[go: up one dir, main page]

CN106102903A - 用于生物颗粒纯化的分离基质 - Google Patents

用于生物颗粒纯化的分离基质 Download PDF

Info

Publication number
CN106102903A
CN106102903A CN201580013843.8A CN201580013843A CN106102903A CN 106102903 A CN106102903 A CN 106102903A CN 201580013843 A CN201580013843 A CN 201580013843A CN 106102903 A CN106102903 A CN 106102903A
Authority
CN
China
Prior art keywords
particles
ligand
separation matrix
matrix
primary amines
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201580013843.8A
Other languages
English (en)
Inventor
J-L.马洛伊塞
K.布斯森
K.拉克
B.诺伦
H.斯科格拉
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Global Life Sciences Solutions USA LLC
Original Assignee
GE Healthcare Bio Sciences Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by GE Healthcare Bio Sciences Corp filed Critical GE Healthcare Bio Sciences Corp
Priority to CN202210695588.1A priority Critical patent/CN114917884A/zh
Publication of CN106102903A publication Critical patent/CN106102903A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
    • B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
    • B01J20/3291—Characterised by the shape of the carrier, the coating or the obtained coated product
    • B01J20/3293—Coatings on a core, the core being particle or fiber shaped, e.g. encapsulated particles, coated fibers
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/10—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by constructional or operational features
    • B01D15/12—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by constructional or operational features relating to the preparation of the feed
    • B01D15/125—Pre-filtration
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/10—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by constructional or operational features
    • B01D15/20—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by constructional or operational features relating to the conditioning of the sorbent material
    • B01D15/203—Equilibration or regeneration
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
    • B01D15/30—Partition chromatography
    • B01D15/305—Hydrophilic interaction chromatography [HILIC]
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
    • B01D15/36—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving ionic interaction, e.g. ion-exchange, ion-pair, ion-suppression or ion-exclusion
    • B01D15/361—Ion-exchange
    • B01D15/363—Anion-exchange
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/28—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof characterised by their form or physical properties
    • B01J20/28014—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof characterised by their form or physical properties characterised by their form
    • B01J20/28016—Particle form
    • B01J20/28019—Spherical, ellipsoidal or cylindrical
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/281—Sorbents specially adapted for preparative, analytical or investigative chromatography
    • B01J20/286—Phases chemically bonded to a substrate, e.g. to silica or to polymers
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
    • B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
    • B01J20/3202—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the carrier, support or substrate used for impregnation or coating
    • B01J20/3206—Organic carriers, supports or substrates
    • B01J20/3208—Polymeric carriers, supports or substrates
    • B01J20/3212—Polymeric carriers, supports or substrates consisting of a polymer obtained by reactions otherwise than involving only carbon to carbon unsaturated bonds
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
    • B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
    • B01J20/3214—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the method for obtaining this coating or impregnating
    • B01J20/3217—Resulting in a chemical bond between the coating or impregnating layer and the carrier, support or substrate, e.g. a covalent bond
    • B01J20/3219—Resulting in a chemical bond between the coating or impregnating layer and the carrier, support or substrate, e.g. a covalent bond involving a particular spacer or linking group, e.g. for attaching an active group
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
    • B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
    • B01J20/3231—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the coating or impregnating layer
    • B01J20/3242—Layers with a functional group, e.g. an affinity material, a ligand, a reactant or a complexing group
    • B01J20/3244—Non-macromolecular compounds
    • B01J20/3246—Non-macromolecular compounds having a well defined chemical structure
    • B01J20/3248—Non-macromolecular compounds having a well defined chemical structure the functional group or the linking, spacer or anchoring group as a whole comprising at least one type of heteroatom selected from a nitrogen, oxygen or sulfur, these atoms not being part of the carrier as such
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
    • B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
    • B01J20/3231—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the coating or impregnating layer
    • B01J20/3242—Layers with a functional group, e.g. an affinity material, a ligand, a reactant or a complexing group
    • B01J20/3268—Macromolecular compounds
    • B01J20/327—Polymers obtained by reactions involving only carbon to carbon unsaturated bonds
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
    • B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
    • B01J20/3231—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the coating or impregnating layer
    • B01J20/3242—Layers with a functional group, e.g. an affinity material, a ligand, a reactant or a complexing group
    • B01J20/3268—Macromolecular compounds
    • B01J20/3278—Polymers being grafted on the carrier
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/22—Affinity chromatography or related techniques based upon selective absorption processes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/76—Albumins
    • C07K14/765—Serum albumin, e.g. HSA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/76—Albumins
    • C07K14/77—Ovalbumin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Treatment Of Liquids With Adsorbents In General (AREA)

Abstract

本发明公开用于生物颗粒纯化的分离基质，该基质包含具有多孔核实体和覆盖核实体的多孔壳实体的多个颗粒，其中核实体包含存在于共价结合配体上的至少50μmol/ml伯胺，显示至少2个伯胺/配体，壳实体包含小于20μmol/ml伯胺。本发明还公开纯化生物颗粒的方法，和制备分离基质的方法。

Description

用于生物颗粒纯化的分离基质
发明技术领域
本发明涉及用于纯化生物颗粒的分离基质，更具体地讲，涉及用于纯化疫苗抗原(例如，病毒颗粒)的分离基质。本发明还涉及分离基质用于纯化生物颗粒的用途，纯化生物颗粒的方法，和制备分离基质的方法。
发明背景
在很多疫苗中，抗原由具有显著大于蛋白分子大小的颗粒组成。这是对于例如病毒、类病毒颗粒、细菌和质粒抗原的情况。在这些抗原的产生过程中，它们与蛋白和显著小于抗原的其它污染物类一起产生。这些物类可以为例如卵-衍生抗原的卵蛋白和宿主细胞蛋白以及在细胞培养中产生的抗原的培养基组分。这些蛋白以高量存在，并且必须在抗原处理期间去除，因为它们可例如引起变态反应。
尺寸排阻色谱法已传统用于基于尺寸分离抗原和污染蛋白，但对产量的增加需求和过程经济已促使寻找替代方法。最近，已可利用一类色谱介质，其中用具有正电荷和疏水部分二者的配体功能化色谱珠粒的内核，而外壳为惰性，并具有小于病毒抗原的孔径。污染蛋白可通过壳穿透进入核，在此，它们被配体强力结合，并且病毒颗粒在不结合下通过柱，并且可收集在流过物中。此类介质可以商品名CaptoTM Core 700购自GE Healthcare Bio-Sciences AB。类似介质也描述于WO9839364、WO2009131526和US7208093，所述专利全文通过引用结合到本文中。
大多数抗原在离子强度接近在生理条件下正常的条件下产生，即，约0.1-0.2mol/l，对应于约10-20mS/cm电导率。在这些条件下，存在产物的结合容量受到限制，特别是依赖电荷相互作用机制的那些产物，因此，为了避免进料施加到色谱介质前稀释或缓冲剂交换，期望提高高盐条件下的结合容量。
另外，期望再用色谱介质进行许多分离循环。这需要在循环之间净化(也称为再生)介质，以去除吸附的蛋白。由于有疏水部分存在，这可能有挑战性，并且可能需要加入溶剂，例如醇，这在操作期间导致燃烧和爆炸风险。在增加配体的疏水性以提高在高离子强度的结合容量的情况下，这一问题变得更加严重。
因此，需要新基质，该基质允许在高离子强度下纯化疫苗抗原和来自污染蛋白的其它生物颗粒，同时允许在再用前安全和方便地净化基质。
发明概述
本发明的一个方面提供能够在高离子强度结合高量蛋白并允许在流通级分中回收生物颗粒的可再生分离基质。这用权利要求1限定的分离基质达到。
一个优点是基质对于一般污染蛋白在100-200mM和更高离子强度仍具有高结合容量。其它优点是，基质不结合病毒颗粒或类病毒颗粒，且可容易通过施加无溶剂再生溶液去除宽范围的顽固吸附污染蛋白，从而允许方便地再用基质。
本发明的第二个方面是提供用于分离生物颗粒的方法。这用权利要求限定的方法达到。这种方法的优点包括在高离子强度结合高量污染蛋白和容易再生基质的可能性。
本发明的第三个方面是提供分离基质用于纯化生物颗粒的用途。这用权利要求限定的方法达到。
本发明的第四个方面是提供制备适用于纯化生物颗粒的分离基质的方法。这用权利要求限定的方法达到。
本发明的其它适合实施方案如从属权利要求中所述。
附图简述
图1显示本发明的基质的示意结构。
图2显示配体的实例：a)三(2-氨基乙基)胺配体前体，b)三(2-氨基乙基)胺偶合配体，c)1,3-二氨基-2-丙醇配体前体，d)1,3-二氨基-2-丙醇偶合配体，e)聚烯丙胺配体前体，和f)聚烯丙胺偶合配体。
图3显示本发明的合成路线的实例：a)烯丙基化，b)溴化，c)失活，和d)偶合。
图4显示用不同再生溶液再生后大肠杆菌(E.coli)-污染CaptoTM Core 700萃取物的芯片电泳数据。泳路：1 - Mw 标记；2 - 1M NaOH；3 - 2M NaOH；4 - 2M NaOH + 30% 2-丙醇；5 - 30% 2-丙醇；6 - 1M NaOH + 20% 1-丙醇；7 - 1M NaOH + 10% 1-丙醇；8 - 1MNaOH + 5% 1-丙醇；9 - 20% 1-丙醇；10 - 0.5M NaOH/10mM HCl/0.5M NaOH；11 - 1MNaOH/10mM HCl/1M NaOH；12 - 20%丙二醇；13 - 40%丙二醇；14 - 1M NaOH + 20%丙二醇；15 - 1M NaOH + 40%丙二醇；16 - 8M 脲/1MNaOH；17 - 1M脲/1M NaOH；18 - 8M 脲；19 -8M 脲 + 0.1M柠檬酸；20 - 8M 脲 + 1M NaCl + 0.1M柠檬酸。
图5显示用不同再生溶液再生后大肠杆菌-污染聚烯丙胺原型萃取物的芯片电泳数据。泳路：1 - 1M NaOH；2 - 2M NaOH；3 - 1M NaOH + 30% 2-丙醇；4 - 1M NaOH + 20%1-丙醇；5 - 8M 脲；6 - 8M 脲 +0.1M柠檬酸；7 - 6M盐酸胍；8 - 0.5M NaOH + 1M NaCl；9- 1M NaOH/10mM HCl/0.5M NaOH；10 - 1M脲/1M NaOH；11 - 未再生；12 - Mw标记。
图6显示用不同再生溶液再生后大肠杆菌-污染三(2-氨基乙基)胺原型萃取物的芯片电泳数据。泳路：1 - 1M NaOH；2 - 2M NaOH；3 - 1M NaOH + 30% 2-丙醇；4 - 1MNaOH + 20% 1-丙醇；5 - 8M 脲；6 - 8M 脲 +0.1M柠檬酸；7 - 6M盐酸胍；8 - 0.5M NaOH+ 1M NaCl；9 - 1M NaOH/10mM HCl/0.5M NaOH；10 - 1M脲/1M NaOH；11 - 未再生；12 -Mw标记。
实施方案详述
在一个方面，如图1和2所示，本发明公开一种用于纯化生物颗粒的分离基质，该基质包含具有多孔核实体101和覆盖核实体的多孔壳实体102的多个颗粒100。多个内的各颗粒100可适合具有由多孔壳实体102覆盖的多孔核实体101。核实体包含存在于共价结合配体上的至少50μmol/ml伯胺，显示至少2个伯胺/配体，壳实体包含小于20μmol/ml伯胺，例如，小于10或小于1μmol/ml。术语显示指在配体处于结合态时，配体具有至少两个伯胺/配体。存在具有低于核实体的配体含量的壳实体可例如通过显微法检测。颗粒可与酸性荧光染料(例如，荧光素)或与对伯胺为反应性的荧光染料(例如，5-羧基荧光素琥珀酰亚氨基酯)接触，并且可在共焦显微镜下检测荧光的空间分布。或者，颗粒可经染色，包埋在树脂中，用切片机切片，并在常规显微镜下观察。利用两种方法，两个区域中的相对配体浓度可通过光密度法估计，绝对浓度通过乘以基质的总配体含量计算，例如，通过在本领域熟知的滴定法或分光方法测定。
在某些实施方案中，基质能够在具有至少10mS/cm(例如，至少20mS/cm)电导率的含水缓冲液中结合至少20mg卵白蛋白/ml基质，例如，至少30或至少40mg卵白蛋白。10mS/cm对应于约0.1M NaCl，20mS/cm对应于约 0.2M NaCl。由于大多数生理系统(例如，细胞培养、卵液、血浆、牛奶等)具有在这些范围内的电导率，因此，有利的是在这些条件下具有高蛋白结合容量，例如以卵白蛋白为例。基质也能够在甚至更高电导率(例如像20-30或30-40mS/cm)结合，这在例如液体为来自离子交换或HIC基质的洗出液时是受关注的。检验结合容量可适合在pH 7.5的Tris缓冲液中使用静态容量检验利用60min接触时间进行，如实施例中所述。
在一些实施方案中，所述配体显示至少2个伯胺/配体，例如，至少3个或至少4个。似乎每配体的可利用伯胺数对在高离子强度的结合容量是有利的，应至少为2。如果伯胺以仅一个键到另一个碳结合到伯碳原子，例如，在氨基甲基-或氨基乙基(分别为H2N-CH2-和H2N-CH2-CH2-)，则可更有利。与伯胺结合到仲或叔碳比较，这提供对蛋白较佳的可接近性。配体可具有不同分子量，可以为单体或聚合物，并且可形成较大结构的部分。
在某些实施方案中，配体通过仲或叔胺键连接到核实体。胺键化学稳定，且容易通过配体前体上的胺和载体材料上的亲电基团(例如，环氧化物或卤代醇)之间的偶合得到。配体前体可适合为具有至少3个伯胺的物类，以便消耗1个伯胺产生连接，在偶合基质中显示至少2个其余伯胺/配体。
在一些实施方案中，所述配体中氮和氧原子的组合含量为至少20%重量。结合配体中伯胺氮的含量可有利为至少18%重量。显示的伯胺与氮原子总量之比可以为至少0.5，例如至少0.7，或至少0.9。在这些比率下，配体亲水，即，它们不会不可逆地结合蛋白，且伯胺含量高得足以在高离子强度得到高结合。
在某些实施方案中，配体选自三(2-氨基乙基)胺和聚烯丙胺。这些配体亲水，并显示多个伯胺，甚至在通过胺结合时。这些配体可例如包括至少1kDa分子量的聚烯丙胺，例如，至少5kDa或至少10kDa。聚烯丙胺可适合地不交联，以提供活动性和接近蛋白。结合可在单点，或者通过多点结合。单点结合可例如通过接枝聚合，或者通过聚烯丙胺上的反应性端基偶合实现。根据在本领域已知的方法，由聚烯丙胺通过胺偶合到核实体上的亲电基团或醛，可实现多点结合。
在一些实施方案中，壳实体具有1至10微米平均厚度，例如1至6微米。最小壳厚度保证配体不可用于结合到分离基质颗粒外侧的生物颗粒，同时，为了使对核实体中蛋白的结合容量达到最大限度，壳厚度应适合地不太高。颗粒可为基本球形，例如，具有15-400微米体积加权平均直径，在此情况下，壳实体可具有颗粒体积加权平均直径0.5至6%的平均厚度。如果颗粒不是球形，壳实体可具有颗粒等效球直径的0.5至6%的平均厚度。颗粒的平均球度，定义为球(具有与指定颗粒相同的体积)的表面积与颗粒表面积之比，可以为至少0.9，例如，至少0.97。壳厚度可对经染色颗粒显微测定，如上讨论。分离基质颗粒可例如根据以下讨论方法制备，在此情况下，壳厚度可由部分失活方法控制。
在某些实施方案中，壳实体具有对于球状蛋白60至1000kDa的截断分子量，例如100-1000或400-800kDa。这有利允许污染蛋白快速质量传递进入和退出颗粒，同时防止生物颗粒达到核实体。例如，通过在它们结合到配体的条件下比较不同分子量蛋白的结合容量，可检测截断。
在第二个方面，本发明公开纯化生物颗粒的方法，所述方法包括以下步骤
a)提供根据以上公开的任何实施方案的分离基质；
b)使所述基质与包含生物颗粒和至少一种污染蛋白的液体接触，使得所述污染蛋白结合到所述基质；
c)从所述基质分离所述液体，并回收具有纯化生物颗粒的所述液体。
液体可以为例如来自卵的尿囊液、细胞培养上清液、溶胞产物等，并且可例如具有至少10mS/cm或甚至至少15mS/cm的电导率，这意味液体不必大量稀释。除了污染蛋白外，其它污染物，例如DNA和/或内毒素，也可结合到基质，并因此去除。方法可以为其中基质填入柱的色谱法，也可以为间歇吸附法(例如，使用磁性基质)，或例如膨胀床吸附法(例如，使用包含高密度填料颗粒的基质颗粒)。在柱中用基质作为填充床时，床可具有1mm-1m高度，例如，1cm至30cm，或1cm至10cm。填充床可仅包含本发明的基质，但也可设想具有其它基质的混合床。
在某些实施方案中，方法进一步包括以下步骤：
d)通过与再生溶液接触再生所述基质；并且
e)重复步骤a)-c)至少1次，例如，至少5次，至少10次，或至少50次。再生溶液可适合地不含有机溶剂，或包含小于15%重量易燃溶剂，例如小于5%重量，或小于1%重量，其有利之处在于，不必在过程中使用昂贵的防爆设备和现场。另外，它也提供更环境友好的过程。
在一些实施方案中，再生溶液包含碱，例如0.1-2M浓度的NaOH，例如0.5-2M。碱，具体地讲，NaOH，是有用的净化剂，因为它使蛋白水解，并且在洗涤和中和后不留下任何潜在毒性残余物。
在某些实施方案中，在步骤d)后基质中的残余蛋白含量小于100μg/ml基质。残余蛋白量，可由在0.5%SDS+28mM DTT萃取溶液中沸腾总萃取并由芯片电泳检测萃取蛋白测定，如实施例中所述。
在一些实施方案中，生物颗粒选自病毒、类病毒颗粒、细胞、细胞器和质粒。
在某些实施方案中，至少40mg/ml所述污染蛋白结合到基质，例如，至少60mg/ml。如果基质可载有大量液体，则是有利的，利用新基质这是可能的。熟知填充量应不超过基质的结合容量，因为这会导致穿透，并因此导致不良去除。
在一些实施方案中，液体包含缓冲物质。例如，这种缓冲物质可包含缓冲阳离子，例如Tris、Bis-Tris、曲辛或哌嗪，和/或单价缓冲阴离子，例如乙酸根、乳酸根等。如果液体不含多价阴离子例如磷酸根，则可为有利的，因为它们可能在一些条件下与配体太强地相互作用。
在某些实施方案中，液体的pH为6.0-8.5，例如6.5-8.5或6.5-8.0。在要纯化活的/存活的生物颗粒时，它们对pH高度敏感，在这些情况下限制可用范围。
在一些实施方案中，污染蛋白为白蛋白，例如，卵白蛋白或血清白蛋白。白蛋白是在卵衍生进料和细胞培养二者中的普通污染蛋白。
在某些实施方案中，生物颗粒包含流感病毒。液体可例如包括从受精卵得到的尿囊液，或者，可包括细胞培养上清液或溶胞产物。
在一些实施方案中，方法可进一步在步骤b)前包括步骤a’)，通过交叉流过滤调节所述液体，例如超滤和/或微滤。微滤，例如，在中空纤维中，可用于去除颗粒，不然可能堵塞色谱柱。如果需要，在液体施加到基质前，液体也可经过超滤，以提高生物颗粒的浓度。
在某些实施方案中，方法可进一步在步骤c)后包括步骤c’)，离子交换色谱法，例如阳离子交换色谱法。可用随后阳离子交换步骤去除任何剩余的带正电荷污染物。随后步骤也可进一步包括在具有功能核实体和惰性壳实体的基质上流通纯化。
在第三个方面，本发明公开以上公开的分离基质用于纯化生物颗粒的用途。生物颗粒可例如选自病毒、类病毒颗粒、细胞、细胞器和质粒。用途可例如用于以上公开的方法中。
在第四个方面，本发明公开制备以上公开分离基质的方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供多个多孔多糖载体颗粒，例如，交联琼脂糖凝胶颗粒；
b)使所述颗粒与烯丙基化试剂反应，以得到至少50、至少100或至少200μmol/ml共价结合到颗粒的烯丙基。
c)使所述颗粒与卤素反应最多30分钟时间，然后与碱性水溶液反应；
d)使包含多个伯胺的配体前体偶合到剩余烯丙基。
烯丙基化试剂可例如为烯丙基缩水甘油醚或烯丙基卤，例如烯丙基溴。卤素适合为溴，并且可施加到水溶液中。在步骤b)中，烯丙基遍布颗粒均匀引入，同时，在步骤b)中，与溴短接触时间只允许在各颗粒最外部分中的烯丙基和溴之间反应。与溴反应引起生成溴代醇，在碱的水溶液中转化成亲水非反应性二醇，因此导致生成惰性壳实体。如果碱的水溶液包含多元醇，多元醇可与溴代醇反应，并固定为亲水非反应性部分。也可用此类方法精细调节壳实体的孔结构。内部的烯丙基不反应，然后可用于偶合其中成为核实体的配体。壳实体的厚度可主要由与卤素的接触时间和步骤c)中所用卤素的量控制。
在某些实施方案中，载体颗粒为基本球形，且具有15-400微米体积平均直径，例如30-100微米。载体颗粒可例如由葡聚糖、琼脂糖、琼脂、角叉菜胶、藻酸盐、纤维素、魔芋或其它适合多糖制成。琼脂糖、琼脂糖衍生物(例如，羟乙基琼脂糖)、琼脂和纤维素特别适合，因为它们可方便地以适合孔隙度和刚度制备。也可使载体颗粒交联，可通过交联剂直接交联，例如表氯醇或二环氧化物，或者通过二级交联，如美国专利6,602,990中所述。后面方法提供改善的刚度。
在一些实施方案中，配体前体具有至少3个伯胺/分子，并且通过首先使烯丙基与卤素例如溴的水溶液反应，然后在碱性条件与配体前体反应偶合到烯丙基。
在某些实施方案中，配体前体选自三(2-氨基乙基)胺和聚烯丙胺，例如Mw为至少5kDa的聚烯丙胺，例如，至少10kDa。
实施例
实施例1. 原型合成
载体颗粒
所用载体颗粒为根据美国专利6,602,990所述方法制备的高度交联琼脂糖粒料，所述专利全文通过引用结合到本文中。粒料具有88微米体积加权平均直径(D50,v)，和使69%孔体积可用于Mw 110kDa葡聚糖分子的孔径分布。在根据"Handbook of ProcessChromatography, A Guide to Optimization, Scale-Up and validation"(工艺色谱手册，优化、放大和验证指南) (1997) Academic Press, San Diego. Gail Sofer & LarsHagel eds.ISBN 0-12-654266-X, p. 368中所述的方法测定时，也可表达为使粒料上葡聚糖110kDa的Kd为0.69。
烯丙基化
中间体5803
用6个凝胶体积蒸馏水洗涤400mL(g)载体颗粒，然后用3个凝胶体积以50%NaOH洗涤。然后将凝胶抽干，并转移到2L圆底烧瓶。加入775mL 50% NaOH，应用机械螺旋桨搅拌，并将烧瓶浸入50℃水浴。30分钟后，加入128mL烯丙基缩水甘油醚(AGE)。反应进行17h。用1个凝胶体积蒸馏水，用5个凝胶体积乙醇，然后用8个凝胶体积蒸馏水洗涤凝胶。
中间体5840
用6个凝胶体积蒸馏水洗涤120mL(g)载体颗粒，通过真空干燥，并转移(90.7g)到250mL圆底烧瓶。加入149.3mL 50% NaOH(11.8M)，应用机械螺旋桨搅拌，并将烧瓶浸入50℃水浴。30分钟后，加入36mL AGE。反应进行17h。用1个凝胶体积蒸馏水，用3个凝胶体积乙醇，然后用8个凝胶体积蒸馏水洗涤凝胶。
中间体6383
利用3个凝胶体积50%NaOH水溶液，在玻璃滤器上洗涤蒸馏水中的200mL(g)烯丙基化载体颗粒5803。然后将凝胶抽干，并转移到1L圆底烧瓶。加入388mL 50%NaOH水溶液，应用机械螺旋桨搅拌，并将烧瓶浸入50℃水浴。30分钟后，加入64mL烯丙基缩水甘油醚，并进行反应16h。用1个凝胶体积蒸馏水，用5个凝胶体积乙醇，然后用8个凝胶体积蒸馏水洗涤凝胶。
中间体3266A
用蒸馏水和用50%NaOH水溶液在玻璃滤器上洗涤256mL(g)载体颗粒。然后将凝胶抽干，并转移到1L圆底烧瓶。加入200mL 50%NaOH水溶液，应用机械螺旋桨搅拌，并将烧瓶浸入50℃水浴。30分钟后，加入200mL AGE，并进行反应17h。用蒸馏水、乙醇和蒸馏水洗涤凝胶。
部分溴化和壳失活
中间体6478
将192g(mL)烯丙基化载体颗粒6383与1728mL蒸馏水一起转移排入3L圆底烧瓶。应用机械搅拌。制备200mL水中1000µL溴的溶液。在约2分钟期间，在300rpm搅拌速度缓慢加入溴溶液(相当于88µm粒料的5µm壳中烯丙基的量)。20分钟后，用10个凝胶体积蒸馏水洗涤凝胶。
将196g(mL)部分活化凝胶转移排入1L圆底烧瓶。加入175.3g蒸馏水和20.7mL 50%NaOH(1M)，并应用机械搅拌。将烧瓶浸入50℃水浴，反应进行18.5h。然后用10个凝胶体积蒸馏水洗涤凝胶。滴定2x1mL以测定剩余烯丙基含量。
中间体5860
将115g(mL)烯丙基化载体颗粒5840与1035mL蒸馏水一起转移排入2L圆底烧瓶。应用机械搅拌。制备100mL水中408µL溴的溶液。在约2分钟期间，在250rpm搅拌速度缓慢加入溴溶液(相当于88µm粒料的5.5µm壳中的烯丙基)。在处理期间，在从锥形瓶(E-flask)倾倒时损失一些溴。随后，用塑料移液管加入。20分钟后，用10个凝胶体积蒸馏水洗涤凝胶。
将116g(mL)部分活化凝胶转移排入500mL圆底烧瓶。加入104g蒸馏水和12.25mL50% NaOH(1M)，并应用机械搅拌。将烧瓶浸入50℃水浴，反应进行16.5h。然后用10个凝胶体积蒸馏水洗涤凝胶。滴定2x1mL以测定剩余烯丙基含量。
中间体3266B
将260g(mL)烯丙基化载体颗粒3266A与2300mL蒸馏水一起转移排入3L圆底烧瓶。应用机械搅拌。制备250mL水中3.55g溴的溶液。在搅拌期间缓慢加入溴溶液。5分钟后，用蒸馏水洗涤凝胶。
将部分活化凝胶转移排入1L圆底烧瓶。加入250mL 2M NaOH水溶液，并应用机械搅拌。将烧瓶浸入50℃水浴，反应进行17h。然后用蒸馏水洗涤凝胶。滴定2x1mL以测定剩余烯丙基含量。
核溴化
将80g(mL)核烯丙基化载体颗粒6478与80mL水和3.2g乙酸钠一起转移排入500mL锥形瓶。然后加入溴的水溶液，直至出现持续黄色。加入甲酸钠(~2g)，以猝灭过量溴。用10个凝胶体积蒸馏水洗涤凝胶。
滴定烯丙基和剩余烯丙基(以测定失活壳厚度)
-用水洗涤凝胶。
-用立方体测量1.0mL凝胶，并转移到具有9mL蒸馏水的吸滤瓶。
-加入水中溴的饱和溶液，直至由于过量Br2出现持续黄色。
-磁力搅拌样品5min。
-使样品处于真空(水抽)下，带有磁力搅拌，以去除过量溴。
-然后，通过用10mL蒸馏水清洗烧瓶将样品转移到滴定烧杯。
-加入2-3滴浓HNO3，并开始用0.1M AgNO3滴定间接测定烯丙基含量。
-结果作为μmol/mL凝胶给出。
-从模型计算理论壳厚度，其中假定部分溴化和失活后的残余烯丙基含量完全在由不具有烯丙基的壳包围的核中。利用88微米直径和x微米壳厚度的粒料，在溴化/失活之前和之后的烯丙基含量之比为443/(44-x)3，由此可计算x。
表1. 烯丙基化和溴化/失活中间体的烯丙基含量
原型 烯丙基含量µmol/mL 理论壳厚度µm
5840 210 n/a
部分溴化和失活后的5860 164 3.5
6383 336 n/a
部分溴化和失活后的6478 264 3.5
3266 A 255 n/a
部分溴化和失活后的3266 B 190 4.0
配体偶合
1,3-二氨基-2-丙醇偶合
将24.8g 1,3-二氨基-2-丙醇(270mmol, 34eq)转移到100mL圆底烧瓶。将烧瓶浸入60℃水浴，以融化配体75分钟。
将30mL(g)核活化烯丙基化载体颗粒6478(7.92mmol烯丙基, 1eq)转移排入烧瓶，并应用机械螺旋桨搅拌(230rpm)。反应进行17h。在冷却烧瓶后，检测pH至~12。用12个凝胶体积蒸馏水洗涤凝胶。
三(2-氨基乙基)胺偶合
将40mL(g)核活化烯丙基化基质6478(10.56mmol烯丙基, 1eq)转移排入250mL圆底烧瓶。加入39.6mL三(2-氨基乙基)胺(264.3mmol, 25eq)，并应用机械螺旋桨搅拌(200rpm)。反应进行17h。检测pH至8.8。用10个凝胶体积蒸馏水洗涤凝胶。
聚烯丙胺偶合
将37mL(g)核活化烯丙基化基质3266B转移排入250mL圆底烧瓶。使11.3g聚烯丙胺Mw15kDa(Aldrich, 283215)溶于20ml蒸馏水+2ml 50%NaOH水溶液，并加到烧瓶。应用机械螺旋桨搅拌(200rpm)，并使反应在50℃进行17h。首先用0.5M HCl，然后用1mM HCl，然后用10个凝胶体积蒸馏水洗涤凝胶。
胺含量滴定
-用水洗涤凝胶。
-用3x0.5M HCl，然后用3x1mM HCl洗涤凝胶。
-用立方体测量1.0mL凝胶，并转移到具有19mL蒸馏水的滴定杯。
-加入2-3滴浓HNO3，并开始用0.1M AgNO3滴定间接测定胺含量。
-结果作为μmol/mL凝胶给出。
表2. 核-壳原型的胺含量
原型 胺含量µmol/mL 配体密度µmol/mL
1,3-二氨基-2-丙醇 168 84
三(2-氨基乙基)胺 221 55
聚烯丙胺Mw 15kDa 210 0.8
实施例2. 蛋白在原型上的结合容量
以6µl凝胶/孔填充空的96孔滤板。在板试验期间使用表3中所述的方法。根据洗出任何未结合蛋白所需，培养后洗涤次数在2和3之间变动。
表3. 板试验方法
分析
通过在280nm的吸光度和从校准曲线计算的浓度分析未结合蛋白。
结合蛋白的量从所加蛋白和未结合蛋白量的差计算。.
从浓度计算各孔的容量。
最大容量表示为g/L，这是基于关于各试验制备蛋白溶液计算的，不是通过在比色皿中UV检测。
对各系列不加蛋白进行空白试验，以排除来自其它UV吸收材料的任何干扰。
PAA上BSA和卵白蛋白的结合容量结果
原型：聚烯丙胺
离子容量：210µmol/ml
蛋白1：BSA 2g/l, IP~4.7
蛋白1：卵白蛋白2g/l, IP~4.7
缓冲剂系统1：40mM Tris pH 7.2-8.2
缓冲剂系统2：20mM哌嗪pH 6
盐：NaCl
表4. 聚烯丙胺原型上BSA的结合容量(g/L)
NaCl (mM) 0 250 500 750 1000 1250
pH 7,2 40mM Tris 32 62 33 11 1 0
pH 7,7 40mM Tris 32 62 44 3 0
pH 8,2 40mM Tris 44 61 40 14 3 0
如表4中所示，聚烯丙胺原型具有在250mM NaCl对于BSA的最高结合容量。在1250mMNaCl，聚烯丙胺原型没有对于BSA的容量，这表明对于BSA盐洗脱良好的可能性。
表5. 聚烯丙胺原型上的BSA和卵白蛋白的结合容量(g/L)
BSA
A pH6 20mM哌嗪 63
B pH6 20mM哌嗪250mM NaCl 49
C pH6 20mM哌嗪500mM NaCl 17
卵白蛋白
E pH6 20mM哌嗪 65
F pH6 20mM哌嗪250mM NaCl 41
G pH6 20mM哌嗪500mM NaCl 18
在用哌嗪作为缓冲剂系统时，聚烯丙胺具有在无盐时对于BSA和卵白蛋白二者最佳的结合容量，见表5中的行A和E。然而，在250mM NaCl，容量仍很好。
原型：聚烯丙胺
离子容量：210µmol/ml
蛋白：卵白蛋白2g/l, IP~4.7
缓冲剂系统：20-40mM磷酸盐pH 7-7.5
盐：NaCl
表6. 聚烯丙胺原型上卵白蛋白的结合容量(g/L)
卵白蛋白
20mM磷酸盐+0mM NaCl, pH 7.0 20
20mM磷酸盐+0mM NaCl, pH 7.5 21
20mM磷酸盐+150mM NaCl, pH 7.0 13
20mM磷酸盐+150mM NaCl, pH 7.5 15
40mM磷酸盐+300mM NaCl, pH 7.0 5
40mM磷酸盐+300mM NaCl, pH 7.5 8
40mM磷酸盐+500mM NaCl, pH 7.0 7
40mM 磷酸盐+500mM NaCl, pH 7.5 8
原型：聚烯丙胺
离子容量：210µmol/ml
蛋白1：卵白蛋白4g/l, IP~4.7
蛋白2：BSA 4g/L, IP~4.7
缓冲剂系统：40mM Tris pH7.2-8.2
盐：NaCl
表7. 聚烯丙胺原型上卵白蛋白和BSA的结合容量(g/L)
卵白蛋白 BSA
40mM Tris pH 7.2 + 250 mM NaCl 73 73
40mM Tris pH 7.7 + 250 mM NaCl 65 70
40mM Tris pH 8.2 + 250 mM NaCl 52 63
在表6中，聚烯丙胺显示在不加盐时对卵白蛋白的最高结合容量，pH影响不能在磷酸盐系统中见到。
比较表6与表7清楚地看到，比磷酸盐缓冲剂系统，聚烯丙胺利用Tris缓冲剂系统更有利于对卵白蛋白的容量。
在表7的Tris系统中，在聚烯丙胺上的容量随降低pH而增加。对卵白蛋白的结合容量比BSA更受pH影响。
原型：聚烯丙胺
离子容量：210µmol/ml
蛋白：卵白蛋白2g/l, IP~4.7
缓冲剂系统：40mM Tris pH7.2-7.5
盐：NaCl
表8. 聚烯丙胺原型上卵白蛋白的结合容量(g/L)
pH 7.2 7.5
A 40mM Tris + 0mM NaCl 66 66
B 40mM Tris + 150mM NaCl 57 57
C 40mM Tris + 300mM NaCl 45 44
再次显示，聚烯丙胺和Tris得到对卵白蛋白的高结合容量，见表。即使容量随加盐降低，但仍然很高。
聚烯丙胺原型和Capto Core 700上卵白蛋白的结合容量比较
原型：聚烯丙胺
离子容量：210µmol/ml
参比介质：Capto core 700
离子容量：40-85µmol/ml
蛋白：卵白蛋白3g/l, IP~4.7
缓冲剂系统：40mM Tris pH 7.2-7.5
盐：NaCl
表9. 聚烯丙胺原型和Capto Core 700上卵白蛋白的静态结合容量(g/L)
CaptoTM Core 700(Ge Healthcare Bio-Sciences AB)是一种市售产品，基于85-90微米体积加权平均直径，具有截断Mw 700 kDa的惰性壳和通过胺氮偶合的辛基胺配体得到的核的高交联琼脂糖粒料。壳结构很类似于目前制备的原型，且已知其与例如病毒颗粒发生实质上0相互作用。
在Tris缓冲剂系统中，在聚烯丙胺上对卵白蛋白的结合容量显著较佳。
聚烯丙胺概述
在运行聚烯丙胺时，适当考虑配体的等电点(IP)，因此，缓冲剂的pH不接近配体的IP，使其不带电荷。聚烯丙胺的IP为~8.7。
聚烯丙胺对卵白蛋白和BSA作用良好。已最多检验卵白蛋白，显然，与磷酸盐缓冲剂比较，Tris缓冲剂系统提高容量。BSA的结合容量在1.25mM NaCl为0，见表4，这表明可用盐洗脱。BSA和卵白蛋白的性质相似，因此，卵白蛋白也可用盐从聚烯丙胺洗脱。
1,3-二氨基-2-丙醇和三(2-氨基乙基)胺原型的结果
原型：1,3-二氨基-2-丙醇
配体密度：84µmol/ml
原型：三(2-氨基乙基)胺
配体密度：55µmol/ml
蛋白溶液：卵白蛋白2g/L, IP ~4.7
缓冲剂系统1：50 mM Tris pH 7.4
缓冲剂系统2：50 mM磷酸盐pH 7.2
盐：NaCl
基质的量/孔：6µl
表10. 1,3-二氨基-2-丙醇和三(2-氨基乙基)胺原型上卵白蛋白的结合容量(g/L)
1,3-二氨基-2-丙醇和三(2-氨基乙基)胺原型在高盐浓度结合，这可在行A中见到。三(2-氨基乙基)胺具有对于卵白蛋白的较高结合容量，两种原型均有利于Tris结合卵白蛋白。
实施例3. 污染原型的净化
利用800微升孔大小，在96孔滤板中进行此项研究。板孔用20微升基质填充，并用大肠杆菌均浆污染。用不同再生液体进行净化，并通过与24mM二硫苏糖醇(DTT)和0.5%十二烷基硫酸钠(SDS)沸腾迫使仍留在粒料中的污染物进入溶液，然后用芯片电泳在Caliper HTProtein LabChip系统中分析。
大肠杆菌溶胞产物
用大肠杆菌均浆污染介质。使冷冻大肠杆菌均浆解冻，并通过玻璃纤维滤器，随后通过0.45µm膜滤器澄清。
板试验
以20µl凝胶/孔填充空滤板。在板试验期间使用表中所述的方法。用每种溶液一式三份进行一个板。对CIP的培养时间为15分钟。
表11. 板试验方法
在粒料结束离心后，通过连接滤板顶上的收集板，并用橡胶带使它们一起固定，使介质塞转移到收集板。转动板塔，以使滤板处于顶上，并离心5min(972xg)。然后向收集板中的所有孔加入200µl Caliper样品缓冲剂。孔用微箔密封覆盖，并放在微量板摇动器上2分钟。将板放在热室(104℃)中5分钟。在加热后另外摇动样品2分钟，并离心2分钟(500xg)，以使凝胶颗粒沉降。将40µl上清液小心转移到PCR板(锥底)。在凝胶塞从滤板转移到收集板期间，颠倒样品次序，在此，通过在行H至行A中吸移样品，如此类推，将顺序改回。使PCR板离心1分钟(500xg)，以旋沉可能已转移的胶凝颗粒。然后，板准备放在Caliper芯片电泳设备(Caliper Life Sciences Inc., USA)中。
Caliper LabChip电泳
根据HT Protein LabChipTM Kit试剂盒用户指南(Caliper Life Sciences Inc.,2010年11月)制备芯片、缓冲条和分子量梯。运行HT Protein Express 200 HighSensitivity高灵敏程序。
结果显示于图4-6中。在Capto Core 700上，只有包含异丙醇的溶液实际有效去除所有污染物。相比之下，在聚烯丙胺原型上，除8M脲以外的所有溶液显示有效杂质去除。二氨基丙醇和三氨基乙基胺原型也可有效用除8M脲和8M脲+柠檬酸以外的所有溶液去除。
本书面说明用实施例公开本发明，包括最佳方式，也用实施例使本领域的技术人员能够实施本发明，包括制造和使用任何装置或系统并施行任何结合方法。本发明的可专利范围由权利要求限定，并且可包括本领域的技术人员想到的其它实例。这些其它实例旨在属于权利要求的范围内，如果它们具有与权利要求字面语言无差异的结构要素，或者如果它们包括与权利要求字面语言无实质差异的等效结构要素。

Claims (36)

1. 一种用于纯化生物颗粒的分离基质，该基质包含具有多孔核实体(101)和覆盖所述核实体的多孔壳实体(102)的多个颗粒(100)，其中
a)所述核实体包含存在于共价结合配体上的至少50μmol/ml伯胺，显示至少2个伯胺/配体，并且
b)所述壳实体包含小于20μmol/ml伯胺。
2.权利要求1的分离基质，其中所述基质能够在具有至少10mS/cm，例如至少20mS/cm的电导率的含水缓冲液中结合至少20mg卵白蛋白/ml基质，例如，至少40mg卵白蛋白。
3.权利要求1的分离基质，其中所述配体显示至少2个伯胺/配体，例如，至少3或至少4个伯胺/配体。
4.前述权利要求中任一项的分离基质，其中所述配体通过仲或叔胺键连接到所述核实体。
5.前述权利要求中任一项的分离基质，其中所述配体中氮和氧原子的含量为至少20%重量。
6.前述权利要求中任一项的分离基质，其中伯胺氮的含量为至少18%重量。
7.前述权利要求中任一项的分离基质，其中显示的伯胺与氮原子总量之比为至少0.5，例如至少0.7，或至少0.9。
8.前述权利要求中任一项的分离基质，其中所述配体选自通过胺连接的三(2-氨基乙基)胺和聚烯丙胺。
9.前述权利要求中任一项的分离基质，其中所述配体包括至少1kDa分子量的聚烯丙胺，例如，至少10kDa。
10.权利要求9的分离基质，其中所述聚烯丙胺不经交联。
11.前述权利要求中任一项的分离基质，其中所述壳实体具有1至10微米的平均厚度。
12.前述权利要求中任一项的分离基质，其中所述颗粒为基本球形。
13.前述权利要求中任一项的分离基质，其中所述壳实体具有所述颗粒直径或等效球直径的0.5至6%的平均厚度。
14.前述权利要求中任一项的分离基质，其中所述壳实体具有对于球状蛋白60至1000kDa的截断分子量，例如100-1000或400-800kDa。
15.一种纯化生物颗粒的方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供权利要求1至14中任一项的分离基质；
b)使所述基质与包含生物颗粒和至少一种污染蛋白的液体接触，使得所述污染蛋白结合到所述基质；
c)从所述基质分离所述液体，并回收具有纯化生物颗粒的所述液体。
16.权利要求15的方法，其中所述液体具有至少10mS/cm的电导率。
17. 权利要求15或16的方法，所述方法进一步包括以下步骤：
d)通过与包含小于15%，例如小于5%的有机溶剂的再生溶液接触再生所述基质；并且
e)重复步骤a)-c)至少1次，例如，至少5次，至少10次，或至少50次。
18.权利要求17的方法，其中所述再生溶液包含碱。
19.权利要求17或18的方法，其中在步骤d)后基质中的残余蛋白含量小于100μg/ml。
20.权利要求15至19中任一项的方法，其中所述生物颗粒选自病毒、类病毒颗粒、细胞、细胞器和质粒。
21.权利要求15至20中任一项的方法，其中至少40mg/ml，例如至少60mg/ml所述污染蛋白结合到基质。
22.权利要求15至21中任一项的方法，其中所述液体包含缓冲物质。
23.权利要求22的方法，其中所述缓冲物质包含缓冲阳离子和/或单价缓冲阴离子。
24.权利要求15至23中任一项的方法，其中所述液体的pH为6.0-8.5，例如6.5-8.5或6.5-8.0。
25.权利要求15至24中任一项的方法，其中所述污染蛋白为白蛋白，例如，卵白蛋白。
26.权利要求25的方法，其中所述生物颗粒包含流感病毒，并且所述液体包含从受精卵得到的尿囊液。
27.权利要求15至26中任一项的方法，所述方法进一步在步骤b)前包括步骤a’)，通过交叉流过滤调节所述液体，例如超滤和/或微滤。
28.权利要求15至27中任一项的方法，所述方法进一步在步骤c)后包括步骤c’)，离子交换色谱法，例如阴离子交换色谱法。
29.权利要求1至14中任一项的分离基质用于纯化生物颗粒的用途。
30.权利要求29的用途，其中所述生物颗粒选自病毒、类病毒颗粒、细胞、细胞器和质粒。
31.权利要求29或30的用途，用于权利要求15至28中任一项的方法。
32.一种制备权利要求1至14中任一项的分离基质的方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供多个多孔多糖颗粒，例如，交联琼脂糖凝胶颗粒；
b)使所述颗粒与烯丙基化试剂反应，以得到至少50μmol/ml共价结合到颗粒的烯丙基；
c)使所述颗粒与卤素反应最多30分钟的时间，然后与碱性水溶液反应；
d)使包含多个伯胺的配体前体偶合到剩余烯丙基。
33.权利要求32的方法，其中所述颗粒为基本球形，且具有15-400微米体积平均直径，例如30-100微米。
34.权利要求32或33的方法，其中所述配体前体每分子具有至少3个伯胺，并且通过首先使烯丙基与卤素水溶液反应，然后在碱性条件与配体前体反应偶合到烯丙基。
35.权利要求32至34中任一项的方法，其中所述配体前体选自三(2-氨基乙基)胺和聚烯丙胺。
36.权利要求32至35中任一项的方法，其中所述烯丙基化试剂选自烯丙基卤化物和烯丙基缩水甘油醚。
CN201580013843.8A 2014-03-14 2015-02-18 用于生物颗粒纯化的分离基质 Pending CN106102903A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210695588.1A CN114917884A (zh) 2014-03-14 2015-02-18 用于生物颗粒纯化的分离基质

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SE1450290-0 2014-03-14
SE1450290 2014-03-14
PCT/SE2015/050186 WO2015137860A1 (en) 2014-03-14 2015-02-18 Separation matrices for purification of biological particles

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210695588.1A Division CN114917884A (zh) 2014-03-14 2015-02-18 用于生物颗粒纯化的分离基质

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN106102903A true CN106102903A (zh) 2016-11-09

Family

ID=54072158

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210695588.1A Pending CN114917884A (zh) 2014-03-14 2015-02-18 用于生物颗粒纯化的分离基质
CN201580013843.8A Pending CN106102903A (zh) 2014-03-14 2015-02-18 用于生物颗粒纯化的分离基质

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210695588.1A Pending CN114917884A (zh) 2014-03-14 2015-02-18 用于生物颗粒纯化的分离基质

Country Status (5)

Country Link
US (1) US11285460B2 (zh)
EP (1) EP3116645B1 (zh)
JP (1) JP6702587B2 (zh)
CN (2) CN114917884A (zh)
WO (1) WO2015137860A1 (zh)

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114917884A (zh) 2014-03-14 2022-08-19 思拓凡生物工艺研发有限公司 用于生物颗粒纯化的分离基质
GB201515339D0 (en) * 2015-08-28 2015-10-14 Ge Healthcare Bio Sciences Ab A seperation matrix and a method of seperating antibodies
US11162880B2 (en) 2015-11-09 2021-11-02 University Of Notre Dame Du Lac Particle size purification method and devices
WO2018063980A1 (en) 2016-09-29 2018-04-05 Bio-Rad Laboratories, Inc. Agarose-filled ceramic apatite
EP3519351B1 (en) 2016-09-29 2025-04-30 Bio-Rad Laboratories, Inc. Protein-nanoparticle conjugate purification methods
US12318757B2 (en) 2018-03-05 2025-06-03 Chiral Technologies Europe Sas Composite materials for bioseparations
US10737259B2 (en) 2018-08-31 2020-08-11 Pall Corporation Salt tolerant anion exchange medium
US11045773B2 (en) 2018-08-31 2021-06-29 Pall Corporation Salt tolerant porous medium
WO2021061790A1 (en) 2019-09-24 2021-04-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Systems and methods for chromatography use and regeneration
EP4106897A4 (en) 2020-02-19 2023-10-25 Bio-Rad Laboratories, Inc. Method of preparing polymer-filled chromatography resin
EP4385618A1 (en) 2022-12-16 2024-06-19 Chiral Technologies Europe SAS Composite material for bioseparations

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1678903A (zh) * 2002-08-27 2005-10-05 阿默森生物科学有限公司 色谱双层颗粒
US20110065900A1 (en) * 2008-05-30 2011-03-17 Ge Healthcare Bio-Science Ab Separation method utilizing polyallylamine ligands
CN102015094A (zh) * 2008-04-22 2011-04-13 通用电气健康护理生物科学股份公司 层析介质
US8070958B2 (en) * 2003-10-31 2011-12-06 Ge Healthcare Bio-Sciences Ab Separation matrix having a ligand density gradient
CN102958602A (zh) * 2010-07-09 2013-03-06 通用电气健康护理生物科学股份公司 层析方法及为此使用的介质
WO2013130001A1 (en) * 2012-02-29 2013-09-06 Ge Healthcare Bio-Sciences Ab Method for endotoxin removal

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SE9600590D0 (sv) * 1996-02-19 1996-02-19 Pharmacia Biotech Ab Sätt för kromatografisk separation av peptider och nukleinsyra samt ny högaffin jonbytesmatris
US6072101A (en) * 1997-11-19 2000-06-06 Amcol International Corporation Multicomponent superabsorbent gel particles
SE9904197D0 (sv) * 1999-11-22 1999-11-22 Amersham Pharm Biotech Ab A method for anion exchange adsorption on matrices carrying mixed mode ligands
CN1589160A (zh) * 2001-11-21 2005-03-02 巴斯福股份公司 超吸收性聚合物颗粒
SE0303532D0 (sv) * 2003-12-23 2003-12-23 Amersham Biosciences Ab Purification of immunoglobulins
US20050181378A1 (en) * 2004-02-18 2005-08-18 Applera Corporation Polyelectrolyte-coated size-exclusion ion-exchange particles
US7750129B2 (en) * 2004-02-27 2010-07-06 Ge Healthcare Bio-Sciences Ab Process for the purification of antibodies
SE0401665D0 (sv) * 2004-06-24 2004-06-24 Amersham Biosciences Ab Purification of immunoglobulins
US7332101B2 (en) * 2004-06-25 2008-02-19 Massachusetts Institute Of Technology Permanently linked, rigid, magnetic chains
US9266041B2 (en) * 2004-10-21 2016-02-23 Ge Healthcare Bio-Sciences Ab Chromatography ligand
GB2454153A (en) * 2006-09-05 2009-04-29 Innovative Purification Techno Affinity separation methods and systems
GB2445579A (en) * 2007-01-11 2008-07-16 Secr Defence An encoded microsphere
US9433922B2 (en) 2007-08-14 2016-09-06 Emd Millipore Corporation Media for membrane ion exchange chromatography based on polymeric primary amines, sorption device containing that media, and chromatography scheme and purification method using the same
US9005436B2 (en) * 2008-05-10 2015-04-14 Brigham Young University Porous composite particulate materials, methods of making and using same, and related apparatuses
CA2789994A1 (en) * 2010-02-19 2011-08-25 Ge Healthcare Bio-Sciences Ab Method for production of chromatography media
US20120077249A1 (en) 2010-04-20 2012-03-29 Millipore Corporation Separation Of Virus And/Or Protein From Nucleic Acids By Primary Amines
WO2011140406A1 (en) * 2010-05-07 2011-11-10 Millipore Corporation Enhanced clarification media
EP2646146A1 (en) * 2010-11-30 2013-10-09 GE Healthcare Bio-Sciences AB Buffering compositions enclosed in a size exclusion matrix
US9272246B2 (en) * 2011-03-28 2016-03-01 3M Innovative Properties Company Ligand functional substrates
US9096648B2 (en) * 2011-08-19 2015-08-04 Emd Millipore Corporation Methods of reducing level of one or more impurities in a sample during protein purification
CN114917884A (zh) 2014-03-14 2022-08-19 思拓凡生物工艺研发有限公司 用于生物颗粒纯化的分离基质

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1678903A (zh) * 2002-08-27 2005-10-05 阿默森生物科学有限公司 色谱双层颗粒
US8070958B2 (en) * 2003-10-31 2011-12-06 Ge Healthcare Bio-Sciences Ab Separation matrix having a ligand density gradient
CN102015094A (zh) * 2008-04-22 2011-04-13 通用电气健康护理生物科学股份公司 层析介质
US20110065900A1 (en) * 2008-05-30 2011-03-17 Ge Healthcare Bio-Science Ab Separation method utilizing polyallylamine ligands
CN102958602A (zh) * 2010-07-09 2013-03-06 通用电气健康护理生物科学股份公司 层析方法及为此使用的介质
WO2013130001A1 (en) * 2012-02-29 2013-09-06 Ge Healthcare Bio-Sciences Ab Method for endotoxin removal

Also Published As

Publication number Publication date
US20160367966A1 (en) 2016-12-22
JP2017515099A (ja) 2017-06-08
US11285460B2 (en) 2022-03-29
EP3116645A1 (en) 2017-01-18
WO2015137860A9 (en) 2016-08-18
EP3116645A4 (en) 2017-04-05
EP3116645B1 (en) 2019-04-10
JP6702587B2 (ja) 2020-06-03
WO2015137860A1 (en) 2015-09-17
CN114917884A (zh) 2022-08-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106102903A (zh) 用于生物颗粒纯化的分离基质
US20220266170A1 (en) Chromatography medium
JP7497891B2 (ja) 大孔径アガロース
CN104797332B (zh) 多元阴离子交换基质
CN101765458B (zh) 分离基质
US20110065900A1 (en) Separation method utilizing polyallylamine ligands
US20070161000A1 (en) Plasmid purification
CN108892803B (zh) 一种耐盐阴离子交换层析介质及其制备方法
CN105646912B (zh) 多孔性纤维素粒子、色谱载体、病毒样颗粒的纯化方法和疫苗
CN117753482A (zh) 一种阴离子交换层析介质及其制备方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CB02 Change of applicant information

Address after: uppsala

Applicant after: Situofan Biotechnology R & D Co.,Ltd.

Address before: uppsala

Applicant before: GE HEALTHCARE BIO-SCIENCES AB

CB02 Change of applicant information
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20161109

RJ01 Rejection of invention patent application after publication