗体，或确定单克隆抗体的结合表位。这是要注意的是，许多生物技术的专利申请冗长，填充了大量的材料，包括领域中成熟和已知的方法和程序，因为生物技术被认为具有低可预测性，因此审查员可能驳回，因未能对本领域技术人员提供足够的细节来实践本发明(启用缺乏)。作为生物技术的研究人员，本发明的发明人坚信，作为一个整体，生物技术足够先进，在过去的三十年，许多基本的程序是成熟和已知的，更重要的是其结果如机械和电子工程领域一样可预测的。例如，对已知的病毒和序列，该病毒的DNA片段通过PCR扩增是一定能得到的；对已知序列的DNA片段，它应当可预见的被亚克隆到载体上，包括体外和体内表达载体；对一个克隆的表达载体，克隆的基因应当可预见地被表达和纯化；病毒样颗粒，也可以用已知的技术来产生；以及一种重组流感病毒可以从质粒系统，如反向遗传救出。作为一名专利律师，我坚信，生物技术专利申请已经来到一个时代，不需要往专利申请中填充不必要的材料，如同一个电子专利申请从不包括电容或放大器的功能的描述。消除填充的不必要的材料有助于审查员和客户避免时间的浪费，并且也使得本发明的原则可以很容易地理解。鉴于此，公知的方法和材料不包括在本申请中。如本文所用，“疫苗”指抗原制备，用于在个体中诱导免疫应答。疫苗可以有一个以上的抗原性成分。如本文所用，“非蛋白载体”指不是蛋白质的载体，并且可以用于实现流感矩阵和/或核蛋白的多聚体显示。
术语“微载体”指的是颗粒组合物,不溶于水，并具有小于约150，120或100微米的大小，更常用的是小于约50-60微米，并且可以小于约10微米或甚至小于约5微米。微载体包括“纳米载体”，这是具有的尺寸小于约1微米的，优选小于约500nm的，微载体。微载体包括固相颗粒如从生物相容性的天然聚合物，合成聚合物或合成的共聚物形成的颗粒，虽然琼脂糖或交联琼脂糖形成的微载体可以被包括在或排除出此处微载体的定义，以及其他领域中已知的生物降解材料。固相微载体由在哺乳类生理条件下非易受侵蚀的和/或不可降解的聚合物或其他材料形成，如聚苯乙烯，聚丙烯，二氧化硅，陶瓷，聚丙烯酰胺，金，乳胶，羟基磷灰石，和铁磁，顺磁材料。可生物降解的固相微载体由在哺乳类生理条件下可降解的聚合物(例如，聚(乳酸)，聚(乙醇酸))和它们的共聚物，如聚(D，L-丙交酯-共-乙交酯)或易受侵蚀的(例如，聚(原酸酯，如3,9-diethylidene-2-2,4,8,10-四氧杂螺[5,5]十一烷(DETOSU)或聚(酐)，如聚(酐)，癸二酸)来形成的。微载体的形状通常是球形的，但偏离球形的微载体也是可以接受的(例如，椭圆形，杆形，等)。由于其不溶性质，一些固相微载体是从水和水基(水溶液)溶液(例如，使用一个0.2微米的过滤器)过滤的。微载体也可以是液体相(例如，油或脂为基础)，如脂质体，无抗原的免疫刺激复合物(免疫刺激复合物，它是稳定的胆固醇，磷脂和佐剂活性皂甙的配合物)，或在水包油或油包水乳化剂中发现的液滴或胶束，如MF59。可生物降解的液相微载体通常含有一种可生物降解的油，其中一些在本领域中是已知的，包括角鲨烯和植物油。术语“不可生物降解的”，如本文所用，是指到一个微载体，在正常哺乳动物的生理条件下不被降解或侵蚀。一般来说，微载体被认为是不可生物降解的，如果在正常人血清中在37℃温育72小时后是没有退化的(即，失去小于它的5％的质量或平均长度)。
“个体”或“受试者”指脊椎动物，如禽类(鸡，鸭，鹅等)，以及哺乳动物。哺乳动物包括，但不限于，人类，非人类灵长类动物，农场动物，运动动物，实验动物，啮齿动物(例如，小鼠和大鼠)和宠物。一种物质的“有效量”或“足量”指一个量，足以实现所希望的生物学效应，如有益的结果，包括临床结果，因此，“有效量”取决于物质被应用的环境。在本发明的范围中，包含期望抗原的组合物的有效量的一个例子，是足够在个体诱导免疫应答的量。有效量可以给予一次或多次。“刺激”免疫应答，如体液或细胞免疫应答，指应答的增加，可能来自引发和/或增强应答。
如本文所用，以及在本领域中所熟知，“治疗”是一种方法，用于获得有益的或预期的结果，包括临床结果。对于本发明的目的，有益的或预期的临床效果包括，但不限于，改善或缓解一种或多种症状，缩小感染程度，稳定(即，不恶化)感染状态，减轻或改善感染状态，并消失(部分或全部)，是否检测或检测不到。“治疗”也可以意味着延长存活，相比于如果不接受治疗的预期生存期。
根据本发明，疫苗组合物的“剂量”，指疫苗组合物在一个特定的时间点给药的量。“剂量”也可以是疫苗组合物的量，通过使用的缓释制剂和/或装置逐渐给药给动物。在本发明的某些实施例中，两个或更多个疫苗组合物的剂量在不同的时间点给予动物。
根据本发明，流感病毒(例如，灭活流感病毒)的“免疫有效量”是流感病毒的量(通常在血细胞凝集单位或“HA单元”表示)，这将在处理过的动物中诱导针对后续的禽流感病毒的毒力株的攻击的完全或部分免疫力。完全或部分免疫力，可以通过观察评估，定量或定性，在禽流感病毒的毒力株的攻击后比较在接种疫苗的和未接种疫苗的动物上流感病毒感染的临床症状。当接种疫苗的动物遭受攻击后，与在未接种疫苗的动物遭受类似或相同的攻击后相比，观察到的流感病毒感染的临床症状被减少，减轻或消除，给予免疫动物的流感病毒的量被视为“免疫有效量”。“交叉保护免疫应答”指防止毒株感染，其与用来引起应答的毒株是不相同的。
如在本领域中所理解，“佐剂”是指一种或多种提高疫苗组合物的免疫原性和/或效力的物质。合适佐剂的非限制性例子包括角鲨烷和角鲨烯(或其他动物来源的油)；嵌段共聚物；洗涤剂如Tween-80；奎尔甲，矿物油如DRAKEOL或用Marcol，植物油如花生油；棒杆菌来源的佐剂，如棒状杆菌；丙酸dznved佐剂如痤疮丙酸杆菌，牛分枝杆菌(卡介苗或BCG)，白细胞介素如白细胞介素2和白介素12，单核因子如白细胞介素1，肿瘤坏死因子，干扰素如作为γ-干扰素；表面活性物质如十六烷基胺，十八烷基胺，十八烷基氨基酸酯，溶血卵磷脂，二甲基二甲基溴化铵，N，IV-dicoctadecyl基-N'，N'-双)2-羟基乙基-丙二胺)，methoxyhexadecylglycerol，和普鲁兰尼克多元醇；多胺如吡喃，葡聚糖，聚IC的卡波普；肽，如胞壁酰二肽及其衍生物，二甲基甘氨酸，促吞噬素(tuftsin)，油乳剂；及矿物凝胶，如磷酸铝，氢氧化铝或明矾；如皂苷-铝的氢氧化物或奎尔-甲铝的组合氢氧化脂质体；分枝杆菌细胞壁提取物，合成糖肽类，如胞壁酰二肽或其他衍生工具Avridine；脂质A衍生物，葡聚糖硫酸酯；DEAE-葡聚糖或磷酸铝；如CarbopoPEMA羧基聚亚甲基丙烯酸共聚物的乳液如Neocryl A640；牛痘或动物的的痘病毒蛋白质；子病毒粒子佐剂如霍乱毒素，或它们的混合物。本发明的治疗组合物可以配制在被治疗的对象可以容忍的赋形剂。此类赋形剂的例子包括水，盐水，林格氏(Ringer’s)溶液，葡萄糖溶液，Hank氏溶液，和其它含水生理平衡盐溶液。赋形剂也可以含有少量的添加剂，如增强等渗性和化学或生物稳定性的物质。缓冲液的例子包括磷酸盐缓冲液，碳酸氢盐缓冲液和Tris缓冲液，稳定剂的例子包括：A1/A2稳定剂，来自钻石动物健康，得梅因，爱荷华州。以有效方式给予治疗性组合物的可接受方案包括个体剂量的大小，剂量的数量，剂量给药的频率，及管理模式。可通过本领域技术人员完成，并且例子在此公开。给药的或给药被定义为引入一种物质到个体的身体，包括口，鼻，眼，直肠，阴道和肠胃外的途径。组合物可单独或与其他药物组合可以通过任何给药途径给药，包括，但并不限于，皮下(SQ)，肌肉内(IM)，静脉(IV)，腹腔内(IP)，皮内(ID)，通过鼻，眼或口腔粘膜(IN)或口服。在本发明的范围内，给予患者的剂量应该是在一个适当的时期内，足以在患者体内引起有益的应答。给予试剂的数量可能取决于受处理者，包括年龄，性别，体重和一般健康状况，其因素将取决于从业者的判断。本发明的免疫治疗组合物可用于预防性或治疗性地免疫动物如人类。然而，其他动物也在考虑之列，最好是脊椎动物，包括家养动物，如牲畜和伴侣动物。
该疫苗可与其他的组合共同使用，例如，用减毒疫苗初免，接着用灭活疫苗加强。
本发明涵盖所有含有抗原，佐剂，和药物上可接受的载体的药物组合物。在本发明中优选使用的药学上可接受的载体可包括无菌水溶液，非水溶液，悬浮液，和乳剂。非水溶剂的例子是丙二醇，聚乙二醇，植物油，如橄榄油，和可注射的有机酯，如油酸乙酯。含水载体包括水，酒精/水溶液，乳剂或悬浮液，包括生理盐水和缓冲介质。肠外载体包括氯化钠溶液，林格氏葡萄糖，葡萄糖和氯化钠，乳酸林格氏或固定油。静脉载体包括流体和营养补充剂，电解质补充剂(如基于林格氏葡萄糖“，和类似物)。防腐剂和其它添加剂也可存在诸如，例如，抗微生物剂，抗氧化剂，螯合剂，和惰性气体等。
实施例
提供下面实施例的唯一目的是说明本发明的原理；它们丝毫没有打算作为本发明的限制。
I、重组HA抗原蛋白
HA是来自PR8，一个众所周知的H1N1病毒。野生型HIHA的氨基酸序列由SEQ ID NO：22(565个氨基酸)所示；重组HIHA被示于SEQ ID NO：23，其中两个在TMD的氨基酸突变为半胱氨酸(S538C和L542C)，被命名为H12C。这些突变是通过点突变方法实现的。
这两个H1WT和H12C首先被亚克隆到一个pFast-Bac载体(Invitrogen公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州，美国)，杆状病毒重组体(rBacHlWT和rBacH12C)被制备，并用于感染草地夜蛾Sf9细胞来表达重组HA蛋白。表达的重组HI WT和H12C进行纯化，经Western blot检测，它们的功能进行了测试。II、包括重组HA抗原蛋白的体内表达载体
H1WT和H12C被克隆到体内表达载体，如腺病毒载体，痘苗病毒载体，腺相关病毒载体，慢病毒载体。它们被用作DNA疫苗用于免疫。他们诱导交叉反应免疫应答的效率是测试他们与亚型间的(例如，H3N2，H5N1)或亚型内的病毒的交叉反应。
III、含有重组HA抗原蛋白的病毒样颗粒
细胞系草地夜蛾Sf9细胞被保持在无血清的SF900II培养基(GIBCO，格兰德艾兰，NY)，28℃,旋转烧瓶的速度为100rpm。重组杆状病毒的生成Bac-Bac杆状病毒表达系统被用于产生重组杆状病毒载体，表达重组HA蛋白(H1WT(SEQ ID NO：22)，H12C(SEQ ID NO：23))。从PR8扩增出其他组分。其次通过使用退火到每个基因的3'和5'末端的特异性引物的PCR，含有HA，NA，Ml和NP基因的片段被克隆到pFast的Bac-双载体(Invitrogen公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州，美国)。重组杆粒的产生是通过位点特异性同源重组和转染含有流感基因的质粒到大肠杆菌的DHIO-BAC感受态细胞，其中含有AcMNPV的杆状病毒基因组(Invitrogen公司)。使用CellFectin试剂(Invitrogen)，1微克纯化的重组杆状病毒质粒DNA被转染到草地夜蛾Sf9昆虫细胞，接种于6孔培养板，浓度在5x105细胞/ml。将细胞培养3天，并从上清液中收获的病毒进行三轮噬斑纯化。
流感病毒样颗粒的形成和纯化
流感病毒样颗粒是通过用杆状病毒重组体共感染Sf9昆虫细胞得到的。
Sf9细胞的接种密度为每个烧瓶中2×106细胞，并在室温下静置沉降30分钟。
接着，用杆状病毒重组体共感染Sf9昆虫细胞，感染的多重性(MOI)为3-5，rBVs，并在28℃培养72小时。Sf9细胞的培养上清液(200ml)被收获和并通过离心澄清，4℃，2000×g，30分钟。在上清液中的病毒样颗粒是通过超速离心沉淀，4℃，100,000xg，60分钟。沉降的颗粒再悬浮于1毫升的磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液(pH 7.2)中,被加载到一个20％-30％-60％(重量/体积)的不连续蔗糖密度梯度并通过超速离心沉降,4℃，100,000xg，60分钟。收集的VLP带，并通过SDS-PAGE和Western blot分析。IV、包含重组HA抗原蛋白的重组流感病毒
采用反向遗传来产生重组流感病毒。两个重组流感病毒被拯救出，一个包含HIWT和一个包含H12C；都共享相同的遗传背景(即剩余的7段均来自PR8)。获救的重组流感病毒在鸡胚中扩增，并用0.1％福尔马林灭活。灭活的病毒与弗氏完全佐剂混合生产用于第一次免疫的疫苗(每剂5微克)，免疫Balb/c小鼠(每组5只)；在第二次免疫接种，使用了不完整的弗洛伊德佐剂。第二次免疫2周后，从不同的组中获得血清，针对一个H3N2病毒株病毒用ELISA法进行测试。ELISA结果(血清，稀释1600倍)如表2所示。
表2、HIWT和H12C血清针对纯化HIWT，H12C和H3N2的ELISA的结果
血清来源 H1WT H12C H3N2
H1WT 0.784 0.708 0.166
H12C 0.426 0.563 0.219
从表2中，当针对H1WT和H12C抗原的滴度相比较时，免疫H12C组的血清比免疫HIWT组的血清有一个较低的滴度。然而，对H3N2的滴度，从H12C来的滴度高于HIWT，证明引入形成一个CxxxC微域(SEQ ID NO：4)一对两个半胱氨酸到HI HA的TMD，增加其引发更强的交叉反应的免疫应答的能量。
尽管本发明参照特定的实施方式来描述，但是将被理解的是，实施例是说明性的，本发明的范围并不局限于此。本发明的替代实施例对本发明涉及的领域的普通技术人员将变得显而易见。这样的替代实施例都被认为是包含在本发明的精神和范围之内。因此，本发明的范围由所附的权利要求被描述，由前面的描述所支持。

Claims (18)

1.重组血凝素(HA)抗原蛋白，其特征在于：包括：
含有主要抗原表位的胞外域；和
长螺旋(LH)；其中在所述LH中存在至少一个选自CxxC(SEQ ID NO：3)，CxxxC(SEQ IDNO：4)或CxxxxC(SEQ ID NO：5)的2-半胱氨酸微域，其中x表示任意氨基酸；
从而当所述重组HA抗原蛋白形成三聚体，在LH中两个半胱氨酸形成一个串联二硫键带，共价键地收紧三聚体。
2.如权利要求1所述重组血凝素(HA)抗原蛋白，其特征在于：进一步包括：近膜螺旋(MPH)；跨膜区(TMD)；和胞质区(CPD)；所述LH，MPH或TMD中存在至少一个选自CxxC(SEQ IDNO：3)，CxxxC(SEQ ID NO：4)或CxxxxC(SEQ ID NO：5)的2-半胱氨酸微域，并且其中如果CxxxC(SEQ ID NO：4)是呈现在TMD中，CFLLC被排除；从而当重组HA抗原蛋白形成三聚体，在LH，MPH或TMD中的两个半胱氨酸形成一个串联二硫键带，共价键地收紧三聚体。
3.根据权利要求2所述重组血凝素(HA)抗原蛋白，其特征在于：其中所述TMD或CPD是来自和提供胞外域和LH的HA蛋白不一样的HA蛋白。
4.根据权利要求2所述重组血凝素(HA)抗原蛋白，其特征在于：其中所述TMD或CPD是人工合成的肽或来自在其自然构象时形成三聚体的非HA蛋白质。
5.根据权利要求1所述重组血凝素(HA)抗原蛋白，其特征在于：其中所述重组HA抗原蛋白是被DNA序列所编码的，该DNA序列被克隆到一个体内表达载体；因此重组HA表达载体被用作针对流感病毒感染的DNA疫苗。
6.根据权利要求2所述重组血凝素(HA)抗原蛋白，其特征在于：其中所述重组HA抗原蛋白是被DNA序列所编码的，该DNA序列被克隆到一个体内表达载体；因此重组HA表达载体被用作针对流感病毒感染的DNA疫苗。
7.根据权利要求1所述重组血凝素(HA)抗原蛋白，其特征在于：其中所述重组HA抗原蛋白被用于针对流感病毒感染的疫苗。
8.根据权利要求2所述重组血凝集(HA)抗原蛋白，其特征在于：其中所述重组HA抗原蛋白被用于针对流感病毒感染的疫苗。
9.病毒样颗粒，其特征在于：其包括：
重组血凝素(HA)抗原蛋白，其中所述重组HA抗原蛋白包括：
含有主要抗原表位的胞外域；长螺旋(LH)；
近膜螺旋(MPH)；
跨膜区(TMD)；和
胞质区(CPD)；
其中在所述LH，MPH或TMD中存在至少一个选自CxxC(SEQ ID NO：3)，CxxxC(SEQ ID NO：4)或CxxxxC(SEQ ID NO：5)的2-半胱氨酸微域，其中x表示任意氨基酸；并且其中如果CxxxC(SEQ ID NO：4)是呈现在TMD中，CFLLC被排除；
从而当所述重组HA抗原蛋白形成三聚体，在LH，MPH或TMD中的两个半胱氨酸形成一个串联二硫键带，共价键地收紧三聚体。
10.根据权利要求9所述病毒样颗粒，其特征在于：其中所述TMD或CPD来自和提供胞外域和LH的HA蛋白不一样的HA蛋白。
11.根据权利要求9所述病毒样颗粒，其特征在于：其中所述TMD或CPD是人工合成的肽或来自在其自然构象时形成三聚体的非HA蛋白质。
12.根据权利要求9所述病毒样颗粒，其特征在于：其中所述病毒样颗粒用于针对流感病毒感染的疫苗。
13.重组流感病毒，其特征在于：包括：
重组血凝素(HA)抗原蛋白，其中所述重组HA抗原蛋白包括：
含有主要的抗原表位的胞外域；长螺旋(LH)；
近膜螺旋(MPH)；
跨膜区(TMD)；和
胞质区(CPD)；
其中在所述LH，MPH或TMD中存在至少一个选自CxxC(SEQ ID NO：3)，CxxxC(SEQ ID NO：4)或CxxxxC(SEQ ID NO：5)的2-半胱氨酸微域，其中x表示任意氨基酸；并且其中如果CxxxC(SEQ ID NO：4)是要呈现在TMD中，CFLLC被排除；
从而当所述重组HA抗原蛋白形成三聚体，在LH，MPH或TMD中的两个半胱氨酸形成一个串联二硫键带，共价键地收紧三聚体。
14.根据权利要求13所述重组流感病毒，其特征在于：其中所述TMD或CPD是人工合成的肽或来自在其自然构象时形成三聚体的非HA蛋白质。
15.根据权利要求13所述重组流感病毒，其特征在于：其中所述TMD或CPD是人工合成的肽或来自在其自然构象时形成三聚体的非HA蛋白质。
16.根据权利要求13所述重组流感病毒，其特征在于：其中所述重组流感病毒用于针对流感病毒感染的疫苗。
17.根据权利要求16所述重组流感病毒，其特征在于：其中所述疫苗减毒重组流感病毒。
18.根据权利要求16所述重组流感病毒，其特征在于：其中所述疫苗包括来自所述重组流感病毒的病毒制备的灭活病毒颗粒。
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