CN106062211A - 与光学超分辨率图案化相关的方法和组合物 - Google Patents
与光学超分辨率图案化相关的方法和组合物 Download PDFInfo
- Publication number
- CN106062211A CN106062211A CN201480075402.6A CN201480075402A CN106062211A CN 106062211 A CN106062211 A CN 106062211A CN 201480075402 A CN201480075402 A CN 201480075402A CN 106062211 A CN106062211 A CN 106062211A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- probe
- target
- substrate
- paint
- dna
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 102
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 title description 18
- 238000000059 patterning Methods 0.000 title description 11
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 114
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims abstract description 52
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 18
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 18
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 18
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 claims description 16
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 15
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 12
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 claims description 10
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 claims description 8
- FOYVTVSSAMSORJ-UHFFFAOYSA-N atto 655 Chemical group OC(=O)CCCN1C(C)(C)CC(CS([O-])(=O)=O)C2=C1C=C1OC3=CC4=[N+](CC)CCCC4=CC3=NC1=C2 FOYVTVSSAMSORJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 claims description 5
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 claims description 5
- 239000011616 biotin Substances 0.000 claims description 5
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 claims description 4
- 150000001345 alkine derivatives Chemical class 0.000 claims description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 4
- 150000001540 azides Chemical class 0.000 claims description 3
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 claims description 3
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 claims description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims 2
- VIRDQWZTIAVLSE-UHFFFAOYSA-N 3-ethenyl-9h-carbazole Chemical group C1=CC=C2C3=CC(C=C)=CC=C3NC2=C1 VIRDQWZTIAVLSE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 241000218636 Thuja Species 0.000 claims 1
- 230000027455 binding Effects 0.000 abstract description 81
- 238000009739 binding Methods 0.000 abstract description 81
- HDAVJPSXEPLOMF-UHFFFAOYSA-N 3-(9h-carbazol-3-yl)prop-2-enenitrile Chemical group C1=CC=C2C3=CC(C=CC#N)=CC=C3NC2=C1 HDAVJPSXEPLOMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 7
- 230000001678 irradiating effect Effects 0.000 abstract description 4
- 108020004711 Nucleic Acid Probes Proteins 0.000 abstract description 3
- 239000002853 nucleic acid probe Substances 0.000 abstract description 3
- 239000003973 paint Substances 0.000 description 90
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 64
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 63
- 108090000862 Ion Channels Proteins 0.000 description 62
- 102000004310 Ion Channels Human genes 0.000 description 62
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 61
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 55
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 48
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 42
- 239000012216 imaging agent Substances 0.000 description 41
- 238000003032 molecular docking Methods 0.000 description 33
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 26
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 21
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 20
- 239000002086 nanomaterial Substances 0.000 description 19
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 18
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 18
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 17
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 16
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 16
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 14
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 14
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 14
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 13
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 12
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 12
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 11
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 11
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 10
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 10
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 10
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 10
- 108091006146 Channels Proteins 0.000 description 9
- 101001139158 Dictyostelium discoideum Kinesin-related protein 3 Proteins 0.000 description 9
- 101001006792 Dictyostelium discoideum Kinesin-related protein 5 Proteins 0.000 description 9
- 101001006786 Dictyostelium discoideum Kinesin-related protein 7 Proteins 0.000 description 9
- 108091022875 Microtubule Proteins 0.000 description 9
- 102000029749 Microtubule Human genes 0.000 description 9
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 9
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 9
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 9
- 210000004688 microtubule Anatomy 0.000 description 9
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 9
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 8
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 description 8
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 8
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 7
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 7
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 7
- -1 1-(2-nitrophenyl)ethyl group Chemical group 0.000 description 6
- 108060006004 Ascorbate peroxidase Proteins 0.000 description 6
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 6
- 239000002585 base Substances 0.000 description 6
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 6
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 6
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 6
- 230000006916 protein interaction Effects 0.000 description 6
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 6
- 201000009310 astigmatism Diseases 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 238000009987 spinning Methods 0.000 description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- 108090000312 Calcium Channels Proteins 0.000 description 4
- 102000003922 Calcium Channels Human genes 0.000 description 4
- 239000004971 Cross linker Substances 0.000 description 4
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 4
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 4
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 4
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical class NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 4
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 4
- 238000001459 lithography Methods 0.000 description 4
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 4
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 4
- 238000010869 super-resolution microscopy Methods 0.000 description 4
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QGKMIGUHVLGJBR-UHFFFAOYSA-M (4z)-1-(3-methylbutyl)-4-[[1-(3-methylbutyl)quinolin-1-ium-4-yl]methylidene]quinoline;iodide Chemical class [I-].C12=CC=CC=C2N(CCC(C)C)C=CC1=CC1=CC=[N+](CCC(C)C)C2=CC=CC=C12 QGKMIGUHVLGJBR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 3
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 3
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 3
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 3
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 3
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 3
- 108010063296 Kinesin Proteins 0.000 description 3
- 102000010638 Kinesin Human genes 0.000 description 3
- 102000007474 Multiprotein Complexes Human genes 0.000 description 3
- 108010085220 Multiprotein Complexes Proteins 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 3
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 3
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 3
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical group [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 3
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 3
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 3
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 3
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 3
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 3
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 3
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 3
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 3
- BPYKTIZUTYGOLE-IFADSCNNSA-N Bilirubin Chemical compound N1C(=O)C(C)=C(C=C)\C1=C\C1=C(C)C(CCC(O)=O)=C(CC2=C(C(C)=C(\C=C/3C(=C(C=C)C(=O)N\3)C)N2)CCC(O)=O)N1 BPYKTIZUTYGOLE-IFADSCNNSA-N 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 2
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 2
- 102000003505 Myosin Human genes 0.000 description 2
- 108060008487 Myosin Proteins 0.000 description 2
- 108010079855 Peptide Aptamers Proteins 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZTHYODDOHIVTJV-UHFFFAOYSA-N Propyl gallate Chemical compound CCCOC(=O)C1=CC(O)=C(O)C(O)=C1 ZTHYODDOHIVTJV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 238000004873 anchoring Methods 0.000 description 2
- 238000003491 array Methods 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 2
- 238000004624 confocal microscopy Methods 0.000 description 2
- 239000006059 cover glass Substances 0.000 description 2
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 2
- KDUIUFJBNGTBMD-VXMYFEMYSA-N cyclooctatetraene Chemical compound C1=C\C=C/C=C\C=C1 KDUIUFJBNGTBMD-VXMYFEMYSA-N 0.000 description 2
- UFULAYFCSOUIOV-UHFFFAOYSA-N cysteamine Chemical compound NCCS UFULAYFCSOUIOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 2
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 108060002430 dynein heavy chain Proteins 0.000 description 2
- 102000013035 dynein heavy chain Human genes 0.000 description 2
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 2
- 238000002866 fluorescence resonance energy transfer Methods 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 2
- 210000001822 immobilized cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 229960003151 mercaptamine Drugs 0.000 description 2
- MCYHPZGUONZRGO-VKHMYHEASA-N methyl L-cysteinate Chemical compound COC(=O)[C@@H](N)CS MCYHPZGUONZRGO-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 230000003955 neuronal function Effects 0.000 description 2
- 238000006303 photolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000015843 photosynthesis, light reaction Effects 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- ZCCUUQDIBDJBTK-UHFFFAOYSA-N psoralen Chemical compound C1=C2OC(=O)C=CC2=CC2=C1OC=C2 ZCCUUQDIBDJBTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000011897 real-time detection Methods 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 2
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 2
- 238000012876 topography Methods 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SLLFVLKNXABYGI-UHFFFAOYSA-N 1,2,3-benzoxadiazole Chemical compound C1=CC=C2ON=NC2=C1 SLLFVLKNXABYGI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HWPZZUQOWRWFDB-UHFFFAOYSA-N 1-methylcytosine Chemical compound CN1C=CC(N)=NC1=O HWPZZUQOWRWFDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VGIRNWJSIRVFRT-UHFFFAOYSA-N 2',7'-difluorofluorescein Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(F)C(=O)C=C2OC2=CC(O)=C(F)C=C21 VGIRNWJSIRVFRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MPPQGYCZBNURDG-UHFFFAOYSA-N 2-propionyl-6-dimethylaminonaphthalene Chemical compound C1=C(N(C)C)C=CC2=CC(C(=O)CC)=CC=C21 MPPQGYCZBNURDG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BNBQQYFXBLBYJK-UHFFFAOYSA-N 2-pyridin-2-yl-1,3-oxazole Chemical compound C1=COC(C=2N=CC=CC=2)=N1 BNBQQYFXBLBYJK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VXGRJERITKFWPL-UHFFFAOYSA-N 4',5'-Dihydropsoralen Natural products C1=C2OC(=O)C=CC2=CC2=C1OCC2 VXGRJERITKFWPL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UWAUSMGZOHPBJJ-UHFFFAOYSA-N 4-nitro-1,2,3-benzoxadiazole Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC=CC2=C1N=NO2 UWAUSMGZOHPBJJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010001497 Agitation Diseases 0.000 description 1
- 108091023037 Aptamer Proteins 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 108091032955 Bacterial small RNA Proteins 0.000 description 1
- 102100022291 C-Jun-amino-terminal kinase-interacting protein 1 Human genes 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710167800 Capsid assembly scaffolding protein Proteins 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000122205 Chamaeleonidae Species 0.000 description 1
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 description 1
- MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N Dioxygen Chemical compound O=O MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000007338 Fragile X Mental Retardation Protein Human genes 0.000 description 1
- 108010032606 Fragile X Mental Retardation Protein Proteins 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 101001046660 Homo sapiens C-Jun-amino-terminal kinase-interacting protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 238000012404 In vitro experiment Methods 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 101710138657 Neurotoxin Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 description 1
- KRWMERLEINMZFT-UHFFFAOYSA-N O6-benzylguanine Chemical compound C=12NC=NC2=NC(N)=NC=1OCC1=CC=CC=C1 KRWMERLEINMZFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005524 O6-benzylguanine Drugs 0.000 description 1
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 102000004257 Potassium Channel Human genes 0.000 description 1
- 102100023204 Potassium channel subfamily K member 2 Human genes 0.000 description 1
- 101710130420 Probable capsid assembly scaffolding protein Proteins 0.000 description 1
- WDVSHHCDHLJJJR-UHFFFAOYSA-N Proflavine Chemical compound C1=CC(N)=CC2=NC3=CC(N)=CC=C3C=C21 WDVSHHCDHLJJJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001069 Raman spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 101710204410 Scaffold protein Proteins 0.000 description 1
- 108010003723 Single-Domain Antibodies Proteins 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010052164 Sodium Channels Proteins 0.000 description 1
- 102000018674 Sodium Channels Human genes 0.000 description 1
- 102000003568 TRPV3 Human genes 0.000 description 1
- GLEVLJDDWXEYCO-UHFFFAOYSA-N Trolox Chemical compound O1C(C)(C(O)=O)CCC2=C1C(C)=C(C)C(O)=C2C GLEVLJDDWXEYCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150043371 Trpv3 gene Proteins 0.000 description 1
- DPKHZNPWBDQZCN-UHFFFAOYSA-N acridine orange free base Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC2=NC3=CC(N(C)C)=CC=C3C=C21 DPKHZNPWBDQZCN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BGLGAKMTYHWWKW-UHFFFAOYSA-N acridine yellow Chemical compound [H+].[Cl-].CC1=C(N)C=C2N=C(C=C(C(C)=C3)N)C3=CC2=C1 BGLGAKMTYHWWKW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001251 acridines Chemical class 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 108091005764 adaptor proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000035181 adaptor proteins Human genes 0.000 description 1
- 239000007801 affinity label Substances 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 229940027998 antiseptic and disinfectant acridine derivative Drugs 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- JPIYZTWMUGTEHX-UHFFFAOYSA-N auramine O free base Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1C(=N)C1=CC=C(N(C)C)C=C1 JPIYZTWMUGTEHX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003376 axonal effect Effects 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N benzoquinolinylidene Natural products C1=CC=CC2=CC3=CC=CC=C3N=C21 DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 238000012984 biological imaging Methods 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 239000007844 bleaching agent Substances 0.000 description 1
- 230000004397 blinking Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 230000036760 body temperature Effects 0.000 description 1
- 238000005282 brightening Methods 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- CZPLANDPABRVHX-UHFFFAOYSA-N cascade blue Chemical compound C=1C2=CC=CC=C2C(NCC)=CC=1C(C=1C=CC(=CC=1)N(CC)CC)=C1C=CC(=[N+](CC)CC)C=C1 CZPLANDPABRVHX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 230000004656 cell transport Effects 0.000 description 1
- 230000030570 cellular localization Effects 0.000 description 1
- 210000003850 cellular structure Anatomy 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000013043 chemical agent Substances 0.000 description 1
- 125000003636 chemical group Chemical group 0.000 description 1
- 229940114081 cinnamate Drugs 0.000 description 1
- 230000001427 coherent effect Effects 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 150000001893 coumarin derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 230000003436 cytoskeletal effect Effects 0.000 description 1
- 125000001295 dansyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(N(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H])=C2C([H])=C([H])C([H])=C(C2=C1[H])S(*)(=O)=O 0.000 description 1
- 230000009849 deactivation Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000000368 destabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000004205 dimethyl polysiloxane Substances 0.000 description 1
- 235000013870 dimethyl polysiloxane Nutrition 0.000 description 1
- BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L disodium;(2',7'-dibromo-3',6'-dioxido-3-oxospiro[2-benzofuran-1,9'-xanthene]-4'-yl)mercury;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Na+].O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(Br)=C([O-])C([Hg])=C1OC1=C2C=C(Br)C([O-])=C1 BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 210000001353 entorhinal cortex Anatomy 0.000 description 1
- YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N eosin Chemical compound [Na+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000052116 epidermal growth factor receptor activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108700015053 epidermal growth factor receptor activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010015037 epilepsy Diseases 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 230000002964 excitative effect Effects 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 238000001298 force spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000004820 halides Chemical class 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 150000002484 inorganic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229910010272 inorganic material Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 230000037427 ion transport Effects 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- FDZZZRQASAIRJF-UHFFFAOYSA-M malachite green Chemical compound [Cl-].C1=CC(N(C)C)=CC=C1C(C=1C=CC=CC=1)=C1C=CC(=[N+](C)C)C=C1 FDZZZRQASAIRJF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229940107698 malachite green Drugs 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- DZVCFNFOPIZQKX-LTHRDKTGSA-M merocyanine Chemical compound [Na+].O=C1N(CCCC)C(=O)N(CCCC)C(=O)C1=C\C=C\C=C/1N(CCCS([O-])(=O)=O)C2=CC=CC=C2O\1 DZVCFNFOPIZQKX-LTHRDKTGSA-M 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 1
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 1
- 231100000324 minimal toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 231100000219 mutagenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 1
- VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N n'-amino-n-iminomethanimidamide Chemical compound N\N=C\N=N VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N 0.000 description 1
- YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N n-[3-[[6-[3-(trifluoromethyl)anilino]pyrimidin-4-yl]amino]phenyl]cyclopropanecarboxamide Chemical compound FC(F)(F)C1=CC=CC(NC=2N=CN=C(NC=3C=C(NC(=O)C4CC4)C=CC=3)C=2)=C1 YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940031182 nanoparticles iron oxide Drugs 0.000 description 1
- 150000002790 naphthalenes Chemical class 0.000 description 1
- 239000002581 neurotoxin Substances 0.000 description 1
- 231100000618 neurotoxin Toxicity 0.000 description 1
- XJCPMUIIBDVFDM-UHFFFAOYSA-M nile blue A Chemical compound [Cl-].C1=CC=C2C3=NC4=CC=C(N(CC)CC)C=C4[O+]=C3C=C(N)C2=C1 XJCPMUIIBDVFDM-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- VOFUROIFQGPCGE-UHFFFAOYSA-N nile red Chemical compound C1=CC=C2C3=NC4=CC=C(N(CC)CC)C=C4OC3=CC(=O)C2=C1 VOFUROIFQGPCGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 108091008104 nucleic acid aptamers Proteins 0.000 description 1
- CXQXSVUQTKDNFP-UHFFFAOYSA-N octamethyltrisiloxane Chemical compound C[Si](C)(C)O[Si](C)(C)O[Si](C)(C)C CXQXSVUQTKDNFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000010355 oscillation Effects 0.000 description 1
- 150000004866 oxadiazoles Chemical class 0.000 description 1
- GHTWDWCFRFTBRB-UHFFFAOYSA-M oxazine-170 Chemical compound [O-]Cl(=O)(=O)=O.N1=C2C3=CC=CC=C3C(NCC)=CC2=[O+]C2=C1C=C(C)C(N(C)CC)=C2 GHTWDWCFRFTBRB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 150000004893 oxazines Chemical class 0.000 description 1
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 description 1
- 102000014187 peptide receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010011903 peptide receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000003094 perturbing effect Effects 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002186 photoactivation Effects 0.000 description 1
- 238000000206 photolithography Methods 0.000 description 1
- 108091008695 photoreceptors Proteins 0.000 description 1
- 238000004987 plasma desorption mass spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 229920000435 poly(dimethylsiloxane) Polymers 0.000 description 1
- 229920003229 poly(methyl methacrylate) Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000004926 polymethyl methacrylate Substances 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 108020001213 potassium channel Proteins 0.000 description 1
- 108010083945 potassium channel protein TREK-1 Proteins 0.000 description 1
- 229960000286 proflavine Drugs 0.000 description 1
- 235000010388 propyl gallate Nutrition 0.000 description 1
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 1
- 230000009145 protein modification Effects 0.000 description 1
- 150000003220 pyrenes Chemical class 0.000 description 1
- 125000000714 pyrimidinyl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 1
- 239000003642 reactive oxygen metabolite Substances 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N renifolin D Natural products CC(=C)[C@@H]1Cc2c(O)c(O)ccc2[C@H]1CC(=O)c3ccc(O)cc3O BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052594 sapphire Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010980 sapphire Substances 0.000 description 1
- 230000002000 scavenging effect Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 239000004065 semiconductor Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000000946 synaptic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 1
- MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N texas red Chemical compound [O-]S(=O)(=O)C1=CC(S(Cl)(=O)=O)=CC=C1C(C1=CC=2CCCN3CCCC(C=23)=C1O1)=C2C1=C(CCC1)C3=[N+]1CCCC3=C2 MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WBYWAXJHAXSJNI-VOTSOKGWSA-M trans-cinnamate Chemical compound [O-]C(=O)\C=C\C1=CC=CC=C1 WBYWAXJHAXSJNI-VOTSOKGWSA-M 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- IMNIMPAHZVJRPE-UHFFFAOYSA-N triethylenediamine Chemical compound C1CN2CCN1CC2 IMNIMPAHZVJRPE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009281 ultraviolet germicidal irradiation Methods 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- 238000007794 visualization technique Methods 0.000 description 1
- 238000012070 whole genome sequencing analysis Methods 0.000 description 1
- 125000001834 xanthenyl group Chemical class C1=CC=CC=2OC3=CC=CC=C3C(C12)* 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
- G01N21/6456—Spatial resolved fluorescence measurements; Imaging
- G01N21/6458—Fluorescence microscopy
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
- G01N21/77—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
- G01N21/77—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator
- G01N2021/7769—Measurement method of reaction-produced change in sensor
- G01N2021/7786—Fluorescence
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Optics & Photonics (AREA)
- Plasma & Fusion (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
Abstract
本公开提供了用于在基板上生成分子的超分辨率图案的方法。在一个方面，本文公开了一种方法，其包括使多个瞬时结合的核酸探针与其各自靶标接触，其中所述靶标被固定在基板上，检测基板的衍射受限区域内的选择区域或选择区域集合中的结合事件，和照射基板的衍射受限区域，其中所述探针包含光交联剂。在一个实施方案中，所述光交联剂是3‑氰基乙烯基咔唑。
Description
相关申请
本申请要求2013年12月15日提交的美国临时申请号61/916259(其各自的完整内容通过引用并入本文)的权益。
联邦资助的研究
本发明是在美国国立卫生研究院授予的拨款号1DP2OD007292-01下的政府支持的情况下进行的。政府在本发明中具有某些权利。
背景
现代分子生物学的标志是在分子尺度上操作和观察生物系统的能力。操作和观察的精度经常决定可以获得的知识的清晰度、质量和置信度。打破光的衍射限制的超分辨率成像方法已经允许研究人员“看到先前看不见的东西”，并在深得多的水平获得洞察力。
概述
本发明提供了允许以纳米精度光学操作分子的方法。迄今为止，标记(和进一步操作且由此研究)小规定的目标区域(诸如5nm×5nm目标区域)中的靶标诸如靶蛋白质、同时还不无差别标记短距离(例如，10nm)远的另一靶标是有挑战性的。本文提供了用于超分辨率标记的方法，其涉及超分辨的光学标记和以纳米精度扰动分子靶标。这些方法允许研究人员“获取先前不可接触的东西”。该能力具有广泛范围的应用，包括但不限于用于捕获和鉴定细胞中在任意用户指定的分子位置的蛋白质靶标的纳米级单细胞空间蛋白质组学，以及用于以纳米精度活化/失活活神经元上的用户指定的位置的特定离子通道的纳米级光遗传学。
本公开提供了用于就目标分子或功能而言在两个或三个维度图案化基板的方法和组合物。本文提供的方法采用了具有化学(其允许与靶标瞬时结合相互作用(例如，参与与探针的序列特异性结合相互作用的表面缀合的核酸))的探针，和光交联剂和/或光可裂解的接头。该方法进一步包括检测结合事件，随后在特定条件下(例如，仅当单一期望的结合事件发生时)照射基板。该过程在本文被称为反馈过程(或系统)，因为其为决定并控制照射事件的时机的结合事件本身的发生。
在一个方面，本文公开了这样的方法，其包括使多个瞬时结合的核酸探针与其各自靶标接触，其中所述靶标被固定在基板上，检测基板的衍射受限区域内的选择区域或选择区域集合中的结合事件，和照射基板的衍射受限区域，其中所述探针包含光交联剂。在一个实施方案中，所述光交联剂是3-氰基乙烯基咔唑。在一个实施方案中，所述基板的衍射受限区域用366nm至405nm光照射少于1秒或少于0.5秒。所述探针可以是序列和长度足以实现瞬时结合至靶标的探针。本文提供了探针序列基序的实例。
在另一个方面，本文公开了这样的方法，其包括使多个瞬时结合的核酸探针与其各自靶标接触，其中所述靶标被固定在基板上，检测基板的衍射受限区域内的选择区域中的结合事件，和照射基板的衍射受限区域，其中所述探针具有发夹二级结构，且沿着其长度具有光可裂解的接头或间隔区(使得所述接头或间隔区的断裂将诱导链中的共价断裂)。在一个实施方案中，所述光可裂解的接头包含1-(2-硝基苯基)乙基。在一些实施方案中，所述基板的衍射受限区域用具有等于或小于405nm的波长的光照射，任选少于1秒或少于0.5秒。所述探针可以包含立足点(即，在结合至靶标前是单链且由其结合至靶标的核苷酸序列)。所述立足点可以具有类似于标准“用于纳米级形势中的成像的点积聚(PointsAccumulation for Imaging in Nanoscale Topography,PAINT)”探针的特征的特征，包括特定结合能量(当结合至靶标时)，其进而取决于序列和长度。
在前述方面，如果选择区域中的结合事件是整个衍射受限区域中的唯一结合事件，则发生照射步骤。在这方面，如果结合事件触发照射步骤(或事件)，则其可以在本文被称为“唯一”结合事件以意指，其为衍射受限区域中的唯一结合事件。如果与选择区域中的结合事件同时检测其它结合事件，则不发生照射。以该方式，探针仅附接至衍射受限区域内的选择区域，而不附接至其它区域。
在一些情况下，所述探针和靶标之间的结合的瞬时性质决定待使用的光交联剂和光可裂解的接头的性质。所述光交联剂和光可裂解的接头通常可以用短激光脉冲持续时间以～1W/cm2(或更小)至千瓦/cm2范围内的功率密度进行活化，其进而意味着它们可以在非常短的时间段内用通常用于生物成像应用诸如随机光学重构显微镜(STORM)超分辨率成像的标准且廉价的激光器进行活化。这是重要的，因为所述探针和靶标之间的结合仅发生短时间段，并且可以希望避免所图案化的基板或先前图案化的探针或其载荷的照射损伤。如本文所使用，所述光交联剂和光可裂解的接头的活化意欲分别形成共价加合物和键的裂解。
待图案化的基板的选择区域可以比所述衍射受限区域更小。待图案化的基板的选择区域可以具有(或可以不具有)这样的特征或区域，其局部具有比其对应的衍射受限区域的面积(或体积)更小的面积(或体积)。在一些实施方案中，待图案化的选择区域不比衍射受限区域更小，并且相反，其可以含有比直接衍射受限区域更小的特征(其可以连接或可以不连接)。基于可以使用超分辨率显微镜观察探针的精度和准确度确定探针是否位于任意二维或三维选择区域(其可以在本文被称为模版)。因此，可以使用大小尺度低于衍射限值的具有几何定义特征的图案化模板。
应当理解的是，照射步骤在检测到期望的结合事件之后不久发生。检测和照射之间的时间可以是毫秒的量级。所述方法可以是自动化的，并且可以采用CCD或EMCCD相机来检测衍射受限区域内的结合事件。所述方法还可以采用激光点照射器或数字微镜装置(DMD)阵列。如果使用DMD阵列，则可以监测且同时或并行图案化多个衍射受限区域。
在一些实施方案中，所述探针进一步包含荧光团。在一些实施方案中，所述荧光团是ATTO 655、Alexa 647或其它亮荧光团。如本文所使用，“亮荧光团”是指发射足够数目的光子、使得CCD或EMCCD相机能够检测单一结合事件的荧光团。在一些实施方案中，所述荧光团是释放至少或约104-106个光子的荧光团。在一些实施方案中，Trolox、b-巯基乙醇(BME)、L-半胱氨酸甲酯(L-Cys-ME)、环辛四烯(COT)、没食子酸正丙酯、1,4-二氮杂双环[2.2.2]辛烷(DABCO)或巯基乙胺(MEA)和其它试剂可以以染料的氧化还原永久光漂白率存在于成像缓冲液中(例如，通过清除反应性氧种类(ROS)如单线态氧)，因此增加染料光子输出和定位精度)。通常，所使用的荧光团的激发和发射波长在用于活化光交联剂或光可裂解的接头的波长范围之外。在一些实施方案中，所述探针进一步包含官能团或部分。在一些实施方案中，所述官能团或部分是化学柄(chemical handle)。在一些实施方案中，所述官能团或部分是生物素、抗生物素蛋白或纳米颗粒。在一些实施方案中，所述官能团或部分是炔烃或叠氮化物(例如，用于“点击化学”)。在一些实施方案中，所述官能团或部分用于将载荷附接至基板。所述载荷可以是通常用于半导体工业中的光刻中的化学化合物。这样的化学化合物的实例是PDMS或PMMA。
在一些实施方案中，所述基板的选择区域是所述基板的选择面积或选择体积。所述选择区域可以是最终用户预定的区域或图案(例如，最终用户希望将具体目标载荷沉积于其中或其上的区域)。所述区域可以是面积或体积。所述图案可以是二维的或三维的。在后一种情况下，所述基板可以是小室(cell)或其它三维部分。
在一些情况下，所述衍射受限区域包含在其整个面积或体积相对均匀结合的多个靶标。以该方式，基板可以制备成包含结合至其表面中的一个或多个和其体积中的一个或多个的靶标，并且可以处理以生成如本文提供的超分辨率图案。结合至基板的靶标可以是彼此相同的或者它们可以是不同的。如果不同，则可以存在附接至基板的2-1000个靶标群体。任何给定的衍射受限区域可以包含1-1000个靶标群体。在一些情况下，所述靶标可以提供为结合至具有催化特性的胶体金颗粒(例如5nm Au纳米颗粒)或氧化铁纳米颗粒的寡核苷酸。
在一些实施方案中，其中去除结合至基板的选择区域之外的靶标的探针(例如，在与其各自靶标解离之后洗掉)。
上述方法可以用于生成目标部分的图案，例如通过在结合至靶标之前或之后将目标部分缀合至探针。如本文所述，所述图案可以具有超分辨率维度(即，小于光学检测系统的分辨率限值的维度)。例如，所述图案可以具有维度小于衍射受限分辨率的特征或组分(并且因此位于衍射受限区域内，其可以一维是例如几百纳米)。
本发明的这些和其它方面和实施方案将描述于本文中且被认为是本公开的部分。
附图简述
图1举例说明本公开的包括使用探针的光交联和探针的经由光裂解的动力学俘获的各个方面和实施方案。
图2举例说明超分辨率标记(操作-PAINT)。
图3A-F举例说明DNA-PAINT概念和高空间分辨率成像。(A-E)修改自Rust等人1。
图4A-C举例说明(A)操作-PAINT机制，(B)光交联基质，和(C)CNVK光交联批量实验。
图5举例说明使用矩形DNA折褶结构为操作-PAINT设基准。
图6A和B举例说明(A)操作-PAINT自动获取、处理和驱动软件，和(B)通过DMD阵列的活化激光空间控制。
图7举例说明光裂解。
图8举例说明3D DNA-PAINT超分辨率成像[39,22]。
图9A-E举例说明细胞中的操作-PAINT。(A,B)细胞靶标的2D(A)和3D(B)DNA-PAINT成像的初步工作[32]；(C,D)3D操作-PAINT原位展示。(C)使用3D-操作-PAINT用独特的DNA分子修饰3D纳米结构(固定在细胞表面上)的指定顶点。(D)使用旋转盘共聚焦系统在整个全细胞体积用3D-操作-PAINT位点特异性修饰微注射的3D纳米结构。(E)以20nm的间隔标记用DNA偶联的抗体标记的微管网络的操作-PAINT。
图10举例说明纳米级单细胞空间蛋白质组学。
图11举例说明单离子通道操作。
详述
超分辨率成像方法是本领域中已知的，且包括但不限于随机光学重构显微术(STORM)[1]和用于纳米级形势中的成像的点积聚(PAINT)[2,3]。本文提供的超分辨率标记方法部分基于这样的超分辨率成像方法(图2A)。简言之，在DNA-PAINT中，将样品用短(8-至9-nt)“对接链”(图2A中的链α)修饰，并且溶液含有荧光团(描述为星号)标记的“成像剂链”(a*)。成像剂链可以瞬时结合至对接链，在全内反射(TIR)成像下使之明亮。成像剂链的重复、瞬时结合将对接链在亮和暗状态之间随机转换，并且使得能够通过一次相继和精确定位一个对接链而将这些链超分辨率成像。DNA-PAINT可用于以小于10-nm分辨率显现固定细胞中的蛋白质[32]。也已经获得高密度、超分辨率图像，其涉及DNA纳米结构上隔开仅5nm的对接链(图2A，右侧)。
为了实现超分辨率标记(图2B)，例如用光交联剂和缀合柄(图2B中的b区段)修饰成像剂链。当成像剂链存在于DNA-PAINT下的期望位置(即，结合至目标区域中的对接链[用框描绘]；图2B中的情况(2))时，将成像剂链光交联至对接链，然后用缀合柄修饰目标区域中的对接链。然而，当成像剂链位于目标区域之外(图2B中的情况(1))时，不会触发交联。该过程在本公开中被称为“操作-PAINT”。这些方法可以在核纳米结构、细胞和组织，包括固定的细胞和组织，和活细胞和细胞膜的背景下实施。
操作-PAINT提供了广泛实施平台以实现细胞中的分子靶标的纳米级标记和操作。操作-PAINT可以用于纳米级单细胞空间蛋白质组学，其中可以在用户指定的位置特异性捕获和标记特定蛋白质及其相关的伴侣(图2C，顶部)。这些蛋白质然后可以使用单一蛋白质指纹分析方法进行鉴定(图2C，底部)，由此变性和拉伸各蛋白质，用DNA对接链标记特定氨基酸(例如，赖氨酸)，并且超分辨率DNA-PAINT将生成光学几何信号用于蛋白质鉴定。操作-PAINT也可以用于纳米级光遗传学，其中分子扰动剂(例如，阻断离子通道的lumitoxin)将递送至神经元上的用户指定的离子通道，由此使得能够以纳米精度特异性光学活化/失活离子通道(图2D)。操作-PAINT也可用于位点特异性靶标标记和纯化、扰动和位点特异性靶标上的载荷，等。
本公开提供了整合的超分辨率显现和标记方法。该方法基于短寡核苷酸的瞬时结合的超分辨率显现，和这些寡核苷酸的实时位点特异性活化而用于化学修饰。先前已经用超高空间分辨率(<5nm)和超高多路功率(多达10种颜色)表明使用DNA-PAINT3的超分辨率成像[32]。本公开通过整合实时显现和活化而延伸了这样的方法。活化步骤经由光反应性化学实现，包括使用包含光裂解和光交联的碱基的短寡核苷酸。
因此，如从上述将理解，在某些超分辨率成像方法中，探针，瞬时、而不是稳定，结合至其靶标。如果基板(或阶段)在图像获取过程中移动，则可以连续地(例如，使用时间推移技术)或串联地(用例如随后的比对和重叠)，任选地用漂移校正，获取图像。用于漂移校正的方法是本领域中已知的。所得图像然后可以用于定义探针结合，因此定位位置。
探针结合的瞬时性质允许最终用户辨别更多靶位置，包括位于给定光学检测系统的分辨率限值内的特别重要的靶位置。因此，使用常规的稳定结合探针，彼此分开小于所使用的光学检测系统的分辨率限值的两个靶位置不会被辨别为两个分开的位置。然而，如果使用瞬时结合探针，有更大可能性的是，在任何给定时间，两个靶位置之一将不会被其相应的探针结合。仅当单一靶位置结合至其相应的探针时，然后才可以获得图像，并且这些图像的编译将使两个靶位置呈现为分开的位置。
本发明采用超分辨率成像技术，并且在其上构建以便以超分辨率水平图案化基板。以超分辨率维度图案化基板的能力具有各种应用，包括光刻。此外，由于可以用多种载荷负载各探针，所以本发明也促进各种载荷的图案化。
探针
待用于本发明的方法中的探针可以是能够结合至目标靶标的任何部分。在一些情况下，所述探针可以特异性结合至靶标(即，其对于一种靶标具有较高的亲和力或有效唯一亲和力)。
所述靶标可以是核酸、蛋白质和其它生物和非生物实体。在一些实施方案中，所述靶标(或对接位点)可以在基板上彼此的200nm内。所述探针可以是核酸(例如，诸如寡核苷酸且包括适配子)、蛋白质(例如，诸如抗体或抗体片段)等。在某些实施方案中，所述靶标和探针是核酸，并且更具体是寡核苷酸。
在重要实施方案中，所述探针是在室温瞬时结合至其靶标的核酸。在一些实施方案中，所述探针长度为7-12个核苷酸。在一些实施方案中，所述探针长度为约9个核苷酸。在一些实施方案中，所述探针被荧光标记。当使用该长度的寡核苷酸时，所述寡核苷酸及其靶标之间的结合强度降低，因此它们比结合至其靶标的更长寡核苷酸更可能解离。在室温，长度为约8个或约9个核苷酸的寡核苷酸和靶区域与彼此仅瞬时结合。如本领域中将理解，在较高温度，寡核苷酸和靶区域的长度将通常增加，以实现相同的结合/解离动力学。这样的长度可以范围为，但不限于，约5个核苷酸至30个核苷酸，或约7个核苷酸至约25个核苷酸，或约9个核苷酸至约21个核苷酸。所述探针可以在本文被称为成像剂链，且所述靶标可以是对接链或可以缀合至对接链，所述对接链与成像剂链互补。因此，所述靶标可以是对接链，或者其可以是已经修饰以包含对接链的另一种目标试剂。
所述探针和靶标可以基于它们的相互作用的结合能来设计。因此，在一些情况下，所述探针和靶标之间的结合相互作用可以被定义为在25℃具有约-6.92kcal/mol的ΔG的结合能。ΔH(焓)可以是约-58kcal/摩尔，且ΔS(熵)可以为约-0.171kcal/(K·mol)。这些结合能假定包含约50mM至约1M NaCl的结合环境(例如，杂交环境)。如果在较高温度(例如，体温)发生结合，则结合能ΔG(在37℃)为约-4.86kcal/mol。因此，所述探针和靶标可以被设计成实现在这些量或约这些量的结合能。
应当进一步理解的是，所述探针可以包含核酸或由核酸组成，并且所述靶标可以包含核酸或由核酸组成。例如，所述探针可以是核酸和另一部分诸如蛋白质的缀合物。在核酸中促进基板上的相互作用和固定化。或者，如果所述探针是具有化学柄的核酸，则可以在固定化后使用这样的化学柄，以便在基板上的特定区域附接另一部分，诸如例如蛋白质。
所述探针将如本文所述用例如官能团或部分进一步修饰。所述官能团或部分的性质将取决于具体应用。实例包括结合伴侣诸如生物素和抗生物素蛋白，纳米颗粒或微粒，其它形式的载荷，和化学基团诸如炔烃或叠氮化物等。
图案化方法
本公开的各个方面将超分辨率成像方法，诸如随机光学重构显微术(STORM)[1]和用于纳米级形势中的成像的点积聚(Points Accumulation for Imaging in NanoscaleTopography,PAINT)[2,3]转化为高通量光刻工具，其允许以可以光学分辨它们的相同分辨率图案化分子。
光交联方法
在一个方面，本发明提供了用于交联PAINT探针的方法、产品和装置。在一些实施方案中，将所述探针光交联。在一些实施方案中，将这样的探针交联，包括光交联，至结合伴侣诸如互补结合伴侣。
在一些实施方案中，所述探针包含交联剂诸如光交联剂。所述交联剂，包括光交联剂，可以位于探针的末端(例如，5’末端或3’末端)，或者它可以在内部位置。在一些实施方案中，所述交联剂，包括光交联剂，可以位于探针的中心附近或探针的中心(例如，相对于其长度)。所述探针可以包含一种或多种交联剂。
在一些实施方案中，所述交联剂是光交联剂。可以根据本公开使用的光交联剂的实例是3-氰基乙烯基咔唑。其它交联剂，包括光交联剂(例如，肉桂酸酯，卤化碱诸如5-溴dU，补骨脂素)，是本领域中已知的，并且可以在其它实施方案中与本公开放在一起。
一个方面组合超分辨率成像技术诸如PAINT[2,3]与交联技术，诸如与3-氰基乙烯基咔唑核苷(CNVk)化学物的光化学交联[4-7]。该组合然后进一步与光源组合，所述光源诸如例如激光点照射器诸如例如在≈20Hz操作的照射器[8]，或具有例如约103至106个单独可编程镜子(用于大规模并行点照射)的数字微镜显示器(DMD)阵列[8-10]。通过整合这些要素，生成快速基于激光的反馈系统，其利用CCD相机输入永久固定(CNVk)-标记的探针诸如PAINT探针，其为二维表面上或三维体积中被随机相继吸附/添加(RSA)放置的瞬时占据对接位点[11-13]。
对接位置通常存在于图案化基板的面积或体积内，其在可用用于荧光团定位的CCD相机观察的全内反射荧光(TIRF)消散场内。
“典型”的CCD相机视场(FOV)为约≈50μm2(例如，用Andor iXon897EMCCD相机[14]，其具有512×512个像素的阵列)，并且可以使用≈4兆像素(2048×2048像素阵列)Orca-Flash 4.0V2Scientific CMOS CCD[15]合理地扩大至≈150μm2至≈200μm2面积。然而，这些FOV可以使用一些现有技术扩大，所述技术包括用于光响应非均匀性(Photo-ResponseNon-Uniformity,PRNU)的校准和校正惯例，其允许使用较低物镜(即，每衍射受限面积的较少像素)[16]，以及提高CCD相机探测器量子效率和像素密度。这些应当为针对高分辨率单分子定位和图案化缩放可工作探测器FOV提供了重要的机会。
关于三维体积中的图案化的事情，沿着可以图案化的焦平面的z-轴的程度(即，可及的“场深度”)和对于图案化可实现的分辨率，取决于各种三维超分辨率方法可以如何好地分辨荧光目标。为此，通过将Rafael Piestun的双螺旋点扩散函数(Double-HelicalPoint Spread Function,DH-PSF)[17]应用于三维超分辨率成像技术诸如STORM(或STORM的蛋白质变体，光活化的定位显微术(PALM)[18])，Moerner等人能够沿着x-、y-和z-轴经≈2μm场深度对单一荧光分子表明各向同性≈10nm至≈200nm分辨率[19,20]，并且还提取≈10度的标准偏差内的(z，θ，φ)染料取向参数[21]。这对于像散性[22]和多平面[23,24]方法实现的荧光染料定位分别超过≈600nm场深度和≈1μm场深度，并且通常经短或长场深度范围超过任一方法的3-空间分辨率[25-27]。因此，这些方法可以用于本公开的方法中。
本公开的某些方法使用CCD相机输入以引导激光反馈系统，以“冷冻”随机荧光探针结合相互作用，由此允许最终用户通过附接至荧光团的分子或颗粒的任意复杂图案的构建而走到熵梯度。使用荧光探针定位的该反馈方案，随机闪烁激光以原位锁定探针将引起潜在探针对接位点的集合的统一且随机的图案化。
(CNVk)[4-7]核苷可以并入PAINT[2,3]探针序列，优先在给定探针的中心附近，以尽可能提高热力学稳定性。优选地，嘧啶碱基(最佳为胸腺嘧啶、尿嘧啶或甲基胞嘧啶)[4-7]作为探针上的(CNVk)插入立即上游的核苷酸的Watson-Crick互补物而存在于修饰探针的对接位点上。
(CNVk)交联反应对于侧接插入位点的最近核苷酸是敏感的[4,7]。在以下核苷酸背景下，
(5'-…X(CNVk)-Y…-3')
(3'-…X’----Z-Y’…-5').
X’是与(CNVk)基团共价交联的嘧啶基团，Z核苷位于(CNVk)双链体插入的相对侧，但不直接参与交联反应，而Y/Y’Watson-Crick碱基对经由与(CNVk)/Z假-碱基对的堆积相互作用影响交联反应。如果X’＝T或U(这对于嘧啶碱基交联靶标是最佳选择)，则Z和Y的选择可以具有较少影响[4,7]。甲基化的胞嘧啶可以充当类似有效的交联靶标(即，X’＝Cm)[7]。
对于特定X’＝T实例[4,7]，以下杂交的寡核苷酸的配对在使用基于UV LED灯的光源用≈1.5W/cm2的功率密度以≈366nm照射<1秒之后得到≈50％光交联得率[4,7]：
5'-TGCACNVkTCGT-3'
3'-ACGT----GAGCA-5'。
因此，探针可以包含以下序列或由以下序列组成：
5'-TGCACNVkTCGT-3'
且对应靶标可以包含以下序列或由以下序列组成：
3'-ACGT--GAGCA-5'。
这样的探针-靶标对的能量近似值如下：
ΔH(0.01M至1M NaCl)::-49.4kcal/mol,
ΔS(1M NaCl)::-0.134kcal/(K*mol),
ΔG(1M NaCl,25℃)::-9.57kcal/mol，且
ΔG(1M NaCl,37℃)::-7.96kcal/mol。
在一些实施方案中，为了使探针更适合于PAINT，可以通过操作溶液的一价离子浓度而改变ΔG值。例如，可以降低NaCl一价离子的浓度以降低该序列的热稳定性，或者可替代地，可以增加NaCl浓度以补偿由于引入(CNVk)基团导致的不稳定影响。
经由1-(2-硝基苯基)乙基光裂解的动力学俘获
本公开的其它方面是本文描述的光交联实施方案的变型。在一个这样的变型中，将光可裂解间隔区诸如1-(2-硝基苯基)乙基光可裂解间隔区[31](商购自Ambergen)插入PAINT[2,3]探针的发夹变体中。这允许使用基于激光的反馈系统以便在所需位置和/或在所需时间原位动力学俘获随机PAINT探针结合相互作用。光可裂解间隔基化学物是与3-氰基乙烯基咔唑(CNVk)[4-7]修饰核苷的快速且直接光交联的替代方案。
可以用于该实施方案中的核酸的实例如下：
5'-/5ATTO655N/TAGATGTAT GGTCTG/iSpPC/CCGGACTTTTTTT TCAATGTAT TTTTTTTGTCCGGCAGACC ATACATCTA TCTTCATTA-3'(SEQ ID NO:1)
其中“/5ATTO655N/”被定义为寡核苷酸上的共价缀合的ATTO655染料的位置的指示符，且“/iSpPC/”被定义为使用例如1-(2-硝基苯基)乙基化学物的光可裂解间隔区的位置的指示符[31]。该探针具有74个核苷酸的长度，并且包含长度为9个核苷酸的立足点(粗体序列)。
本公开的方面和实施方案在图1中举例说明，其在下面更详细描述。如图中所示，本文提供的方法可用于在基板上以预定的(和潜在任意的)图案放置特定目标化学柄(在图底部通过5角星表示)。该图顶部举例说明其内任意图案以粗“弯曲矩形”表示的衍射受限区域。图中举例说明的过程的最终结果是使用目标部分生成预定图案，如右上框中所示。
中间小图举例说明可以如何使用光交联来实现图案。左小图举例说明基板上存在靶标。在该情况下，所述靶标是单链核酸。作为一个实例，单链核酸可以存在于沿着面积相对均匀分布的5nm胶态金颗粒上。所述探针还是具有一端的荧光团且另一端的化学柄的单链核酸。应当理解的是，化学柄仅仅代表任何目标官能团或部分。所述探针进一步包含3-氰基乙烯基咔唑的形式的光交联剂。所述光交联剂作为寡核苷酸探针的修饰核苷的部分存在。当探针结合至其靶标(在核酸靶标和探针的情况下通常通过Watson-Crick杂交)，靶标的位置作为从探针上的荧光团发射的结果是显而易见的。如果靶标位于预定目标区域(在图中被称为“模版”)中，且重要地，如果其在当时是唯一检测的结合事件，则整个区域将被照射，导致仅在目标区域形成靶标和探针之间的共价键。在举例说明的实例中，生成3-氰基乙烯基咔唑及其对接位点(胞嘧啶碱基的形式)之间的共价光加合物。因此，经由这样的共价键结合固定探针，如同其载荷一样。照射也用于光漂白荧光团，或者可替代地更接近于荧光团的波长的照射可用于完成这一点，使得该过程可以重复多次以便将额外探针固定于目标区域中，而不受先前固定的探针的干扰。在该具体情况下，可以通过用366-405nm的波长照射少于1秒或少于0.5秒来实现光交联。应当理解的是，仅当在衍射受限区域中检测到单一结合事件时才发生照射，并且结合事件存在于目标区域中。如果在目标区域之外检测到结合事件，则不发生照射。在模板面积(或体积)之外结合至靶标的任何探针仅瞬时结合，因此可以容易地经由一次或多次洗涤去除。
应当理解的是，可以使用其它光交联剂和其它荧光团，只要可以相对快速地活化光交联剂(并且因此具有相对少的能量)，并且荧光团能够发射足够数目的光子，足以在相对短的时间段内被检测。因此应当理解的是，探针结合的动力学，探针结合的检测(作为荧光团发射的结果)，和光交联剂活化都是相互关联的。
探针和靶标也可以被设计为包括特定序列模式，以增强它们的结合和随后的共价相互作用，如本文所述。
底部小图举例说明可以如何使用光裂解来实现模式。再次，与中间小图类似，左小图举例说明基板上存在靶标。如举例说明，所述靶标具有两个区域(核苷酸序列)。这些区域之一与探针上化学柄(本文被称为立足点)附近的特定区域(核苷酸序列)互补。另一区域与发夹探针上的另一特定区域互补。还举例说明发夹探针在其未结合和结合状态的结构。所述发夹探针包括在一端的化学柄，在另一端的荧光团，和在内部位置的光可裂解的接头。当结合至基板上的其靶标(通过通常从立足点与靶标的相互作用进行的过程)时，靶标的位置由从荧光团的荧光发射表示。如果靶标在预定目标区域(模版)中，且如果在衍射受限区域中没有检测到其它结合事件，则整个区域将被照射，导致发夹环的裂解和包含荧光团的探针区域的释放。在该情况下，经由小于或等于405nm的照射，1-(2-硝基苯基)乙基接头的闪光光裂解，生成热稳定的18聚体双链体。如举例说明，探针区域的释放在所得相对固定的探针上生成单链区域。如图中举例说明，裂解之后，固定的探针可以具有“无瘢痕5’磷酸酯”(例如，如果使用1-(2-硝基苯基)乙基接头，如图中举例说明)，意欲可以在连接反应中使用这样的末端，例如，没有进一步修饰。
设计立足点序列和长度，使得所述立足点的结合能足够强，足以开始探针杂交至靶标的过程，但不稳定，足以仍然瞬时结合(从而实现超分辨率成像，因此如本文提供的模式化)。在一些情况下，立足点区域因此可以长度为约9个核苷酸或更少。
应当理解的是，可以使用其它光可裂解的接头和其它荧光团，只要可以相对快速地活化光可裂解的接头(并且因此以～1W/cm2至千瓦/cm2的功率密度用短持续时间激光脉冲)，并且荧光团能够发射足够数目的光子，足以在相对短的时间段内被检测。因此应当理解的是，探针结合的动力学，探针结合的检测(作为荧光团发射的结果)，和光可裂解的接头活化都是相互关联的。
因此，如在本公开的背景下将理解，结合事件的期望性取决于衍射受限区域中的其位置(例如，(x,y)或(x,y,z))及其独特性。
本文提供的方法允许最终用户替代选择区域上的化学柄或标志物。一旦在选择区域中且仅在选择区域中检测到结合事件，则可以照射整个衍射受限区域，由此将探针固定至选择区域。所述化学柄或标志物可以是或可以用于附接例如纳米颗粒(对于拉曼光谱)或珠粒(对于力光谱)或荧光颗粒(对于FACS)。
等待(x,y)或(x,y,z)中的一些期望位置的探针结合事件、检查探针是否仅在衍射受限区域中、然后是否如此、决定用激光将其共价附接至基板(在其结合位置)的能力，允许最终用户在低于衍射限制的特定位点标记部分。作为非限制性实例，所述标记可以是可检测标记，或者它们可以是亲和标记。在光刻背景下，可以期望以模拟标准光刻技术(其改变衍射受限区域中的化学组成)的方式将大量标记置于衍射受限区域中。
在一些实施方案中，可以使用超快皮秒至飞秒激光脉冲以非常高功率密度(例如，使用Coherent’s Ti:sapphire Chameleon Ultra II系统)[36]代替UV或近UV光(例如，405nm光)。这允许使用“红偏移”光(例如，吸收两个810nm光子，至第一阶近似，类似于以两倍能量吸收一个405nm光子)。较长波长可以意指较少的对样品的损伤，或背景荧光，并且还可以在例如组织或3D聚合物网络中提供较深的穿透。
用于本公开的方法中的蛋白质的实例包括，但不限于，抗体(例如，单克隆单体)、抗原结合抗体片段(例如，Fab片段)、受体、肽和肽适配子。
如本文所使用，“抗体”包括全长抗体及其任何抗原结合片段(例如，“抗原结合部分”)或单链。术语“抗体”包括，但不限于，包含通过二硫键相互连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白，或其抗原结合部分。抗体可以是多克隆的或单克隆的；异种的、同种异体的或同基因的；或其修饰形式(例如人源化的、嵌合的)。
如本文所使用，抗体的“抗原结合部分”是指保留特异性地结合至抗原的能力的抗体的一个或多个片段。抗体的抗原结合功能可以由全长抗体的片段进行。术语抗体的“抗原结合部分”内涵盖的结合片段的实例包括(i)Fab片段，由VH、VL、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，包含通过二硫键在铰链区连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体的单一臂的VH和VL结构域组成的Fv片段，(v)dAb片段(Ward et al.,Nature 341:544 546,1989)，其由VH结构域组成；和(vi)分离的互补性决定区(CDR)或(vii)两个或更多个分离的CDR的组合，其可以任选地通过合成接头接合。而且，尽管Fv片段的两个结构域VH和VL由分开的基因编码，但可以使用重组方法通过合成接头将它们接合，所述接头能够使其成为单一蛋白质链，其中VH和VL区域配对以形成单价分子(被称为单链Fv(scFv)；参见，例如，Bird等人Science 242:423426,1988；andHuston et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883,1988)。这样的单链抗体也意欲涵盖于术语抗体的“抗原结合部分”中。可以使用本领域技术人员已知的常规技术获得这些抗体片段，并且筛选片段用于以与完整抗体相同的方式应用。
如本文所使用，“受体”是指结合至配体的源自细胞的分子(例如，蛋白质)，诸如，例如，肽或小分子(例如低分子量(<900道尔顿)有机或无机化合物)。
如本文所使用，“肽适配子”是指可变肽序列插入恒定支架蛋白质的分子(参见，例如，Baines IC,等人.Drug Discov.Today 11:334–341,2006))。
如本文所使用，“核酸适配子”是指可以形成能够特异性结合蛋白质或其它细胞靶标的二级和三级结构的小RNA或DNA分子(参见，例如，Ni X,等人.Curr Med Chem.18(27):4206–4214,2011)。
可以用于本文描述的方法中的荧光标记包括呫吨衍生物(例如荧光素、罗丹明、俄勒冈绿、伊红和德克萨斯红)、花青衍生物(例如花青、吲哚羰花青(indocarbocyanine)、氧代羰花青(oxacarbocyanine)、硫杂羰花青(thiacarbocyanine)和部花青)、萘衍生物(例如丹磺酰和普罗丹衍生物)、香豆素衍生物、噁二唑衍生物(例如吡啶基噁唑、硝基苯噁二唑和苯并噁二唑)、芘衍生物(例如级联蓝)、噁嗪衍生物(例如尼罗红、尼罗蓝、甲酚紫和噁嗪170)、吖啶衍生物(例如原黄素、吖啶橙和吖啶黄)、芳基次甲基衍生物(例如金胺、结晶紫和孔雀绿)、和四吡咯衍生物(例如卟吩、酞菁和胆红素)。在某些实施方案中，所述荧光团是ATTO655或Alexa 647或其它亮荧光团(例如，发射至少104–106个光子的荧光团)。
在某些实施方案中，所述荧光团是能够被可逆或永久光漂白的荧光团。
下面将更详细地描述各个方面和实施方案及其各种应用。
通过DNA-PAINT的超分辨率成像
远场荧光显微镜近年来已经看到真正复兴，因为出现了绕过经典衍射限制的方法，即，超分辨率显微术[39-41]。超分辨率显微术依赖于这样的事实，分子在有荧光和无荧光状态之间‘转换’，以获得亚衍射图像分辨率[42,18,1]。用于纳米级形势中的成像的点积聚(PAINT)[2]是用于随机超分辨率成像的易于实施的方法，其中使用与样品瞬时相互作用的扩散分子进行成像。一种实施PAINT的方式被称为DNA-PAINT3，其中短荧光标记的寡核苷酸(‘成像剂’链)与互补‘对接’链的重复、瞬时结合将分子从暗状态转换至亮状态(图3A，3B)。当成像剂链未被结合时，仅从样品观察到背景荧光；在成像剂链结合之后，使用全内反射(TIR)或高度倾斜且层叠的光学片(HILO)[43]照射检测其荧光发射。该整合能够以高度可调节的有荧光和无荧光时间(通过成像剂链结合强度和浓度设置)实现特定的模块化的超分辨率成像。最近，DNA-PAINT的分辨率增加至体外合成DNA结构的～10nm横向成像分辨率[32](图3C-3E)。使用先进的漂移校正算法和仔细优化的成像条件，已经实现了高密度、超分辨率DNA-PAINT图像，其中对接位点隔开仅～5nm(图3F)。也已经表明了合成纳米结构[38]和固定细胞38的3D成像。
2D中的操作-PAINT
DNA-PAINT与光化学过程偶联以永久固定瞬时结合的成像剂链，以实现具有纳米级精度的可编程和位点特异性标记。该方案的一种简单的实施方式(图4A)涉及首先将缀合柄(例如生物素或另一单链DNA结构域)和光交联剂附接至成像剂链，然后当成像剂链结合至目标区域中的靶标上的对接链时，触发成像剂和对接链之间的快速光交联反应。该位置中的靶标然后连接至缀合柄，并且可以进一步操作或分析。当对接链位于目标区域的外侧时，不会触发交联。
在合成DNA纳米结构平台上的超分辨率DNA探针捕获。
光反应性核碱基类似物3-氰基乙烯基咔唑(CNVK)[4,45]可以用作光交联剂(图4B)。在含有CNVK的DNA双链体中，UV光(350-405nm)可以诱导CNVK和相反链上的胸腺嘧啶(T)或胞嘧啶(C)之间的快速交联，由此形成两条链之间的共价连接。当照射的强度足够高时，光交联可以在一秒内进行完全。如图4C中所示，在1秒的365nm光暴露内实现10-nt寡核苷酸和含有CNVK的互补寡核苷酸之间的有效交联(>90％)。
该系统可以使用矩形的DNA折褶纳米结构进行基准化，所述矩形的DNA折褶纳米结构充当先前超分辨率成像方法中的校准标准品。32可以如下所述进行实验。
矩形的DNA折褶纳米结构以3×4 20nm栅格显示12个对接链。为了表明超分辨的标记，含有CNVK的成像剂链共价标记至仅在4个角的对接链。具体地，所有对接链都含有相同的9-nt序列α，而荧光标记的成像剂链含有两个结构域：序列“a*”(基本上与“a”互补，但含有CNVK修饰)和序列“b”。对于初始表征，每个视场仅分析一个DNA折褶纳米结构。如图5中所图示举例说明，该实验含有4个阶段。(1)在定位阶段，使用标准DNA-PAINT监测成像剂链与DNA折褶纳米结构上的对接链的结合。成像～10分钟之后，可以确定并存储DNA折褶纳米结构上的所有12个对接链的位置。(2)在ROI选择阶段中，用户指定待在下一步骤中修饰的对接位点(即，在ROI中，目标区域)(表示为圆形)。(3)在标记阶段中，无论何时成像剂链结合所研究的DNA折褶纳米结构上的对接链，将通过实时软件程序迅速确定其定位，以决定其是否在角上。如果它是，则该软件将触发UV源的打开以诱导成像剂链和对接链之间的交联。接下来，将递送强激光脉冲以漂白交联的成像剂链上的荧光团。将重复该过程，直到所有4个角都被成像剂链标记。(4)在分析阶段中，洗掉初始成像剂链，并且添加具有序列“b*”的二级成像剂链。第二成像剂链将用于标准DNA-PAINT中以显现交联的初始成像剂链的位置。DNA折褶纳米结构的仅4个角被预期‘亮起来’。
软件。该方法将通常使用软件进行，所述软件允许成像剂链的实时检测、定位、选择和交联。合适的软件满足两个要求。第一个要求是DNA-PAINT超分辨率图像的实时检测和处理。瞬时DNA-PAINT结合事件在定位阶段过程中进行检测和定位。作为该处理惯例的部分校正随着时间的任何阶段漂移以确保高分辨率成像和靶向。第二个要求是基于上述信息的实时选择和反馈。这对于确保成像剂链结合至其各自对接链的短时间段过程中的成像剂链的交联是必需的。该结合事件的瞬时性质要求顺利整合和实时进行整个过程。应当尽可能减少由软件计算循环引入的延迟以短于平均结合事件的持续时间(0.5-2秒)，以确保成功的交联。
能够快速且准确检测和定位且实现最小的定位误差的算法是已知的[46]。这样的算法提供了与要求高的超分辨率需求相容的理论上最佳的拟合精确度，并且还有效地使用GPU计算以加速处理速度以允许实时成像处理。漂移校正将基于追踪由金纳米颗粒和专门设计的核酸纳米颗粒制成的漂移标志物。两种方法的组合允许快速且精确的漂移校正，使得能够高要求的超分辨率成像。在其中在光谱分开通道中实时监测新活化的靶标的情况下，也可以实施实时报道。然后可以将处理的定位汇集并渲染成超分辨的图像，用于最终用户实时查看和分析并决定靶标选择用于后一活化步骤。该软件还包括常规的从渲染图像选择目标区域(ROI)。
硬件。为了提供指定结合寡核苷酸的实时位点特异性活化，使用具有快速转换和照射面积控制的UV激光。激光转换可以用具有<30ms转换延迟的声光可调谐滤光片(AOTF)快门来实施。激光照射可以用不受控制的全平面照射来实现。该方法在以期望图案产生局部(<5μm)位点特异性标记或扰动中是有效的。作为一个实例，可以使用配备具有小于30ms转换的AOTF快门的Nikon Ti显微镜系统。先前已经报道了与Nikon显微镜系统整合的成功尝试[8]。
为了实现更高效的大视场位点特异性图案化，使用数字微镜装置(DMD)阵列以便在整场实现UV激光照射的并行转换，如上所述。这样的DMD阵列装置提供了用于分割整个照射场的大像素阵列；定制控制在各像素是可能的，允许各像素进行ON或OFF转换。这允许独立控制各微阵列像素，同时在较大面积实现类似有效的操作和扰动。作为一个实例，可以使用Andor MOSAIC数字转换平台，因为其提供了在大1M像素阵列的基于像素的定制控制，并得到亚毫秒转换延迟。
替代固定化学。已经显示光可裂解的接头邻硝基苄基和其许多衍生物与生物系统具有优异的相容性，这是由于来自反应物和产物的毒性最小。这些化合物已经用于各种各样的生物应用中[47,17,48]。接头的一些变体甚至可以用高强度可见光经由二光子效应裂解，[49]因此消除潜在诱变的UV照射。已经开发了方案以通过使用光可裂解的接头、而不是光交联剂来实现成像剂链的光诱导的固定(图7)。此处，成像剂链假定为发夹结构，并在环中含有光可裂解的位点。当茎-环是完整的时，成像剂链可以经由短(～8-nt)立足点结合(图7)、随后等能链置换仅与对接链瞬时相互作用。当裂解环中的光可裂解的接头时，链置换可以导致发夹的一个臂的不可逆解离。尽管在最终产品中成像剂链没有共价连接至对接链，但其仍然稳定地杂交至对接链。
动力学。DNA寡核苷酸结合时间可以在宽范围(0.1-10s)内灵活地调谐，具有约0.5-2s的典型值。当前的成像率通常为每帧100ms。基于当前的软件处理速度的估计显示可以在100ms内实现有效的拟合和处理，且可以在30ms内实现硬件通信和活化。以1W/cm2UV激光功率，交联需要少于1s来完成。加在一起，这保证了化学活化将在结合事件发生之后<300ms的延迟内开始；因此，对于具有约2s的结合时间的寡核苷酸，这提供了足够的时间(>1s)用于交联发生。
特异性。通过确保结合事件在时间上彼此分离而保证修饰的特异性，使得因为两次连续结合而不发生错误活化。可以如下实现特异性。DNA-PAINT结合亮时间(ON-时间)和暗时间(OFF-时间)均可以独立且以宽动态范围进行调谐。结合ON/OFF时间比可以被调谐至足够低，使得在各衍射受限区域中，闪烁的可能性低(<1/10)。这保证了活化的>90％正确性。在已经发生错误检测和活化的事件中，我们可以利用光交联化学的可逆性，并且使用类似的方法用于在312nm UV照射下分离寡核苷酸[4]。
3D中的操作-PAINT
提出了在三维空间中的两次操作-PAINT实施。一种适合于接近于表面的应用，而另一种适用于更深的3D穿透诸如全细胞或甚至组织应用。对于接近于盖玻璃表面的操作-PAINT的应用，将使用基于像散性的3D超分辨率成像组合高度倾斜且层叠的光学片(HILO)[44]照明。这允许亚衍射检测和随后的操作-PAINT修饰用于～1μm场深度应用。在基于像散性的单分子成像中，当失焦成像时，成像路径中使用的圆柱形透镜将分子的球形点扩散函数(PSF)“转化”为椭圆形PSF(图8A)。
椭圆形PSF的程度和取向取决于来自当前焦点成像平面的点源的位移和方向，并且用于以亚衍射精确度确定其z位置(图8B)。基于像散性的3D操作-PAINT的实施如下：由于检测和驱动(即，使用UV脉冲固定DNA链用于交联)依赖于仅单一探针结合且在衍射受限体素中被检测(基于单分子的3D超分辨率显微术的先决条件)的事实，可以使用3D DNA-PAINT技术[32,39]以便以目前在x、y中～5nm精确度和在z中～10nm将分子定位于该体素(～200x200x 1000nm)中，确定结合是否发生于指定的5x 5x 10nm体素中，并且如果结合发生，则以3D中的高精确度固定探针。亚衍射大小的3D DNA多面体结构可以用作对照，其中结构的所有顶点都携带相同的DNA-PAINT对接位点(图8C)。表面固定之后，获取3D DNA-PAINT图像。可以定义四面体的顶点用于操作-PAINT修饰。本文描述的软件可以容易地延伸用于实时3D检测和驱动。
对于更深的3D成像，TIRF或HILO照射不太适合于3D DNA-PAINT(和因此操作-PAINT)，这是由于来自游离扩散成像剂链的增加平面外荧光，其恶化了有效定位单分子所必需的高信噪检测比。为了克服该限制，旋转盘共聚焦激光显微术用于深穿透3D操作-PAINT，允许我们在几十个微米(即，通过全细胞和潜在组织或小生物体)获得亚衍射位点特异性3D标记。对于远高于盖玻璃表面的结构的成像，已经广泛使用了共焦显微镜，因为其光学切片能力得到具有良好信噪比的图像。近来，当使用自发闪烁荧光分子时，使用旋转盘系统用于单分子超分辨率成像50]。鉴于DNA-PAINT探针自主闪烁(无需光转换)的事实，旋转盘共聚焦的3D切片能力应当适用于本文提供的方法。实际地说，可以一次在～1μm厚的z-切片中使用旋转盘共聚焦显微镜进行深度穿透3D操作-PAINT成像和标记。将通过如上所述的光学像散性成像获得亚衍射超分辨率能力。
细胞中的操作-PAINT
进行两项并发细胞研究。在第一项研究中，将纳米级DNA探针附接至DNA折褶纳米结构，所述DNA折褶纳米结构被锚定至固定细胞的表面或注射入细胞中且存在于细胞质或核中。在第二项研究中，操作-PAINT用于直接标记固定细胞中的蛋白质靶标(例如，以20nm的周期性间隔标记微管网络)。
DNA-PAINT细胞成像。已经表明使用DNA-PAINT的细胞结构的超分辨率成像[32]。此外，已经使用DNA缀合的抗体成像固定HeLa细胞中的细胞骨架微管网络(图8a)。此外，光学像散性[22,51]用于获得固定HeLa细胞内的微管网络的3D超分辨率图像(图9B；其中颜色指示高度)。
附接至细胞表面或显微注射入细胞的DNA结构上的操作-PAINT。为了评估操作-PAINT在细胞环境的背景下的表现，对附接至细胞表面的DNA四面体上的单个指定点进行高精度DNA寡核苷酸修饰。经由使用预组装的抗体DNA折褶缀合物免疫标记过表达的表面受体(诸如EGFR)实现将DNA纳米结构锚定至细胞表面(图9C)。细胞锚定之后，使用超分辨率DNA-PAINT成像解析四面体结构的四个角。此处，类似于先前的体外实验，使用含有两个序列结构域的荧光标记的成像剂链进行DNA-PAINT成像。第一结构域是与四面体结构上的对接链互补的序列，且含有CNVK修饰。第二结构域是独特的缀合柄，其在四面体结构的操作-PAINT纳米修饰之后可得，其用于通过第二轮的DNA-PAINT表征性能。接下来，如本文所述的软件和硬件组件，进行3D-操作-PAINT以便将成像剂链特异性附接至3D纳米结构的单一、指定的顶点。使用第二轮的DNA-PAINT评估细胞表面上的纳米结构修饰的性能。该实验得到关于影响细胞性能的参数的信息。
进行下一实验以表明修饰固定细胞内的纳米结构的能力(图9D)。将DNA四面体纳米显微注射入固定细胞的核和细胞质中。使用DNA-PAINT显现纳米结构，并且使用操作-PAINT修饰特定的顶点。该实验促进校准和减轻与获得自细胞表面的参考结果的偏差(如果有的话)。
标记细胞内蛋白质结构的操作-PAINT。在进一步实验中，操作-PAINT用于实现固定细胞中的蛋白质的位点特异性标记。在一项实验中，周期性标记微管网络。通过使用具有DNA链的微管靶向的抗体缀合物将DNA链锚定于整个微管网络上。获取微管网络的DNA-PAINT图像之后，进行操作-PAINT，以便以用户指定的图案，例如，以周期性的20nm间隔，永久固定DNA探针(图9E)。其后，通过DNA-PAINT成像图案化微管结构以评估蛋白质修饰的性能。这些细胞实验允许进一步优化参与细胞操作-PAINT的某些参数，包括选择具有低非特异性结合的成像剂序列，激光功率，和最佳交联所需的时间。在又另一项实验中，DNA-PAINT用于以周期性图案(例如，20nm栅格)标记细胞表面蛋白质簇。
在一些情况下，用纳米抗体替代全规模抗体，特别是当期望高密度成像时。在一些情况下，设计成像剂和对接链被，使得在CNVK交联实施中，T或C存在于对接链DNA中的-1位置。预期这尽可能减少非特异性交联。此外，为了消除可以导致含有CNVK的成像剂链与细胞自身的核酸的不期望的交联的序列相似性，将针对细胞的基因组内容物筛选含有CNVK的成像剂链序列。
应用
本文提供的方法可以用于在单细胞水平分析蛋白质特异性相互作用。与使用限于遗传可及的细胞隔室的小分子试剂的工程改造的基因标签的先前方法(例如，APEX)[34-36]相比，具有实时光学反馈的本文提供的方法允许任意标记和扰动图案，其具有并入基于来自实时超分辨率成像数据的信息的最终用户的决定的潜能。此外，该新方法可以在单细胞水平上进行，为最终用户提供细胞特异性蛋白质组学信息和细胞行为的随机波动的前所未有的知识。
本文提供的方法也可以用于纳米级光遗传学中，包括在空间时间受控的单离子通道操作中。在研究神经元激发和活动水平的离子通道效应的先前方法已经被限制为仅基于批次的转换，这是由于缺乏可以以超分辨率精度检测和扰动离子通道行为的操作工具。使用分子扰动剂诸如lumitoxin[37]，本文提供的方法提供了整合的工具集，其允许这些离子通道的超分辨率和分子特异性的显现和操作。这将促进鉴定和描绘致密簇中各单离子通道的作用，并且使得能够进一步研究其成簇排列的作用。
下面将更详细地描述这些应用。
实现纳米级单细胞空间蛋白质组学的操作-PAINT
本实施例描述了用于纳米级单细胞空间蛋白质组学的第一种方法。该方法特异性地捕获和鉴定细胞中的用户指定的位置的特定蛋白质及其相关伴侣。特异性捕获和鉴定特定蛋白质靶标及其相关伴侣的能力使得能够以位点特异性的方式详细理解来自单细胞的蛋白质网络结构。
已经传统上使用基于质谱(MS)的蛋白质组学解决描绘细胞中的蛋白质相互作用网络，其被限制为可以以高得率和纯度分离的细胞隔室。然而，许多细胞蛋白质相互作用难以纯化，并且作为结果，某些蛋白质的“相互作用组”无法使用现有技术方法进行探索。更近的技术使得能够使用工程改造的抗坏血酸过氧化物酶(APEX)作图活细胞中的特异性蛋白质相互作用组[34-36]。然而，基于APEX-蛋白质网络作图获得自来自大细胞群体、而不是来自单细胞的平均蛋白质相互作用。进一步，也已经假设某些蛋白质具有完全不同的相互作用蛋白质伴侣，这取决于它们的细胞功能，并且这些相互作用无法使用基于APEX-生物化学表征进行作图。重要的是，用于基于遗传标签(诸如APEX)的位置特异性标记的方法限于遗传可及的位置，并且无法实现任意用户指定的位置选择。相反，操作-PAINT使得用户能够在任意用户指定的位置“抓住”蛋白质。
纳米级空间标记和捕获。图10A提供了这些方法的设计。在步骤1中，固定细胞，并且用缀合至对接链(序列a)的抗体标记靶蛋白质。在步骤2中，以～5nm的分辨率进行DNA-PAINT超分辨率成像(图3F)。这允许以亚衍射分辨率空间鉴定靶蛋白质的位置。在步骤3中，使用操作-PAINT，将使用携带缀合柄(序列b)的成像剂链修饰ROI中的对接链(框)。在步骤4中，裂解细胞，并且使用与缀合柄b互补的链(b*)将内容物捕获于成像室中，其允许分离目标蛋白质复合物。然后使用如下所述的单一蛋白质光学指纹分析法鉴定复合物中的蛋白质。可以以2D和3D实施进行实验。
经由超分辨率指纹分析的单一蛋白质鉴定。通过将DNA(用化学标签修饰)附接至特定氨基酸残基(例如，用NHS-酯化学附接至赖氨酸)和以DNA-PAINT超分辨率(2nm定位精确度)成像来实现“蛋白质指纹分析”。图10B提供了这些方法的设计。在步骤1中，使用化学剂诸如SDS变性和拉伸从先前方法(上文)捕获的蛋白质复合物。用另一种标签特异性标记肽链中的所有赖氨酸残基，所述另一种标签包含DNA-PAINT柄，并且在该情况下包含点击化学反应基团(诸如TCO)。可以使用其它缀合方式代替点击化学反应基团。在步骤2中，将具有额外的点击化学锚的拉伸肽链固定在用反作用点击化学基团(诸如TZ)完全修饰的表面上。在步骤3中，用新标记的DNA-PAINT柄的超分辨率DNA-PAINT成像用于显示所有赖氨酸残基的位置，具有<2nm定位精确度。拉伸肽链中的所有鉴定的赖氨酸残基的集合提供了肽序列中的赖氨酸分布的条形码样代表。特异性标记的残基的组合多样性允许独特鉴定蛋白质(文库大小>107)。在步骤4中，将该条形码信息与来自全基因组测序的所有基因鉴定的蛋白质编码序列的文库进行比较和匹配，然后确定目前蛋白质的身份。
用该方法，来自相同蛋白质复合物的蛋白质将是彼此接近的，并且可以与来自不同复合物的那些分开。也可以鉴定大蛋白质复合物内的各单一组分，并且将其与其基因序列直接匹配，而无需蛋白质组分的任何先前知识，并且不使用预先存在的针对各组分的抗体。可以用交换-PAINT进行多轮残基特异性的条形码成像[32]，以便进一步鉴定具有类似条形码的蛋白质，或研究特定特征，诸如磷酸化和翻译后修饰图案。
应用于马达蛋白质。先前工作已经确定，马达蛋白质诸如肌球蛋白、驱动蛋白和动力蛋白具有完全不同的蛋白质相互作用网络，这取决于它们与之相关的细胞载荷[52,53]及其在细胞环境内的位置(例如，甚至当与相同载荷相关时)[54]。对于这些马达蛋白质的大部分现有蛋白质相互作用作图研究来自大量生物化学和一些单分子分析数据[55-57]。使用本文所述的技术，独特的DNA柄可以附接至蛋白质靶标以促进单细胞内的不同细胞位置中存在的单独马达蛋白质复合物的拉下和蛋白质概况分析。一种合适的复合物是驱动蛋白-1马达蛋白质的蛋白质相互作用组，因为使用其它先前系统对其进行广泛研究，并且可以将结果与先前作为验证获得的结果进行比较[58]。
首先，固定哺乳动物细胞，并且经由预组装的驱动蛋白-1抗体-DNA缀合物将DNA锚寡核苷酸附接至驱动蛋白-1马达蛋白质[32]。然后进行DNA-PAINT超分辨率成像，以对细胞内的所有驱动蛋白-1马达蛋白质的细胞定位进行作图。进一步，该实验可用于研究驱动蛋白-1相互作用组与不同形式的细胞载荷(例如，mRNA、脂质、线粒体等)的相互作用。这可以通过进行多路DNA-PAINT成像和仅选择与特定载荷类型共定位的那些驱动蛋白-1蛋白质来实现，并且存在于微管上，后一特征表明在活性细胞转运的过程中的驱动蛋白-1。然后，如前所述，使用用光交联或光裂解DNA碱基修饰的DNA，将独特DNA柄附接至目标特定驱动蛋白-1蛋白质复合物，并且可以通过遵循上述方法来检查其蛋白质相互作用组。通过理解驱动蛋白-1相互作用组中对于不同细胞位置中的相同载荷或对于相同细胞位置中的不同载荷的变化，将可能理解某些驱动蛋白-1适配子蛋白质诸如JIP1、Miro、Milton、FMRP等的特定生物功能[59]。类似技术可以用于驱动蛋白超家族的其它成员或其它分子马达(诸如肌球蛋白和动力蛋白)。
在拉伸的肽链的各赖氨酸残基上标记DNA-PAINT柄。可以用NHS酯化学实现赖氨酸特异性修饰。在一些情况下，特别是当潜在的拥挤性是问题时，NHS基团和DNA-PAINT柄之间可以包括长接头。新近数据显示，长度为约10nm的接头不会牺牲定位精确度(数据未显示)。
可以如下进行由赖氨酸残基的可变定位编码的可能文库大小的估计。假设典型的蛋白质编码肽链具有300个残基。本文所述的成像能力允许向下定位至2nm精确度(数据未显示)，其等于～10个肽键。将整个肽链分为10个肽键部分(300/10)导致产生约30个部分。如果赖氨酸存在，则各部分被指定为1，或者如果不存在赖氨酸，则各部分被指定为0。这样的0或1指定，得到230(或109)种不同的可能性。然而，在实践中，蛋白质编码序列中的赖氨酸分布为约7％，这意味着蛋白质内将平均存在21个赖氨酸残基，这得到(30,21)＝1.4x 107种可能性。人基因组中的基因的目前估计数目低于100,000，这完全低于此处允许的文库大小。
在两种蛋白质具有相似或相同的赖氨酸信号的事件中，可以用不同的残基特异性的化学物，诸如例如半胱氨酸或精氨酸，经由交换-PAINT进行额外的筛选[32]。为了成像多轮不同的氨基酸信号，在DNA-PAINT寡核苷酸之前放置光可裂解的接头，使得成像之后，可以通过UV光照射去除标记寡核苷酸。鉴于在肽链上允许的紧密空间，这允许化学修饰第二个氨基酸。
不完全拉伸的肽序列可以潜在提供错误信号(诸如在链的中间的丢失区段)，并且可以导致不正确的蛋白质身份分配。为了解决该问题，可以将氨基酸信号首先局部匹配，然后全局组装。该方法既是计算更有效的(与整个序列匹配相比)，其又提供错误拉伸序列的更多误差耐受性。
可以在整合的微流体装置中实现整个操作-PAINT和蛋白质条形码平台。本发明考虑整合流平台，其为蛋白质条形码分析提供足够的支持。
实现纳米级光遗传学的操作-PAINT
光遗传学工具已经证明在神经科学中具有很大效用。这些分析技术通过递送外源离子通道、随后照射和离子转运而引起细胞中的电压变化[60]。作为结果，它们不能用于分析内源离子通道对神经计算的影响。同时，越来越理解，内源离子通道的确切身份和分布对于神经计算是重要的。例如，树突钾通道可以精确雕刻神经活动传播入神经元的不同隔室，并且在癫痫中，该兴奋性控制可以被破坏，引起过度兴奋[61]。在神经元的某些子集中，如在轴突小丘，相对少量钠通道的作用可以控制神经元是否生成和传播操作电位[62]。因此，控制离子通道的小集合的能力在神经元如何整合来自上游神经元的神经输入以生成尖峰、然后将其传输至下游神经元的研究中可具有很大效用。甚至单独离子通道或单独离子通道的集合的驱动或阻断可具有很大效用。事实上，理论研究已经表明，由于单离子通道的闪烁影响导致的离散通道噪音，可对于内嗅皮层的某些星状神经元中的慢阈值附近振荡(slowperi-threshold oscillations)是关键的[63]。不考虑单独离子通道的随机门控的模型比考虑的模型表现出更贫乏的神经动力学[64]。另一个理论研究已经暗示，如果离子通道在特定大小的簇中操作，或者如果离子通道被认为概率性闪烁打开或关闭的离散实体(与仅被认为具有聚集动力学的协调群体相反)，则离子通道噪音可以优化神经元将输入编码成尖峰的能力[65]。没有先前的技术允许以时间精度阻断或驱动单独离子通道，因此离子通道门控的随机性质可能如何有助于神经动力学的模型仍然未被探索。实验性研究已经局限于通道的小子集，诸如钙通道，其中纳米域的成像已经变得可能，表明在离子通道功率附近，大浓度的钙可以瞬时发生[66]，并且通道成簇可以增强该过程[67]。事实上，钙通道可以在突触连接竞争稀少“槽(slots)”，这意味着特定钙通道的身份可以在个体水平是重要的[68]。然而，除了钙通道的该特定情况以外，没有研究单独通道或小簇的通用方式已经变得显而易见。
本公开考虑使用操作-PAINT以首次实现纳米级光遗传学(即，以纳米精度在用户指定的位置精确控制单独离子通道的活性的能力)。纳米光遗传学将允许以好得多的精度扰动和分析神经元功能，并且将有助于广泛地实现神经元功能的真正的分子、而不是细胞、的理解。
细胞膜和内部膜中的离子通道和受体经常以100nm的平均直径分布于离散簇中[69]。这些簇随机分布于整个细胞膜，并且已知这些簇各自含有几个至几百个单独离子通道[67]。因此，为了描绘单离子通道的贡献，需要能够以纳米精度以时间精确和可逆的方式活化或失活单独离子通道的技术。
近来，开发了新颖的蛋白质结构(lumitoxin)，其能够通过完全遗传编码和通过光活化而调节内源离子通道[37]。Lumitoxin是包含两个功能元件肽神经毒素和光受体LOV2-J的融合蛋白质，并且其充当目标蛋白质配体和膜之间的系链。在PC12细胞和Kv通道上使用lumitoxin和蓝色(455nm)光，显示大多数离子通道在黑暗状态下被失活，并且在暴露于蓝光几秒内被活化。全细胞膜片钳记录用于确定离子通道的活性。与蓝光组合的Lumitoxin能够控制离散离子通道簇，但不能调节单离子通道，因为蓝色激光源不能破坏衍射屏障(～200nm)。
在本公开中，lumitoxin用于控制首先体外、然后活哺乳动物细胞中的单独离子通道的活性。先前的工作已经显示成功纯化和重构脂质体中的活性离子通道(TREK-1和TRPV3)且使用膜片钳记录测量活性47。将在合成脂质体系统中进行纳米级单离子通道操作的实验(图11A)。具体地，首先如先前所述连同蛋白质标签(诸如SNAP)纯化这些离子通道，并且将DNA锚寡核苷酸(经由O6-苄基鸟嘌呤)附接至单独离子通道。作为下一步骤，在脂质小滴中重构纯化蛋白质与DNA寡核苷酸，并且DNA-PAINT超分辨率成像用于理解每个蛋白质-脂质体的离子通道的确切位置和拷贝数[32]。然后，使用操作-PAINT，将偶联至lumitoxin的DNA寡核苷酸置于单独目标离子通道上。选择性沉默单独离子通道或测量单独离子通道的活性(使用技术诸如单分子膜片钳FRET显微术[71])之前和之后的膜片钳测量用于分析单独离子通道的活性。
也可以分析活细胞中的簇内的单一离子通道的贡献。在一个实验中，可以使用操作-PAINT活化用户指定的通道以便向其递送lumitoxin载荷(图11B)。首先，使用基于DNA-PAINT的超分辨率成像(分辨率～5nm)确定簇内的单一离子通道的精确位置。然后，使用现有的膜片钳记录或单分子膜片钳FRET显微术，记录整个离子通道簇的活性[71-73]。在此之后，鉴定目标单离子通道，并且使用操作-PAINT将偶联至lumitoxin的DNA寡核苷酸置于该离子通道附近以失活该通道。下一步骤涉及记录离子通道簇的活性(同时用蓝光失活靶向的离子通道)且将这样的活性与先前的记录进行比较。
一种补充方法是驱动单一用户指定的离子通道(图11C)。首先，使用其中表达具有蛋白质标签的目标离子通道的细胞，将DNA对接链附接至这样的离子通道(与图11B中类似)。然后，将DNA-lumitoxin附接至所述柄，使得每一离子通道具有蛋白质标签对。偶联至DNA-lumitoxin之后，使得所述通道失活，除非用蓝光活化。现在，通过采用如图11C中所述的方案，可以从单一离子通道选择性去除lumitoxin，并且测量所述簇的活性以测定单一离子通道的贡献。具体地，在步骤1中，操作-PAINT用于将(3*—4*)链缀合至连接至选择的待活化的离子通道的链。在步骤2中，引入活化剂发夹；这将通过由“立足点”区段4起始的立足点介导的链置换反应仅特异性置换来自用步骤1中的链修饰的离子通道的DNA-lumitoxin。以该方式，将仅失活该具体离子通道。
本文所述的纳米级光遗传学工具可用于例如研究离子通道的纳米级空间调节对于精确信号整合和传播的作用，以及离散离子通道噪音的微妙作用。
参考文献
[1]Rust,M.J.,Bates,M.,Zhuang,X.Stochastic optical reconstructionmicroscopy(STORM)provides sub–diffraction–limit image resolution.NatureMethods 3(10),pp.793–795(2006).
[2]Sharonov,A.,Hochstrasser,R.M.Wide–field subdiffraction imaging byaccumulated binding of diffusing probes.PNAS 103(50),pp.18911–18916(2006).
[3]Jungmann,R.,Steinhauer,C.,Scheible,M.,Kuzyk,A.,Tinnefeld,P.,Simmel,F.C.Single–molecule kinetics and super–resolution microscopy byfluorescence imaging of transient binding on DNA origami.Nano Letters 10,pp4756–4761(2010).
[4]Yoshimura,Y.,Fujimoto,K.Ultrafast reversible photo-cross-linkingreaction:toward in situ DNA manipulation.Organic Letters 10,pp.3227–3230(2008).
[5]Fujimoto,K.,Konishi–Hiratsuka,K.,Sakamoto,T.,Yoshimura,Y.Site–specific photochemical RNA editing.Chemical Communications 46,pp.7545–7547(2010).
[6]Shigeno,A.,Sakamoto,T.,Yoshimura,Y.,Fujimoto K.Quick regulation ofmRNA functions by a few seconds of photoirradiation.Organic&BiomolecularChemistry 10,pp.7820–7825(2012).
[7]Fujimo,K.,Konishi–Hiratsuka,K.,Sakamoto,T.Quick,Selective andreversible photocrosslinking Reaction between 5–methylcytosine and 3–cyanovinylcarbazole in DNA double strand.International Journal of MolecularSciences 14(3),pp.5765–5774(2013).
[8]Levskaya,A.,Weiner,O.D.,Lim,W.A.,Voigt,C.A.Spatiotemporal controlof cell signalling using a light–switchable protein interaction.Nature 461,pp.997–1001(2009).
[10]Texas Instruments(TI)(Posted:Aug.2012,Rev.Sept.2012).“DLP9500:0.95 1080p 2x LVDS Type A DMD.”Retrieved(April20th,2013)from:<http://www.ti.com/lit/ds/dlps025a/dlps025a.pdf>.
[11]Hinrichsen,E.L.,Feder,J.,T.Geometry of random sequentialadsorption.Journal of Statistical Physics 44(5|6),pp.793–827(1986).
[12]Cadilhe,A.,Araujo,N.A.M.,Privman,V.Random sequential adsorption:from continuum to lattice and pre–patterned substrates.Journal of Physics:Condensed Matter 19,065124(2007).
[13]Torquato,S.,Uche,O.U.,Stillinger,F.H.Random sequential additionof hard spheres in high Euclidean dimensions.<arXiv:cond–mat/0608402>
[14]Andor Technology(Andor).“iXon EMCCD Camera Series.”Retrieved(November 23rd,2013)from:<http://www.andor.com/scientific-cameras/ixon-emccd-camera-series>.
[15]Hamamatsu Corporation.“Digital CMOS camera-ORCA-Flash4.0 V2C11440-22CU.”Retrieved(November 23rd,2013)from:<http://www.hamamatsu.com/jp/en/community/life_science_camera/pro duct/search/C11440-22CU/index.html>.
[16]Pertsinidis,A.,Zhang,Y.,Chu,S.,Subnanometre single-moleculelocalization,registration and distance measurements.Nature 466,pp.647-651(2010).
[17]Piestun,R.,Schechner,Y.Y.,Shamir,J.Propagation-invariant wavefields with finite energy.Journal of the Optical Society of America A17,pp.294-303(2000).
[18]Betzig,E.,Patterson,G.H.,Sougrat,R.,Lindwasser,O.W.,Olenych,S.,Bonifacino,J.S.,Davidson,M.W.,Lippincott-Schwartz,J.,Hess,H.F.Imagingintracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.Science 313,pp.1642–1645(2006).
[19]Pavani,S.R.P.,Thompson,M.A.,Biteen,J.S.,Lord,S.J.,Liu,N.,Twieg,R.K.,Piestun,R.,Moerner,W.E.Three-dimensional single-molecule fluorescenceimaging beyond the diffraction limit using a double-helix point spreadfunction.PNAS 106,pp.2995-2999(2009).
[20]Lee,H.D.,Sahl,S.J.,Lew,M.D.,Moerner,W.E.The double-helixmicroscope super-resolves extended biological structures by localizing singleblinking molecules in three dimensions with Nanoscale precision.AppliedPhysics Letters 100(15),153701(2012).
[21]Backlund,M.P.,Lew,M.D.,Backer,A.S.,Sahl,S.J.,Grover,G.,Agrawal,A.,Piestun,R.,Moerner,W.E.Simultaneous,accurate measurement of the 3Dposition and orientation of single molecules.PNAS 109,pp.19087-19092(2012).
[22]Huang,B.,Wang,W.,Bates,M.,Zhuang,X.Three-dimensional super-resolution by stochastic optical reconstruction microscopy.Science 319(5864),pp.810-813(2008).
[23]Ram,S.,Chao,J.,Prabhat,P.,Ward,E.S.,Ober,R.J.A novel approach todetermining the three-dimensional location of microscopic objects withapplications to 3D particle tracking.Proc.SPIE 6443(2007).
[24]Juette,M.F.,Gould,T.J.,Lessard,M.D.,Mlodzianoski,M.J.,Nagpure,B.S.,Bennett,B.T.,Hess,S.T.,Bewersdorf,J.Three-dimensional sub-100 nmresolution fluorescence microscopy of thick samples.Nature Methods 5(6),pp.527-529(2008).
[25]Pavani,S.R.P.,Piestun,R.Three dimensional tracking of fluorescentmicroparticles using a photon-limited double-helix response system.OpticsExpress 16(26),pp.22048-22057(2008).
[26]Middendorff,C.V.,Egner.,A.,Geisler,C.,Hell,S.W.,Schonle,A.Isotropic 3D nanoscopy based on single emitter switching.Optics Express16(25),pp.20774-20788(2008).
[27]Badieirostami,M.,Lew,M.D.,Thompson,M.A.,Moerner,W.E.Three-dimensional localization precision of the double-helix point spread functionversus astigmatism and biplane.Applied Physics Letters97,161103(2010).
[28]Szilard,L.On the decrease of entropy in a thermodynamic system bythe intervention of intelligent beings.Zeitschrift fur Physik 53,pp.840–856(1929).
[29]Toyabe,S.,Sagawa,T.,Ueda,M.,Muneyuki,E.,Sano,M.Experimentaldemonstration of information–to–energy conversion and validation of thegeneralized Jarzynski equality.Nature Physics 6,pp.988–992(2010).
[30]Vaughan,J.C.,Jia,S.,Zhuang X.Ultrabright photoactivatablefluorophores created by reductive caging.Nature Methods 9,pp.1181-1184(2012).
[31]Olejnik,J.,Sonar,S.,-Olejnik,E.,Rothschild,K.J.Photocleavable biotin derivatives:a versatile approach for the isolationof biomolecules.PNAS 92(16),pp.7590-7594(1995).
[32]Jungmann,R.；Avendano,M.S.；Woehrstein,J.B.；Dai,M.；Shih,W.M.；Yin,P.Nat.Methods 2014,11,313–318.
[33]Manfrinato,V.R.；Wen,J.；Zhang,L.；Yang,Y.；Hobbs,R.G.；Baker,B.；Su,D.；Zakharov,D.；Zaluzec,N.J.；Miller,D.J.；Stach,E.A.；Berggren,K.K.NanoLett.2014,14,4406–4412.
[34]Martell,J.D.；Deerinck,T.J.；Sancak,Y.；Poulos,T.L.；Mootha,V.K.；Sosinsky,G.E.；Ellisman,M.H.；Ting,A.Y.Nat.Biotechnol.2012,30,1143–1148.
[35]Rhee,H.W.；Zou,P.；Udeshi,N.D.；Martell,J.D.；Mootha,V.K.；Carr,S.A.；Ting,A.Y.Science 2013,339,1328–1331.
[36]Hung,V.；Zou,P.；Rhee,H.W.；Udeshi,N.D.；Cracan,V.；Svinkina,T.；Carr,S.A.；Mootha,V.K.；Ting,A.Y.Mol.Cell 2014,55,332–341.
[37]Schmidt,D.；Tillberg,P.W.；Chen,F.；Boyden,E.S.Nat Commun2014,5,3019.
[38]Grotjohann T,Testa I,Leutenegger M,Bock H,Urban NT,Lavoie-Cardinal F,Willig KI,Eggeling C,Jakobs S,Hell SW.Nature.2011 Sep11；478(7368):204-8.
[39]Iinuma,R.；Ke,Y.；Jungmann,R.；Schlichthaerle,T.；Woehrstein,J.B.；Yin,P.Science 2014,344,65–69.
[40]Hell,S.W.Science 2007,316,1153-1158.
[41]Hell,S.W.Nat.Methods 2009,6,24–32.
[42]Huang,B.；Babcock,H.；Zhuang,X.Cell 2010,143,1047–1058.
[43]Hell,S.W.；Wichmann,J.Opt Lett 1994,19,780–782.
[44]Tokunaga,M.；Imamoto,N.；Sakata-Sogawa,K.Nat.Methods 2008,5,159–161.
[45]Vieregg,J.R.；Nelson,H.M.；Stoltz,B.M.；Pierce,N.A.J.Am.Chem.Soc.2013,135,9691–9699.
[46]Smith CS,Joseph N,Rieger B,Lidke KA.Nature Methods 2010,7,373-375.
[47]Ellis-Davies,G.C.Nat.Methods 2007,4,619–628.
[48]Agasti,S.S.；Kohler,R.H.；Liong,M.；Peterson,V.M.；Lee,H.；Weissleder,R.Small 2013,9,222–227.
[49]Lusic,H.；Uprety,R.；Deiters,A.Org.Lett.2010,12,916–919.
[50]Uno,S.N.；Kamiya,M.；Yoshihara,T.；Sugawara,K.；Okabe,K.；Tarhan,M.C.；Fujita,H.；Funatsu,T.；Okada,Y.；Tobita,S.；Urano,Y.Nat Chem 2014,6,681–689.
[51]Kao,H.P.；Verkman,A.S.Biophys.J.1994,67,1291–1300.
[52]Bullock,S.L.Biochem.Soc.Trans.2011,39,1161–1165.
[53]van den Berg,R.；Hoogenraad,C.C.Adv.Exp.Med.Biol.2012,970,173–196.
[54]Holt,C.E.；Bullock,S.L.Science 2009,326,1212–1216.
[55]Belyy,V.；Yildiz,A.FEBS Lett.2014,588,3520–3525.
[56]Ishii,Y.；Ishijima,A.；Yanagida,T.Trends Biotechnol.2001,19,211–216.
[57]De La Cruz,E.M.；Holzbaur,E.L.J.Cell.Sci.2014,127,2997–2998.
[58]Vale,R.D.Cell 2003,112,467–480.
[59]Hirokawa,N.；Noda,Y.；Tanaka,Y.；Niwa,S.Nat.Rev.Mol.Cell Biol.2009,10,682–696.
[60]Bernstein,J.G.；Boyden,E.S.Trends Cogn.Sci.(Regul.Ed.)2011,15,592–600.
[61]Bernard,C.；Anderson,A.；Becker,A.；Poolos,N.P.；Beck,H.；Johnston,D.Science 2004,305,532–535.
[62]Kole,M.H.；Ilschner,S.U.；Kampa,B.M.；Williams,S.R.；Ruben,P.C.；Stuart,G.J.Nat.Neurosci.2008,11,178–186.
[63]Dorval,A.D.；White,J.A.J.Neurosci.2005,25,10025–10028.
[64]White,J.A.；Klink,R.；Alonso,A.；Kay,A.R.J.Neurophysiol.1998,80,262–269.
[65]Schneidman,E.；Freedman,B.；Segev,I.Neural Comput 1998,10,1679–1703.
[66]Tadross,M.R.；Tsien,R.W.；Yue,D.T.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2013,110,15794–15799.
[67]Shuai,J.W.；Jung,P.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2003,100,506–510.
[68]Cao,Y.Q.；Piedras-Renteria,E.S.；Smith,G.B.；Chen,G.；Harata,N.C.；Tsien,R.W.Neuron 2004,43,387–400.
[69]Ianoul,A.；Street,M.；Grant,D.；Pezacki,J.；Taylor,R.S.；Johnston,L.J.Biophys.J.2004,87,3525–3535.
[70]Brohawn,S.G.；Su,Z.；MacKinnon,R.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2014,111,3614–3619.
[71]Sasmal,D.K.；Lu,H.P.J.Am.Chem.Soc.2014,136,12998–13005.
[72]Borisenko,V.；Lougheed,T.；Hesse,J.；Fureder-Kitzmuller,E.；Fertig,N.；Behrends,J.C.；Woolley,G.A.；Schutz,G.J.Biophys.J.2003,84,612–622.
[73]Gonzalez,J.E.；Oades,K.；Leychkis,Y.；Harootunian,A.；Negulescu,P.A.Drug Discov.Today 1999,4,431–439.
Claims (26)
1.一种方法，其包括
使多个瞬时结合的核酸探针与其各自靶标接触，其中所述靶标被固定在基板上，和
检测探针与所述基板的衍射受限区域内的所述基板的选择区域中且仅在其中的靶标的结合，
然后照射所述基板的衍射受限区域以便将所述探针固定至所述基板的选择区域，
其中所述探针包含光交联剂和荧光团。
2.权利要求1的方法，其中所述荧光团发射至少104-106个光子，任选地其中所述荧光团是ATTO655。
3.权利要求1或2的方法，其中所述探针进一步包含官能团或部分。
4.权利要求4的方法，其中所述官能团或部分是化学柄。
5.权利要求4的方法，其中所述官能团或部分是生物素、抗生物素蛋白或纳米颗粒。
6.权利要求4的方法，其中所述官能团或部分是炔烃或叠氮化物。
7.前述权利要求中任一项的方法，其中所述基板的选择区域用366nm至405nm光照射少于1秒或少于0.5秒。
8.前述权利要求中任一项的方法，其中所述基板的选择区域是所述基板的选择面积或选择体积。
9.前述权利要求中任一项的方法，其中所述光交联剂是3-氰基乙烯基咔唑。
10.前述权利要求中任一项的方法，其中所述方法是自动化的。
11.前述权利要求中任一项的方法，其中使用CCD或EMCCD相机检测所述探针与所述靶标的结合。
12.前述权利要求中任一项的方法，其中使用激光点照射器或DMD阵列照射所述衍射受限区域。
13.前述权利要求中任一项的方法，其中所述瞬时结合的核酸探针长度为8或9个核苷酸。
14.前述权利要求中任一项的方法，其中所述靶标是或缀合至具有长度为约8或9个核苷酸的长度的核酸。
15.一种方法，其包括
使多个瞬时结合的核酸探针与其各自靶标接触，其中所述靶标被固定在基板上，和
检测探针与所述基板的衍射受限区域内的所述基板的选择区域中且仅在其中的靶标的结合，
然后照射所述基板的衍射受限区域，
其中所述探针是包含光可裂解的接头和荧光团的发夹探针。
16.权利要求15的方法，其中所述荧光团发射至少104-106个光子，任选地其中所述荧光团是ATTO655。
17.权利要求15或16的方法，其中所述探针进一步包含官能团或部分。
18.权利要求17的方法，其中所述官能团或部分是化学柄。
19.权利要求17的方法，其中所述官能团或部分是生物素、抗生物素蛋白或纳米颗粒。
20.权利要求17的方法，其中所述官能团或部分是炔烃。
21.权利要求15-20中任一项的方法，其中所述基板的选择区域用具有等于或小于405nm的波长的光照射少于1秒或少于0.5秒。
22.权利要求15-20中任一项的方法，其中所述基板的选择区域是所述基板的选择面积或选择体积。
23.权利要求15-22中任一项的方法，其中所述光可裂解的接头包含1-(2-硝基苯基)乙基。
24.权利要求15-23中任一项的方法，其中所述方法是自动化的。
25.权利要求15-24中任一项的方法，其中使用CCD相机检测所述探针与所述靶标的结合。
26.权利要求15-25中任一项的方法，其中使用激光点照射器或DMD阵列照射所述衍射受限区域。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201361916259P | 2013-12-15 | 2013-12-15 | |
| US61/916,259 | 2013-12-15 | ||
| PCT/US2014/070394 WO2015089506A2 (en) | 2013-12-15 | 2014-12-15 | Methods and compositions relating to optical super-resolution patterning |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN106062211A true CN106062211A (zh) | 2016-10-26 |
Family
ID=53371978
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201480075402.6A Pending CN106062211A (zh) | 2013-12-15 | 2014-12-15 | 与光学超分辨率图案化相关的方法和组合物 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US10041108B2 (zh) |
| EP (1) | EP3080301A4 (zh) |
| CN (1) | CN106062211A (zh) |
| CA (1) | CA2938082A1 (zh) |
| WO (1) | WO2015089506A2 (zh) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2018196691A1 (zh) * | 2017-04-24 | 2018-11-01 | 倪燕翔 | 核酸的精确识别方法 |
| CN109071641A (zh) * | 2016-04-26 | 2018-12-21 | 乌尔蒂维尤股份有限公司 | 具有衍射极限预览的超分辨率免疫荧光 |
| CN111247211A (zh) * | 2017-09-15 | 2020-06-05 | 苏黎世联邦理工学院 | 有机硅3d打印墨 |
| CN112508779A (zh) * | 2019-09-16 | 2021-03-16 | 四川大学 | 一种基于门控多反馈网络的图像超分辨率重构方法 |
Families Citing this family (23)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9284602B2 (en) | 2010-10-27 | 2016-03-15 | President And Fellows Of Harvard College | Compositions of toehold primer duplexes and methods of use |
| WO2012058638A2 (en) | 2010-10-29 | 2012-05-03 | President And Fellows Of Harvard College | Nucleic acid nanostructure barcode probes |
| EP3027773B1 (en) | 2013-07-30 | 2020-03-25 | President and Fellows of Harvard College | Quantitative dna-based imaging and super-resolution imaging |
| WO2015088990A1 (en) | 2013-12-09 | 2015-06-18 | Durect Corporation | Pharmaceutically active agent complexes, polymer complexes, and compositions and methods involving the same |
| CN110004208A (zh) | 2014-03-11 | 2019-07-12 | 哈佛学院院长及董事 | 利用可编程核酸探针的高通量且高度多路复用的成像 |
| US10006917B2 (en) | 2014-12-15 | 2018-06-26 | President And Fellows Of Harvard College | Methods and compositions relating to super-resolution imaging and modification |
| US9921161B1 (en) * | 2015-01-08 | 2018-03-20 | Daniel Feldkhun | Structured light active localization microscopy |
| WO2016123419A1 (en) | 2015-01-30 | 2016-08-04 | President And Fellows Of Harvard College | Microscope-free imaging |
| HK1251906A1 (zh) * | 2015-08-07 | 2019-04-26 | 哈佛学院院长及董事 | 蛋白质-蛋白质相互作用的超分辨成像 |
| EP4678766A2 (en) * | 2015-11-18 | 2026-01-14 | Kalim U. Mir | Super-resolution sequencing |
| WO2017100251A1 (en) * | 2015-12-08 | 2017-06-15 | President And Fellows Of Harvard College | Target detection using barcode conjugates and nucleic acid nanoarrays |
| EP3916107B1 (en) * | 2016-02-17 | 2023-04-05 | President and Fellows of Harvard College | Molecular programming tools |
| EP3472351B1 (de) | 2016-06-15 | 2020-10-28 | Ludwig-Maximilians-Universität München | Einzelmolekülnachweis bzw. -quantifizierung durch dna-nanotechnologie |
| EP3516079B1 (en) | 2016-09-20 | 2022-06-22 | President and Fellows of Harvard College | Molecular product authentication systems |
| CA3043639A1 (en) | 2016-12-09 | 2018-06-14 | Ultivue, Inc. | Improved methods for multiplex imaging using labeled nucleic acid imaging agents |
| EP3568492B1 (en) | 2017-01-10 | 2025-01-01 | President and Fellows of Harvard College | Multiplexed signal amplification |
| WO2018165309A1 (en) | 2017-03-08 | 2018-09-13 | The Regents Of The University Of Michigan | Analyte detection |
| EP3743525A4 (en) | 2018-01-26 | 2021-09-29 | President and Fellows of Harvard College | PROXIMITY DETECTION METHODS AND COMPOSITIONS |
| WO2020045984A1 (ko) * | 2018-08-28 | 2020-03-05 | 주식회사 제이엘메디랩스 | 타겟 물질 검출을 위한 방법 및 키트 |
| EP3874058B1 (en) * | 2018-11-01 | 2025-12-31 | President And Fellows Of Harvard College | BARCODE CARRIED OUT WITH NUCLEIC ACID |
| WO2021108493A1 (en) * | 2019-11-27 | 2021-06-03 | Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education | Method and system for enhanced photon microscopy |
| CA3246607A1 (en) | 2022-03-24 | 2023-09-28 | Digital Biology Inc. | TISSUE SPATIAL OMICS |
| WO2024020395A2 (en) | 2022-07-19 | 2024-01-25 | Digital Biology Inc. | Barcode diffusion-based spatial omics |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8481714B2 (en) * | 2007-11-19 | 2013-07-09 | Japan Advanced Institute Of Science And Technology | Light-responsive artificial nucleotide having photo-crosslinking ability |
| US20130261019A1 (en) * | 2010-10-29 | 2013-10-03 | President And Fellows Of Harvard College | Nucleic acid nanostructure barcode probes |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7776613B2 (en) | 2006-08-07 | 2010-08-17 | President And Fellows Of Harvard College | Sub-diffraction image resolution and other imaging techniques |
| DE102009060793A1 (de) | 2009-12-22 | 2011-07-28 | Carl Zeiss Microlmaging GmbH, 07745 | Hochauflösendes Mikroskop und Verfahren zur zwei- oder dreidimensionalen Positionsbestimmung von Objekten |
| US8658780B2 (en) * | 2010-05-18 | 2014-02-25 | California Institute Of Technology | Triggered covalent probes for imaging and silencing genetic expression |
| WO2013090360A2 (en) | 2011-12-15 | 2013-06-20 | President And Fellows Of Harvard College | High resolution dual-objective microscopy |
| US8599388B1 (en) * | 2012-11-02 | 2013-12-03 | The Board Of Trustees Of The University Of Illinois | Coherent optical mapping of particles |
| US20160033411A1 (en) | 2014-07-29 | 2016-02-04 | President And Fellows Of Harvard College | Methods and compositions relating to storm-based patterning |
| US10006917B2 (en) | 2014-12-15 | 2018-06-26 | President And Fellows Of Harvard College | Methods and compositions relating to super-resolution imaging and modification |
-
2014
- 2014-12-15 US US15/104,570 patent/US10041108B2/en active Active
- 2014-12-15 CN CN201480075402.6A patent/CN106062211A/zh active Pending
- 2014-12-15 CA CA2938082A patent/CA2938082A1/en not_active Abandoned
- 2014-12-15 WO PCT/US2014/070394 patent/WO2015089506A2/en not_active Ceased
- 2014-12-15 EP EP14869597.6A patent/EP3080301A4/en not_active Withdrawn
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8481714B2 (en) * | 2007-11-19 | 2013-07-09 | Japan Advanced Institute Of Science And Technology | Light-responsive artificial nucleotide having photo-crosslinking ability |
| US20130261019A1 (en) * | 2010-10-29 | 2013-10-03 | President And Fellows Of Harvard College | Nucleic acid nanostructure barcode probes |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| JANEK SZYCHOWSKI,ET AL: "Cleavable Biotin Probes for Labeling of Biomolecules via Azide-Alkyne Cycloaddition", 《J. AM. CHEM. SOC.》 * |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109071641A (zh) * | 2016-04-26 | 2018-12-21 | 乌尔蒂维尤股份有限公司 | 具有衍射极限预览的超分辨率免疫荧光 |
| WO2018196691A1 (zh) * | 2017-04-24 | 2018-11-01 | 倪燕翔 | 核酸的精确识别方法 |
| CN111247211A (zh) * | 2017-09-15 | 2020-06-05 | 苏黎世联邦理工学院 | 有机硅3d打印墨 |
| CN111247211B (zh) * | 2017-09-15 | 2022-03-08 | 苏黎世联邦理工学院 | 有机硅3d打印墨 |
| US11787958B2 (en) | 2017-09-15 | 2023-10-17 | Eth Zurich | Silicone 3D printing ink |
| CN112508779A (zh) * | 2019-09-16 | 2021-03-16 | 四川大学 | 一种基于门控多反馈网络的图像超分辨率重构方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA2938082A1 (en) | 2015-06-18 |
| US10041108B2 (en) | 2018-08-07 |
| EP3080301A2 (en) | 2016-10-19 |
| US20160312272A1 (en) | 2016-10-27 |
| WO2015089506A2 (en) | 2015-06-18 |
| EP3080301A4 (en) | 2017-06-07 |
| WO2015089506A3 (en) | 2015-11-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US10041108B2 (en) | Methods and compositions relating to optical super-resolution patterning | |
| US10006917B2 (en) | Methods and compositions relating to super-resolution imaging and modification | |
| Liu et al. | Single-virus tracking: from imaging methodologies to virological applications | |
| EP3027773B1 (en) | Quantitative dna-based imaging and super-resolution imaging | |
| Lord et al. | Single-molecule spectroscopy and imaging of biomolecules in living cells | |
| Sauer et al. | Single-molecule localization microscopy in eukaryotes | |
| Iwaki et al. | A programmable DNA origami nanospring that reveals force-induced adjacent binding of myosin VI heads | |
| Wang et al. | Lifetime and spectrally resolved characterization of the photodynamics of single fluorophores in solution using the anti-Brownian electrokinetic trap | |
| Han et al. | Time-resolved, confocal single-molecule tracking of individual organic dyes and fluorescent proteins in three dimensions | |
| US20120135410A1 (en) | Method for imaging on thin solid-state interface between two fluids | |
| You et al. | Dynamic submicroscopic signaling zones revealed by pair correlation tracking and localization microscopy | |
| Lidke et al. | Caught in the act: quantifying protein behaviour in living cells | |
| Liu et al. | Single-molecule tracking and its application in biomolecular binding detection | |
| Presley | Imaging the secretory pathway: the past and future impact of live cell optical techniques | |
| Carpenter et al. | Label-Free Anti-Brownian Trapping of Single Nanoparticles in Solution | |
| US20250198928A1 (en) | Method and apparatus for optical imaging with a high number of imaging samples | |
| WO2023187189A1 (en) | Method and apparatus for optical imaging with a high number of imaging samples | |
| DeVore et al. | Three dimensional time-gated tracking of non-blinking quantum dots in live cells | |
| Hwang et al. | Single-molecule FRET: methods and biological applications | |
| Levi et al. | Three-dimensional particle tracking in a laser scanning fluorescence microscope | |
| Lutz | New optical super-resolution imaging approaches involving DNA nanotechnology | |
| Zähringer | Pulsed-interleaved MINFLUX super-resolution microscopy | |
| Sakuragi et al. | Oligo DNA-based quantum dot (QD) single-particle tracking for multicolor single-molecule imaging | |
| US20040101824A1 (en) | Method for identifying substances which are suitable to be used as medicaments for the treating virus infections or for testing the effectiveness of such substances | |
| Gómez García | Development and application of localization-based microscopy methods to study the structure and dynamics of chromatin through the process of cellular differentiation |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20161026 |
|
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |