CN106086039B - 一种青蒿wrky类转录因子编码序列及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种青蒿WRKY类转录因子编码序列，该编码序列记为AaGSW1，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。本发明的编码WRKY类转录因子AaGSW1，通过调控青蒿素合成关键酶基因的表达，从而提高青蒿素的含量。在非转基因普通青蒿的叶片中青蒿素含量为9mg/g DW，超表达AaGSW1基因表达的转基因青蒿的叶片青蒿素含量提高到20mg/g DW。该发明对于为青蒿素的规模化生产提供高产、稳定新药源具有重要意义。

Description

一种青蒿WRKY类转录因子编码序列及应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种青蒿WRKY类转录因子编码序列及应用。

背景技术

青蒿(Artemisia annua L.)是菊科蒿属的一年生草本植物。青蒿素(artemisinin)是从其地上部分分离的一种含有过氧桥结构的倍半萜内酯化合物，是目前世界上公认的最有效的治疗疟疾的药物，特别是对于脑型疟疾和抗氯喹疟疾具有速效和低毒的特点。目前，世界卫生组织推荐的最有效的治疗疟疾的方法就是青蒿素联合疗法(ACTs)。另外，随着对青蒿素药理研究的逐步深入，科学家发现青蒿素及其衍生物还具有抗炎、抗血吸虫、抗肿瘤以及免疫调节的功能。可见青蒿素是一种极具潜力的天然药物。

目前青蒿素的主要来源是从青蒿植株的地上部分提取，然而青蒿中青蒿素的含量非常低，不同种植环境和种植品种中其平均含量在青蒿叶片干重的0.01-1％，使得这种药物的大规模商业化生产受到了限制。由于青蒿素结构复杂，人工合成难度大，产量低，成本高。虽然目前有人成功利用酵母发酵产生青蒿素前体物质青蒿酸，还需将青蒿酸人工化学半合成至青蒿素，该研究尚处于实验室研发初级阶段。也有人尝试用组织培养和细胞工程的方法来生产青蒿素，然而青蒿素在愈伤组织中含量低于干重的0.1％，在芽中最高也只有干重的0.16％，而大多数研究在根中没有检测到青蒿素。因此利用组织培养及细胞工程来生产青蒿素的可行性也不高。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种青蒿AaGSW1蛋白编码序列，该基因编码WRKY类转录因子(AaGSW1)，它参与调控青蒿腺毛的密度；利用转基因技术将青蒿AaGSW1转录因子超表达载体转化青蒿可以有效调控青蒿表皮的腺毛密度，从而提高青蒿素的含量。青蒿素含量从非转基因青蒿的9mg/g DW提高到20mg/g DW(图2)，该发明对于为青蒿素的规模化生产提供高产、稳定新药源具有重要意义。

本发明是通过以下的技术方案实现的：

本发明提供了一种青蒿WRKY类转录因子编码序列，所述编码序列记为AaGSW1，所述AaGSW1的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明还提供了一种多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明还提供了一种重组表达载体，所述重组表达载体包含如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

本发明还提供了一种重组表达转化体，所述重组表达转化体包含如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

本发明还提供了青蒿WRKY类转录因子编码序列AaGSW1在提高青蒿素含量中的应用。

进一步地，所述应用包括以下步骤：

步骤1、将青蒿WRKY类转录因子编码序列AaGSW1连于植物表达调控序列上，构建含所述青蒿WRKY类转录因子编码序列的植物表达载体；

步骤2、将步骤1中的所述植物表达载体转入农杆菌，将所述农杆菌转入青蒿；

步骤3、通过抗生素筛选，获得含有所述青蒿WRKY类转录因子编码序列AaGSW1的转化细胞，再生转基因植株。

进一步地，在上述步骤2中，采用冻融法进行转入。

本发明还提供了一种提高青蒿中青蒿素含量的方法，所述方法包括如下步骤：

步骤1、对青蒿栽培种WRKY类转录因子分析，从青蒿cDNA文库中克隆得到青蒿WRKY类转录因子AaGSW1；

步骤2、将AaGSW1基因可操作性地连接于表达调控序列，形成含所述AaGSW1基因的植物超表达载体；

步骤3、将含所述AaGSW1基因的植物超表达载体转化根癌农杆菌，获得具有所述植物超表达载体的根癌农杆菌菌株；

步骤4、利用所述根癌农杆菌菌株转化青蒿，经潮霉素筛选得到抗性苗，再经PCR检测为阳性的植株即为转基因青蒿苗；

步骤5、对获得的转基因青蒿进行腺毛密度分析，获得腺毛密度显著提高的转基因青蒿，进而获得青蒿素含量提高的青蒿植株。

进一步地，所述根癌农杆菌为EHA105。

进一步地，步骤4中，所述的经PCR检测的转基因青蒿植株是指，分别设计合成AaGSW1基因的检测引物，进行DNA扩增，紫外线下观察到目的条带的阳性株系即为转基因青蒿植株，所述的腺毛密度检测是指在荧光显微镜下，青蒿分泌型腺毛在特定波长下显示明亮荧光，经拍照后再统计其数量和密度。

其中，对获得的转基因青蒿中青蒿素含量进行HPLC-ELSD测定。

本发明从青蒿中克隆AaGSW1基因，构建含AaGSW1基因的植物超表达载体，用根癌农杆菌介导，采用叶盘法将AaGSW1基因超表达载体转化青蒿；PCR检测外源目的基因AaGSW1的整合情况，通过荧光显微镜观察和统计腺毛密度，获得了腺毛密度显著提高的转基因青蒿；高效液相色谱-蒸发光散射检测器(HPLC-ELSD)测定青蒿中青蒿素含量，表明获得的青蒿表皮腺毛密度显著提高的转基因青蒿中的青蒿素含量也显著提高。

在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体，包括质粒，粘粒等。在生产本发明的青蒿AaGSW1蛋白多肽时，可以将青蒿AaGSW1蛋白编码序列可操作地连于表达调控序列，从而形成青蒿AaGSW1蛋白表达载体。

如本文所用，“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。

以下将结合附图对本发明作进一步说明，以充分说明本发明的目的、技术特征和技术效果。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1示出了本发明较优实施例中定量PCR检测青蒿中AaGSW1表达量的结果；

图2示出了本发明较优实施例中使用HPLC检测青蒿素含量的结果；*，P<0.01(T检验)。

具体实施方式

下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

下面对本发明的实施例作详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1、青蒿AaGSW1基因的克隆

1.青蒿基因组总RNA的提取

取青蒿叶片组织，置于液氮中研碎，加入盛有裂解液的1.5mL Eppendorf(EP)离心管中，充分振荡后，按照TIANGEN试剂盒的说明书抽提总RNA。用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量，然后在分光光度计上测定RNA含量。

2.青蒿AaGSW1基因的克隆

以所提取的总RNA为模板，在PowerScript反转录酶的作用下合成cDNA；根据AaGSW1基因的序列设计基因特异性引物(SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4)，通过PCR从总cDNA中扩增AaGSW1基因，并测序。

通过上述步骤，获得了青蒿中该转录因子的全长编码序列(SEQ ID NO:1)并推导出其蛋白编码序列(SEQ ID NO：2)，其中，起始密码子为ATG，终止密码子为TAG。

实施例2、含AaGSW1基因的植物双元干扰表达载体的构建

为研究AaGSW1基因对青蒿分泌性腺毛发育的影响，构建AaGSW1过量表达的超表达载体PHB-AaGSW1。为了方便表达载体的构建，正向引物中引入了BamH1的酶切位点，反向引物中引入了Sac1的酶切位点，引物如表1所示；

表1 PHB-AaGSW1载体构建的PCR引物

本实施例将青蒿AaGSW1基因可操作性地连接于表达调控序列，该载体可用于通过发育调控策略来调控青蒿中青蒿素的含量。

实施例3、根癌农杆菌介导的AaGSW1干扰载体遗传转化青蒿获得转基因青蒿植株

1.含AaGSW1超表达载体的根癌农杆菌工程菌的获得

将实施例2中含AaGSW1的植物双元超表达载体采用冻融法转入根癌农杆菌(如EHA105，为市场有公开出售的生物材料，可以从澳大利亚CAMBIA公司购得，菌株编号为Gambar 1)，并进行PCR验证。结果表明，含AaGSW1的植物双元干扰表达载体已成功构建到根癌农杆菌菌株中。

2.根癌农杆菌介导AaGSW1基因转化青蒿

2.1.外植体的预培养

青蒿种子用75％乙醇浸泡1min，再用20％NaClO浸泡20min，无菌水冲洗3-4次，用无菌吸水纸吸干表面水分，接种于无激素的MS(Murashige and Skoog,1962)固体培养基中，25℃、16h/8h(光亮/黑暗)光照培养，即可获得青蒿无菌苗。待苗长至5cm左右后,剪取无菌苗叶片外植体用于转化。

2.2.农杆菌与外植体的共培养

将所述的叶片外植体，转到共培养培养基(1/2MS+AS 100μmol/L)中，滴加含活化好的所述含AaGSW1植物双元超表达载体的根癌农杆菌工程菌的1/2MS悬液，使外植体与菌液充分接触，28℃暗培养3d。以滴加在不带有目的基因的根癌农杆菌的1/2MS液体培养基悬液的叶片外植体为对照。

2.3.抗性再生植株的筛选

将所述的共培养3d的青蒿外植体转入到发芽筛选培养基(MS+6-BA 0.5mg/L+NAA0.05mg/L+Hyg 50mg/L+Cb 500mg/L)上于25℃、16h/8h光照培养，每两周继代培养一次，经过2-3次继代后即可获得Hyg抗性丛生芽。将生长良好的抗性丛生芽剪下转入生根培养基(1/2MS+Cb 125mg/L)上培养至生根，从而获得Hyg抗性再生青蒿植株。

3.转基因青蒿植株的PCR检测

根据目的基因所在表达盒上游的35S启动子区域和AaGSW1分别设计正向引物设计和反向引物对目的基因进行检测。结果表明，利用所设计的PCR特异引物，能扩增出特异DNA片段。而以非转化青蒿基因组DNA为模板时，没有扩增出任何片段。

本实施例将所述的植物表达载体转化根癌农杆菌，获得用于转化青蒿的含AaGSW1植物双元超表达载体的根癌农杆菌菌株，利用所构建的根癌农杆菌菌株转化青蒿，获得经PCR检测的转基因青蒿植株。转基因青蒿植株的获得为筛选获得较高青蒿素含量的青蒿株系提供了直接素材。

实施例4、利用HPLC-ELSD测定转基因青蒿中青蒿素含量

1.HPLC-ELSD条件及系统适用性以及标准溶液的配制

HPLC：采用water alliance 2695系统，色谱柱为C-18反相硅胶柱(SymmetryShieldTM C18，5μm，250×4.6mm，Waters)，流动相为甲醇:水，甲醇:水的体积比为70:30，柱温30℃，流速1.0mL/min，进样量10μL，灵敏度(AUFS＝1.0)，理论塔板数按青蒿素峰计算不低于2000。

ELSD：采用water alliance 2420系统,蒸发光散射检测器漂移管温度40℃,放大系数(gain)为7，载气压力5bar；

精密称取青蒿素标准品(Sigma公司)2.0mg用1mL甲醇完全溶解，得到2mg/mL青蒿素标准品溶液，保存于-20℃备用。

本发明中流动相为甲醇(methanol):水，比例为70％:30％时，青蒿素的保留时间为5.1min,峰型良好。理论塔板数按青蒿素计算不低于2000。

2.标准曲线的制作

将所述对照品溶液在相应色谱条件下分别进样2μl，4μl，6μl，8μl，10μl记录图谱及色谱参数，分别以峰面积(Y)对标准品含量(X,μg)进行回归分析。通过研究，本发明中青蒿素在4-20μg范围内呈现良好的log-log线性关系。青蒿素对照品的log-log线性回归方程为：Y＝1.28e+000X+4.71e+000，R＝0.979546。

3.样品的制备和青蒿素含量的测定

在青蒿植株的上，中和下部共取2g新鲜的青蒿叶片，于45℃烘箱中烘至恒重。然后从烘干的枝条上敲下叶，磨成粉末。称取约0.1g干粉于2mL Eppendorf管中，加入2mL乙醇，用40W超声波处理30min，5000rpm离心10min，取上清用0.22μm滤膜过滤，即可用于HPLC-ELSD测定青蒿素的含量。

采用HPLC-ELSD测定青蒿素含量，样品进样体积为20μl,根据峰面积代入线形回归方程计算出样品中的青蒿素含量(mg)，再除以样品的青蒿叶干重(g)，从而计算出青蒿植株中青蒿素的含量。

在本发明中转AaGSW1超表达载体的转基因植株可显著提高了青蒿中青蒿素含量。在非转化普通青蒿含量为9mg/g DW时，同时期转AaGSW1超表达载体青蒿中青蒿素的含量平均达到20mg/g DW，其含量是非转化青蒿含量的2.2倍，如图2所示，转AaGSW1超表达青蒿中，使用HPLC检测青蒿素，结果为三次重复的平均值，误差线表示标准差。统计分析用t-test检验(*，P<0.01)。

本实施例采用HPLC-ELSD法测定了转基因青蒿中青蒿素含量，采用转化AaGSW1超表达载体代谢工程策略发现AaGSW1基因的表达与青蒿素的含量具有明显的关联关系，为利用该基因进行过表达研究进而提高青蒿中青蒿素的含量提供了有力的实验证据。

本发明的青蒿WRKY类转录因子编码序列AaGSW1能够实现提高植物中青蒿素含量，将所述编码序列连于植物表达调控载体上，构建含所述编码序列的植物表达载体；将表达载体转入农杆菌，将农杆菌转入青蒿；通过抗生素筛选，获得含有所述编码序列的转化细胞，再生转基因植株；本发明获得的转基因青蒿中青蒿素的含量受到显著调控，在非转化普通青蒿含量为9mg/g DW时，同时期转AaGSW1超表达载体青蒿中青蒿素的含量平均为20mg/gDW，其含量是非转化青蒿含量的2.2倍。本发明提供了一个调控青蒿中青蒿素含量的转录因子编码序列，为利用该编码序列大规模生产青蒿素打下了坚实的基础。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims (8)

1.一种青蒿WRKY类转录因子基因，其特征在于，所述基因记为AaGSW1，所述AaGSW1的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述AaGSW1编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

2.一种多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

3.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包含如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

4.根据权利要求1所述的青蒿WRKY类转录因子基因AaGSW1在提高青蒿素含量中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述应用包括以下步骤：

步骤1、将青蒿WRKY类转录因子基因AaGSW1连于植物表达调控序列上，构建含所述青蒿WRKY类转录因子基因的植物表达载体；

步骤2、将步骤1中的所述植物表达载体转入农杆菌，将所述农杆菌转入青蒿；

步骤3、通过抗生素筛选，获得含有所述青蒿WRKY类转录因子基因AaGSW1的转化细胞，再生生成转基因植株。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述步骤2中，采用冻融法进行转入。

7.一种提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

步骤1、对青蒿栽培种H-ZIP IV类转录因子分析，从青蒿cDNA文库中克隆得到青蒿WRKY类转录因子AaGSW1，所述AaGSW1的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；

步骤2、将AaGSW1基因可操作性地连接于表达调控序列，形成含所述AaGSW1基因的植物超表达载体；

步骤3、将含所述AaGSW1基因的植物超表达载体转化根癌农杆菌，获得具有所述植物超表达载体的根癌农杆菌菌株；

步骤4、利用所述根癌农杆菌菌株转化青蒿，经潮霉素筛选得到抗性苗，再经PCR检测为阳性的植株即为转基因青蒿苗；

步骤5、对获得的转基因青蒿进行腺毛密度分析，获得腺毛密度显著提高的转基因青蒿，进而获得青蒿素含量提高的青蒿植株。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述根癌农杆菌为EHA105。

Images