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CN106030310B - 可溶性高分子量(hmw)tau种类及其应用 - Google Patents

可溶性高分子量(hmw)tau种类及其应用 Download PDF

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Abstract

本公开提供了tau种类的新型形式及其应用以及诊断和/或治疗tau相关神经退行性变的方法。本发明人已示出，tau‑空白神经元在神经元中缺少Aβ诱导的线粒体内在caspase级联的活化，并随后免受Aβ诱导的树突棘损失和神经退行性变。因此，本文所述多个方面的实施方式涉及包含负责神经元间传播的可溶性HMW tau种类的组合物及其应用。本文还提供了治疗和诊断受试者中的tau相关神经退行性变的方法。

Description

可溶性高分子量(HMW)TAU种类及其应用
相关申请的交叉引用
根据35U.S.C.§119(e)，本申请要求2013年12月13日提交的美国临时申请号61/915,762、2014年7月30日提交的美国临时申请号62/030,984以及2014年9月3日提交的美国临时申请号62/045,313的优先权，以引用的方式将它们各自的内容整体并入本文。
政府支持
本发明是在由美国国立卫生研究院(NIH)授予的合同号AG026249的政府支持下作出的。美国政府对本发明拥有一定的权利。
技术领域
本文所述的技术一般而言涉及tau种类(tau species)的新型形式及其应用，以及治疗和/或诊断受试者中的tau相关神经退行性变的方法。
背景技术
微管相关蛋白tau的积累和聚集(Mandelkow等，(1995)Neurobiology of aging，16(3)：355-362；discussion 362-353)，作为被称作神经原纤维缠结(NFT)的细胞内包涵体，是包括阿尔茨海默氏病(AD)在内的神经退行性疾病的病理性标志(Iqbal等，(2010)Current Alzheimer research，7(8)：656-664)。AD中的认知缺陷与处于分级模式的NFT的进展最紧密相关，其起始于内嗅皮质(EC)，并在疾病进展期间蔓延整个脑(Hyman等，(1984)Science，225(4667)：1168-1170)。一种理论设想了tau的“朊病毒样”散播(spreading)：错误折叠的tau在神经元间行进，并为受体神经元中的初始内源性tau提供了聚集模板，使其具有神经毒性。尽管这一特征性tau病理散播的确切机制尚不清楚，但先前已讨论了，tau病理散播可通过tau蛋白在神经元间的跨突触传递发生(Pooler等，(2013)Alzheimer'sresearch&therapy，5(5):49；Walker等，(2013)JAMA neurology，70(3)：304-310)。然而，参与神经元间传播(propagation)的tau种类仍不清楚。
更好地理解tau传播的分子基础可防止从早期轻度记忆损伤进展为完全认知退化和痴呆。因此，存在对负责神经元间传播的特定tau种类进行识别的需要，可将其用作治疗性干预和生物标志物开发的更有效靶点。
发明内容
本文所述的多个方面至少部分地源于：以低水平存在于患有阿尔茨海默氏病(AD)或额颞叶痴呆(FTD)的受试者的脑中的可溶性高分子量(HMW)tau种类(包括磷酸化形式)的发现，以及该可溶性HMW tau种类被神经元摄取以及在神经元间传播的能力。具体而言，为了识别负责传播的可溶性HMW tau种类，发明人已经开发了新型的三腔室微流体装置，以形成双层神经元并检查神经元的tau摄取、轴突运输和突触传递。通过对源自于例如清醒的行为正常的tau转基因小鼠的间质液以及来自小鼠和人AD死后(postmortem)皮质的皮质提取物的不同tau种类的摄取和传播性质进行表征，发明人在一个方面已发现，尽管丰度非常低，但PBS可溶性磷酸化高分子量(HMW)tau种类以时间和浓度依赖的方式被摄取、经轴突运输并传递至突触连接的神经元。相反，尽管丰度高得多，低分子量(LMW)tau种类(例如，单体/二聚体尺寸的tau)不能有效地被神经元摄取。因此，在一个方面，参与神经元间传播的可溶性HMW磷酸化tau的稀有种类的发现为治疗性干预和生物标志物开发提供了更有效的靶点。
此外，发明人已发现神经元间的tau传播不需要内源性细胞内tau(用于模板错误折叠)，而tau-空白(tau-null)小鼠具有少得多的病理性错误折叠和胶质细胞增生，因此，在一个实施方式中，内源性tau或宿主tau的完全去除产生神经保护作用。例如，发明人已示出tau-空白神经元在神经元中缺少Aβ诱导的线粒体内在caspase级联的活化，并随后免受Aβ诱导的树突棘损失和神经退行性变。因此，本文所述多个方面的实施方式涉及包含负责神经元间传播的可溶性HMW tau种类的组合物及其应用。本文还提供了治疗和诊断受试者中的tau相关神经退行性变的方法。
在一个方面，本文提供了包含可溶性高分子量(HMW)tau种类的组合物。该组合物中的可溶性HMW tau种类是非纤维状的(non-fibrillar)，具有至少约500kDa的分子量，并且该组合物基本上不含可溶性低分子量(LMW)tau种类。
在一些实施方式中，可溶性HMW tau种类可具有至少约669kDa的分子量。在一些实施方式中，可溶性HMW tau种类可具有约669kDa至约1000kDa的分子量。
在一些实施方式中，非纤维状可溶性HMW tau种类可处于颗粒的形式。粒径(particle size)可随tau种类的分子量而变化。在一些实施方式中，粒径范围可为约10nm至约30nm。
发明人已发现，当与未患有AD的对照脑相比较时，AD脑提取物含有显著更高水平的磷酸化可溶性HMW tau种类。因此，在一些实施方式中，组合物中的可溶性HMW tau种类可为磷酸化的。在一些实施方式中，组合物中的可溶性HMW tau种类可为过磷酸化的(hyper-phosphorylated)。
可溶性HMW tau种类可溶于水性溶液和/或缓冲溶液。例如，在一些实施方式中，可溶性HMW tau种类可溶于磷酸盐缓冲盐水。在一些实施方式中，可溶性HMW tau种类可溶于生物流体(例如，脑间质液或脑脊液)。
在一些实施方式中，与可溶性LMW tau种类的神经元摄取和神经元至神经元的运输相比，可溶性HMW tau种类可优先被神经元摄取并从神经元经轴突运输至突触连接的神经元。与可溶性HMW tau种类的分子量相比，可溶性LMW tau种类具有较低的分子量。在一些实施方式中，可溶性LMW tau种类可具有不超过200kDa的分子量。
在一些实施方式中，本文所述的组合物可包含试剂，以适应所选定的应用的需要。例如，在HMW tau被用作抗原来产生抗体的情况中，纯化的可溶性HMW tau可与盐水或磷酸盐缓冲盐水组合。可替代地或另外地，可将HMW tau抗原与佐剂或载体混合或缀合，以增强其抗原性。
因此，本文所述的另一方面提供了分离的抗体或其抗原结合部分，所述抗体或其抗原结合部分特异性地结合可溶性高分子量(HMW)tau种类，且不结合可溶性低分子量(LMW)tau种类。HMW tau种类是非纤维状的，具有至少约500kDa的分子量；LMW tau种类具有不超过200kDa的分子量。在一些实施方式中，可溶性HMW tau种类可具有至少约669kDa或更高的分子量。在一些实施方式中，可溶性HMW tau种类可具有约669kDa至约1000kDa的分子量。
在一些实施方式中，非纤维状可溶性HMW tau种类可处于颗粒的形式。粒径可随tau种类的分子量而变化。在一些实施方式中，粒径范围可为约10nm至约30nm。
在一些实施方式中，分离的抗体或其抗原结合部分可特异性地结合可溶性HMWtau种类的磷酸化形式。
在一些实施方式中，分离的抗体或其抗原结合部分可特异性地结合可溶于水性溶液和/或缓冲溶液的可溶性HMW tau种类。例如，在一些实施方式中，分离的抗体或其抗原结合部分可特异性地结合可溶于磷酸盐缓冲盐水的可溶性HMW tau种类。在一些实施方式中，分离的抗体或其抗原结合部分可特异性地结合可溶于生物流体(例如，脑间质液或脑脊液)的可溶性HMW tau种类。
在一些实施方式中，可对分离的抗体或其抗原结合部分进行设计，以使神经元摄取的可溶性HMW tau种类降低至少约10％或更多。
在一些实施方式中，可对分离的抗体或其抗原结合部分进行设计，以使从神经元经轴突运输至突触连接的神经元的可溶性HMW tau种类降低至少约10％或更多。
发明人已示出从神经元释放了相对较低水平的可溶性HMW tau种类并在脑间质液中发现了该种类，还示出仅占试样中全部tau的一小部分的可溶性HMW tau种类被神经元稳健地摄取并参与了神经元间传播，而可溶性LMW tau种类(例如，单体尺寸/二聚体尺寸)的摄取是非常低效的。因此，本文还提供了防止病理性tau蛋白在突触连接的神经元间传播的方法。该方法包括选择性地降低与突触连接的神经元接触的可溶性HMWtau种类的细胞外水平，其中，可溶性HMW tau种类是非纤维状的，具有至少约500kDa的分子量。可溶性HMW tau种类的水平降低使得病理性tau蛋白在突触连接的神经元间的传播降低。
在一些实施方式中，在所述选择性地降低期间，可溶性LMW tau种类的细胞外水平基本上不降低。
用于选择性地降低可溶性HMW tau种类的细胞外水平的方法可基于：物理去除、和/或可溶性HMW tau种类与适当的拮抗剂之间的分子相互作用。在一些实施方式中，可通过微透析来选择性地降低可溶性HMWtau种类。在一些实施方式中，可通过使与突触连接的神经元接触的细胞外间隙或流体与可溶性HMW tau种类的拮抗剂接触，来选择性地降低可溶性HMW tau种类。可溶性HMW tau种类的拮抗剂的实例包括但不限于抗体、核酸酶(例如但不限于锌指核酸酶(ZFN)、转录激活样效应因子核酸酶(TALEN)、CRISPR/Cas系统、转录阻抑因子、核酸抑制剂(例如，RNAi、siRNA、抗-miR、反义寡核苷酸、核酶以及它们的两种以上的组合)、小分子、适体以及它们的两种以上的组合。
已知在疾病进展期间，tau病理例如通过神经元间的跨突触tau传递在阿尔茨海默氏病(AD)脑中以分级模式散播。由于可溶性HMW tau种类在本文被识别为参与了神经元至神经元的传播，因此进行干预以使此类HMW tau种类耗竭可抑制tau传播以及由此而来的tau病变中的疾病进展。因此，本文提供了降低受试者中的tau相关神经退行性变的方法。Tau相关神经退行性变的实例包括但不限于阿尔茨海默氏病、帕金森氏病或额颞叶痴呆。该治疗方法包括选择性地降低受试者(经确定患有或有风险患tau相关神经退行性变)的脑脊液(CSF)或脑中的可溶性HMW tau种类的水平，其中，可溶性HMW tau种类是非纤维状的，具有至少约500kDa的分子量，其中，可溶性HMW tau种类的水平降低使得tau相关神经退行性变降低。
在一些实施方式中，在治疗期间，受试者中的可溶性LMW tau种类的水平基本上不降低。
在一些实施方式中，将存在于受试者脑间质液中的可溶性HMW tau种类的至少一部分去除或使其失活。在一些实施方式中，将存在于受试者脑脊液中的可溶性HMW tau种类的至少一部分去除或使其失活。
用于选择性地降低受试者脑中的可溶性HMW tau种类的细胞外水平的方法可基于：物理去除、和/或可溶性HMW tau种类与适当的拮抗剂之间的分子相互作用。在一些实施方式中，可通过脑微透析来选择性地降低存在于受试者脑间质液和/或脑脊液中的可溶性HMW tau种类。在一些实施方式中，可通过向受试者的CSF或脑给予可溶性HMW tau种类的拮抗剂，来选择性地降低存在于受试者脑间质液和/或脑脊液中的可溶性HMW tau种类。可溶性HMW tau种类的拮抗剂的实例包括但不限于抗体、核酸酶(例如但不限于锌指核酸酶(ZFN)、转录激活样效应因子核酸酶(TALEN)、CRISPR/Cas系统、转录阻抑因子、核酸抑制剂(例如，RNAi、siRNA、抗-miR、反义寡核苷酸、核酶以及它们的两种以上的组合)、小分子、适体以及它们的两种以上的组合。
在一些实施方式中，该方法可进一步包括对受试者进行选择，所述受试者经确定具有以高于参考水平的水平存在于脑或CSF中的可溶性HMW tau种类。参考水平可代表存在于健康受试者中的可溶性HMW tau种类的水平。
在另一方面，本文还提供了基于可溶性HMW tau种类的存在和/或水平来诊断tau相关神经退行性变的方法。示例性的tau相关神经退行性变包括但不限于阿尔茨海默氏病、帕金森氏病或额颞叶痴呆。发明人已示出，尽管来自AD脑和对照脑的脑提取物中的总tau水平没有显著差异，当与对照脑相比时，AD脑提取物包含显著更高水平的可溶性HMW tau种类或磷酸化可溶性HMW tau种类。因此，诊断tau相关神经退行性变的方法可包括：(a)对来自受试者的脑间质液或脑脊液的试样进行分级分离(fractionating)；(b)对试样中的可溶性HMW tau种类进行检测，从而确定可溶性HMW tau种类的存在和量，其中，可溶性HMW tau种类是非纤维状的，具有至少约500kDa的分子量；以及(c)当试样中可溶性HMW tau种类的水平与参考水平相同或高于参考水平时，将受试者识别为患有或有风险患tau相关神经退行性变；或当可溶性HMW tau种类的水平低于参考水平时，将受试者识别为不太可能患有tau相关神经退行性变。参考水平可代表存在于健康受试者中的可溶性HMW tau种类的水平。
在一些实施方式中，在(a)的分级分离前，试样可基本上不含可溶性LMW tau种类，其中，可溶性LMW tau种类具有不超过200kDa的分子量。例如，脑间质液或脑脊液的试样可从待通过微透析进行诊断的受试者获得，例如使用适当的分子量截留过滤器(只允许具有至少约600kDa的分子量的分子被收集)进行。
在替代的实施方式中，在(a)的分级分离前，试样可包含可溶性LMW tau种类，其中，可溶性LMW tau种类具有不超过200kDa的分子量。通过对试样进行分级分离，可将可溶性HMW tau种类与试样的其余部分(例如，包括可溶性LMW tau种类的部分)分离，以确定诊断水平。非限制性地，分级分离可基于尺寸排阻方法和/或基于抗体的方法。
在可溶性LMW tau种类存在于试样中的一些实施方式中，该方法可进一步包括检测试样中的可溶性LMW tau种类的量。在此类实施方式中，如果可溶性HMW tau种类与可溶性LMW tau种类的比例与参考水平比例相同或高于参考水平比例，可将受试者识别为患有或有风险患tau相关神经退行性变；或如果可溶性HMW tau种类与可溶性LMW tau种类的比例低于参考水平比例，将受试者识别为不太可能患有tau相关神经退行性变。参考水平比例可代表存在于健康受试者中的可溶性HMW tau种类与可溶性LMW tau种类的水平比例。
在一些实施方式中，检测可进一步包括检测可溶性HMW tau种类的磷酸化。
如本文所述的，可溶性HMW tau种类的发现不仅为tau相关神经退行性变提供了治疗靶点和生物标志物，可溶性HMW tau种类还可在体外使用以诱导神经元间传播(神经退行性变中进展的表型特征)，从而开发出体外模型，以对降低错误折叠的tau蛋白的跨突触散播的有效试剂进行筛选，并由此治疗tau相关神经退行性变。因此，本文提供的又一方面涉及对有效降低错误折叠的tau蛋白的跨突触散播的试剂进行识别的方法。该方法包括：(a)使神经元培养装置第一腔室中的第一神经元与可溶性HMW tau种类接触，其中，第一神经元与神经元培养装置第二腔室中的第二神经元通过轴突连接，并且其中，第二神经元不与可溶性HMW tau种类接触；(b)使第一腔室中的来自(a)的第一神经元与候选试剂接触；以及(c)检测可溶性HMW tau种类从第一神经元向第二神经元的运输。可基于检测第二神经元的胞体(soma)和/或轴突中的可溶性HMW tau种类的存在，来识别用于降低错误折叠的tau蛋白的跨突触散播的有效试剂。
虽然在本文所述的方法中可使用适于监测轴突延伸和/或运输的任何神经元培养装置，在一些实施方式中，神经元培养装置是微流体装置。在一些实施方式中，微流体装置可包含用于放置第一神经元的第一腔室和用于放置第二神经元的第二腔室，其中，第一腔室和第二腔室通过至少一个微通道相互连接，所述微通道专门经尺寸设计以允许轴突生长。
本文所述的可溶性HMW tau种类还可用于筛选分析，以识别调控HMW tau种类本身的形成或活性的试剂(例如，通过阻断HMW tau种类的形成或稳定性，或者例如通过阻断翻译后修饰或通过使HMW tau结构失去稳定性)。例如，可将适体、小分子或其它试剂施用于神经元细胞培养物，并监测可溶性HMW tau的存在或量。如此识别的阻断HMW tau的形成或积累的试剂将成为感兴趣的潜在治疗剂。
在一个方面，发明人已示出，与表达tau的动物相比，即使在神经原纤维缠结(NFT)的存在下，tau-空白动物表现出更少的病理性tau错误折叠和胶质细胞增生，并且还在神经元中表现出Aβ诱导的线粒体内在caspase级联的活化降低。因此，去除内源性细胞内tau蛋白可提供神经保护作用，例如降低神经毒性和/或增加神经元存活。虽然在先报道已经讨论了tau蛋白的降低可改善神经退行性变，本领域技术人员将不会预期到去除显著量的内源性细胞内tau蛋白(即稳定微管必需的蛋白)不会对神经元产生任何其它不利影响。然而，发明人在此已发现，与表达tau蛋白的健康人受试者一样，tau-空白人受试者具有正常的神经元表型。因此，本文还提供了降低tau病变诱导的神经损伤或神经退行性变的方法。示例性的tau病变可以是阿尔茨海默氏病、帕金森氏病或额颞叶痴呆。
降低tau病变诱导的神经损伤或神经退行性变的方法包括：向经确定患有tau病变的受试者的脑给予试剂，所述试剂抑制受试者中的内源性细胞内tau蛋白的至少约50％的表达水平，从而在神经原纤维缠结的存在下降低神经毒性(和/或增加神经元存活)。
在一些实施方式中，该试剂可抑制受试者中的tau蛋白的至少约70％的表达水平。在一些实施方式中，该试剂可抑制受试者中的tau蛋白的至少约90％的表达水平。在一些实施方式中，该试剂可抑制受试者中的tau蛋白的至少约95％的表达水平。在一些实施方式中，该试剂可抑制受试者中的tau蛋白的100％的表达水平。
所选定的抑制内源性细胞内tau蛋白表达水平的试剂可扰乱MAPT(微管相关蛋白tau)基因的表达和/或抑制MAPT基因的转录。此类试剂可包括但不限于抗体、核酸酶(例如但不限于锌指核酸酶(ZFN)、转录激活样效应因子核酸酶(TALEN)、CRISPR/Cas系统、转录阻抑因子、核酸抑制剂(例如，RNAi、siRNA、抗-miR、反义寡核苷酸、核酶以及它们的两种以上的组合)、小分子、适体以及它们的两种以上的组合。
已知的用于将试剂有效递送至受试者的脑的方法可用来执行本文所述的方法。在一些实施方式中，试剂可经由载体向脑给予。示例性的载体可以是腺相关病毒。
在一些实施方式中，可进一步确定受试者的脑具有β淀粉样蛋白斑(amyloid betaplaque)，并且，所述给予可在β淀粉样蛋白的存在下降低神经毒性(和/或增加神经元存活)。
附图说明
图1A-图1K是荧光图像和数据图，示出了来自rTg4510tau转基因小鼠的脑提取物的HMW低聚物tau的神经元摄取。(图1A)将小鼠原代神经元用来自12月龄的rTg4510小鼠的PBS可溶性脑提取物(3,000g、10,000g、50,000g或150,000g离心上清液)孵育24小时。各脑提取物用培养基稀释至500ng/ml人tau的终浓度。(图1A，左侧)用人tau特异性抗体(“Hutau”)和总(人和小鼠)tau抗体(“Hu&Ms tau”，作为神经元标志物)对神经元进行免疫染色。(图1A，右侧)人tau摄取的定量(荧光强度)。n＝9-12/组；**P<0.01。(图1B)将原代神经元用3,000g或150,000g的脑提取物(12月龄rTg4510，PBS可溶性，500ng/ml人tau)孵育2天和5天，并用人tau特异性抗体(“Hu tau”)和总(“Hu&Ms tau”)tau抗体进行免疫染色。(图1C和图1D)来自rTg4510小鼠的PBS可溶性脑提取物的尺寸排阻色谱(SEC)。通过ELISA测量各SEC分离的试样中的人tau水平。(图1C)来自3,000g和150,000g脑提取物的SEC分离试样中的人tau水平的代表性图。(图1D)HMW(Frc.2-4)SEC部分(fraction)、MMW(Frc.9-10)SEC部分和LMW(Frc.13-16)SEC部分的平均人tau水平(n＝3/组)；*P<0.05。HMW，高分子量；MMW，中等分子量；LMW，低分子量。(图1E，左侧)将原代神经元用来自PBS可溶性rTg4510脑提取物(3,000g)的SEC部分孵育2天，并就人tau(“Hu tau”)和总(“Hu&Ms tau”)tau而言进行免疫染色。将各SEC部分稀释至100ng/ml人tau的终浓度。(图1E，右侧)人tau摄取的定量(荧光强度)。n＝3-5/组；**P<0.01。(图1F和图1G)分离自rTg4510小鼠脑的HMW tau的原子力显微术(AFM)分析。(图1F)通过使用人tau特异性抗体Tau13，从rTg4510(12月龄)的PBS可溶性脑提取物(10,000g总提取物(左侧)或SEC Frc.3(右侧))通过免疫沉淀(IP)分离Tau。全色范围对应于20nm的垂直刻度。比例尺：100nm。(图1G)HMW tau低聚物(SEC Frc.3)的尺寸(AFM高度)分布直方图。n＝来自七个随机挑选的图像(1.5μm×1.5μm)的1206个颗粒。(图1H)用Alz50抗体(病理性tau错误折叠的早期指标)或ThioS(高度纤维化的tau)对由原代神经元从rTg4510脑提取物摄取的人tau进行共染色。将来自rTg4510小鼠(12月龄)的脑切片用作各个染色的阳性对照(右侧子图)。(图1I)由原代神经元摄取的人tau的亚细胞定位(PBS可溶性脑提取物，3,000g，500ng/ml人tau，第3天)。用就高尔基体(TGN46)、内质网(ER)(GRP94)、核内体(Rab5)、溶酶体(LAMP2)和过氧化物酶体(过氧化氢酶)而言的亚细胞细胞器标志物对由原代神经元摄取的人tau(“Hu tau”)进行共免疫染色。在第3天，摄取到神经元中的人tau与高尔基体标志物和溶酶体标志物共定位(白色箭头)。(图1J)人tau摄取到原代神经元中的时间过程。在开始用rTg4510脑提取物孵育之后6小时、12小时及10天时，用高尔基体标志物(TGN46)对人tau(“Hu tau”)进行共免疫染色。(图1K)人tau摄取的浓度依赖性。将小鼠原代神经元用来自rTg4510脑提取物(PBS可溶性，3,000g)的SEC Frc.2的四种不同浓度的人tau(在培养基中0.1ng/ml、1.0ng/ml、10ng/ml及50ng/ml)孵育2天。除了(图1F)之外，比例尺为25μm。
图2A-图2H是荧光图像、数据图和免疫印迹图片，示出了PBS可溶性磷酸化HMW tau种类的缺乏与原代神经元中的低tau摄取有关。(图2A)小鼠原代神经元对来自rTg4510小鼠(过表达P301L突变tau)和rTg21221小鼠(过表达野生型人tau)的脑提取物中的人tau的摄取(PBS可溶性，3,000g ext.，培养基中的500ng/ml人tau的终浓度)。在第2天和第5天，用人tau特异性抗体(“Hu tau”)和总(人和小鼠，“Hu&Ms tau”)tau抗体对神经元进行免疫染色。比例尺：50μm。(图2B)通过人tau特异性ELISA测量的来自rTg4510和rTg21221小鼠的PBS可溶性脑提取物(3,000g)中的人tau水平。(图2C)用总tau抗体(DA9)对PBS可溶性脑提取物(3,000g)进行的免疫印迹分析。rTg4510脑中的上移条带表明tau的磷酸化(箭头)。(图2D)rTg4510小鼠脑提取物和rTg21221小鼠脑提取物(PBS可溶性，3,000g)中的磷酸化tau水平。用识别不同表位的十种不同的磷酸化tau特异性抗体对脑提取物进行免疫印迹。在各个表位处的代表性免疫印迹(左侧子图)和磷酸化tau水平的定量(右)。(n＝3-4)；*P<0.05，**P<0.01。(图2E和图2F)来自rTg4510小鼠脑提取物和rTg21221小鼠脑提取物的PBS可溶性tau种类的SEC分析。通过人tau特异性ELISA测量各个SEC分离试样中的人tau水平。(图2E)来自rTg4510脑提取物和rTg21221脑提取物的SEC分离试样中的人tau水平的代表性图。(图2F)HMW(Frc.2-4)SEC部分和LMW(Frc.13-16)SEC部分的平均人tau水平。(n＝3-6)；*P<0.05。(图2G)在各个SEC分离部分中，由原代神经元摄取的人tau与人tau水平的相关性。(n＝11)Spearman秩检验。(图2H)来自PBS可溶性脑提取物的SEC分离部分的免疫印迹分析。用总tau抗体(DA9)和磷酸化tau(pS422)特异性抗体对各SEC部分进行免疫印迹。使用11月龄-13月龄的动物。
图3A-图3C是示意图和荧光图像，示出了用于建立双层神经元模型的三腔室微流体装置。(图3A)用于在三个不同的腔室中培养神经元的微流体装置的示意图。将小鼠原代神经元铺于第一腔室和第二腔室中(厚度100μm)，并通过连接各个腔室的微槽(厚度3μm，长度600μm)引导轴突生长。(图3B，左侧)来自第一腔室神经元的轴突(DA9作为轴突标志物)在4天内延伸到第二腔室中(仅在第一腔室中铺神经元)。在第二腔室中未发现MAP2阳性树突，表明600μm微槽足够长，从而将轴突末端与胞体和树突分离。(图3B，中间)来自第二腔室神经元的大部分轴突延伸到第三腔室中(仅在第二腔室中铺神经元)。(图3B，右侧)将两组神经元铺到第一腔室和第二腔室中，并使其在第二腔室中建立突触接触。(图3C)分别用绿色荧光蛋白(GFP)和红色荧光蛋白(RFP)转染第一腔室和第二腔室中的神经元。来自第一腔室神经元的GFP阳性轴突延伸到第二腔室中，与RFP阳性第二腔室神经元连接，第二腔室神经元将其轴突伸入第三腔室。比例尺：50μm。
图4A-图4E包括荧光图像，示出了在三腔室微流体装置中源自于rTg4510小鼠脑的人tau种类的神经元至神经元的传递。(图4A)将来自rTg4510小鼠脑的PBS可溶性提取物(500ng/ml人tau)加入三腔室微流体神经元装置的第一腔室。在孵育期间通过流体静压屏障(hydrostatic pressure barrier)阻断脑提取物从第一腔室向第二腔室的扩散。(图4B)在第5天对人tau(“Hu tau”)和总(人和小鼠；“Hu&Ms tau”)tau进行的免疫染色。在第二腔室中检测到人tau阳性神经元(白色箭头)。第二腔室的侧面储存部(side reservoir)中的神经元对人tau染色呈阴性(底部)。(图4C)从第二腔室神经元延伸出的人tau阳性轴突(箭头)和树突(箭头头部)。(图4D)tau摄取和传播的浓度依赖性。在培养基中对rTg4510脑提取物(PBS可溶性，3,000g)进行稀释，以获得三种不同浓度(6ng/ml、60ng/ml和600ng/ml)的人tau，并将其加入到第一腔室中。在第5天，就人tau(“Hu tau”)和总(人和小鼠；“Hu&Mstau”)tau(红色)而言对神经元进行免疫染色。(图4E)源自于rTg4510脑的人tau的神经元至神经元的传递的时间过程。将rTg4510脑提取物(PBS可溶性，3,000g，500ng/ml人tau)加入至第一腔室，并孵育长达14天。在不同时间点对神经元进行免疫染色。孵育5天后，检测到人tau阳性第二腔室神经元(箭头头部)和来自第一腔室神经元的轴突(箭头头部)。孵育8天后，在第三腔室中检测到人tau阳性轴突(箭头)。比例尺：50μm。
图5A-图5C包括荧光图像，示出了即使在从腔室去除脑提取物后，源自于rTg4510脑的人tau仍是稳定且传播的。(图5A)在培养基中对rTg4510脑提取物(PBS可溶性，3,000g)进行稀释(终浓度为500ng/ml人tau)，并将其加入到三腔室微流体神经元装置的第一腔室。在孵育2天(在tau传播发生前)或5天(在tau传播发生后，但还未进展至第三腔室)后，将脑提取物从第一腔室洗掉，并用新鲜培养基将其替换。(图5B和图5C)在指定的时间点，就人tau(“Hu tau”)和总(人和小鼠，“Hu&Ms tau”)tau而言对神经元进行免疫染色。(图5B)即使在第2天将Tg脑提取物从第一腔室洗掉后，在第二腔室中也检测到了人tau阳性神经元(第8天，箭头)。(图5C)即使在第5天将Tg脑提取物从第一腔室洗掉后，在第三腔室轴突中也检测到了人tau(箭头)。在第14天(去除Tg脑提取物后9天)，由第一腔室神经元摄取的人tau仍是可检测的。比例尺：50μm。
图6A-图6J是荧光图像和数据图，示出了源自于人AD脑的PBS可溶性HMW低聚物tau的神经元摄取。(图6A和图6B)将小鼠原代神经元用来自人AD脑组织或对照脑组织的PBS可溶性提取物(3,000g或150,000g离心上清液)孵育。用培养基将各个脑提取物稀释至500ng/ml人tau的终浓度。(图6A)在第2天，就人tau(“Hu tau”)和总(人和小鼠，“Hu&Ms tau”)tau而言对神经元进行免疫染色。(图6B)在第2天时人tau阳性神经元数量的定量(n＝3/组)；**P<0.01。(图6C)由小鼠原代神经元摄取的人tau的亚细胞定位(PBS可溶性脑提取物，3,000g，500ng/ml人tau)。用高尔基体(TGN46)标志物和溶酶体(LAMP2)标志物对摄取到原代神经元中的人tau(“Hu tau”)进行共免疫染色。(图6D)三腔室微流体神经元培养装置中的源自于人AD脑的tau的神经元至神经元的传递。将人AD脑提取物(PBS可溶性，3,000g，500ng/ml人tau)加入至三腔室微流体神经元装置的第一腔室。在第7天，在第一腔室和第二腔室中均检测到人tau(“Hu tau”)阳性神经元(箭头)。(图6E和图6F)来自人AD脑和对照脑的各个提取物中的总tau(图6E)和磷酸化tau(pS396，图6F)水平的定量(ELISA)。n＝3/组；*P<0.05。(图6G和图6H)来自人AD脑和对照脑的PBS可溶性tau种类的SEC分析。通过ELISA对各个SEC分离试样中的总tau水平进行测量。(图6G)来自AD脑提取物和对照脑提取物的SEC分离试样中的总tau水平的代表性图。在两组中均检测到HMW部分的小峰(右侧子图)。(图6H)HMW SEC部分(Frc.1-3)的平均总tau水平。n＝3/组。(图6I)小鼠原代神经元对各SEC部分的tau摄取。将各SEC部分稀释至5ng/ml或500ng/ml人tau的终浓度，并用小鼠原代神经元对其进行孵育。在第2天，就人tau(“Hu tau”)和总(人和小鼠，“Hu&Ms tau”)tau而言对神经元进行免疫染色。(图6J)来自人AD脑和对照脑的各SEC部分中的磷酸化tau(pS396)水平的定量(ELISA)。n＝3/组；*P<0.05。比例尺：25μm。HMW，高分子量。
图7A-图7F是实验数据，示出了来自人家族性额颞叶痴呆脑的磷酸化tau种类(而非来自非磷酸化的合成人tau)的神经元摄取。(图7A)来自对照、AD和两个不同的家族性额颞叶痴呆(FTD)病例(P301L和G389R tau突变)的tau免疫染色的脑切片。AD和P301L脑显示频繁的NFT，而G389R脑仅具有tau阳性的神经纤维网细丝，不存在NFT。(图7B)将小鼠原代神经元用来自AD和两个FTD病例的额叶皮质的PBS可溶性提取物(3,000g，500ng/ml人tau)孵育。(图7B，左侧)在第1天和第3天，就人tau(“Hu tau”)和总(人和小鼠，“Hu&Ms tau”)tau而言对神经元进行免疫染色。(图7B，右侧)人tau染色的荧光强度(第1天)。对于每种情况而言，从6个-7个独立的培养孔获得结果。(图7C)PBS可溶性脑提取物中的磷酸化tau(pS396)水平和总tau水平(DA9)的免疫印迹分析。(图7D-图7F)非磷酸化HMW tau种类未被原代神经元摄取。(图7D)通过使重组人tau(hTau-441，3.35mg/ml)在37℃下与2mM DTT孵育2天来制备tau低聚物混合物溶液，随后进行SEC分离以及各部分中的tau水平的ELISA测量。(图7E)脑提取物(人对照、AD和rTg4510小鼠；PBS可溶性，3,000g)和重组tau低聚物混合物的SEC部分中的磷酸化tau(pS396)水平(通过总tau水平归一化)的ELISA测量。(图7F)将各SEC部分用培养基稀释至500ng/ml tau的终浓度，并用小鼠原代神经元对其进行孵育。在第2天，就人tau(“Hu tau”)和总(人和小鼠，“Hu&Ms tau”)tau而言对神经元进行免疫染色。来自人AD脑提取物(PBS可溶性，3,000g)的SEC Frac.2也以相同浓度的tau(500ng/ml)孵育，以作为阳性对照。比例尺：50μm。HMW，高分子量。
图8A-图8E是实验数据，示出了来自rTg4510小鼠脑的细胞外tau种类可被小鼠原代神经元摄取。(图8A)具有推拉式灌注系统的大孔探针体内微透析技术。使用1,000kDa截留微透析探针从清醒的、活动自由的rTg4510小鼠和对照小鼠(7月龄)收集ISF试样(流速＝0.5μl/ml，来自海马)。(图8B)海马中的代表性探针布置。在ISF收集后(探针插入后24小时)从rTg4510小鼠获得水平脑切片，并针对人tau(Tau13，“Hutau”)和DAPI对其进行染色。虚线描绘了微透析探针位置(图8B，顶部)。用Texas红染料(70kDa，1mg/ml)短暂灌注探针以定位微透析的位点。在微透析探针轨迹周围的海马组织内不存在实质性神经元损失的形态学证据。同侧海马切片(探针植入侧)和对侧海马切片之间的人tau阳性神经元的数量不存在明显差异(图8B，底部)。Hip：海马。(图8C)来自rTg4510小鼠的SEC分离的ISF试样中的人tau水平的代表性图。将400μl微透析液加载到SEC柱上，并通过ELISA对各部分中的tau水平进行测量。(图8D)将收集自rTg4510小鼠和对照小鼠的ISF用小鼠原代神经元孵育，然后在第3天，就人tau(“Hu tau”)和总(人和小鼠，“Hu&Ms tau”)tau而言对其进行免疫染色。用培养基将来自rTg4510的ISF稀释至40ng/ml人tau的终浓度，并将来自对照小鼠的相同体积的ISF用于孵育。(图8E)由原代神经元进行的ISF tau摄取的浓度依赖性。在培养基中对rTg4510脑ISF进行稀释，以得到三种不同浓度(10ng/ml、20ng/ml和40ng/ml)的人tau。在第3天对神经元进行免疫染色。HMW，高分子量；MMW，中等分子量。比例尺：50μm。
图9A-图9C是实验数据，示出了HMW低聚物tau被释放到脑的细胞外间隙中并在阿尔茨海默氏病患者的CSF中积累。对AD受试者和对照受试者的脑脊液(CSF)进行检查，以分离特异性的tau种类，并对该tau种类的诊断潜力进行评价。(图9A-图9B)为了检测和表征人CSF中的HMW tau种类，借助SEC对人CSF试样中包含的tau种类的分子量大小分布进行了评估。对来自7个AD病例和10个对照病例的CSF试样进行了分析。(图9C)使用人tau特异性ELISA对各SEC部分中的总tau水平进行测量。值得注意的是，在AD患者的CSF中检测到了HMWtau种类。尽管各组之间的单体尺寸/二聚体尺寸的tau水平是相当的，然而与对照受试者相比，AD患者中的CSF HMW tau的浓度显著更高(p<0.01，Mann-Whitney U检验)。
图10A-图10D示出了在缺乏内源性小鼠tau的条件下转基因人tau的跨突触传播。(图10A)ECrTgTau小鼠的3D脑模型和水平脑切片说明了转基因人突变P301L tau在内嗅皮质(EC)的层2/3中的表达以及转基因tau向齿状回(DG)与海马区CA1和CA3的传播。(图10B)免疫染色的水平切片显示了，在存在内源性小鼠tau(ECrTgTau)和缺乏内源性小鼠tau(ECrTgTau-Mapt0/0)这两种条件下，人tau都从EC中的表达神经元向DG中的神经元稳健传播(白色箭头)。(图10C-图10D)在ECrTgTau-Mapt0/0小鼠和ECrTgTau小鼠中，DG中的人tau阳性(huTau+)细胞体的数量(C；n＝4只小鼠/组，p＝0.58)和海马提取物中的人tau水平(D；n＝3只小鼠/组，p＝0.14)是类似的。双尾学生T检验，数据显示为平均值±SEM。ns，不显著，比例尺为50μm。使用Allen 3D小鼠脑图集(可在http://www.brain-map.org/上在线得到)生成3D脑模型。
图11A-图11G示出了tau传播、磷酸化和错误折叠的非相关性。在ECrTgTau小鼠(图11A)和ECrTgTau-Mapt0/0小鼠(图11B)中，用磷酸化位点特异性抗体CP13(pS202/pT205)和PHF1(pS394/pS404)对人tau(TauY9)进行的共免疫染色均显示出EC神经元的胞体中的磷酸化tau(白色圆圈)以及接受人tau的DG神经元的子集和它们的投射(白色箭头头部)。中间分子层(MML，白色箭头)中的人tau被PHF1染色，但未被CP13染色。“错误折叠的”(Alz50)tau存在于ECrTgTau小鼠(图11A)中的EC神经元和DG神经元的胞体中以及MML中，但不存在于ECrTgTau-Mapt0/0小鼠(图11B)中。(图11C-图11F)与ECrTgTau-Mapt0/0小鼠相比，在ECrTgTau小鼠中，来自EC的PBS提取物中的磷酸化tau水平(图11C和图11E)显示更高的pT205(p＝0.0005)、CP13(pS202/pT205，p＝0.026)、PHF1(pS396/pS404，p＝0.37)和12E8(pS262/pS356，p＝0.31，不显著)。在来自ECrTgTau小鼠的HPC提取物中，CP13(p＝0.0003)和PHF1(p＝0.03)也显著升高(图11D和图11F)。(图11G)与ECrTgTau小鼠相比，在ECrTgTau-Mapt0/0小鼠中，从海马:内嗅(HPC:EC)的tau比例估计的tau传播对于人tau(Tau13，p＝0.26)和PHF1(p＝0.98)而言是类似的，但对于CP13(p＝0.034)而言显著更低。n＝3只小鼠/组，双尾学生T检验，数据显示为平均值±SEM。ns，不显著，比例尺为50μm。
图12A-图12C示出了在ECrTgTau-Mapt0/0小鼠中降低的胶质细胞增生和神经丝磷酸化。(图12A)与WT小鼠(p＝0.008)、ECrTgTau-Mapt0/0小鼠(p＝0.0025)和Mapt0/0小鼠(p＝0.012)相比，在ECrTgTau小鼠中，EC(层1和层2/3)中的免疫荧光标记显示出数量显著增加的小胶质细胞(Iba1+)。在EC提取物中，ECrTgTau小鼠中的Iba的量相较于WT小鼠(p＝0.0006)增加≈20倍、相较于ECrTgTau-Mapt0/0小鼠(p＝0.24)增加≈1.4倍、且相较于Mapt0/0小鼠(p＝0.01)增加≈2倍。(图12B)在WT小鼠、ECrTgTau小鼠、ECrTgTau-Mapt0/0小鼠和Mapt0/0小鼠中，海马中的活化星形胶质细胞(GFAP+)的数量类似(不显著)。然而，与WT小鼠(HPC：p＝0.004；EC：p＝0.03)、ECrTgTau-Mapt0/0小鼠(HPC：p＝0.047；EC：p＝0.1)以及TauKO小鼠(HPC：0.13；EC：p＝0.38)相比，在ECrTgTau小鼠中，HPC和EC提取物中的GFAP的量更高。n＝3只小鼠/组，双尾学生T检验，数据显示为平均值±SEM。(图12C)用SMI132进行的磷酸化神经丝蛋白的免疫染色显示出ECrTgTau的含人tau(TauY9)的EC神经元的强烈局部标记及它们遍布HPC的轴突投射(projections)，但ECrTgTau-Mapt0/0或对照WT和Mapt0/0动物中没有。DG和EC区域的放大倍率更高的图像在ECrTgTau小鼠中显示出许多过程的强烈SMI132标记，但在ECrTgTau-Mapt0/0小鼠中很少。ns，不显著，比例尺100μm。
图13A-图13D示出了内源性小鼠tau的缺乏在rTg4510小鼠中挽救了P301L tau诱导的萎缩并延迟了缠结病理。(图13A)对9月龄和12月龄的rTg4510动物和rTg4510-Mapt0/0动物的全脑湿重的比较显示，在rTg4510小鼠中观察到的相比于WT小鼠的明显的脑物质损失(9个月时重量损失>16％，p＝0.0002；12个月时重量损失>22％，p＝0.0087)在9月龄rTg4510-Mapt0/0小鼠中被挽救至>96％，在12月龄rTg4510-Mapt0/0小鼠中被挽救至≈89％(9个月：p＝0001，n＝5只混合性别小鼠/组；12个月：p＝0.042，n＝3只混合性别小鼠/组)。(图13B)与WT小鼠(p＝0.009，p＝0.0002)、rTg4510-Mapt0/0小鼠(p＝0.005，p＝0.0223)以及Mapt0/0小鼠(p＝0.0008，p＝0.0006；n＝3只小鼠/组)相比，在rTg4510小鼠中，皮质厚度在9月龄时降低了≈23％-26％，并在12月龄时降低了≈46％，所述皮质厚度在水平脑切片(9个月)或冠状脑切片(12个月)中在邻近海马处从CTX表面到胼胝体测量得到。在9个月(p＝0.13)和12个月(p＝0.975)时，rTg4510-Mapt0/0和Mapt0/0的皮质厚度类似。(图13C)9月龄和12月龄的rTg4510小鼠的皮质和海马CA1神经元被过磷酸化的tau(用PHF1免疫标记)填充，该过磷酸化的tau形成致密的缠结状包涵体。在9月龄时，rTg4510-Mapt0/0小鼠在皮质中具有较少的PHF1填充的细胞体，且PHF1染色仍然存在于CA1神经元的轴突中(白色箭头)。在12月龄时，在rTg4510小鼠和rTg4510-Mapt0/0小鼠中，CTX和CA1中的PHF1填充的胞体的数量和外观均类似。(图13D)通过Gallyas银染色，与rTg4510-Mapt0/0小鼠相比，12月龄的rTg4510小鼠在轴突、CTX的神经突以及胼胝体(GCC)中似乎具有类似数量的皮质(CTX)缠结，但具有较少聚集的tau。WT小鼠和Mapt0/0小鼠既未显示出PHF1染色(图13C)也未显示出银染色(图13D)。ns，不显著，比例尺为100μm。
图14A-图14D示出了在内源性tau缺乏的条件下减少的神经元损失和缠结毒性。(图14A)在9个月时，与WT小鼠(p＝0.0223)和rTg4510-Mapt0/0小鼠(p<0.0001)两者相比，rTg4510小鼠皮质中神经元(NeuN+细胞)的数量显著降低至≈67％。在12个月时，rTg4510小鼠中的神经元损失(约为WT的63％)仍然与9个月时类似。rTg4510-Mapt0/0小鼠中神经元的数量轻微下降至Mapt0/0小鼠的≈88％(不显著)。(图14B)用硫黄素-S(ThioS，白色箭头)染色的皮质缠结的数量在rTg4510小鼠和rTg4510-Mapt0/0小鼠中类似(9个月：p＝0.32；12个月；p＝0.51)，并从9月龄至12月龄显著增加(rTg4510：p＝0.0074；rTg4510-Mapt0/0：p＝0.0002)。(图14C)在9个月(p＝0.03)以及在12个月(p＝0.0087；学生T检验，n＝3只小鼠/组)时，rTg4510小鼠皮质中具有缠结的神经元的百分比(＝缠结数量/神经元数量)为≈1.6倍至1.8倍高。(图14D)对9月龄和12月龄时缠结数量:神经元损失的比例(＝缠结/([WT或Mapt0/0对照中神经元的数量]-[rTg4510或rTg4510-Mapt0/0中神经元的数量])进行比较，突出了在给定的缠结负载(tangle load)下rTg4510-Mapt0/0小鼠中提高的神经元存活。ns，不显著，比例尺为100μm。
图15A-图15C示出了由Western印迹得出的Mapt0/0小鼠中小鼠tau的缺乏以及HPC中人tau的存在。(图15A)使用识别人tau转基因转录物(顶部)或基因组小鼠tau(MapT)转录物(底部)的引物，将提取自18月龄的Mapt0/0小鼠、ECrTgTau-Mapt0/0小鼠和ECrTgTau小鼠(n＝4只小鼠/组)的新鲜冷冻脑组织的RNA转录为cDNA，并进行qPCR。作为扩增对照对GAPDHmRNA进行共转录。ECrTgTau-Mapt0/0小鼠和ECrTgTau小鼠显示出人tau表达，而Mapt0/0小鼠和ECrTgTau-Mapt0/0小鼠缺乏小鼠tau表达。(图15B-图15C)来自18月龄的野生型小鼠(WT)、ECrTgTau小鼠、与tau敲除小鼠杂交的ECrTgTau小鼠(ECrTgTau-Mapt0/0)以及Mapt0/0小鼠的脑提取物中的人tau(huTau)和总tau(hu+moTau)水平(n＝3只小鼠/组)。ECrTgTau动物和ECrTgTau-Mapt0/0动物显示出EC中相等的转基因huTau表达(图15B，n＝3只小鼠，p＝0.29)以及海马(HPC)中类似量的huTau(图15C，n＝3只小鼠，p＝0.14)。ns，不显著。
图16A-图16B示出了在ECrTgTau-Mapt0/0小鼠中全长tau蛋白从EC到DG中的传播。(图16A)用Tau13(识别人(非小鼠)tau的N-末端(表位＝氨基酸20-35)的单克隆小鼠抗体)和DAKO(识别所有(小鼠和人)tau的C-末端一半(表位＝氨基酸243-441之间的多个位点)的多克隆兔抗体)共免疫标记的水平脑切片。通过N-末端抗体和C-末端抗体在EC神经元和DG神经元中均识别出细胞体(白色圆圈)和过程(白色箭头)中的人tau，表明全长tau的跨突触传播。(图16B)使用联合人tau(TauY9，“hu Tau”)免疫荧光标记的人tau mRNA(“hu TaumRNA”)原位荧光杂交(FISH)(免疫-FISH)，在18月龄的ECrTgTau小鼠和ECrTgTau-Mapt0/0小鼠中，对转基因人P301L tau(huTau)的表达受限于EC进行验证。在两个小鼠品系中，EC神经元对于人tau mRNA和huTau蛋白而言均呈阳性，而DG神经元具有huTau蛋白、但不具有人taumRNA。比例尺为100μm。
图17A-图17C示出了ECrTgTau-Mapt0/0小鼠和ECrTgTau小鼠的HPC提取物和EC提取物中的磷酸化tau。(图17A-图17B)在全部四种基因型(WT、ECrTgTau、ECrTgTau-Mapt0/0、Mapt0/0)中，来自(图17A)内嗅皮质(EC)和(图17B)海马(HPC)的匀浆物中的磷酸化tau的Western印迹分析。注意到WT小鼠和ECrTgTau小鼠显示类似的磷酸化水平，且这些水平高于ECrTgTau-Mapt0/0小鼠中观察到的水平。(图17C)在EC和HPC中，与ECrTgTau-Mapt0/0小鼠相比，ECrTgTau小鼠中的不同磷酸化tau形式相对于人tau蛋白含量的水平均为≈2倍-10倍高(n＝3只小鼠/组，学生T检验)。这些结果表明，在ECrTgTau小鼠中，相较于人tau，小鼠tau为磷酸化tau池提供更主要的贡献。
图18A-图18B示出了，聚集的tau在18月龄的ECrTgTau小鼠的细胞体中出现，但未在ECrTgTau-Mapt0/0小鼠中出现。(图18A)在就人tau(huTau)而言进行免疫标记、并经红色缠结染料噻嗪红(ThiaRed)共染色的脑切片中，聚集的tau存在于ECrTgTau小鼠EC和DG中的具有人tau的细胞体的子集中(白色圆圈)。(图18B)未能在ECrTgTau-Mapt0/0小鼠的任何脑区域中发现噻嗪红(n＝4只小鼠)。比例尺为50μm。
图19A-图19B示出了在18个月时，ECrTgTau小鼠中的突触蛋白-1水平和EC细胞数量没有变化。(图19A)在ECrTgTau小鼠、ECrTgTau-Mapt0/0小鼠、WT小鼠和Mapt0/0小鼠中，内嗅皮质的层2/3中的DAPI-阳性细胞核的数量是相同的(n＝3只小鼠/组)，表明在18月龄时人tau的缺乏在这些小鼠品系中诱导神经元死亡。(图19B)在WT小鼠、ECrTgTau小鼠、ECrTgTau-Mapt0/0小鼠和Mapt0/0小鼠中，内嗅皮质(EC)提取物和海马(HPC)提取物中的突触前蛋白(pre-synaptic protein)突触蛋白-1的水平是类似的(n＝3只小鼠/组，不显著)，表明在18月龄时ECrTgTau小鼠中不存在突触损失。ns，不显著。
图20A-图20C示出了rTg4510-Mapt0/0小鼠的CTX中降低的缠结毒性以及CA1中得到挽救的神经退行性变。(图20A-图20B)在9月龄的动物中，与WT(CA1体积：p＝0.0004；CA1神经元：p<0.0001)小鼠相比，rTg4510小鼠中海马区CA1的体积(图20A)和神经元数量(图20B)显著降低。在rTg4510-Mapt0/0小鼠中，这一CA1退行性变得到部分挽救(CA1体积：p<0.0001；CA1神经元：p＝0.06)。(图20C)在9个月和12个月时，相较于rTg4510-MapT0/0小鼠，rTg4510小鼠均显示出每个缠结更大幅度的皮质变薄(cortex thinning)(与WT小鼠或MapT0/0小鼠相比CTX厚度减少)，表明在内源性小鼠tau的存在下，缠结具有更高的神经纤维网毒性。在9月龄和12月龄之间，缠结毒性在rTg4510-MapT0/0小鼠中仅轻微增加，在rTg4510小鼠中轻微降低。
图21A-图21F示出了Aβ诱导caspase 3和caspase 9活化、tau切割和BAD去磷酸化。(图21A-图21F)经WtCM、TgCM(包含4nM Aβ)、Aβ-免疫耗竭的TgCM(TgCM-ID)、20μM zVAD-FMK(泛caspase抑制剂)或星形孢菌素(STS，1μM，6小时)处理24小时的野生型原代皮质神经元(来自CD1小鼠)的Western印迹分析。(图21A)对总细胞裂解物的tau、Asp421处切割的tau(TauC3)、caspase 3、切割的(cleaved)caspase 3和肌动蛋白(上样对照)进行探测的代表性免疫印迹。切割的caspase 3水平相对于总caspase 3的定量(图21B)以及TauC3相对于总tau的定量(图21C)。(图21D)还对全细胞裂解物的caspase 9、切割的caspase 9、BAD、pBAD和肌动蛋白进行了Western印迹。(图21E)切割的caspase 9(活性caspase 9)水平与总caspase 9水平的比例的定量以及(图21F)磷酸化BAD与总BAD的比例的定量。对于代表性的印迹，对同一膜进行BAD和pBAD探测，对第二个膜进行切割的caspase 9、caspase 9和肌动蛋白探测。(棒代表n＝3次独立试验的平均值±SEM。单因素ANOVA与Bonferroni多重比较检验，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，n.s.＝不显著。)
图22A-图22E示出了Aβ经由线粒体内在通路促进caspase活化。(图22A-图22B)经TgCM、WtCM、TgCM-ID、zVAD-FMK和STS处理24小时的野生型原代皮质神经元的Western印迹分析。在将大细胞碎片和不溶性物质沉淀后，将细胞裂解物进一步分离成含有胞质溶胶上清液的部分(图22A)和含有富集了线粒体的沉淀的部分(图22B)，对两个部分的细胞色素c(cyt c)、VDAC、BAX和肌动蛋白进行分析(图22C-图22E)。就图22B中示出的代表性印迹而言，对同一膜进行VDAC和肌动蛋白探测，对第二个膜进行BAX和cyt c探测。(棒代表n＝3次独立试验的平均值±SEM。单因素ANOVA与Bonferroni多重比较检验，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，n.s.＝不显著。)
图23A-图23F示出了Aβ经由钙调磷酸酶(calcineurin)活化促进caspase活化。(图23A-图23F)来自经TgCM、WtCM、FK506和STS处理24小时的神经元的全细胞裂解物的Western印迹分析，显示(图23A和图23B)切割的caspase 3和总caspase 3的水平、(图23A和图23C)切割的tau和总tau的水平、(图23D和图23E)切割的caspase 9和总caspase9的水平以及(图23D和图23F)BAD磷酸化的水平。对于代表性的印迹而言：(图23A)对同一膜进行tau、tauC3和肌动蛋白探测，对第二个膜进行切割的caspase 3和caspase 3探测；(图23D)对同一膜进行BAD、pBAD和肌动蛋白探测，对第二个膜进行切割的caspase 9和caspase 9探测。(棒代表n＝3次独立试验的平均值±SEM。单因素ANOVA与Bonferroni多重比较检验，**p<0.01，***p<0.001，n.s.＝不显著。)
图24A-图24D示出了通过caspase抑制降低了Aβ诱导的棘损失。(图24A)来自经WtCM、TgCM、TgCM-ID或zVAD-FMK处理24小时的GFP转染神经元的棘的共聚焦图像。(图24B)来自处理的神经元的细胞裂解物的Western印迹，验证了PSD95(突触标志物)。(图24C)从共聚焦图像对棘密度进行的定量(Kruskal-Wallis ANOVA，Dunn多重比较检验，n＝30个-40个神经元/组)。(图24D)从Western印迹对PSD95水平进行的定量(棒代表n＝3次独立试验的平均值±SEM。单因素ANOVA与Bonferroni多重比较检验，**p<0.01，***p<0.001，n.s.＝不显著。)
图25A-图25I示出了tau介导了Aβ诱导的凋亡级联活化和棘损失。(图25A和图25C)来自经WtCM或TgCM处理的Tau-/-小鼠、Tau+/-小鼠和Tau+/+小鼠的切割的caspase 3培养物和总caspase 3培养物(n＝3次独立试验/组)。在同一培养物中(图25B和图25D)切割的caspase 9和总caspase 9的水平以及(图25B和图25E)pBAD和BAD的水平。对于代表性的印迹而言：(图25A)对同一膜进行BAD和pBAD探测，对第二个膜进行切割的caspase 9、caspase9和肌动蛋白探测；(图25D)对同一膜进行tau和肌动蛋白探测，对第二个膜进行切割的caspase 3和caspase3探测。(图25F和图25I)使用AAV(腺相关病毒)介导的基因递送，用GFP(对照)、人全长tau(Tau4R)转导的Tau-/-神经元。在转导后三天，将神经元培养物暴露至TgCM(Tg)或WtCM(Wt)24小时。示出了使用针对tau(Tau)、切割的caspase 3、总caspase 3和β-肌动蛋白的抗体对神经元裂解物进行的Western印迹分析。对于代表性的印迹而言，对同一膜进行tau探测，对第二个膜进行切割的caspase 3、caspase 3和肌动蛋白探测(n＝3次独立试验/组)。将结果归一化至对照(经WtCM处理的GFP转导神经元)。(图25G)经WtCM或TgCM处理24小时的表达GFP的Tau+/+神经元、Tau+/-神经元和Tau-/-神经元的共聚焦图像。(图25H)GFP转染神经元的棘密度(n＝30个-40个神经元/组)。(棒代表平均值±SEM。双因素ANOVA与Bonferroni多重比较检验，**p<0.01，***p<0.001，n.s.＝不显著。)
图26A-图26J示出了tau降低在体内防止Aβ诱导的变化。从6月龄APP/PS1小鼠获得的脑胞质溶胶部分(图26A)和线粒体沉淀(图26B)中的BAX、cyt c的Western印迹。(图26C和图26D)胞质溶胶中的BAX和cyt c的定量。(图26E和图26F)线粒体沉淀中的BAX和cyt c的定量。来自4月龄的对照小鼠(野生型)、APP/PS1小鼠、APP/PS1Tau+/-小鼠或Tau+/-小鼠的胞质溶胶部分中的cyt c的Western印迹(图26G)和定量(图26I)。从4月龄的APP/PS1小鼠、APP/PS1Tau+/-小鼠和Tau+/-小鼠制备的突触神经小体中的PSD95的Western印迹(图26H)和定量(图26J)。(图26C-图26F中使用学生t检验。图I、图J中使用单因素ANOVA与Bonferroni多重比较检验。棒代表平均值±SEM，n＝3只动物/组。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，n.s.＝不显著)。
图27A-图27F示出了tau在体内和体外与线粒体相关。(图27A、图27D)用TgCM孵育原代神经元24小时增加了线粒体的tau(每个条件n＝8个孔)。(图27B、图27E)与对照小鼠相比，来自6月龄APP/PS1小鼠的线粒体提取物具有增加的tau(n＝3只动物/组)。(图27C、图27F)与年龄匹配的对照相比，来自人阿尔茨海默氏病脑的线粒体提取物具有增加的tau(n＝9个试样/组)。(棒代表平均值±SEM。学生t检验。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001)。
图28示出了来自原代神经元的全细胞裂解物中的总tau未发生改变。来自经WtCM或TgCM处理24小时的培养物的tau的western印迹水平(来自图21A)的定量。(棒表示平均值±SEM，n＝5个孔/组。学生t检验。n.s.＝不显著)。
图29A-图29C示出了在原代神经元培养物中施用TgCM 24小时不诱导细胞死亡。(图29A)经WtCM、TgCM、STS和zVAD处理24小时的培养物中的总PARP和切割的PARP的Western印迹(n＝3/组)。(图29B)经WtCM、TgCM、TgCM-ID和zVAD处理24小时的培养物中的细胞死亡的Toxilight分析(a.u.＝任意单位，单因素ANOVA，n＝3-8/组)。(图29C)来自Tau+/+小鼠、Tau+/-小鼠和Tau-/-小鼠的培养物中的细胞死亡的Toxilight分析(双因素ANOVA，n＝4/组)。(棒代表平均值±SEM。Bonferroni多重比较检验。***p<0.0001，n.s.＝不显著)。
图30A-图30D示出了人突触神经小体中tau的定位和caspase 3增加的活化。从AD人组织或非痴呆人组织制得突触神经小体。(图30A、图30B)在AD试样与非痴呆对照中，对突触神经小体的切割的caspase 3和总caspase 3进行探测的Western印迹分析。(图30C、图30D)在AD试样与非痴呆对照中，对突触神经小体的总tau进行探测的Western印迹分析。(棒代表平均值±SEM。n＝4/组。学生t检验，**p<0.01)。
图31A-图31B示出了tau降低在体内防止Aβ诱导的caspase 3活化。从4月龄的非转基因对照小鼠、APP/PS1小鼠、APP/PS1Tau+/-小鼠和Tau+/-小鼠制备的突触神经小体的Western印迹(图31A)显示，与仅携带一个拷贝的tau等位基因的APP/PS1Tau+/-小鼠相比，来自APP/PS1小鼠的突触神经小体中切割的caspase 3增加(图31B)。(单因素ANOVA与Bonferroni多重比较检验，n＝3/组。棒代表平均值±SEM。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，n.s.＝不显著)
具体实施方式
本文所述的多个方面至少部分地源于：以低细胞外水平存在于患有阿尔茨海默氏病(AD)或额颞叶痴呆(FTD)的受试者的脑中的可溶性高分子量(HMW)tau种类(包括磷酸化形式)的发现，以及该可溶性HMW tau种类被神经元摄取以及在神经元间传播的能力。具体而言，为了识别负责传播的可溶性HMW tau种类，发明人已经开发了新型的三腔室微流体装置，以形成双层神经元并检查神经元的tau摄取、轴突运输和突触传递。通过对源自于例如清醒的行为正常的tau转基因小鼠的间质液以及来自小鼠和人AD死后皮质的皮质提取物的不同tau种类的摄取和传播性质进行表征，发明人在一个方面已发现，尽管丰度非常低，但PBS可溶性磷酸化高分子量(HMW)tau种类以时间和浓度依赖的方式被摄取、经轴突运输并传递至突触连接的神经元。相反，尽管丰度高得多，低分子量(LMW)tau种类(例如，单体/二聚体尺寸的tau)不能有效地被神经元摄取。因此，在一个方面，参与神经元间传播的可溶性HMW磷酸化tau的稀有种类的发现为治疗性干预和生物标志物开发提供了更有效的靶点。
此外，发明人已发现神经元间的tau传播不需要内源性细胞内tau(用于模板错误折叠)，而tau-空白小鼠具有少得多的病理性错误折叠和胶质细胞增生，因此，在一个实施方式中，内源性细胞内宿主tau的完全去除产生神经保护作用。例如，发明人已示出tau-空白神经元在神经元中缺少Aβ诱导的线粒体内在caspase级联的活化，并随后免受Aβ诱导的树突棘损失和神经退行性变。
因此，本文所述多个方面的实施方式涉及包含负责神经元间传播的可溶性HMWtau种类的组合物及其应用。本文还提供了治疗和诊断受试者中的tau相关神经退行性变的方法。
包含可溶性高分子量(HMW)tau种类的组合物
在一个方面，本文提供了包含可溶性高分子量(HMW)tau种类的组合物。该组合物中的可溶性HMW tau种类是非纤维状的，具有至少约500kDa的分子量。
在一些实施方式中，组合物基本上不含可溶性低分子量(LMW)tau种类。本文和整个说明书中所使用的术语“基本上不含可溶性低分子量(LMW)tau种类”包括：通过本领域已知的方法(例如但不限于尺寸排阻色谱、ELISA、显微术、原子力显微术或它们的任意组合)不易检测到的痕量的LMW tau种类以及完全不存在(即，0％)的LMW tau种类。在一些实施方式中，本文所述的组合物中的HMW tau与LMW tau的比例实质上与这些蛋白形式在体内存在的比例不同。因此，在HMW tau仅占体内(例如，人体内)正常存在的总tau的一小部分的情况下，本文描述了其中至少50％的总tau蛋白是HMW形式的制剂，例如具有至少50％的HMW tau和50％以下的LMW tau、至少60％的HMW tau和40％以下的LMW tau、至少70％的HMW tau和30％以下的LMW tau、至少80％的HMW tau和20％以下的LMW tau、至少90％的HMW tau和10％以下的LMW tau、或95％的HMW Tau和少于5％的LMW tau的制剂。
在一些实施方式中，组合物可包含不超过5％(w/w)的可溶性LMW tau种类，包括例如不超过4％、不超过3％、不超过2％、不超过1％、不超过0.5％(w/w)的可溶性LMW tau种类。本文所使用的术语“基本上缺乏LMW tau”意为给定的HMW tau制剂具有以重量计少于1％的LMW tau、优选少于0.1％的LMW tau、少于0.01％的LMW tau或更少。
本文和整个说明书中所使用的术语“高分子量tau种类”或“HMW tau种类”是指非纤维状和低聚的tau种类分子群，其中tau种类分子各自具有至少约500kDa的分子量。HMWtau种类具有病理性错误折叠的构象(例如，对Alz 50抗体染色呈阳性)并以低聚结构出现(例如，在原子力显微镜下)。HMW tau种类可以是细胞内的(例如，在神经元内部)或细胞外的(例如，在脑间质液和/或脑脊液中)。在一些实施方式中，HMWtau种类可通过以下方式来生产：例如通过实施例中所述的离心(例如，×3000g以下)和/或尺寸排阻色谱对来自tau转基因动物(例如，tau转基因小鼠)的脑提取物和/或脑间质液进行分级分离，并选择具有至少约500kDa或更高的分子量的部分。在一些实施方式中，HMW tau种类可通过使重组tau蛋白发生多聚化来生产。在一些实施方式中，如在下文中进一步详细描述的，HMW tau种类可为磷酸化的或过磷酸化的。
本文所使用的术语“非纤维状”是指未聚集成神经原纤维缠结(NFT)的HMW tau种类。NFT通常在神经元内部由集结(assembled)成不溶性丝状体(filaments)的tau蛋白的过磷酸化形成。
就本文所述的可溶性HMW tau种类而言的本文所使用的术语“低聚的”或“低聚物”意为包含有限(finite)数量的tau单体或二聚体亚基的聚集体或复合物。在一些实施方式中，本文所述的可溶性HMW tau种类可包含至少2个或更多个tau单体或二聚体亚基，包括例如至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少15个、至少20个、至少30个、至少40个或更多个tau单体或二聚体亚基。在一些实施方式中，本文所述的HMW tau种类可包含约3个-100个tau单体或二聚体亚基、约4个-90个tau单体或二聚体亚基、约5个-80个tau单体或二聚体亚基、约5个-70个tau单体或二聚体亚基、约5个-60个tau单体或二聚体亚基、约5个-50个tau单体或二聚体亚基、约5个-40个tau单体或二聚体亚基、约5个-30个tau单体或二聚体亚基、或约5个-20个tau单体或二聚体亚基。
Tau蛋白或微管相关蛋白tau(MAPT)：Tau蛋白属于微管相关蛋白(MAP)家族。Tau蛋白主要在神经元中表达，在神经元中，它们在将微管蛋白单体组装成微管以构成神经元微管网的过程中起重要作用，不过，非神经元细胞(例如心脏、肾、肺、肌肉或胰腺细胞)也可具有痕量Tau蛋白。微管参与细胞形状的维持，并作为用于轴突运输的轨道。Tau蛋白由位于17号染色体上的单个基因翻译而来。它们的表达由可变剪接机制发育性地调节，成人脑中存在六种不同的异形体(isoforms)。Buee等，Brain Research Reviews(2000)33:95-130。
Tau可被细分成四个区域：N-末端突起区域、脯氨酸富集结构域、微管结合结构域(MBD)和C-末端区域。Morris等，Neuron(2011)70:410-426。N-末端区域和MBD周围的可变剪接产生成人脑中六种主要的异形体(Goedert等，Neuron(1989)3:519-526)，具有352个-441个氨基酸。六种异形体的区别在于N-末端部分处29个氨基酸的零插入、一个插入或两个插入(外显子2和外显子3)以及C-末端部分外显子10缺失处的三个或四个重复区域。因此，CNS中最长的异形体具有四个重复(R1、R2、R3和R4)和两个插入(总共441个氨基酸)，而最短的异形体具有三个重复(R1、R3和R4)且没有插入(总共352个氨基酸)。通过表达的微管结合重复序列的数量(称为R)和包含的N-末端外显子(称为N)，对Tau异形体进行命名。例如，3Rtau具有三个微管结合重复序列，而由于包含外显子10，4R tau具有四个微管结合重复序列。0N tau不包含N-末端外显子，1N tau包含外显子2，2N tau包含外显子2和外显子3(Lee等，Annu.Rev.Neurosci.(2001)24:1121-1159)。通过Tau突变在4R2N人tau中的位置对其进行编号(Lee等，2001)。通过在外显子6周围的可变剪接形成六种额外的异形体，产生了总共12种在脑中表达的tau异形体(Wei和Andreadis，J.Neurochem(1998)70:1346-1356)。通过引用的方式将本文引用的参考文献并入本文。
在一些实施方式中，可溶性HMW tau种类可以是富含选自于由如下tau异形体所组成的组中的tau异形体中的至少一种或更多种(例如，至少两种或更多种)的低聚物：tau异形体1、tau异形体2、tau异形体3、tau异形体4、tau异形体5和tau异形体6。在一些实施方式中，可溶性HMW tau种类可以是富含选自于由如下tau异形体所组成的组中的tau异形体中的至少一种或更多种(例如，至少两种或更多种)的低聚物：(2-3-10-)、(2+3-10-)、(2+3+10-)、(2-3-10+)、(2+3-10+)、(2+3+10+)。所有的MAP(微管相关蛋白)tau蛋白异形体在本领域中是已知的，而且它们的核苷酸序列和蛋白序列可从NCBI在万维网上得到(包括例如人)。下面的表1示出了可在NCBI上得到的不同的人tau异形体的核苷酸序列和氨基酸序列的示例性登录号。
表1.不同人tau异形体的氨基酸序列
当提及HMW tau种类或LMW tau种类时，本文和整个说明书中所使用的术语“可溶性”意为该HMW tau种类或LMW tau种类在生物流体(例如CSF、脑间质液、血浆等)中溶解并形成基本上均质的溶液。本文所述的HMW tau可溶性种类还在磷酸盐缓冲盐水中溶解并形成基本上均质的溶液。
本文所使用的术语“分子量”是指给定分子(例如，HMW tau种类分子或LMW tau种类分子)的质量或给定分子群(例如，两个以上)(例如，LMW tau种类分子群或HMW tau种类分子群)的平均质量。根据施用的统计方法，可定义出不同的平均值。在一些实施方式中，分子量是数均分子量。在一些实施方式中，分子量是重均分子量(mass average molecularweight)。通常可通过本领域中已知的任何方法(例如但不限于凝胶电泳法、凝胶色谱法、尺寸排阻色谱法、光散射法和/或质谱法)来测量HMW tau种类或LMW tau种类的分子量。在一些实施方式中，通过尺寸排阻色谱法来测量HMW tau种类或LMW tau种类的分子量。
在本文所述的组合物中，可溶性HMW tau种类具有至少约500kDa或更高的分子量。在一些实施方式中，可溶性HMW tau种类可具有至少约550kDa、至少约600kDa、至少约650kDa、至少约700kDa、至少约750kDa、至少约800kDa、至少约850kDa、至少约900kDa、至少约950kDa或更高的分子量。在一些实施方式中，可溶性HMW tau种类可具有至少约669kDa或更高的分子量。在一些实施方式中，可溶性HMW tau种类可具有约500kDa至约2000kDa、约550kDa至约1500kDa、约600kDa至约1000kDa、约650kDa至约1000kDa、或约669kDa至约1000kDa的分子量。在一些实施方式中，可溶性HMW tau种类可形成分子量分布。在一些实施方式中，可溶性HMW tau种类可全部具有基本上相同的分子量。
在一些实施方式中，非纤维状的可溶性HMW tau种类可以颗粒聚集体存在。颗粒可为任何形状，且不限于球形(spherical)或球状(globular)颗粒。可溶性HMW tau种类的粒径可随它们的分子量而变化。在一些实施方式中，可溶性HMW tau种类的粒径范围可以为约1nm至约50nm、约5nm至约40nm、约10nm至约30nm、或约15nm至约25nm。在一些实施方式中，可溶性HMW tau种类可形成粒径分布。在一些实施方式中，可溶性HMW tau种类可全部具有基本上相同的粒径。
在一些实施方式中，可溶性HMW tau种类可由tau单体和/或二聚体亚基组成、或基本上由tau单体和/或二聚体亚基组成。
在一些实施方式中，可溶性HMW tau种类可包含其它成分，例如其它蛋白和脂质。
发明人已发现，当与未患有AD的对照脑相比较时，AD脑提取物含有显著更高水平的磷酸化可溶性HMW tau种类。因此，在一些实施方式中，组合物中的可溶性HMW tau种类可为磷酸化的。在一些实施方式中，组合物中的可溶性HMW tau种类可为过磷酸化的。本文所使用的术语“过磷酸化的”或“过磷酸化”是指如下情况：相较于LMW tau种类或非聚集的正常tau蛋白上的磷酸化位点的数量(即磷酸盐部分的数量)，HMWtau种类上的磷酸化位点的数量更高；或者，相较于LMW tau种类或非聚集的正常tau蛋白中的水平，HMW tau种类上的磷酸化位点以更高的水平被磷酸化。在一些实施方式中，相较于LMW tau种类或非聚集的正常tau蛋白中的水平，HMW tau种类上的至少一个或更多个(包括例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或全部)磷酸化位点以高出至少约50％(包括至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或上至100％)的水平被磷酸化。在一些实施方式中，相较于LMW tau种类或非聚集的正常tau蛋白中的水平，HMW tau种类上的至少一个或更多个(包括例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或全部)磷酸化位点以高出至少约1.5倍(包括至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约3.5倍、至少约4倍、至少约4.5倍、至少约5倍或更高)的水平被磷酸化。HMW tau种类中可被过磷酸化的磷酸化位点的实例包括但不限于pS199、pT205、pS262、pS396、pS396/404、pS400、pS409、pS422或它们的两个以上的组合。在一些实施方式中，HMW tau种类可在如下磷酸化位点中的至少一个或更多个(例如，至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个)处被过磷酸化：pT205、pS262、pS400、pS404、pS409和pS422。全长tau异形体由例如NCBI登录号NP_005901.2表示，将此处的信息通过引用的方式并入本文。
在一些实施方式中，可溶性HMW tau种类可优先被神经元摄取。本文所使用的术语“优先被神经元摄取”是指相较于摄取可溶性LMW tau种类，神经元具有更高的可能性来摄取可溶性HMW tau种类。在一些实施方式中，相较于摄取可溶性LMW tau种类，神经元具有高出至少约30％或更高(包括例如至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或更高)的可能性来摄取可溶性HMW tau种类。在一些实施方式中，相较于摄取可溶性LMW tau种类，神经元具有高出至少约1.5倍或更高(包括例如至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约3.5倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约10倍或更高)的可能性来摄取可溶性HMW tau种类。
一旦可溶性HMW tau种类被神经元摄取，可溶性HMW tau种类可从神经元经轴突运输至突触连接的神经元。因此，在一些实施方式中，神经元可优先将可溶性HMW tau种类从其细胞体经轴突运输至突触连接的神经元。本文所用的术语“优先将可溶性HMW tau种类从其细胞体经轴突运输至突触连接的神经元”是指与突触连接的神经元之间的可溶性LMWtau种类的轴突运输相比，神经元具有更高的可能性来将可溶性HMW tau种类从其细胞体经轴突运输至突触连接的神经元。在一些实施方式中，与突触连接的神经元之间的可溶性LMWtau种类的轴突运输相比，神经元可具有高出至少约30％或更高(包括例如至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或更高)的可能性来将可溶性HMW tau种类从其细胞体经轴突运输至突触连接的神经元。在一些实施方式中，与突触连接的神经元之间的可溶性LMW tau种类的轴突运输相比，神经元可具有高出至少约1.5倍或更高(包括例如至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约3.5倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约10倍或更高)的可能性来将可溶性HMW tau种类从其细胞体经轴突运输至突触连接的神经元。
本文所使用的术语“经轴突运输”或“轴突运输”是指沿神经元的轴突定向运输分子和/或细胞器。“轴突运输”可以是“顺行的”(从细胞体向外(outward from))或“逆行的”(返回到(back toward)细胞体)。因此，可溶性HMW tau种类的顺行运输将神经元摄取的可溶性HMW tau种类从其细胞体向外递送至远处的突触。
本文和整个说明书中所使用的术语“突触连接”是指神经元经由突触彼此联系。突触是专门用于信号传递的神经元区域。可通过如下方面对突触进行表征：突触作为信号传递区域的能力；以及两个神经元间突触处的物理接近程度。信号传导可通过电的方式或化学方式进行。
本文和整个说明书中所使用的术语“低分子量tau种类”或“LMW tau种类”是指基本上为tau单体亚基和/或tau二聚体亚基的tau种类分子群。LMW tau种类可以是细胞内的(例如，在神经元内部)或细胞外的(例如，在脑间质液和/或脑脊液中)。在一些实施方式中，LMW tau种类可通过以下方式来生产：例如通过如实施例中所述的以较高速度进行的离心(例如，×50000g以上)和/或尺寸排阻色谱对来自tau转基因动物(例如，tau转基因小鼠)的脑提取物和/或脑间质液进行分级分离，并选择具有不超过200kDa或更小的分子量的部分。在一些实施方式中，可溶性LMW tau种类可具有不超过200kDa或更小(包括例如不超过150kDa、不超过100kDa、不超过50kDa或更小)的分子量。
在一些实施方式中，本文所述的组合物可包含试剂，以适应所选定的应用的需要。例如，在一些实施方式中，本文所述的组合物可适合于针对可溶性HMW tau种类产生抗体。因此，在此类实施方式中，组合物可进一步包含用于针对可溶性HMW tau种类产生抗体的佐剂。本文所使用的术语“佐剂”是指当被体外给予个体或动物(例如，小鼠)时，增加个体或动物对给予的抗原(例如，可溶性HMW tau种类)的免疫应答的分子、化合物和/或材料。在个体或动物中，当一些抗原被单独给予时，该抗原具有弱的免疫原性；或者，在引起免疫应答的浓度下，该抗原对个体具有毒性。佐剂可通过使抗原的免疫原性更强来增强个体或动物对抗原的免疫应答，从而增强抗体产生。佐剂作用还可降低个体或动物中实现免疫应答所需的抗原的剂量。常用的佐剂包括但不限于弗氏不完全佐剂(由油包水乳液组成)、弗氏完全佐剂(包含弗氏不完全佐剂的组分，并添加结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)和明矾(alum))。本文所述的HMW tau组合物可缀合至佐剂。缀合至抗原性载体(诸如钥孔血蓝蛋白)还可用于增加本文所述的HMW tau复合物的抗原性。可被缀合至HMW tau的其它抗原性载体蛋白包括：例如似鲍罗螺(Concholepas concholepas)血蓝蛋白(“蓝载体”)、牛血清白蛋白、阳离子化牛血清和卵清蛋白。进一步预期的是，使HMW tau复合物稳定在优先从神经元传递至神经元的HMW形式的处理将使得HMW tau更有可能作为抗原来产生特异性针对tau蛋白的HMW形式(而不是HMW形式或LMW形式中的任一者)的抗体。可使用多种途径来实现HMW tau结构的稳定化。例如，可通过使分离的HMW tau交联，使HMW tau稳定在tau的HMW/突触可传递形式。许多化学交联试剂是已知的并可商购得到的，包括与如下物质发生反应的同双功能交联剂和异双功能交联剂：例如，胺(例如，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯交联剂，包括双琥珀酰亚胺戊二酸酯、双琥珀酰亚胺辛二酸酯、双[磺基琥珀酰亚胺]辛二酸酯、二硫代双[琥珀酰亚胺]丙酸酯，尤其是亚氨酸酯，包括己二亚氨酸二甲酯-2HCl(dimethyladipimidate-2HCl)、辛二亚氨酸二甲酯等)；或巯基(例如，基于马来酰亚胺的交联剂，例如，双马来酰亚胺基乙烷、双马来酰亚胺基己烷、二硫代双马来酰亚胺基乙烷等)。可通过本领域中已知的定制反应条件对交联剂进行调控。在一个实施方式中，相对于非交联的HMW，相对低程度的交联可提供基本的稳定化，从而例如为作为用于筛选分析的靶点或作为抗原提供增强的活性。还可通过例如与表面(例如，塑料、硝化纤维素或尼龙膜)相互作用来稳定HMW tau。在这一形式中，稳定化的HMW tau可作为底物或靶点，用于筛选特异性地结合tau蛋白的HMW复合物形式的试剂。仅作为一个实例，以HMW tau官能化的表面可用于筛查例如展示结合多肽的噬菌体。噬菌体展示构建体文库在本领域中是公知的。可通过首先使噬菌体文库与固定在表面上的LMW tau接触，以扣除包括LMW-tau结合多肽的那些文库成员，来提高获得噬菌体展示HMW tau结合蛋白(基本上不结合LMW tau)的可能性。以这一方式扣除后，然后使文库与固定在不同表面上的HMW tau接触，随后使粘至HMW tau的此类噬菌体分离和增殖。尤其地，固体支持物/表面可包括但不限于硝化纤维素或尼龙膜、亲和柱层析基质、尼龙或其它聚合物珠。
抗可溶性HMW tau种类拮抗性试剂或可溶性HMW tau种类的拮抗剂
与神经元中作为细胞内蛋白的不溶性神经原纤维缠结不同，本文所述的可溶性HMW tau种类是新型的可溶性非纤维状tau聚集体，该聚集体可在细胞外间隙中发现，例如可溶于脑间质液和/或脑脊液。如前所述的，发明人已示出可溶性HMW tau种类优先被神经元摄取并经轴突运输至突触连接的神经元，因此行进中的tau在神经元间散播。通过降低或阻断本文所述的可溶性HMW tau种类的神经元摄取，可防止tau散播。因此，本文在多个方面中提供了：包含可溶性HMW tau种类拮抗性试剂(例如抗体或其抗原结合片段、核酸和小分子)的组合物，用于抑制或降低可溶性HMW tau种类被神经元摄取和/或从神经元经轴突运输至突触连接的神经元；以及其使用方法，用于抑制或降低可溶性HMW tau种类的神经元摄取和与tau传播相关的病理。
本文中可互换使用的术语“tau传播”和“tau散播”是指错误折叠的tau蛋白在神经元间的运输。
本文所使用的“可溶性HMW tau种类拮抗性试剂”或“可溶性HMWtau种类的拮抗剂”是指在由可溶性HMW tau种类介导的一种或多种过程、机制、作用、应答、功能、活动或通路中，抑制或导致或促进定性的或定量的抑制、减少或降低的试剂，例如小分子、抑制性核酸或可溶性HMW tau种类特异性抗体或其抗原结合片段。因此，术语“可溶性HMW tau种类拮抗性试剂”是指此类试剂：所述试剂抑制可溶性HMW tau种类的形成，或者结合至可溶性HMWtau种类、部分地或完全地阻断、减少或防止例如至少约10％或更多(包括例如至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或更多、上至100％)的可溶性HMW tau种类的神经元摄取，和/或在神经元摄取后阻断、减少或防止例如至少约10％或更多(包括例如至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或更多、上至100％)的可溶性HMWtau种类的神经元间传播。
在本文所述这些方面和所有此类方面的一些实施方式中，可溶性HMW tau种类拮抗性试剂不与可溶性低分子量(LMW)tau种类结合。例如，在一些实施方式中，可溶性HMWtau种类拮抗性试剂不与分子量不超过200kDa(包括例如不超过150kDa、不超过100kDa或更低)的可溶性LMW tau种类结合。
就可溶性HMW tau种类拮抗剂而言的本文所使用的术语“试剂”意为任何化合物或物质，例如但不限于小分子、核酸、多肽、肽、药物、离子等。“试剂”可以是任何化学品、实体或部分，包括但不限于合成和天然存在的蛋白实体和非蛋白实体。在一些实施方式中，试剂是核酸、核酸类似物、蛋白、抗体、肽、适体、核酸低聚物、氨基酸或碳水化合物，并且包括但不限于蛋白、寡核苷酸、核酶、DNA酶、糖蛋白、siRNA、脂蛋白、适体以及它们的组合和修饰等。在一些实施方式中，试剂是具有化学部分的小分子。例如，化学部分包括未取代或取代的烷基部分、芳基部分或杂环基部分。可已知化合物具有期望的活性和/或性质(例如，抑制可溶性HMW tau种类的神经元摄取和/或任选的可溶性HMW tau种类的神经元间传播)，或可使用例如筛选方法从不同化合物的文库中选择。
在一些实施方式中，可溶性HMW tau种类拮抗性试剂可特异性地结合本文所述的非纤维状可溶性HMW tau种类(例如具有至少约500kDa的分子量)并降低或抑制本文所述的非纤维状可溶性HMW tau种类的神经元摄取。在一些实施方式中，可溶性HMW tau种类可具有至少约669kDa或更高的分子量。在一些实施方式中，可溶性HMW tau种类可具有约669kDa至约1000kDa的分子量。在一些实施方式中，非纤维状可溶性HMW tau种类可处于颗粒形式。粒径可随tau种类的分子量而变化。在一些实施方式中，粒径范围可为约10nm至约30nm。
在一些实施方式中，可溶性HMW tau种类拮抗性试剂可特异性地结合本文所述的可溶性HMW tau种类的至少一种或更多种磷酸化形式并降低或抑制本文所述的可溶性HMWtau种类的至少一种或更多种磷酸化形式的神经元摄取。
在一些实施方式中，可溶性HMW tau种类拮抗性试剂可特异性地结合本文所述的可溶于水性溶液和/或缓冲溶液中的HMW tau种类并降低或抑制本文所述的可溶于水性溶液和/或缓冲溶液中的HMW tau种类的神经元摄取。例如，在一些实施方式中，可溶性HMWtau种类拮抗性试剂可特异性地结合本文所述的可溶于磷酸盐缓冲盐水中的HMW tau种类并降低或抑制本文所述的可溶于磷酸盐缓冲盐水中的HMW tau种类的神经元摄取。在一些实施方式中，可溶性HMW tau种类拮抗性试剂可特异性地结合本文所述的可溶于生物流体(例如，脑间质液或脑脊液)中的HMW tau种类并降低或抑制本文所述的可溶于生物流体(例如，脑间质液或脑脊液)中的HMW tau种类的神经元摄取。
可溶性HMW tau种类拮抗性抗体及其抗原结合片段：本文在一些方面还提供了包含可溶性HMW tau种类拮抗性抗体的组合物，所述拮抗性抗体特异性地结合可溶性HMW tau种类并且不结合可溶性低分子量(LMW)tau种类。
用于本文所述的组合物和方法的可溶性HMW tau种类抗体拮抗剂包括：完全免疫球蛋白、免疫球蛋白的抗原结合片段、以及包含免疫球蛋白的抗原结合结构域的抗原结合片段。本文所使用的免疫球蛋白的“抗原结合片段”包括例如Fab、Fab’、F(ab’)2、scFv和dAb。已开发出修饰的抗体形式，该形式保留了结合特异性、但具有可能是所期望的其它特性，包括例如双特异性、多价(多于两个结合位点)以及紧凑的尺寸(例如，仅结合结构域)。
由于可以多种方式对抗体进行修饰，术语“抗体”应解释为涵盖了具有抗体结合结构域的任何特异性结合成员或物质，所述抗体结合结构域具有对可溶性HMW tau种类而言所需的特异性。因此，这一术语涵盖了抗体片段、衍生物、功能等效物和抗体同系物(homologues)，包括任何含有HMW tau特异性免疫球蛋白结合结构域的多肽，不论是天然的还是整体或部分合成的。因此，含有融合至另一多肽的免疫球蛋白结合结构域或其等效物的嵌合分子被包括在内。EP-A-0120694、EP-A-0125023、美国专利号4,816,397和4,816,567中描述了嵌合抗体的克隆和表达。
因此，在一些方面，本文提供了特异性针对可溶性HMW tau种类的可溶性HMW tau种类拮抗性抗体或其抗体片段，其中，可溶性HMW tau种类拮抗性抗体或其抗体片段特异性地结合至可溶性HMW tau种类，并降低或抑制可溶性HMW tau种类的生物活性(例如被神经元摄取和/或诱导神经元间传播)。在一些实施方式中，可溶性HMW tau种类是人可溶性HMWtau种类。
本文所使用的“可溶性HMW tau种类抗体”是以足够的亲和性和特异性结合至可溶性HMW tau种类、但基本上不结合可溶性LMW tau种类的抗体。选定的抗体通常对可溶性HMWtau种类具有结合亲和性，例如，抗体可以10-5M至10-10M或更低的KD值结合人可溶性HMW tau种类。可例如通过基于表面等离子共振的分析(例如在PCT申请公开号WO2005/012359中描述的BIAcore分析)、酶联免疫吸附分析(ELISA)和竞争分析(例如RIA竞争分析)，对抗体亲和性进行测定。相对于针对可溶性LMW tau蛋白的KD，本文所述的HMW tau特异性抗体以低出至少100倍的KD结合可溶性HMW tau蛋白，优选低出至少103倍、低出104倍或甚至低出105倍。还可例如通过竞争分析对相对亲和性进行评价。
在本文所述的一些方面，在靶向和干扰可溶性HMW tau种类活性参与的疾病或病症中，可将可溶性HMW tau种类抗体用作治疗剂。另外，可使可溶性HMW tau种类抗体接受其它生物活性分析，例如以评价其作为治疗剂的有效性、或者其作为诊断辅助剂的有效性等。此类分析在本领域中是已知的，并依赖于靶抗原和抗体的预期用途。实例包括：实施例1中所述的神经元摄取可溶性HMW tau种类的测量；抗体依赖性细胞毒性(ADCC)分析和补体介导的细胞毒性(CDC)分析(美国专利号5,500,362)；激动剂活性分析或造血作用分析(参见WO 95/27062)。实施例部分中描述了可用于评估可溶性HMW tau种类抗体的其它生物活性分析，例如使用三腔室微流体装置测量可溶性HMW tau种类的神经元间传播。
本文所使用的“阻断”抗体或抗体“拮抗剂”指抑制或降低其所结合的抗原的生物活性的抗体。在此上下文中，“降低”是指相关生物活性(例如，HMW tau的神经元间传递)降低至少50％，例如降低至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或更多。例如，可溶性HMWtau种类拮抗性抗体与可溶性HMW tau种类结合，并抑制可溶性HMW tau种类例如被神经元摄取的能力和/或参与到神经元间传播中的能力。尽管100％抑制不一定是达到治疗益处所必需的，在一些实施方式中，阻断抗体或拮抗性抗体完全抑制了本文所述的可溶性HMW tau种类的生物活性。
因此，在本文所述的方法和组合物中有用的可溶性HMW tau种类抗体或其抗体片段包括以足够的亲和性和特异性结合至可溶性HMW tau种类(即对于可溶性HMW tau种类具有特异性)、并能降低或抑制可溶性HMW tau种类的生物活性(特别是可溶性HMW tau种类被神经元摄取和/或诱导神经元间传播的能力)的任何抗体或其抗体片段。
本文所述的“抗原”是被抗体或其抗原结合片段的高变区结合位点结合的分子。通常，抗原被抗体配体结合并能引发体内抗体应答。抗原可以是多肽、蛋白、核酸或其它分子。在常规抗体及其片段的情况中，由高变环(L1、L2、L3和H1、H2、H3)定义的抗原结合位点能结合至抗原。
本文所使用的“表位”可从邻接的氨基酸形成，或可从通过蛋白的三级折叠而紧靠的非邻接氨基酸形成。在暴露至变性溶剂时，从邻接的氨基酸形成的表位通常得以保留，而在用变性溶剂处理时，通过三级折叠形成的表位通常会丢失。表位通常包含至少3个、并更经常地包含至少5个、约9个或约8个-10个处于独特空间构象的氨基酸。“表位”包含由免疫球蛋白VH/VL对常规结合的结构单元。表位定义抗体的最小结合位点，因而代表了抗体的特异性靶点。在单域抗体的情况中，表位代表由孤立的(in isolation)可变结构域结合的结构单元。术语“抗原决定簇”和“表位”还可在本文中互换使用。
在本文所述方面的一些实施方式中，可溶性HMW tau种类拮抗性抗体是单克隆抗体。本文所用的术语“单克隆抗体”是指从基本上均质的抗体群获得的抗体，即，除了能够以微量存在的可能的天然存在的突变之外，构成该群的各抗体是相同的。针对单一抗原，单克隆抗体是高度特异性的。此外，与多克隆抗体制剂(通常包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体)相反，各单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。修饰语“单克隆”不应解释为需要通过任何特定方法来生成抗体。例如，根据本文所述的多个方面使用的单克隆抗体可通过由Kohler等，Nature 256:495(1975)首次描述的杂交瘤方法来制备，或者可通过重组DNA方法来制备(参见例如美国专利号4,816,567)。也可使用例如Clackson等，Nature352:624-628(1991)或Marks等，J.Mol.Biol.222:581-597(1991)中描述的技术从噬菌体抗体文库中分离“单克隆抗体”。
本文所述的可溶性HMW tau种类拮抗性单克隆抗体特定地包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)以及此类抗体的片段，其中，重链和/或轻链的一部分与源自于特定物种或属于特定抗体类或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的剩余部分与源自于另一物种或属于另一抗体类或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，只要它们展现期望的生物学活性。(美国专利号4,816,567；以及Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:6851-6855(1984))。
非人(例如鼠类)抗体的“人源化”形式是嵌合抗体，其含有源自于非人免疫球蛋白的最小序列。大多数情况下，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中，来自受体的高变区的残基被来自非人物种(供体抗体)(如小鼠、大鼠、兔或者非人灵长类动物)的高变区的具有期望的特异性、亲和性和能力的残基替换。在一些实例中，人免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基被相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可包含在受体抗体或者供体抗体中未发现的残基。进行此类修饰以进一步优化抗体性能。一般而言，人源化抗体基本上包含至少一个、通常两个可变结构域的全部，其中，高变环的全部或者基本上全部对应于非人免疫球蛋白的高变环，且FR区的全部或者基本上全部是人免疫球蛋白序列的FR区。人源化抗体还任选地包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常包含人免疫球蛋白恒定区的至少一部分。进一步的详细描述参见Jones等，Nature 321:522-525(1986)；Riechmann等，Nature332:323-329(1988)；以及Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。
本文所使用的“人抗体”是指具有如下氨基酸序列的抗体：与人产生的抗体的氨基酸序列相对应的氨基酸序列、和/或使用本文公开的用于产生人抗体的任何技术产生的氨基酸序列。人抗体的这一定义特定地排除了包含非人抗原结合残基的人源化抗体。人抗体可使用本领域已知的多种技术来产生。在一个实施方式中，人抗体选自于噬菌体文库，其中所述噬菌体文库表达人抗体(Vaughan等，Nature Biotechnology 14:309-314(1996)；Sheets等，Proc.Natl.Acad.Sci.95:6157-6162(1998)；Hoogenboom和Winter，J.Mol.Biol.，227:381(1991)；Marks等，J.Mol.Biol.，222:581(1991))。人抗体还可通过将人免疫球蛋白基因座引入转基因动物(例如，其中的内源性小鼠免疫球蛋白基因已经部分或完全失活的小鼠)来产生。激发(challenge)后，观察到人抗体产生，这在所有方面均与在人中看到的极为相似，包括基因重排、组装和抗体谱。在例如美国专利号5,545,807、5,545,806、5,569,825、5,625,126、5,633,425、5,661,016中以及下列科学出版物中对这一途径进行了描述：Marks等，Bio/Technology10:779-783(1992)；Lonberg等，Nature 368:856-859(1994)；Morrison，Nature 368:812-13(1994)；Fishwild等，Nature Biotechnology 14:845-51(1996)；Neuberger，Nature Biotechnology 14:826(1996)；Lonberg和Huszar，Intern.Rev.Immunol.13:65-93(1995)。或者，可经由针对靶抗原产生抗体的人B淋巴细胞的永生化来制备人抗体(此类B淋巴细胞可从个体回收或者可已经在体外免疫)。参见例如Cole等，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，第77页(1985)；Boerner等，J.Immunol.，147(1):86-95(1991)；以及美国专利号5,750,373。
在这些方面的其它实施方式中，可溶性HMW tau种类拮抗性抗体是可溶性HMW tau种类特异性抗体片段。本文所使用的术语“抗体片段”是指仅包含完整抗体的一部分的蛋白片段，通常包含完整抗体的抗原结合位点，从而保留结合抗原的能力。本定义所涵盖的抗体片段的实例包括：(i)Fab片段，具有VL结构域、CL结构域、VH结构域和CH1结构域；(ii)Fab'片段，其是在CH1结构域的C-末端处具有一个或多个半胱氨酸残基的Fab片段；(iii)Fd片段，具有VH结构域和CH1结构域；(iv)Fd'片段，具有VH结构域和CH1结构域以及CH1结构域的C-末端处的一个或多个半胱氨酸残基；(v)Fv片段，具有抗体单臂的VL结构域和VH结构域；(vi)dAb片段(Ward等，Nature 341，544-546(1989))，其由VH结构域组成；(vii)分离的CDR区域；(viii)F(ab')2片段，包含在铰链区通过二硫桥连接的两个Fab'片段的二价片段；(ix)单链抗体分子(例如，单链Fv；scFv)(Bird等，Science 242:423-426(1988)；以及Huston等，PNAS(USA)85:5879-5883(1988))；(x)具有两个抗原结合位点的“双功能抗体(diabodies)”，包含与同一多肽链中的轻链可变结构域(VL)相连的重链可变结构域(VH)(参见例如EP 404,097；WO 93/11161；以及Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90:6444-6448(1993))；(xi)包含串联的Fd片段对(VH-CH1-VH-CH1)的“线性抗体”，其与互补的轻链多肽一起形成抗原结合区对(Zapata等，Protein Eng.8(10):1057-1062(1995)；以及美国专利号5,641,870)。
因此，在一些此类实施方式中，可溶性HMW tau种类拮抗性抗体片段是包含VL结构域、CL结构域、VH结构域和CH1结构域的Fab片段。在一些实施方式中，可溶性HMW tau种类拮抗性抗体片段是Fab'片段，该片段是在CH1结构域的C-末端处具有一个或多个半胱氨酸残基的Fab片段。在一些实施方式中，可溶性HMW tau种类拮抗性抗体片段是包含VH结构域和CH1结构域的Fd片段。在一些实施方式中，可溶性HMW tau种类拮抗性抗体是包含VH结构域和CH1结构域以及CH1结构域的C-末端处的一个或多个半胱氨酸残基的Fd'片段。在一些实施方式中，可溶性HMW tau种类拮抗性抗体片段是包含抗体单臂的VL结构域和VH结构域的Fv片段。在一些实施方式中，可溶性HMW tau种类拮抗性抗体片段是包含VH结构域的dAb片段。在一些实施方式中，可溶性HMW tau种类拮抗性抗体片段包含分离的CDR区域。在一些实施方式中，人可溶性HMW tau种类拮抗性抗体片段是包含二价片段的F(ab')2片段，该二价片段包含在铰链区通过二硫桥连接的两个Fab'片段。在一些实施方式中，可溶性HMW tau种类拮抗性抗体片段是单链抗体分子，例如单链Fv。在一些实施方式中，可溶性HMW tau种类拮抗性抗体片段是包含两个抗原结合位点的双功能抗体，该抗体包含与同一多肽链中的轻链可变结构域(VL)相连的重链可变结构域(VH)。在一些实施方式中，可溶性HMW tau种类拮抗性抗体片段是包含串联的Fd片段对(VH-CH1-VH-CH1)的线性抗体，其与互补的轻链多肽一起形成抗原结合区对。
本领域技术人员可使用公知的方法产生可溶性HMW tau种类的抗体。通过用抗原(例如可溶性HMW tau种类)或其片段进行免疫接种可容易地在诸如兔或小鼠的动物中产生抗体。经免疫的小鼠对于提供用于杂交瘤生产的B细胞来源而言特别有用，杂交瘤转而被培养以产生大量单克隆抗体。抗体生产方法例如在Harlow等编，Antibodies：A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory，New York(1988)中被详细描述，在此通过引用的方式将其整体并入本文。可溶性HMW tau种类的多克隆拮抗性抗体和单克隆拮抗性抗体都可用于本文所述的方法中。在一些实施方式中，在条件要求对于特定蛋白而言具有提高的特异性的情况下，使用可溶性HMW tau种类的单克隆拮抗性抗体。
其它抗体修饰。在这些方面的一些实施方式中，对于本文所述的可溶性HMW tau种类而言具有特异性的抗体或其抗体片段的氨基酸序列修饰是可预期的。例如，可期望改善抗体的结合亲和性和/或其它生物学性质。通过将合适的核苷酸变化引入抗体核酸或通过肽合成来制备抗体的氨基酸序列变体。此类修饰包括例如从抗体的氨基酸序列中删除残基、和/或在抗体的氨基酸序列中插入残基、和/或置换抗体的氨基酸序列中的残基。只要最终构建体具有期望的特性，进行删除、插入和置换的任何组合以获得最终构建体。氨基酸变化还可以改变抗体的翻译后过程，例如改变糖基化位点的数量或位置。
氨基酸序列插入包括：长度范围为一个残基至含有上百个残基的多肽的氨基末端和/或羧基末端融合，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包括具有N-末端甲硫氨酰残基的抗体、或融合至细胞毒性多肽的抗体。抗体分子的其它插入变体包括使抗体的N-末端或C-末端融合至酶(例如，用于抗体导向的酶前药治疗(ADEPT))或延长该抗体的血清半衰期的多肽。
变体的另一类型是氨基酸置换变体。这些变体在抗体分子中有至少一个氨基酸残基被不同残基替换。就置换诱变而言最感兴趣的位点包括高变区，但就用于本文所述的可溶性HMW tau种类拮抗性抗体或其抗体片段而言，FR改变也是可预期的。
通过选择在对如下方面进行维持的作用中显著不同的置换来完成对可溶性HMWtau种类而言具有特异性的抗体或其抗体片段的生物学性质的实质性修饰：(a)置换区域中的多肽骨架的结构，例如作为折叠构象或螺旋构象；(b)靶位点处分子的电荷或疏水性；或(c)侧链的体积(bulk)。可根据侧链性质的相似性对氨基酸进行分组(A.L.Lehninger，Biochemistry，第二版，第73-75页，Worth Publishers，纽约(1975))：(1)非极性的：Ala(A)、Val(V)、Leu(L)、Ile(I)、Pro(P)、Phe(F)、Trp(W)、Met(M)；(2)不带电荷、极性的：Gly(G)、Ser(S)、Thr(T)、Cys(C)、Tyr(Y)、Asn(N)、Gln(Q)；(3)酸性的：Asp(D)、Glu(E)；(4)碱性的：Lys(K)、Arg(R)、His(H)。
或者，可基于共同的侧链性质对天然存在的残基进行分组：(1)疏水性的：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；(2)中性、亲水性的：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；(3)酸性的：Asp、Glu；(4)碱性的：His、Lys、Arg；(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；(6)芳香族的：Trp、Tyr、Phe。非保守性置换将需要用这些类别之一的成员交换另一类别的成员。
通常可将未涉及维持可溶性HMW tau种类抗体或其抗体片段的适当构象的任何半胱氨酸残基用丝氨酸置换，以提高分子的氧化稳定性并防止异常的交联。相反，可将半胱氨酸键加入抗体以提高其稳定性(特别是在抗体是诸如Fv片段的抗体片段的情况中)。
置换变体特别优选的类型涉及置换母体抗体的一个或多个高变区残基。通常，选定用于进一步开发的所得变体相对于该变体从其中产生的母体抗体而言具有改进的生物学性质。用于产生此类置换变体的简便方式涉及使用噬菌体展示进行的亲和性成熟。
抗体的另一类氨基酸变体改变了抗体的原始糖基化模式。改变意味着删除在抗体中发现的一个或多个碳水化合物部分(carbohydrate moiety)和/或添加抗体中不存在的一个或多个糖基化位点。
抗体的糖基化通常是N-连接的或O-连接的。N-连接是指碳水化合物部分附着于天冬酰胺残基的侧链。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸(其中X是除脯氨酸以外的任何氨基酸)是用于将碳水化合物部分酶促附着于天冬酰胺侧链的识别序列。因此，多肽中此类三肽序列中任一者的存在产生了潜在的糖基化位点。O-连接的糖基化是指将糖类N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖之一附着于羟基氨基酸，最常见的是丝氨酸或苏氨酸，但也可使用5-羟脯氨酸或5-羟赖氨酸。
向可溶性HMW tau种类抗体或其抗体片段添加糖基化位点通过改变氨基酸序列以使其包含上述三肽序列中的一个或多个来完成(用于N-连接的糖基化位点)。所述改变还可通过向原始抗体的序列中添加或置换为一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基来进行(用于O-连接的糖基化位点)。
若抗体包含Fc区域，则可改变附着其上的碳水化合物。例如，美国专利申请号US2003/0157108Al，Presta,L.中描述了具有缺乏岩藻糖的附着于抗体Fc区域的成熟碳水化合物结构的抗体。还参见US 2004/0093621A1(Kyowa Hakko Kogyo Co.，Ltd)。WO03/011878(Jean-Mairet等)和美国专利号6,602,684(Umana等)中引用了碳水化合物中的等分(bisecting)N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)附着于抗体Fc区域的抗体。WO97/30087(Patel等)中报道了寡糖中的至少一个半乳糖残基附着于抗体Fc区域的抗体。关于具有改变的附着于抗体Fc区域的碳水化合物的抗体，还参见WO98/58964(Raju,S.)和WO99/22764(Raju,S.)。
为了延长本文所述的可溶性HMW tau种类抗体的血清半衰期，例如如美国专利号5,739,277中所述的，可将补救受体结合表位(salvage receptor binding epitope)并入抗体(尤其是抗体片段)。如本文所使用的术语“补救受体结合表位”是指IgG分子(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)的Fc区域中负责延长IgG分子体内血清半衰期的表位。
WO00/42072(Presta,L.)和US2005/0014934A1(Hinton等)中描述了具有对新生儿Fc受体(FcRn)改进的结合和延长的半衰期的抗体。此类抗体包含其中具有一处或多处置换的Fc区域，所述置换改进了Fc区域与FcRn的结合。
编码抗体的氨基酸序列变体的核酸分子通过本领域已知的多种方法来制备。此类方法包括但不限于从天然来源分离(在天然存在的氨基酸序列变体的情况中)，或者通过对早期制备的抗体的变体或非变体形式进行寡核苷酸介导的(或定点)诱变、PCR诱变和盒式诱变来制备。
在一些实施方式中，还可将本文所述的可溶性HMW tau种类抗体及其抗体片段配制成免疫脂质体。通过本领域已知的方法来制备含有抗体的脂质体，例如Epstein等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82:3688(1985)；Hwang等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77:4030(1980)；以及美国专利号4,485,045和4,544,545中描述的方法。美国专利号5,013,556中公开了具有延长的循环时间的脂质体。
特别有用的脂质体可用含有磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG衍生化磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂质组合物例如通过反相蒸发法生成。将脂质体挤过具有限定孔径的过滤器，以产生具有期望直径的脂质体。可将本文所述的可溶性HMW tau种类抗体的Fab'片段经由二硫化物交换反应缀合至如在Martin等，J.Biol.Chem.257:286-288(1982)中所描述的脂质体。任选地在脂质体中包含例如用于治疗tau病变的治疗剂。参见Gabizon等，J.National CancerInst.81(19)1484(1989)。
可溶性HMW tau种类的核酸抑制剂。在本文所述组合物和方法的一些实施方式中，可溶性HMW tau种类拮抗性试剂是特异性靶向微管相关蛋白tau(MAPT)且可用于抑制体内MAPT表达的RNA干扰试剂。RNA干扰(RNAi)使用靶向信使RNA(编码靶多肽)的小干扰RNA(siRNA)双链以用于选择性降解，而且RNA干扰是用于抑制选定的靶多肽表达的有力途径。siRNA依赖性的基因表达的转录后沉默参与在siRNA指导的位点处对靶信使RNA分子的切割。本文所使用的“RNA干扰(RNAi)”是指进化保守的过程，其中，引入或表达与靶基因相同或高度相似的序列的RNA导致转录自该靶基因的信使RNA(mRNA)的序列特异性降解或特异性转录后基因沉默(PTGS)(参见Coburn,G.和Cullen,B.(2002)J.of Virology 76(18):9225)，从而抑制靶基因的表达。在一些实施方式中，RNA干扰试剂或siRNA是双链RNA(dsRNA)。已在植物、无脊椎动物和哺乳动物细胞中对这一过程进行了描述。在自然界中，RNAi通过dsRNA特异性核酸内切酶Dicer起始，Dicer促进长dsRNA持续切割为双链片段(称为siRNA)。siRNA被并入识别和切割靶mRNA的蛋白复合物(称为“RNA诱导的沉默复合物”或“RISC”)。RNAi还可通过引入核酸分子(例如，合成的siRNA或RNA干扰试剂)起始，以抑制或沉默靶基因的表达。本文所使用的“抑制靶基因表达”包括与其中未诱导RNA干扰的情况相比，由靶基因编码的蛋白或靶基因的水平、或蛋白活性、或表达中的任何降低。与由未被RNA干扰试剂靶向的靶基因编码的蛋白的水平或活性、或该靶基因的表达相比，所述降低将为至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、或至少99％或更多。
本文所使用的siRNA还包括小发夹(亦称为茎环)RNA(shRNA)。在一些实施方式中，此类shRNA由短的(例如，约19个-约25个核苷酸)反义链、接着是约5个-约9个核苷酸的核苷酸环、以及类似的正义链构成。或者，在其它实施方式中，正义链可先于核苷酸环结构，反义链可在其后。此类shRNA可包含于质粒、逆转录病毒和慢病毒中，并从例如pol III U6启动子或另一启动子表达(参见例如Stewart等，(2003)RNA Apr，9(4):493-501，通过引用的方式将其整体并入本文)。RNA干扰试剂的靶基因或序列可以是细胞基因或基因组序列，例如，人MAPT基因组序列。siRNA可基本上与靶基因或基因组序列或其片段(即MAPT基因或mRNA)同源。将此上下文中所使用的术语“同源(homologous)”定义为与靶MAPT mRNA或其片段基本上相同、充分互补或类似，以实现靶MAPT的RNA干扰。除了天然RNA分子之外，适于抑制或干扰靶序列表达的RNA包括RNA衍生物和类似物。优选地，siRNA与其靶点相同。siRNA优选只靶向一个序列。
可通过例如表达谱对每种RNA干扰试剂(例如siRNA)的潜在脱靶效应进行筛选。此类方法为本领域技术人员已知的，并例如在Jackson等，Nature Biotechnology 6:635-637，2003中进行了描述。除表达谱外，还可在序列数据库中对潜在靶序列的类似序列进行筛选，以识别可能具有脱靶效应的潜在序列。例如，根据Jackson等(同前)，15个或也许少至11个邻接核苷酸的序列同一性足以指导非靶向转录物的沉默。因此，可通过任何已知的序列比较方法(例如BLAST)，使用序列同一性分析对提议的siRNA进行初步筛选，以避免潜在的脱靶沉默。对siRNA序列进行选择，以使siRNA的反义(指导)链向RISC中的摄取最大化，从而使RISC靶向人GGT mRNA以用于降解的能力最大化。这可通过筛选在反义链的5’末端处具有最低的结合自由能的序列来完成。较低的自由能使得siRNA双链的反义链的5’-端的解旋增强，从而确保反义链被RISC摄取并指导人MAPT mRNA的序列特异性切割。
siRNA分子不必限于仅包含RNA的分子，但例如进一步涵盖了化学修饰的核苷酸和非核苷酸，还包括其中的核糖分子被另一糖分子或执行类似功能的分子取代的分子。此外，可在核苷酸残基之间使用非天然连接，例如硫代磷酸连接。可用报告基团(例如荧光团)的反应性官能团将RNA链衍生化。特别有用的衍生物是在RNA链的末端(通常在正义链的3’末端)进行修饰。例如，可用多种基团容易地和选择性地将3’末端处的2’-羟基衍生化。其它有用的RNA衍生物并入了具有修饰的碳水化合物部分的核苷酸，例如2’O-烷基化残基或2’-O-甲基核糖基衍生物和2’-O-氟代核糖基衍生物。还可对RNA碱基进行修饰。可使用对抑制或干扰靶序列表达有用的任何修饰的碱基。例如，可并入诸如5-溴尿嘧啶和5-碘尿嘧啶的卤化碱基。碱基还可被烷基化，例如，可并入7-甲基鸟苷以取代鸟苷残基。还可并入产生成功抑制作用的非天然碱基。最优选的siRNA修饰包括：2’-脱氧-2’-氟尿苷或锁核酸(LNA)核苷酸以及含有磷酸二酯或不同数量的硫代磷酸连接的RNA双链。此类修饰是本领域技术人员已知的，并例如在Braasch等，Biochemistry，42:7967-7975，2003中有所描述。siRNA分子的大部分有用修饰可使用基于反义寡核苷酸技术建立的化学来引入。优选地，修饰涉及最小的2’-O-甲基修饰，优选排除此类修饰。修饰还优选排除siRNA的游离5’-羟基基团的修饰。
在一些实施方式中，在药学上可接受的载体中对靶向MAPT的RNA干扰试剂进行递送或给予。可向药学上可接受的载体加入诸如脂质体的额外的载体试剂。在另一实施方式中，在药学上可接受的载体中通过编码小发夹RNA(shRNA)的载体将RNA干扰试剂递送至个体器官中的细胞。在转录后，shRNA通过细胞转换成能够靶向MAPT的siRNA。
在一些实施方式中，载体是可调节的载体，例如四环素诱导型载体。可使用例如在Wang等，Proc.Natl.Acad.Sci.100:5103-5106中描述的使用pTet-On载体(BD BiosciencesClontech，Palo Alto，CA)的方法。在一些实施方式中，在颅内注射(例如水流动力学(hydrodynamic)注射)后，本文所述方法中使用的RNA干扰试剂在体内被神经元主动摄取，无需使用载体，说明RNA干扰试剂有效的体内递送。递送siRNA的一种方法是靶器官的血液供给血管的导管插入术。还可采用递送RNA干扰试剂(例如本文所述方法中使用的siRNA或shRNA)的其它策略，诸如例如通过载体(例如质粒或病毒载体，例如慢病毒载体和/或腺相关病毒(AAV)载体)递送。可按照例如Xiao-Feng Qin等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，100:183-188中所描述的使用此类载体。其它递送方法包括通过使RNA干扰试剂与碱性(basic)肽(例如，TAT肽片段)缀合或混合，与阳离子脂质混合或配制成颗粒，使用碱性肽递送RNA干扰试剂(例如，本文所述的靶向MAPT的siRNA)。RNA干扰试剂(例如靶向MAPT mRNA的siRNA)可单独递送或与其它RNA干扰试剂(例如，siRNA，诸如例如针对其它细胞基因的siRNA)联合递送。
可使用本领域技术人员已知的多种技术来产生合成的siRNA分子，包括shRNA分子。例如，可使用本领域已知的方法(例如，使用适当保护的核糖核苷亚磷酰胺和常规DNA/RNA合成器)化学合成或重组生产siRNA分子(参见例如Elbashir，S.M.等(2001)Nature411:494-498；Elbashir，S.M.,W.Lendeckel和T.Tuschl(2001)Genes&Development 15:188-200；Harborth,J.等，(2001)J.Cell Science 114:4557-4565；Masters,J.R.等，(2001)Proc.Natl.Acad.Sci.，USA98:8012-8017；以及Tuschl,T.等，(1999)Genes&Development 13:3191-3197)。或者，存在一些可用的商业RNA合成供应商，包括但不限于Proligo(Hamburg，德国)、Dharmacon Research(Lafayette，CO，美国)、Pierce Chemical(Perbio Science的部分，Rockford，IL，美国)、Glen Research(Sterling，VA，美国)、ChemGenes(Ashland，MA，美国)以及Cruachem(Glasgow，UK)。因此，siRNA分子并不过于难以合成且易于以适合于RNAi的质量提供。另外，可使dsRNA作为由质粒载体、逆转录病毒和慢病毒编码的茎环结构表达(Paddison,P.J.等(2002)Genes Dev.16:948-958；McManus,M.T.等(2002)RNA8:842-850；Paul,C.P.等(2002)Nat.Biotechnol.20:505-508；Miyagishi,M.等(2002)Nat.Biotechnol.20:497-500；Sui,G.等(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.，USA99:5515-5520；Brummelkamp,T.等(2002)Cancer Cell 2:243；Lee,N.S.等(2002)Nat.Biotechnol.20:500-505；Yu,J.Y.等(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.，USA99:6047-6052；Zeng,Y.等(2002)Mol.Cell 9:1327-1333；Rubinson,D.A.等(2003)Nat.Genet.33:401-406；Stewart,S.A.等(2003)RNA9:493-501)。此类载体通常在dsRNA上游具有polIII启动子，并且可分别表达正义RNA链和反义RNA链和/或将其表达为发夹结构。在细胞中，Dicer将短发夹RNA(shRNA)加工成有效的siRNA。
用于本文所述组合物和方法中的siRNA分子的靶向区域可选自于给定的靶基因序列(例如，MAPT编码序列)，该靶基因序列开始于起始密码子下游的约25个至50个核苷酸、约50个至75个核苷酸、或约75个至100个核苷酸。核苷酸序列可包含5’UTR或3’UTR和起始密码子附近的区域。还可将序列数据库(包括但不限于NCBI、BLAST、Derwent和GenSeq)的分析以及诸如的商业可得的寡合成公司用于针对EST文库来选择siRNA序列，以确保只有一个基因被靶向。
RNA干扰试剂的递送。将RNA干扰试剂(例如siRNA)或包含RNA干扰试剂的载体递送至靶细胞(例如，淋巴细胞或其它期望的靶细胞)以用于摄取的方法包括：注射含有RNA干扰试剂(例如，靶向MAPT的siRNA)的组合物、或直接使细胞(例如，淋巴细胞)与含有RNA干扰试剂(例如，靶向MAPT的siRNA)的组合物接触。在其它实施方式中，可经由例如水流动力学注射或导管插入术将RNA干扰试剂(例如，靶向MAPT的siRNA)直接注入受试者的脑或任何神经元。可通过单次注射或两次以上注射进行给予。在药学上可接受的载体中递送RNA干扰试剂。可同时使用一种或多种RNA干扰试剂。
在一些实施方式中，用RNA干扰靶向特定细胞，限制了由RNA干扰的非特异性靶向引起的RNA干扰的潜在副作用。该方法可使用例如用于将RNA干扰有效递送到细胞中的包含细胞靶向部分以及RNA干扰结合部分的融合分子或复合物。例如，当与siRNA混合时，抗体-鱼精蛋白融合蛋白与siRNA结合，并选择性将siRNA递送到表达被抗体识别的抗原的细胞中，仅在表达抗原的此类细胞中导致基因表达的沉默。siRNA结合部分或诱导RNA干扰的分子的结合部分是蛋白或核酸结合结构域或蛋白的片段，且该结合部分被融合至靶向部分的一部分。靶向部分的位置既可处于构建体的羧基末端或氨基末端，也可处于融合蛋白中间。如在Xia,H.等((2002)Nat Biotechnol 20(10):1006)中描述的，还可采用病毒介导的递送机制来将siRNA体外和体内递送至细胞。如在Rubinson,D.A.等((2003)Nat.Genet.33:401-406)和Stewart,S.A.等((2003)RNA9:493-501)中描述的，还可采用shRNA的质粒介导的递送机制或病毒介导的递送机制来将siRNA体外和体内递送至细胞。可连同执行下列活性中的一种或多种的组分引入靶向MAPT的RNA干扰试剂(例如siRNA或shRNA)：增强神经元对RNA干扰试剂(例如siRNA)的摄取；抑制单链退火；稳定单链；或以其它方式促进向靶神经元的递送以及增加靶MAPT的抑制。特定RNA干扰试剂的剂量是实现特定靶基因的RNA干扰(例如翻译后基因沉默(PTGS))所需的量，从而导致靶基因表达的抑制或靶基因编码的蛋白的水平或活性的抑制。
可溶性HMW tau种类的小分子抑制剂。在本文所述组合物和方法的一些实施方式中，可溶性HMW tau种类拮抗性试剂是特异性靶向可溶性HMW tau种类、并可用于抑制可溶性HMW tau种类被神经元摄取和/或诱导神经元间传播的小分子拮抗剂或试剂。
本文所使用的术语“小分子”是指化学试剂，所述化学试剂可包括但不限于：肽、拟肽、氨基酸、氨基酸类似物、多核苷酸、多核苷酸类似物、适体、核苷酸、核苷酸类似物、具有小于约10,000克/摩尔的分子量的有机化合物或无机化合物(例如，包括杂有机化合物和有机金属化合物)、具有小于约5,000克/摩尔的分子量的有机化合物或无机化合物、具有小于约1,000克/摩尔的分子量的有机化合物或无机化合物、具有小于约500克/摩尔的分子量的有机化合物或无机化合物、以及此类化合物的盐、酯和其它药学上可接受的形式。
在一些实施方式中，可溶性HMW tau种类的小分子拮抗剂选择性地结合至可溶性HMW tau种类，并且基本上不结合可溶性低分子量(LMW)tau种类。本文所使用的“选择性地结合”或“特异性地结合”是指本文所述的可溶性HMW tau种类拮抗剂以10-5M(10000nM)以下(例如，10-6M以下、10-7M以下、10-8M以下、10-9M以下、10-10M以下、10-11M以下或10-12M以下)的KD结合至可溶性HMW tau种类多肽的能力。例如，如果本文所述的拮抗剂(小分子、抗体或其它)以10-5M以下的KD结合至可溶性HMW tau种类多肽，但基本上不结合至其它分子或相关同系物，则认为该试剂特异性地结合可溶性HMW tau种类多肽。在一些实施方式中，就阻断tau病理传播的作用而言，特异性地结合tau(无论是HMW tau或LMW tau)的试剂是可预期的。然而，如本文所述，优选试剂或拮抗剂(无论是小分子、抗体或其它)结合至HMW tau且基本上不结合至LMW tau。“基本上不”意为例如通过竞争分析或通过本领域已知的其它方式所测定的就HMW tau而言的KD比就LMW tau而言的KD低至少102倍，优选低至少103倍、低至少104倍、低至少105倍或更低。特异性结合可受到例如所使用的拮抗剂的浓度以及所使用的拮抗剂的亲和性和亲合性的影响。本领域的普通技术人员能够使用任何合适的方法来确定合适的条件(在该条件下本文所述的拮抗剂选择性地结合)，所述方法例如在本文实施例中所述的那些方法，例如在测量可溶性HMW tau种类的神经元摄取的合适分析中对可溶性HMW tau种类拮抗剂的滴定。
MAPT特异性核酸酶：在本文所述组合物和方法的一些实施方式中，可溶性HMW tau种类拮抗性试剂是特异性靶向MAPT基因、并可用于抑制可溶性HMW tau种类被神经元摄取和/或诱导神经元间传播的核酸酶。
本文所使用的术语“核酸酶”是指在核酸序列中诱导断裂(例如双链DNA序列中的单链断裂或双链断裂)的试剂。核酸酶包括结合预先选定的序列或特定的序列、并在预先选定的序列或特定的序列处或其附近进行切割的核酸酶，例如，工程化的锌指核酸酶(ZFN)和工程化的TAL效应因子核酸酶。核酸酶不限于ZFN和TAL(转录激活样)效应因子核酸酶，而可以是适用于靶向载体以实现改进的靶向效率的任何核酸酶。非限制性的实例包括其它基于锌指的核酸酶和工程化的大范围核酸酶，其在预先选定的序列或特定的序列(例如，MAPT)处进行切割。
本文特别预期的是对MAPT和融合蛋白而言具有特异性的活性锌指核酸酶蛋白，包括锌指蛋白转录因子(ZFP-TF)或锌指核酸酶(ZFN)，其含有此类MAPT特异性锌指蛋白。含有MAPT特异性锌指蛋白的蛋白可用于治疗目的，包括用于治疗tau相关神经退行性变或tau病变。例如，在神经元中对MAPT基因座的锌指核酸酶靶向可用于扰乱或删除MAPT序列。锌指核酸酶已被用于靶向不同的基因(例如，在国际专利申请号WO2010/076939、WO2010/107493和WO2011/139336；美国专利申请号US 2011/0158957；和美国专利8,563,314中所描述的(在此通过引用将其各自并入))，并且可适于扰乱或抑制MAPT基因的表达和/或活性。
适用于本文所述多个方面的方法的TAL效应因子核酸酶包括本领域中已知的任何TAL核酸酶。适合的TAL核酸酶以及用于制备适合的TAL核酸酶的方法的实例公开于例如美国专利申请号2011/0239315；2011/0269234；2011/0145940；2003/0232410；2005/0208489；2005/0026157；2005/0064474；2006/0188987和2006/0063231(在此将其各自通过引用并入)中。在多个实施方式中，将TAL效应因子核酸酶工程化，使其在例如感兴趣的基因组中的靶核酸序列(例如MAPT)中或附近进行切割，其中，所述靶核酸序列位于待被靶向载体修饰的序列处或附近。TAL效应因子核酸酶是包含核酸内切酶结构域和一个或多个TAL效应因子DNA结合结构域的蛋白，其中，所述一个或多个TAL效应因子DNA结合结构域包含识别预先选定的或特定的核酸序列(例如MAPT)的序列。
在一些实施方式中，CRISPR(规律成簇的间隔短回文重复序列)/Cas系统可用于在靶核酸序列(例如MAPT)中诱导单链断裂或双链断裂。该CRISPR/Cas系统基于细菌和古细菌进化出的适应性防御机制，来保护它们免受病毒和质粒的入侵，所述机制依赖于用于外来核酸的序列特异性检测和沉默的小RNA。使用CRISPR/Cas系统进行基因编辑和/或改变基因产物表达的方法在本领域中是已知的(例如在美国专利号8697359和国际专利申请号WO2014/131833和WO 2013/176772(将其各自通过引用的方式并入本文)中所描述的)，并且可适于扰乱和/或抑制MAPT基因的表达水平和/或活性。
基于选择性地降低可溶性HMW tau种类的细胞外水平的治疗方法
发明人已示出从神经元释放了相对较低水平的可溶性HMW tau种类并在脑间质液中发现了该种类，还示出仅占试样中全部tau的一小部分的可溶性HMW tau种类被神经元稳健地摄取并参与了神经元间传播，而可溶性LMW tau种类(例如，单体尺寸/二聚体尺寸)的摄取是非常低效的。因此，本文还提供了防止病理性tau蛋白在突触连接的神经元间传播的方法。该方法包括选择性地降低与突触连接的神经元接触的本文所述的可溶性HMW tau种类的细胞外水平。可溶性HMW tau种类的细胞外水平降低使得可溶性HMW tau种类的神经元摄取降低，从而降低了病理性tau蛋白在突触连接的神经元间的传播。
在本文所述的这一方面和其它方面中，本文所使用的术语“选择性地降低”意为与降低本文所述的可溶性LMW tau种类的细胞外水平相比，降低本文所述的可溶性HMW tau种类的细胞外水平的能力更大。在一些实施方式中，“选择性地降低”是指降低可溶性HMW tau种类的细胞外水平的至少约30％或更高(包括例如至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少95％或更高)，而可溶性LMW tau种类的细胞外水平降低了不超过30％或更低(包括例如不超过20％、不超过10％、不超过9％、不超过8％、不超过6％、不超过5％、不超过4％、不超过2％、不超过1％或更低)。在一些实施方式中，“选择性地降低”是指降低可溶性HMW tau种类的细胞外水平的至少约30％或更高(包括例如至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少95％或更高)，而可溶性LMW tau种类的细胞外水平在选择性降低期间基本上不降低。例如，在选择性降低期间，可溶性LMW tau种类的细胞外水平降低了不超过10％或更低(包括例如不超过9％、不超过8％、不超过6％、不超过5％、不超过4％、不超过2％、不超过1％或更低)。
本文所使用的术语“细胞外水平”是指神经元外的可溶性分子(例如HMW tau种类或LMW tau种类)的水平。取决于各应用的上下文，在一个实施方式中，细胞外水平是指细胞培养基中的水平。在一个实施方式中，细胞外水平是指脑间质液中的水平。在一个实施方式中，细胞外水平是指脑脊液中的水平。
在一些实施方式中，可将可溶性HMW tau种类的细胞外水平选择性地降低至不超过250ng/mL、不超过200ng/mL、不超过150ng/mL、不超过100ng/mL、不超过75ng/mL、不超过50ng/mL、不超过25ng/mL、不超过20ng/mL、不超过10ng/mL、不超过5ng/mL、不超过1ng/mL或更低的浓度。
用于选择性地降低可溶性HMW tau种类的细胞外水平的方法可基于：物理去除、和/或可溶性HMW tau种类与本文所述的抗可溶性HMW tau种类拮抗剂之间的分子相互作用。在一些实施方式中，可通过微透析来选择性地降低可溶性HMW tau种类。本文和整个说明书中所使用的术语“微透析”通常表示经由半渗透膜或选择性渗透膜将感兴趣的物质或分子从待分析的微环境(例如从人或动物组织或液体)收集至收集装置(例如微透析探针的内部)的方法。例如，感兴趣的物质或分子扩散穿过膜，并被在微透析探针内部流动的灌注流体收集。
在一些实施方式中，可通过使与突触连接的神经元相接触的细胞外间隙或流体与可溶性HMW tau种类的至少一种或更多种拮抗剂(例如在本文“抗可溶性HMW tau种类拮抗性试剂或可溶性HMW tau种类的拮抗剂”部分中所描述的)接触，选择性地降低可溶性HMWtau种类。可溶性HMW tau种类的拮抗剂的实例包括但不限于抗体、核酸酶(例如但不限于锌指核酸酶(ZFN)、转录激活样效应因子核酸酶(TALEN)、CRISPR/Cas系统、转录阻抑因子、核酸抑制剂(例如，RNAi、siRNA、抗-miR、反义寡核苷酸、核酶以及它们的两种以上的组合)、小分子、适体以及它们的两种以上的组合。在接触在体外进行的一些实施方式中，可通过将本文所述的可溶性HMW tau种类的至少一种或更多种拮抗剂加入细胞培养基(其中培养有突触连接的神经元)中，选择性地降低可溶性HMW tau种类。在接触在体内进行的一些实施方式中，可通过将本文所述的可溶性HMW tau种类的至少一种或更多种拮抗剂引入脑间质液或脑脊液中，选择性地降低可溶性HMW tau种类。
与未选择性地降低可溶性HMW tau种类的情况相比，使用本文所述的方法降低可溶性HMW tau种类的细胞外水平可使得可溶性HMW tau种类的神经元摄取降低至少约10％或更多(包括例如至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或更多)，从而使病理性tau蛋白在突触连接的神经元之间的传播降低至少约10％或更多(包括例如至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或更多)。
本文所述的方法可用于tau相关神经退行性变或tau病变的治疗性处理。已知在疾病进展期间，tau病理例如通过神经元间的跨突触tau传递在阿尔茨海默氏病(AD)脑中以分级模式散播。由于可溶性HMW tau种类在本文被识别为参与了神经元至神经元的传播，因此进行干预以使此类少的HMW tau种类耗竭可抑制tau传播以及由此而来的tau病变中的疾病进展。因此，本文提供了降低受试者中的tau相关神经退行性变的方法。tau相关神经退行性变的实例包括但不限于阿尔茨海默氏病、帕金森氏病或额颞叶痴呆。该治疗方法包括选择性地降低受试者(经确定患有或有风险患tau相关神经退行性变)的脑中的可溶性HMW tau种类的水平，其中，可溶性HMW tau种类是非纤维状的，具有至少约500kDa的分子量，其中，可溶性HMW tau种类的水平降低使得tau相关神经退行性变降低。在一些实施方式中，在治疗期间，受试者中的可溶性LMW tau种类的水平基本上不降低。
在一些实施方式中，将存在于受试者脑间质液中的可溶性HMW tau种类的至少一部分去除。在一些实施方式中，将存在于受试者脑脊液中的可溶性HMW tau种类的至少一部分去除。
以上已对用于选择性地降低可溶性HMW tau种类的细胞外水平的方法进行了描述，并可将其用于选择性地降低受试者脑中的HMW tau种类的水平。例如，在一些实施方式中，可通过脑微透析来选择性地降低存在于受试者脑间质液和/或脑脊液中的可溶性HMWtau种类。在一些实施方式中，可通过向受试者的脑给予可溶性HMW tau种类的拮抗剂(例如通过颅内注射、皮质内注射、或脑室内注射、或以足够的量经由跨越血脑屏障的分子的外周给予)来选择性地降低存在于受试者脑间质液和/或脑脊液中的可溶性HMW tau种类。
在一些实施方式中，该方法可进一步包括对受试者进行选择，所述受试者经确定具有以高于参考水平的水平存在于脑中(例如脑间质液或脑脊液中)的可溶性HMW tau种类，或经确定有风险患或患有tau相关神经退行性变或tau病变。参考水平可代表存在于健康受试者脑中(例如脑间质液或脑脊液中)的可溶性HMW tau种类的细胞外水平。在一些实施方式中，参考水平可为至少约25ng/mL或更高(包括例如至少约50ng/mL、至少约100ng/mL、至少约150ng/mL、至少约200ng/mL或更高)。诊断或确定受试者的tau相关神经退行性变或tau病变的方法在本领域中是已知的，并可在本文中用于对可接受本文所述治疗方法的受试者进行选择。下列“对本文所述的治疗方法有需要的受试者的选择”部分中所述的以及下文所述的诊断tau相关神经退行性变的方法也可用于对可接受本文所述治疗方法的受试者进行选择。
诊断tau相关神经退行性变的方法
在另一方面，本文还提供了基于可溶性HMW tau种类的存在和/或水平(例如，细胞外水平)来诊断tau相关神经退行性变的方法。示例性的tau相关神经退行性变包括但不限于阿尔茨海默氏病、帕金森氏病或额颞叶痴呆。发明人已示出，尽管来自AD脑和对照脑的脑提取物中的总tau水平没有显著差异，当与对照脑相比时，AD脑提取物包含显著更高水平的可溶性HMW tau种类或磷酸化可溶性HMW tau种类。因此，诊断tau相关神经退行性变的方法可包括：(a)对来自受试者的脑间质液或脑脊液的试样进行分级分离；(b)对试样中的可溶性HMW tau种类进行检测，从而确定可溶性HMW tau种类的存在和量，其中，可溶性HMW tau种类是非纤维状的，具有至少约500kDa的分子量；以及(c)当试样中可溶性HMW tau种类的水平与参考水平相同或高于参考水平时，将受试者识别为患有或有风险患tau相关神经退行性变；或当可溶性HMW tau种类的水平低于参考水平时，将受试者识别为不太可能患有tau相关神经退行性变。
在一些实施方式中，可出于诊断目的对试样中的可溶性HMW tau种类的总水平进行检测。在一些实施方式中，可出于诊断目的对试样中的磷酸化HMW tau种类的水平进行检测。在一些实施方式中，可出于诊断目的对存在于试样中的可溶性HMW tau种类中的至少一个或更多个磷酸化位点的磷酸化水平进行检测。HMW tau种类中可被磷酸化或过磷酸化的磷酸化位点的实例包括但不限于pS199、pT205、pS262、pS396、pS396/404、pS400、pS409、pS422、它们的两个以上的组合。在一些实施方式中，HMW tau种类可在下列磷酸化位点中的至少一个或更多个(例如，至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个)处被磷酸化或过磷酸化：pT205、pS262、pS400、pS404、pS409和pS422。针对此类磷酸化位点的抗体是可商购得到的，例如来自Life Technologies。
因此，在一些实施方式中，参考水平可代表存在于健康受试者脑中的可溶性HMWtau种类的总水平。在此类实施方式中，参考水平可代表存在于健康受试者脑间质液或脑脊液中的可溶性HMW tau种类的总水平。在此类实施方式中，参考水平可以是至少约25ng/mL或更高(包括例如至少约50ng/mL、至少约100ng/mL、至少约150ng/mL、至少约200ng/mL或更高)。
在一些实施方式中，参考水平可代表存在于健康受试者脑中的磷酸化HMW tau种类的水平。在此类实施方式中，参考水平可代表存在于健康受试者脑间质液或脑脊液中的磷酸化HMW tau种类的水平。在此类实施方式中，参考水平可以是至少约25ng/mL或更高(包括例如至少约50ng/mL、至少约100ng/mL、至少约150ng/mL、至少约200ng/mL或更高)。
在一些实施方式中，参考水平可代表存在于试样中的可溶性HMW tau种类中的至少一个或更多个磷酸化位点的磷酸化水平。
本文所使用的术语“分级分离”是指基于特定参数(例如分子尺寸或分子量)将试样分离成多个部分。在本文所述多个方面的上下文中，术语“分级分离”是指从脑脊液或脑间质液的试样分离可溶性HMW tau种类，或对含有可溶性HMW tau种类的试样进行富集。在一些实施方式中，分级分离基于存在于试样中的分子的分子量和/或分子尺寸进行。此类尺寸排阻方法或重量排阻方法在本领域中是已知的，例如但不限于尺寸排阻色谱法、离心法、凝胶电泳法、蔗糖密度法、亲和色谱法、透析法或它们的两种以上的组合。
在一些实施方式中，在(a)的分级分离前，试样可基本上不含可溶性LMW tau种类，其中，可溶性LMW tau种类具有不超过200kDa或更低的分子量。例如，脑间质液或脑脊液的试样可从待通过微透析进行诊断的受试者获得，例如使用具有适当分子量截留的渗透膜(例如只允许具有至少约600kDa的分子量的分子被收集)。
在替代的实施方式中，在(a)的分级分离前，试样可包含可溶性LMW tau种类，其中，可溶性LMW tau种类具有不超过200kDa的分子量。出于诊断目的，通过对试样进行分级分离，可将可溶性HMW tau种类与试样中的其它低MW分子(例如，可溶性LMW tau种类)分离，并对含有可溶性HMW tau种类的试样进行富集。
在分级分离后，可通过通常用于检测tau蛋白的任何方法(包括例如但不限于ELISA、western印迹、免疫分析法、尺寸排阻色谱法、它们的两种以上的组合)对试样中的可溶性HMW tau种类进行检测。
在可溶性LMW tau种类存在于试样中的一些实施方式中，该方法可进一步包括检测试样中的可溶性LMW tau种类的量。在此类实施方式中，如果可溶性HMW tau种类与可溶性LMW tau种类的比例与参考水平比例相同或高于参考水平比例，可将受试者识别为患有或有风险患tau相关神经退行性变；或如果可溶性HMW tau种类与可溶性LMW tau种类的比例低于参考水平比例，将受试者识别为不太可能患有tau相关神经退行性变。
参考水平比例可代表存在于健康受试者脑中的可溶性HMW tau种类与可溶性LMWtau种类的细胞外水平比例。即使在患有AD的个体中，LMW tau的水平也大大超过HMW tau的水平。因此，HMW tau通常只占总tau蛋白的约1％-5％(或更少)。在一些实施方式中，参考水平比例可代表存在于健康受试者脑脊液或脑间质液中的可溶性HMW tau种类与可溶性LMWtau种类的水平比例。在一些实施方式中，参考水平比例范围可为约10000:1至约20:1、约1000:1至约50:1、或约500:1至约100:1。在一些实施方式中，该方法可进一步包括向经识别患有或有风险患tau相关神经退行性变的受试者给予治疗性处理，例如给予包含本文所述的一种或多种抗可溶性HMW tau种类拮抗剂的药物组合物。
对降低错误折叠的tau蛋白跨突触散播的试剂进行筛选的方法
可溶性HMW tau种类的发现不仅为本文所述的tau相关神经退行性变提供了治疗靶点和生物标志物，可溶性HMW tau种类还可在体外使用以诱导神经元间传播(神经退行性变中进展的表型特征)，从而开发出体外模型，以对降低错误折叠的tau蛋白的跨突触散播的有效试剂进行筛选，并由此治疗tau相关神经退行性变。因此，本文提供的又一方面涉及对有效降低本文所述的可溶性HMW tau种类或错误折叠的tau蛋白的跨突触散播的试剂进行识别的方法。该方法包括：(a)使神经元培养装置第一腔室中的第一神经元与可溶性HMWtau种类接触，其中，第一神经元与神经元培养装置第二腔室中的第二神经元通过轴突连接，并且其中，第二神经元不与可溶性HMW tau种类接触；(b)使第一腔室中的第一神经元与候选试剂接触；以及(c)检测可溶性HMW tau种类从第一神经元向第二神经元的运输。
在一些实施方式中，可使第一神经元同时与可溶性HMW tau种类和候选试剂接触。在一些实施方式中，可在与候选试剂接触前，使第一神经元与可溶性HMW tau种类接触。在一些实施方式中，可在与候选试剂接触后，使第一神经元与可溶性HMW tau种类接触。
本文所使用的术语“候选试剂”是指期望对其以下能力进行检测的任何化合物或物质(例如但不限于小分子、核酸、多肽、肽、药物、离子等)：降低或抑制可溶性HMW tau种类的神经元摄取和/或降低可溶性HMW tau种类的神经元间传播的能力。“候选试剂”可以是任何化学品、实体或部分，包括但不限于合成和天然存在的蛋白实体和非蛋白实体。在一些实施方式中，候选试剂是核酸、核酸类似物、蛋白、抗体、肽、适体、核酸低聚物、氨基酸或碳水化合物，并且包括但不限于蛋白、寡核苷酸、核酶、DNA酶、糖蛋白、siRNA、脂蛋白、适体以及它们的组合和修饰等。在一些实施方式中，试剂是具有化学部分的小分子。例如，化学部分包括未取代或取代的烷基部分、芳基部分或杂环基部分。
可基于检测第二神经元的胞体和/或轴突中的可溶性HMW tau种类的存在或水平，来识别用于降低错误折叠的tau蛋白的跨突触散播的有效试剂。与当第一腔室中的第一神经元未与候选试剂接触时相比，如果第二神经元的胞体和/或轴突中的可溶性HMW tau种类降低了至少约30％或更多(包括例如至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或更多、并上至100％)，则将候选试剂识别为用于降低本文所述的可溶性HMW tau种类或错误折叠的tau蛋白的跨突触散播的有效试剂。
本文所使用的术语“通过轴突连接”是指神经元通过轴突而连接。本文所使用的术语“轴突”是指来自神经元的长细胞突出物，藉此从细胞体向靶细胞进行传出(出射)动作电位。
虽然在本文所述的方法中可使用适于监测轴突延伸和/或运输的任何神经元培养装置，在一些实施方式中，神经元培养装置是微流体装置。在一些实施方式中，微流体装置可包含用于放置至少第一神经元的第一腔室和用于放置至少第二神经元的第二腔室，其中，第一腔室和第二腔室通过至少一个微通道相互连接，所述微通道专门经尺寸设计以允许轴突生长。在一些实施方式中，微流体装置可包含用于放置第一神经元群(例如至少2个或更多)的第一腔室和用于放置第二神经元群(例如至少2个或更多)的第二腔室，其中，第一腔室和第二腔室通过至少两个或更多微通道相互连接，所述微通道各自专门经尺寸设计以允许轴突生长。
本文所使用的术语“专门经尺寸设计以允许轴突生长”是指对相互连接的微通道的规格进行尺寸设计，以专门允许源自于第一腔室中的神经元细胞体的轴突延伸进入第二腔室。例如，对使第一腔室和第二腔室相互连接的微通道的长度进行优化，从而使得没有MAP2阳性树突可进入第二腔室，从而将轴突末端与胞体和树突分离。在一些实施方式中，微通道的长度可以是至少约400μm或更长，包括例如至少约500μm、至少约600μm、至少约700μm、至少约800μm、至少约900μm、至少约1000μm。在一个实施方式中，微通道的长度可以是至少约450μm或更长。在一个实施方式中，微通道的长度可以是至少约600μm或更长。
在一些实施方式中，微通道的宽度可专门经尺寸设计以允许轴突生长。在一些实施方式中，微通道的宽度范围可以是约3μm至约15μm、或约5μm至约10μm、或约6μm至约10μm。
在一些实施方式中，微流体装置可进一步包含用于放置至少第三神经元的第三腔室，其中，如本文所述的，第二腔室和第三腔室通过至少一个微通道相互连接，所述微通道专门经尺寸设计以允许轴突生长。
通过举例的方式，图3A示出了示例性神经元培养装置的示意图。图3A示出了微流体装置300，其包含用于放置至少第一神经元的第一腔室302和用于放置至少第二神经元的第二腔室304，其中，第一腔室302和第二腔室304通过至少一个微通道306(专门经尺寸设计以允许轴突生长)相互连接。在一些实施方式中，可以期望多于一个微通道306(例如，至少两个或更多个微通道)使两个腔室相互连接，从而使得可同时监测多个轴突。在一些实施方式中，微流体装置300可进一步包含用于放置至少第三神经元的第三腔室308，其中，第二腔室304和第三腔室308通过至少一个微通道306(专门经尺寸设计以允许轴突生长)相互连接。
为了防止可溶性HMW tau种类和候选试剂从第一腔室扩散进入其它腔室(例如，第二腔室和/或任选的第三腔室)，相较于第一腔室中加入的细胞培养基，第二腔室和/或任选的第三腔室中可加入更大量的细胞培养基，从而使得腔室之间的体积差异可产生连续对流(“流体静压屏障”)。在一些实施方式中，相较于第一腔室中的细胞培养基的量，加入到第二腔室和/或任选的第三腔室中的细胞培养基的量可多出至少约1.5倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约10倍或更高。在一个实施方式中，相较于第一腔室中的细胞培养基的量，加入到第二腔室和/或任选的第三腔室中的细胞培养基的量可多出至少约4倍或更高。
为了检测可溶性HMW tau种类从第一神经元向第二神经元的运输，可将神经元固定、就可溶性HMW tau种类的存在而言使用实施例中所述的抗-tau抗体或任何可商购得到的抗-tau抗体对神经元进行免疫染色、并在显微镜下检查。在一些实施方式中，为了将第一神经元与第二神经元区分开来，可使用不同的荧光分子对第一神经元和第二神经元进行标记。
基于降低内源性细胞内tau蛋白的治疗方法
在一个方面，发明人已示出，与表达tau的动物相比，即使在神经原纤维缠结(NFT)的存在下，tau-空白动物表现出更少的病理性tau错误折叠和胶质细胞增生，并且还在神经元中表现出Aβ诱导的线粒体内在caspase级联的活化降低。因此，去除内源性细胞内tau蛋白可提供神经保护作用，例如降低神经毒性和/或增加神经元存活。虽然在先报道已经讨论了tau蛋白的降低可改善神经退行性变，本领域技术人员将不会预期到去除显著量的内源性细胞内tau蛋白(即稳定微管必需的蛋白)不会对神经元产生任何不利影响。然而，发明人在此已发现，与表达非聚集tau蛋白的健康人受试者一样，tau-空白人受试者具有正常的神经元表型或认知功能无异常。因此，本文还提供了基于降低内源性细胞内tau蛋白来降低tau病变诱导的神经损伤或神经退行性变的方法。示例性的tau病变可以是阿尔茨海默氏病、帕金森氏病或额颞叶痴呆。
在受试者中降低tau病变诱导的神经损伤或神经退行性变的方法包括：向经确定患有tau病变的受试者的脑给予tau拮抗性试剂(例如，抑制内源性细胞内tau蛋白的至少约50％的表达水平的试剂)，从而在神经原纤维缠结和/或β淀粉样蛋白的存在下降低神经毒性(和/或增加神经元存活)。
术语“神经毒性”是指神经原纤维缠结和/或作为Aβ的多聚神经毒性形式的淀粉样蛋白衍生的可扩散配体(ADDL)在体外和/或体内对神经元的毒性作用。例如，ADDL结合至触发异常神经元信号传导的特异性神经元受体，损害了长时程增强效应(long termpotentiation)并导致记忆缺陷。因此，ADDL以如下方式改变神经元的功能：虽然神经元仍然存活，但不能正常发挥作用。本文将此种改变的功能性称为“神经元功能障碍”，其是神经毒性的亚类。持续的ADDL信号传导引起异常的转录和突触的渐进性损失，而且，非常长期持续的ADDL信号传导和积累的结构性病理导致最终的神经元死亡和严重的脑萎缩。
本文所使用的“tau拮抗性试剂”或“tau拮抗剂”是指在由MAPT介导的一种或多种过程、机制、作用、应答、功能、活动或通路中，抑制或导致或促进定性的或定量的抑制、减少或降低的试剂，例如小分子、拮抗性多肽、抑制性核酸、或MAPT特异性抗体或其抗原结合片段。因此，术语“tau拮抗性试剂”是指抑制MAPT多肽或编码MAPT的多核苷酸表达的试剂，或是指如下试剂：结合至MAPT多肽或编码MAPT的多核苷酸；部分地或完全地阻断MAPT多肽或编码MAPT的多核苷酸的刺激；减少、防止、延迟MAPT多肽或编码MAPT的多核苷酸的活化；使MAPT多肽或编码MAPT的多核苷酸失活、脱敏或活性下调。此类MAPT拮抗剂可例如抑制MAPT表达，例如MAPT翻译、MAPT的翻译后加工，MAPT多肽的稳定性、降解或细胞核定位或细胞质定位，或编码MAPT的多核苷酸的转录、转录后加工、稳定性或降解。Tau拮抗性试剂可已知具有期望的活性和/或性质(例如，抑制MAPT活性或表达)，或可使用例如本文所述的或本领域已知的筛选方法从不同化合物的文库中选择。
本文和整个说明书中所使用的术语“MAPT”或“微管相关蛋白tau”通常是指与野生型MAPT的序列类似或相同的MAPT多肽或MAPT多核苷酸。
在一些实施方式中，术语“MAPT”是指具有此类氨基酸序列、并且能够调控轴突微管的稳定性的MAPT多肽：所述氨基酸序列与野生型MAPT的氨基酸序列至少70％或更多(包括至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)相同。
在一些实施方式中，术语“MAPT”是指具有此类核苷酸序列、并且编码如本文所述的MAPT多肽的MAPT多核苷酸：所述核苷酸序列与野生型MAPT或其部分的核苷酸序列至少70％或更多(包括至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)相同。
在万维网上从NCBI可得到不同物种和多种异形体的野生型MAPT序列，包括人、小鼠、大鼠和狗。例如，在NCBI上可得到编码人MAPT的不同异形体的核苷酸序列及它们相应的氨基酸序列，它们的登录号包含在本文所示的表1中。
在术语“MAPT”是指MAPT多肽的情况中，MAPT多肽的“变体”涵盖了此类MAPT多肽的部分或片段：所述MAPT多肽保留了至少约70％或更多(包括至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)的野生型MAPT多肽的轴突微管稳定化活性。该变体还涵盖了如下MAPT多肽的保守性置换变体：所述MAPT多肽的保守性置换变体保留了至少约70％或更多(包括至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)的野生型MAPT多肽的轴突微管稳定化活性。
可例如通过使用比对算法(例如)或本领域公知的其它方法首先对两个多肽序列进行比对来确定两个多肽之间的氨基酸同一性。
在本文所述的多个方面中，用于测量来自试样的MAPT或其片段的方法在本领域中是已知的，包括但不限于使用PCR或实时PCR的mRNA表达分析，使用western印迹、免疫分析和/或ELISA的蛋白分析，和/或测序分析。因此，在一些实施方式中，可从患者的试样(例如活检物)分离核酸分子以测量MAPT mRNA表达，或可分离蛋白以测量MAPT蛋白表达。
在一些实施方式中，所选定的用于本文所述方法的tau拮抗性试剂抑制了内源性细胞内tau蛋白的至少约50％的表达水平。在一些实施方式中，所选定的用于本文所述方法的tau拮抗性试剂抑制了内源性细胞内tau蛋白的至少约70％的表达水平。在一些实施方式中，所选定的用于本文所述方法的tau拮抗性试剂抑制了内源性细胞内tau蛋白的至少约90％的表达水平。在一些实施方式中，所选定的用于本文所述方法的tau拮抗性试剂抑制了内源性细胞内tau蛋白的95％的表达水平。在一些实施方式中，所选定的用于本文所述方法的tau拮抗性试剂抑制了内源性细胞内tau蛋白的99％的表达水平。
选定的抑制内源性细胞内tau蛋白表达水平的试剂可扰乱MAPT(微管相关蛋白tau)基因的表达和/或抑制MAPT基因的转录。此类试剂可包括但不限于抗体、核酸酶(例如但不限于锌指核酸酶(ZFN)、转录激活样效应因子核酸酶(TALEN)、CRISPR/Cas系统、转录阻抑因子、核酸抑制剂(例如，RNAi、siRNA、抗-miR、反义寡核苷酸、核酶以及它们的两种以上的组合)、小分子、适体以及它们的两种以上的组合。MAPT特异性siRNA是可商购得到的，例如，来自Santa Cruz Biotechnology的SC-36614和/或可从Dharmacon Inc.获得的AccellSMART POOLTM MAPT siRNA或个体AccellTM MAPT siRNA。
已知的用于将试剂有效递送至受试者的脑的方法可用来执行本文所述的方法。在一些实施方式中，试剂可经由载体向脑给予，例如用于增强试剂的递送。示例性的载体可以是病毒或病毒载体(例如但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒(AAV)、重组AAV表达载体)、纳米颗粒和/或脂质体。
在一些实施方式中，可进一步确定受试者的脑具有β淀粉样蛋白斑(例如通过磁共振成像(MRI)，在Baltes等，Methods Mol Biol(2011)711:511-33中对其进行了进一步描述)，并且，所述给予可在β淀粉样蛋白的存在下降低神经毒性(和/或增加神经元存活)。
本文所使用的术语“β淀粉样蛋白”是指肽的家族，所述肽是老年斑和发现于例如阿尔茨海默氏病(AD)、唐氏综合症以及具有Dutch型淀粉样变性的遗传性脑出血(HCHWA-D)患者脑中的血管淀粉样蛋白沉积物(淀粉样血管病)的主要化学成分。β淀粉样蛋白肽是β淀粉样前体蛋白(APP)的片段，其包含可变数目的氨基酸，通常为38个-43个氨基酸。
对本文所述多个方面的治疗方法有需要的受试者的选择
就疾病治疗而言，本文所使用的术语“治疗(treatment/treating)”意为防止疾病的进展、或改变紊乱的进程(例如但不限于延缓紊乱的进展)、或逆转紊乱的症状、或减少受试者中的一种或多种生化标志物和/或一种或多种症状、防止一种或多种症状恶化或进展、促进恢复或改善预后。例如，在治疗tau相关神经退行性变或tau病变(例如，AD)的情况中，治疗性处理是指减少神经退行性变的形态，例如在给予本文所述的可溶性HMW tau种类拮抗性试剂后减少神经元间传播。在另一实施方式中，治疗性处理是指与tau相关神经退行性变或tau病变(例如，AD)相关的至少一种症状的缓解。可测量的减少包括可测量的标志物或症状的任何统计显著性的下降，例如在治疗后用神经心理学测试来评估认知改进(例如语言和感知)。在一个实施方式中，tau相关神经退行性变或tau病变(例如，AD)的至少一种症状缓解了至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约30％、至少约40％或至少约50％。在另一实施方式中，至少一种症状缓解了超过50％，例如至少约60％、或至少约70％。在一个实施方式中，与对照(例如，在缺乏本文所述的可溶性HMW tau种类拮抗性试剂的情况中)相比，至少一种症状缓解了至少约80％、至少约90％或更多。
在一些实施方式中，本文所述的治疗方法可进一步包括在治疗前对患有tau相关神经退行性变或tau病变AD的受试者进行诊断的步骤。可接受(amenable to)治疗方法的受试者是已被诊断患有tau相关神经退行性变或tau病变的受试者。示例性的tau相关神经退行性变或tau病变包括但不限于阿尔茨海默氏病、帕金森氏病或额颞叶痴呆。
在一个实施方式中，可接受治疗方法的受试者是已被诊断患有阿尔茨海默氏病的受试者。用于诊断阿尔茨海默氏病的方法在本领域中是已知的。例如，可使用功能性评估分期(FAST)量表来评估阿尔茨海默氏病的阶段，在功能性能力和丧失的7个主要标题下，该量表将阿尔茨海默氏病的进展分成16个连续阶段。第1阶段被定义为功能或记忆没有衰退的正常成人。第2阶段被定义为对功能性衰退具有一些个人觉察的正常老年人，通常抱怨记忆缺陷以及忘记熟悉的人和地方的名字。第3阶段(早期阿尔茨海默氏病)在要求高的工作环境中表现出症状，特征为当前往陌生地点时的定向障碍；被同事报告表现下降；名称和词语查找缺陷；从书中的段落回忆信息或记忆向他们新介绍的人的名字的能力降低；乱放贵重物品；注意力降低。在第4阶段(轻度阿尔茨海默氏病)，患者在复杂的任务(例如策划派对或处理财务)中可能需要协助，表现出记忆生活事件的问题，并难以集中注意力和行走。在第5阶段(中度阿尔茨海默氏病)，患者需要协助以执行日常任务，例如选择适当的装束；出现在时间方面的定向障碍且不能回忆他们目前生活的重要信息，但患者仍能记得关于他们自己、他们的家人和其他人的主要信息。在第6阶段(中重度阿尔茨海默氏病)，患者开始忘记关于他们自己和他们的环境的大量信息，并需要协助穿衣、洗澡和如厕；出现尿失禁和睡眠受扰模式；性格和情绪变化变得相当明显，并且观察到认知意识缺失。在第7阶段(重度阿尔茨海默氏病)，语言能力变得仅限于几个词语且可理解的词汇可能限于一个词；患者可能失去行走、端坐或微笑的能力，并最终无法托起头部。
用于AD的其它替代诊断方法包括但不限于在美国专利号7,771,937、美国专利号7,595,167、US 55580748和PCT申请号WO2009/009457中公开的细胞和分子测试方法，通过引用将它们的内容整体并入。另外，美国专利号7,794,948中公开了用于AD的基于蛋白的生物标志物，其中一些可通过非侵入性成像(例如PET)进行检测，通过引用将其内容整体并入。
AD风险中涉及的基因可用于AD的诊断。其它AD风险基因的一个实例是载脂蛋白E-ε4(APOE-ε4)。APOE-ε4是三种常见形式之一，或APOE基因的等位基因；其它的为APOE-e2和APOE-e3。APOE为在血流中携带胆固醇的蛋白之一提供蓝图(blueprint)。每个个体都从各亲代继承了一些形式的APOE的拷贝。继承一个拷贝的APOE-ε4的个体具有增加的发展出AD的风险。继承两个拷贝的个体具有甚至更高的风险，但并不具有发展出AD的确定性。除了提高风险之外，APOE-ε4可倾向于使症状在比平常更小的年龄出现。除了APOE-e4之外，其它AD风险基因也是本领域中充分确立的。一些AD风险基因被公开于美国专利申请号US 2010/0249107、US 2008/0318220、US 2003/0170678和PCT申请号WO 2010/048497中，通过引用将它们的内容整体并入本文。遗传学测试是本领域中充分确立的，并且可用于例如APOE-e4。因此，可将携带APOE-ε4等位基因的受试者识别为有风险发展出AD的受试者。
在进一步的实施方式中，具有Aβ负担(burden)的受试者可接受本文所述的治疗方法。此类受试者包括但不限于：患有唐氏综合症的受试者，APP或早老蛋白基因突变、以及晚发型AD风险因素(载脂蛋白E-ε4)的未受影响的携带者。
在一些实施方式中，还可使正在接受tau相关神经退行性变或tau病变的治疗性处理的患有tau相关神经退行性变或tau病变(例如，AD)的受试者接受本文所述的治疗方法。
在一些实施方式中，可使已被诊断(例如使用本文所述的诊断方法或本领域已知的任何诊断方法(例如，用于AD))为具有增加的风险发展出tau相关神经退行性变或tau病变(例如，AD)的受试者接受本文所述的治疗方法。
本文所使用的“受试者”可指人或动物。受试者的实例包括灵长类动物(例如，人和猴子)。通常，动物是脊椎动物，例如灵长类动物、啮齿类动物、家养动物(domestic)或狩猎(game)动物。灵长类动物包括黑猩猩、食蟹猴(cynomologous monkeys)、蜘蛛猴和猕猴(例如恒河猴)。啮齿类动物包括小鼠、大鼠、旱獭、雪貂、兔和仓鼠。家养动物和狩猎动物包括奶牛、马、猪、鹿、野牛、水牛、猫科动物(例如家猫)、犬科动物(例如狗、狐狸、狼)、鸟类(例如鸡、鸸鹋、鸵鸟)和鱼类(例如鳟鱼、鲶鱼和鲑鱼)。患者或受试者包括前述的任意子集(例如上述的所有)或包括一个或多个组或物种(例如人、灵长类动物或啮齿类动物)。在本文所述方面的一些实施方式中，受试者是哺乳动物，例如灵长类动物，例如人。术语“患者”和“受试者”在本文中可互换使用。受试者可以是雄性或雌性。
在一个实施方式中，受试者是哺乳动物。哺乳动物可以是人、非人灵长类动物、小鼠、大鼠、狗、猫、马或奶牛，但不限于这些实例。除人之外的哺乳动物可有利地用作代表神经退行性变的动物模型的受试者。此外，本文所述的方法和组合物可在家养动物和/或宠物中使用。在一些实施方式中，受试者是人受试者。人受试者可为任何年龄、性别、种族或族群，例如，高加索人(白种人)、亚洲人、非洲人、黑种人、非裔美国人、非裔欧洲人、西班牙人(Hispanic)、中东人等。
用于本文所述治疗方法的药物组合物和给药模式
本文所提供的另一方面涵盖了药物组合物，所述药物组合物包含有效量的本文所述的至少一种或更多种(例如，1种、2种、3种或更多种)可溶性HMW tau种类拮抗性试剂和/或本文所述的至少一种或更多种(例如，1种、2种、3种或更多种)tau拮抗剂。在一个实施方式中，该组合物进一步包含至少一种额外的抑制神经退行性变的治疗剂，例如，美国专利申请号2013/0195866中所述的AKAP79肽、或FK506或NFAT拮抗剂，通过引用将其内容并入本文。
在一些实施方式中，载体可用于使可溶性HMW tau种类拮抗性试剂和/或tau拮抗剂表达和递送进入神经元。例如，具有表达盒的本文所述的病毒载体可编码MAPT拮抗剂序列。有效剂量的精确确定可基于个体因素，包括个体的斑尺寸、年龄以及神经退行性变以来的时间量。因此，本领域技术人员可针对各个体患者容易地调整剂量。
本领域已知的任何表达载体都可用于表达本文所述的传感系统。可与“质粒”互换使用的术语“载体”是指能够运输与其连接的另一核酸的核酸分子。能够指导与其可操作地连接的核酸序列和/或基因的表达的载体在本文中称为“表达载体”。通常，重组DNA技术中实用的表达载体经常处于“质粒”的形式，其是指环状双链DNA环，其在其载体形式中不与染色体结合。其它表达载体可用于本文所述的不同实施方式中，例如但不限于质粒、附加体、噬菌体或病毒载体，并且此类载体可整合到宿主的基因组中，或在特定的细胞中自主复制。还可使用本领域技术人员已知的提供等效功能的其它形式的表达载体。表达载体包括用于稳定或瞬时表达编码DNA的表达载体。
在一些实施方式中，表达载体进一步包含启动子。本文所使用的在本文中可互换使用的“启动子”或“启动子区”或“启动子元件”是指控制与其可操作地连接的核酸序列的转录的核酸序列的片段，通常但不限于DNA或RNA或它们的类似物。启动子区包含足以进行RNA聚合酶识别、结合和转录起始的特定序列。启动子区的这一部分被称为启动子。此外，启动子区包含调控RNA聚合酶的这一识别、结合和转录起始活性的序列。这些序列可以是顺式作用的，或者可对反式作用因子作出响应。取决于调节的性质，启动子可以是组成型的或调节型的。
在一些实施方式中，表达载体进一步包含调节序列。与本文中的“调节元件”可互换使用的术语“调节序列”是指调控与其可操作地连接的核酸序列的转录、并因此作为转录调控因子的核酸的片段，通常但不限于DNA或RNA或它们的类似物。调节序列调控与其可操作地连接的核酸序列和/或基因的表达。调节序列经常包含“调节元件”，其是转录结合结构域的核酸序列，并被转录蛋白和/或转录因子、抑制子或增强子等的核酸结合结构域识别。典型的调节序列包括但不限于转录启动子、任选的控制转录的操作序列、编码合适的mRNA核糖体结合位点的序列、以及控制转录和/或翻译终止的序列。对调节序列进行选择用于分析，以控制在计划进行表达的细胞类型中断裂(split)-生物分子缀合物的表达。
调节序列可以是单个调节序列或多个调节序列、或修饰的调节序列或它们的片段。修饰的调节序列是其中的核酸序列已通过一些手段(例如但不限于突变、甲基化等)改变或修饰的调节序列。
术语“可操作地连接”或“可操作地关联(associated)”在本文中可互换使用，是指核酸序列与核苷酸调节序列(如启动子、增强子、转录和翻译终止位点以及其它信号序列)的功能关系。例如，核酸序列(通常为DNA)与调节序列或启动子区的可操作的连接是指DNA和调节序列或启动子之间的物理和功能关系，使得此类DNA的转录通过特异识别、结合和转录该DNA的RNA聚合酶从调节序列或启动子起始。为了优化表达和/或体外转录，可能需要在进行表达的细胞类型中修饰用于核酸或DNA表达的调节序列。对此种修饰的期望或需要可由经验确定。
在一些实施方式中，表达载体是病毒载体。本文所使用的术语“病毒载体”是指源自于病毒的任何形式的核酸，并用于经由转导将遗传物质传递到细胞中。该术语涵盖了病毒载体核酸(如DNA和RNA)、此类核酸的壳体化(encapsidated)形式以及病毒载体核酸已被包装在其中的病毒颗粒。病毒载体的实例包括但不限于逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒以及它们的组合。
就给予有需要的受试者(如经诊断患有或易患tau相关神经退行性变或tau病变(如AD)的受试者)而言，可在药学上可接受的组合物中提供可溶性HMW tau种类拮抗剂和/或tau拮抗剂。本文所使用的术语“药学上可接受的”是指此类化合物、材料、组合物和/或剂型：在健全的医学判断范围内，适于与人类和动物的组织接触而无过度的毒性、刺激、过敏反应或其它问题或并发症，与合理的收益/风险比相匹配。
药学上可接受的组合物可进一步包含一种或多种药学上可接受的载体(添加剂)和/或稀释剂。本文所使用的术语“药学上可接受的载体”意为用于给予本文所述的可溶性HMW tau种类拮抗剂或本文所述的tau拮抗剂的药学上可接受的材料、组合物或辅料，例如液体、稀释剂、赋形剂、制造辅料或封装材料。从与制剂的其它成分相容的意义上而言，每种载体必须是“可接受的”，且对患者无害。药学上可接受的载体包括与可溶性HMW tau种类拮抗剂和/或tau拮抗剂的活性相容且是受试者生理上可接受的任何和所有溶剂、分散媒介、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。可作为药学上可接受的载体的材料的一些实例包括：(i)糖，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(ii)淀粉，例如玉米淀粉和马铃薯淀粉；(iii)纤维素及其衍生物，例如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、乙基纤维素、微晶纤维素和醋酸纤维素；(iv)黄蓍胶粉；(v)麦芽；(vi)明胶；(vii)润滑剂，例如硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠和滑石；(viii)赋形剂，例如可可脂和栓蜡；(ix)油，例如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；(x)二醇，例如丙二醇；(xi)多元醇，例如甘油、山梨糖醇、甘露醇和聚乙二醇(PEG)；(xii)酯，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(xiii)琼脂；(xiv)缓冲剂，例如氢氧化镁和氢氧化铝；(xv)海藻酸；(xvi)无热原水；(xvii)等渗盐水；(xviii)林格氏溶液；(xix)乙醇；(xx)pH缓冲溶液；(xxi)聚酯、聚碳酸酯和/或聚酸酐；(xxii)膨胀剂(bulking agents)，例如多肽和氨基酸；(xxiii)血清成分，例如血清白蛋白、HDL和LDL；(xxiv)C2-C12醇，例如乙醇；以及(xxv)用于药物制剂中的其它无毒相容物质。润湿剂、着色剂、脱模剂(release agents)、包衣剂、甜味剂、调味剂、芳香剂、防腐剂和抗氧化剂也可以存在于制剂中。
对于待口服给予的本文所述的组合物或制剂而言，药学上可接受的载体包括但不限于药学上可接受的赋形剂，例如惰性稀释剂、崩解剂、结合剂、润滑剂、甜味剂、调味剂、着色剂和防腐剂。合适的惰性稀释剂包括碳酸钠和碳酸钙、磷酸钠和磷酸钙以及乳糖，而玉米淀粉和海藻酸是合适的崩解剂。结合剂可包括淀粉和明胶，而润滑剂(如果存在的话)通常是硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。如果需要的话，片剂可以用诸如单硬脂酸甘油酯或双硬脂酸甘油酯的材料涂覆，以延迟在胃肠道中的吸收。
根据给药途径和制剂，药学上可接受的载体在本文所述的药物组合物中可有所变化。例如，本文所述的药学上可接受的组合物可经由注射递送。用于给予(递送)的此类途径包括但不限于：皮下给予或胃肠外给予，包括静脉内给予、皮质内给予、颅内给予、脑室内给予、肌内给予、腹膜内给予和输注技术。在一个实施方式中，药学上可接受的组合物处于适合于皮质内注射的形式。在另一实施方式中，将药物组合物配制为用于颅内注射。还可采用其它给药形式，例如口服给予、全身给予或胃肠外给予。
可将本文所述的药物组合物特别配制用于以固体形式或液体形式给予。另外，可将药物组合物植入患者或使用药物递送系统注射。参见例如Urquhart等，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.24:199-236(1984)；Lewis,ed.“Controlled Release ofPesticides and Pharmaceuticals”(Plenum Press，纽约，1981)；美国专利号3,773,919；以及美国专利号35 3,270,960。
当胃肠外给予本文所述的药物组合物时，通常将该药物组合物配制成单位剂量的可注射形式(溶液剂、混悬剂、乳剂)。适于注射的药物制剂包括无菌水性溶液剂或分散剂。载体可以是包含例如如下成分的溶剂或分散介质：水、细胞培养基、缓冲液(例如，磷酸盐缓冲盐水)、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)以及它们的合适的混合物。在一些实施方式中，药物载体可以是缓冲溶液(例如PBS)。
在一些实施方式中，可将药物组合物配制成乳剂或凝胶剂。在此类实施方式中，可将本文所述的至少一种可溶性HMW tau种类拮抗剂和/或本文所述的至少一种tau拮抗剂封装在生物相容的凝胶(例如，水凝胶和肽凝胶)中。可在退化神经元细胞(例如，靠近淀粉样蛋白斑或神经原纤维缠结、或在脑组织间隙中的细胞)附近将凝胶药物组合物植入脑。
另外，可加入增强组合物的稳定性、无菌性和等渗性的多种添加剂，包括抗菌性防腐剂、抗氧化剂、螯合剂和缓冲液。可通过多种抗细菌剂和抗真菌剂(例如，对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等)来确保防止微生物作用。在许多情况中，可期望包括等渗剂，例如，糖、氯化钠等。
取决于期望的制剂和给药途径，组合物还可包含辅助性物质，例如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂、胶凝或粘度增强添加剂、防腐剂、着色剂等。可咨询标准文本(例如“REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCE”，第17版，1985，通过引用的方式并入本文)来制备合适的制剂，而无需过多实验。然而，就本文所述的药物组合物而言，所使用的任何辅料、稀释剂或添加剂对于本文所述的可溶性HMW tau种类拮抗剂和/或本文所述的tau拮抗剂而言应该是生物相容的或是惰性的。
组合物可以是等渗的，即组合物可与血液和泪液具有相同的渗透压。本文所述的药物组合物的期望的等渗性可使用氯化钠或其它药学上可接受的试剂(如右旋糖、硼酸、酒石酸钠、丙二醇或其它无机或有机溶质)来实现。在一个实施方式中，在含有钠离子的缓冲液中使用氯化钠。
可使用药学上可接受的增稠剂来使组合物的粘度维持在选定水平。在一个实施方式中，使用甲基纤维素，因为其经济易得并易于使用。其它合适的增稠剂包括例如黄原胶、羧甲基纤维素、羟丙基纤维素、卡波姆等。增稠剂的优选浓度取决于所选择的试剂。关键点在于使用将实现选定粘度的量。通常通过加入此类增稠剂从溶液制备粘性组合物。
在一些实施方式中，经载体转导的神经元可包含在药物组合物中并被冷冻储存，所述载体编码本文所述的可溶性HMW tau种类拮抗剂和/或本文所述的tau拮抗剂。在此类实施方式中，已知用于冷冻细胞的添加剂或防腐剂可包含在组合物中。防腐剂的合适浓度可基于总重量从0.02％变化至2％，不过，取决于所选择的防腐剂或添加剂，该浓度可能存在明显的变化。此类添加剂或防腐剂的一个实例可以是二甲亚砜(DMSO)或本领域技术人员已知的任何其它细胞冷冻剂。在此类实施方式中，在使用或给予受试者(例如，神经元干细胞治疗)前，使组合物解冻。
通常，任何添加剂(除了本文所述的可溶性HMW tau种类拮抗剂和/或本文所述的tau拮抗剂之外)可在磷酸盐缓冲盐水中以0.001wt％-50wt％的量存在，且活性成分以微克至毫克的量级存在，例如约0.0001wt％-约5wt％、约0.0001wt％-约1wt％、约0.0001wt％-约0.05wt％或约0.001wt％-约20wt％、约0.01wt％-约10wt％以及约0.05wt％-约5wt％。对于向有需要的受试者给予的任何治疗组合物以及对于任何特定的给药方法而言，优选的是确定毒性(例如通过在合适的动物模型(例如啮齿类动物，如小鼠)中确定致死剂量(LD)和LD50)；以及确定引起合适应答的组合物的剂量、其中的组分的浓度以及给予组合物的时间安排。此类确定根据本领域技术人员的知识不需要进行过多实验。
可根据普遍认可的程序，通过使成分混合来制备本文所述的药物组合物。例如，可使有效量的本文所述的至少一种可溶性HMW tau种类拮抗剂和/或本文所述的至少一种tau拮抗剂重悬于合适的药学上可接受的载体中，并可通过加入水或增稠剂、以及可能的控制pH的缓冲液、或额外的控制渗透压的溶质，将该混合物调整至终浓度和粘度。可使有效量的本文所述的至少一种可溶性HMW tau种类拮抗剂和/或本文所述的至少一种tau拮抗剂以及任何其它额外的试剂(例如，用于抑制神经退行性变)与细胞混合物混合。通常，pH可从约3变化至约7.5。在一些实施方式中，组合物的pH可以是约6.5至约7.5。可在考虑到诸如以下因素的情况下，将组合物以医学领域和兽医领域中的技术人员公知的技术和剂量给予：年龄、性别、体重、具体患者的病情、以及用于给药的组合物形式(例如，液体)。可由本领域技术人员在无需过多实验的情况下对人或其它哺乳动物的剂量进行确定。
用于初始给药和进一步用药或用于序贯(sequential)给药的合适方案(regimes)可以变化。在一个实施方式中，治疗方案包括初始给药以及接下来的后续给药(如果必要的话)。在一些实施方式中，可将多次给予的本文所述的至少一种可溶性HMW tau种类拮抗剂和/或本文所述的至少一种tau拮抗剂注射至受试者的脑。例如，可在两次以上、三次以上、四次以上、五次以上或六次以上注射中，给予本文所述的至少一种可溶性HMW tau种类拮抗剂和/或本文所述的至少一种tau拮抗剂。在一些实施方式中，可在各后续给药中给予相同的本文所述的可溶性HMW tau种类拮抗剂和/或相同的本文所述的tau拮抗剂。在一些实施方式中，可在各后续给药中给予不同的本文所述的可溶性HMW tau种类拮抗剂和/或不同的本文所述的tau拮抗剂。注射可在皮质(例如，躯体感觉(somatosensory)皮质)中进行。在其它实施方式中，注射可靠近斑块(例如，β淀粉样蛋白斑或神经原纤维缠结)给予。
可在先前注射(previous injection)后立即给予后续注射，或在至少约1分钟后、至少约2分钟后、至少约5分钟后、至少约15分钟后、至少约30分钟后、至少约1小时后、至少约2小时后、至少约3小时后、至少约6小时后、至少约12小时后、至少约24小时后、至少约2天后、至少约3天后、至少约4天后、至少约5天后、至少约6天后、或至少约7天后给予后续注射。在一些实施方式中，可在至少约1周后、至少约2周后、至少约1个月后、至少约2年后、至少约3年后、至少约6年后或至少约10年后给予后续注射。
在多个实施方式中，如果用药(dosage)使神经退行性变的程度降低了至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、或至少约50％，则认为包含本文所述的药物组合物的用药是药学上有效的，所述神经退行性变的程度降低例如通过神经元存活增加、或神经毒性降低、或脑或认知功能改善来表明。在一个实施方式中，脑或认知功能改善了超过50％，例如至少约60％或至少约70％。在另一实施方式中，与对照(例如，在缺乏本文所述的组合物的情况中)相比，脑或认知功能改善了至少约80％、至少约90％或更高。
本文所述多个方面的实施方式可以根据下列编号段落中的任何一段进行定义：
1.一种包含可溶性高分子量(HMW)tau种类的组合物，其中，所述可溶性HMW tau种类是非纤维状的，具有至少约500kDa的分子量；并且其中，所述组合物基本上不含可溶性低分子量(LMW)tau种类。
2.如段落1所述的组合物，其中，所述可溶性HMW tau种类具有至少约669kDa的分子量。
3.如段落1所述的组合物，其中，所述可溶性HMW tau种类具有约669kDa至约1000kDa的分子量。
4.如段落1-3中任一项所述的组合物，其中，所述可溶性HMW tau种类处于颗粒的形式。
5.如段落4所述的组合物，其中，所述颗粒的粒径范围为约10nm至约30nm。
6.如段落1-5中任一项所述的组合物，其中，所述可溶性HMW tau种类为磷酸化的。
7.如段落1-6中任一项所述的组合物，其中，所述可溶性HMW tau种类在磷酸盐缓冲盐水中是可溶的。
8.如段落1-7中任一项所述的组合物，其中，与所述可溶性LMW tau种类的神经元摄取和神经元至神经元的运输相比，所述可溶性HMW tau种类优先被神经元摄取并从神经元经轴突运输至突触连接的神经元。
9.如段落8所述的组合物，其中，所述可溶性LMW tau种类具有不超过200kDa的分子量。
10.如段落9所述的组合物，所述组合物进一步包含佐剂，所述佐剂用于针对所述可溶性HMW tau种类产生抗体。
11.一种分离的抗体或其抗原结合部分，所述分离的抗体或其抗原结合部分特异性地结合可溶性高分子量(HMW)tau种类，且不结合可溶性低分子量(LMW)tau种类，其中，所述HMW tau种类是非纤维状的，具有至少约500kDa的分子量；并且其中，所述LMW tau种类具有不超过200kDa的分子量。
12.如段落11所述的分离的抗体或其抗原结合部分，所述分离的抗体或其抗原结合部分降低由神经元摄取的所述可溶性HMW tau种类。
13.如段落11或12所述的分离的抗体或其抗原结合部分，所述分离的抗体或其抗原结合部分降低从神经元经轴突运输至突触连接的神经元的所述可溶性HMW tau种类。
14.如段落11-13中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合部分，其中，所述可溶性HMW tau种类具有至少约669kDa的分子量。
15.如段落14所述的分离的抗体或其抗原结合部分，其中，所述可溶性HMW tau种类具有约669kDa至约1000kDa的分子量。
16.如段落11-15中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合部分，其中，所述可溶性HMW tau种类处于颗粒的形式。
17.如段落16所述的分离的抗体或其抗原结合部分，其中，所述颗粒的粒径范围为约10nm至约30nm。
18.如段落11-17中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合部分，其中，所述可溶性HMW tau种类为磷酸化的。
19.如段落11-18中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合部分，其中，所述可溶性HMW tau种类在磷酸盐缓冲盐水中是可溶的。
20.一种防止病理性tau蛋白在突触连接的神经元间传播的方法，所述方法包括选择性地降低与突触连接的神经元接触的可溶性HMW tau种类的细胞外水平，其中，所述可溶性HMW tau种类是非纤维状的，具有至少约500kDa的分子量；其中，所述可溶性HMW tau种类的水平降低使得病理性tau蛋白在突触连接的神经元间的传播降低。
21.如段落20所述的方法，其中，在所述选择性地降低期间，可溶性LMW tau种类的细胞外水平基本上不降低。
22.如段落20或21所述的方法，其中，通过微透析来选择性地降低所述可溶性HMWtau种类。
23.如段落20-22中任一项所述的方法，其中，通过使与突触连接的神经元接触的细胞外间隙或流体与所述可溶性HMW tau种类的拮抗剂接触，来选择性地降低所述可溶性HMW tau种类。
24.如段落23所述的方法，其中，所述HMW tau种类的拮抗剂选自于由以下物质所组成的组：抗体、锌指核酸酶、转录阻抑因子、核酸抑制剂、小分子、适体、基因编辑组合物，以及它们的组合。
25.一种降低受试者中的tau相关神经退行性变的方法，所述方法包括选择性地降低经确定患有或有风险患tau相关神经退行性变的受试者的脑中的可溶性HMW tau种类的水平，其中，所述可溶性HMW tau种类是非纤维状的，具有至少约500kDa的分子量；其中，所述可溶性HMW tau种类的水平降低使得tau相关神经退行性变降低。
26.如段落25所述的方法，其中，在治疗期间，所述受试者中的可溶性LMW tau种类的水平基本上不降低。
27.如段落25或26所述的方法，其中，所述可溶性HMW tau种类的至少一部分存在于所述受试者的脑间质液中。
28.如段落25-27中任一项所述的方法，其中，所述可溶性HMW tau种类的至少一部分存在于所述受试者的脑脊液中。
29.如段落25-28中任一项所述的方法，其中，通过脑微透析来选择性地降低所述受试者的脑中的所述可溶性HMW tau种类。
30.如段落25-29中任一项所述的方法，其中，通过向所述受试者的脑给予所述可溶性HMW tau种类的拮抗剂，来选择性地降低所述可溶性HMW tau种类。
31.如段落30所述的方法，其中，所述HMW tau种类的拮抗剂选自于由以下物质所组成的组：抗体、锌指核酸酶、转录阻抑因子、核酸抑制剂、小分子、适体、基因编辑组合物，以及它们的组合。
32.如段落25-31中任一项所述的方法，所述方法进一步包括对受试者进行选择，所述受试者经确定具有以高于参考水平的水平存在于脑中的可溶性HMW tau种类。
33.如段落25-32中任一项所述的方法，其中，所述tau相关神经退行性变是阿尔茨海默氏病、帕金森氏病或额颞叶痴呆。
34.一种诊断tau相关神经退行性变的方法，所述方法包括：
a.对来自受试者的脑间质液或脑脊液的试样进行分级分离；
b.对所述试样中的可溶性HMW tau种类进行检测，从而确定所述可溶性HMW tau种类的存在和量，其中，所述可溶性HMW tau种类是非纤维状的，具有至少约500kDa的分子量；以及
c.当所述试样中的所述可溶性HMW tau种类的水平与参考水平相同或高于参考水平时，将所述受试者识别为患有或有风险患tau相关神经退行性变；或者
当所述可溶性HMW tau种类的水平低于参考水平时，将所述受试者识别为不太可能患有tau相关神经退行性变。
35.如段落34所述的方法，其中，所述试样基本上不含可溶性LMW tau种类，其中，所述可溶性LMW tau种类具有不超过200kDa的分子量。
36.如段落34或35所述的方法，其中，所述试样包含可溶性LMW tau种类，其中，所述可溶性LMW tau种类具有不超过200kDa的分子量。
37.如段落36所述的方法，所述方法进一步包括对所述试样中的所述可溶性LMWtau种类的量进行检测。
38.如段落34-37中任一项所述的方法，其中，如果所述可溶性HMWtau种类与可溶性LMW tau种类的比例与参考水平比例相同或高于参考水平比例，将所述受试者识别为患有或有风险患tau相关神经退行性变；或者，如果所述可溶性HMW tau种类与所述可溶性LMWtau种类的比例低于所述参考水平比例，将所述受试者识别为不太可能患有tau相关神经退行性变。
39.如段落34-38中任一项所述的方法，其中，通过尺寸排阻进行所述分级分离。
40.如段落34-39中任一项所述的方法，其中，所述检测进一步包括检测所述可溶性HMW tau种类的磷酸化。
41.如段落34-40中任一项所述的方法，其中，所述tau相关神经退行性变是阿尔茨海默氏病、帕金森氏病或额颞叶痴呆。
42.一种对有效降低错误折叠的tau蛋白的跨突触散播的试剂进行识别的方法，所述方法包括：
a.使神经元培养装置第一腔室中的第一神经元与可溶性HMW tau种类接触，其中，所述第一神经元与所述神经元培养装置第二腔室中的第二神经元通过轴突连接，并且其中，所述第二神经元不与所述可溶性HMW tau种类接触；
b.使所述第一腔室中的来自(a)的所述第一神经元与候选试剂接触；
c.检测所述可溶性HMW tau种类从所述第一神经元向所述第二神经元的运输，从而基于检测所述第二神经元的胞体和/或轴突中的所述可溶性HMW tau种类的存在，来识别用于降低错误折叠的tau蛋白的跨突触散播的有效试剂。
43.如段落42所述的方法，其中，所述神经元培养装置是微流体装置。
44.如段落43所述的方法，其中，所述微流体装置包含用于放置第一神经元的第一腔室和用于放置第二神经元的第二腔室，其中，所述第一腔室和所述第二腔室通过至少一个微通道相互连接，所述微通道专门经尺寸设计以允许轴突生长。
45.一种降低tau病变诱导的神经损伤或神经退行性变的方法，所述方法包括：向经确定患有tau病变的受试者的脑给予试剂，所述试剂抑制所述受试者中的内源性细胞内tau蛋白的至少约50％的表达水平，从而在神经原纤维缠结的存在下降低神经毒性(和/或增加神经元存活)。
46.如段落45所述的方法，其中，所述试剂抑制所述受试者中的内源性细胞内tau蛋白的至少约70％的表达水平。
47.如段落45所述的方法，其中，所述试剂抑制所述受试者中的内源性细胞内tau蛋白的至少约90％的表达水平。
48.如段落45所述的方法，其中，所述试剂抑制所述受试者中的内源性细胞内tau蛋白的至少约95％的表达水平。
49.如段落45-48中任一项所述的方法，其中，所述试剂扰乱MAPT(微管相关蛋白tau)基因的表达。
50.如段落45-49中任一项所述的方法，其中，所述试剂抑制MAPT基因的转录。
51.如段落45-50中任一项所述的方法，其中，所述试剂选自于由以下试剂所组成的组：抗体、锌指核酸酶、转录阻抑因子、核酸抑制剂、小分子、适体、基因编辑组合物，以及它们的组合。
52.如段落45-51中任一项所述的方法，其中，经由载体向脑给予所述试剂。
53.如段落52所述的方法，其中，所述载体是腺相关病毒。
54.如段落45-53中任一项所述的方法，其中，进一步确定所述受试者的脑具有β淀粉样蛋白斑，并且，所述给予在β淀粉样蛋白的存在下降低神经毒性(和/或增加神经元存活)。
55.如段落45-54中任一项所述的方法，其中，所述tau病变是阿尔茨海默氏病、帕金森氏病或额颞叶痴呆。
56.一种固体支持物，所述固体支持物包含固定于其上的可溶性HMW tau多肽，所述支持物基本上没有LMW tau。
57.一种HMW tau多肽的制剂，所述制剂在一个或多个tau多肽单体之间包含共价交联。
58.一种组合物，所述组合物包含共价缀合至载体多肽或佐剂的HMW tau。
一些选择的定义
为了方便起见，本文将在说明书、实施例和所附权利要求书中使用的一些术语汇集在此。除非另有说明或从上下文中暗示得到，下列术语和短语包含下文所提供的含义。除非另有明确说明或从上下文可明显得到，下列术语和短语不排除该术语或短语在其所属领域已经获得的含义。提供这些定义以帮助描述具体实施方式，而并不打算限制所要求保护的发明，因为本发明的范围仅通过权利要求书加以限定。另外，除非上下文另有要求，单数术语应包括复数，且复数术语应包括单数。
除非另有定义，本文所使用的所有技术术语和科学术语具有与本发明所属技术领域中的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管任何已知的方法、装置和材料可用于本发明的实践或测试中，本文对这方面的方法、装置和材料进行了描述。
在一个方面，本发明涉及本文所述的对于本发明而言必不可少的组合物、方法及它们各自的组成部分，但对于包含未指定的要素(必要或非必要的)而言也是开放的(“包含/包括(comprising)”)。在一些实施方式中，待包括于组合物、方法及它们各自的组成部分的描述中的其它要素限于不会实质上影响本发明的基本特征和新颖性特征的要素(“基本上由…组成(consisting essentially of)”)。这同样适用于所描述的方法中的步骤以及其中的组合物和组成部分。在其它实施方式中，本文所述的发明、组合物、方法及它们各自的组成部分意在排除对该组成部分、组合物或方法而言不是必要要素的任何要素(“由…组成(consisting of)”)。
除非上下文另有明确指示，单数术语“一/该/所述(a/an/the)”包括复数指代物。类似地，除非上下文另有明确指示，单词“或”意在包括“和”。
除了在操作实施例中或另有指示以外，本文所使用的表示成分的量或反应条件的所有数字均应理解为在所有情况下均由术语“约”加以修饰。术语“约”在与百分比连接使用时可意为被提及数值的±1％。例如，约100表示从99至101。
尽管与本文描述的方法和材料相似或等同的方法和材料可用于本公开的实践或测试中，在下文中对合适的方法和材料进行了描述。术语“包含”意为“包括”。缩写“例如(e.g.)”源自拉丁文的例如(exempli gratia)，并且在本文中用于表示非限制性的实例。因此，缩写“e.g.”与术语“例如(for example)”同义。
本文所使用的术语“神经元”是指表达一种或多种神经元特异性标志物的细胞。此类标志物的实例可包括但不限于神经丝、微管相关蛋白-2、tau蛋白、神经元特异性III类β-微管蛋白以及NeuN。在一些实施方式中，神经元可包括有丝分裂后(post-mitotic)并表达一种或多种神经元特异性标志物的细胞。
本文所使用的术语“转录阻抑因子”是指结合至DNA上的特异性位点并防止附近基因转录的试剂(例如，蛋白)。在一些实施方式中，转录阻抑因子是结合至DNA上的特异性位点并防止MAPT基因转录的试剂(例如，蛋白、肽、适体和/或核酸分子)。在一些实施方式中，转录阻抑因子可以是可调节的。
本文和整个说明书中所使用的术语“给予/给药(administering/administration)”是指通过一定的方法或途径将试剂(例如，抗菌剂)置于受试者中，使得此试剂至少部分定位至期望位点(例如感染位点)，从而产生期望的效果。给药途径的实例可包括但不限于颅内给药、皮质内给药、脑室内给药和胃肠外给药。本文所使用的短语“胃肠外给药”是指除了肠内给药和局部给药之外的给药方式，通常通过注射进行。在一些实施方式中，给药可包括导管插入术(使用导管)。
本文所使用的“表达载体”是指DNA分子或此类分子的克隆，所述分子已通过人工干预进行修饰，从而包含以本来不存在于自然界中的方式组合和并置的(juxtaposed)DNA片段。可对DNA构建体进行工程化，以包含可操作地连接至额外的DNA片段(编码期望的感兴趣重组蛋白)的第一DNA片段(编码本文所述的乙酰化抗性的抗可溶性HMW tau种类拮抗剂或tau拮抗剂)。另外，表达载体可包含额外的DNA片段，例如启动子、转录终止子、增强子和其它元件。还可包含一个或多个可选择标志物。用于在多种原核宿主细胞和真核宿主细胞中表达克隆的DNA片段的DNA构建体可从易得的组分制备或从商业供应商购买。
“细胞培养”或“培养”是指细胞在多细胞生物或组织外部的生长和繁殖。用于哺乳动物细胞的合适培养条件在本领域中是已知的。参见例如Animal cell culture：APractical Approach，D.Rickwood编，OxfordUniversity Press，New York(1992)。可在悬浮液中或附着于固体基底时培养哺乳动物细胞。可在具有或不具有微载体的条件下，使用流化床生物反应器、中空纤维生物反应器、滚瓶、摇瓶或搅拌罐生物反应器。
本文所使用的“细胞培养基”是适用于动物细胞(如哺乳动物细胞)在体外细胞培养中生长的介质。细胞培养基制剂在本领域是公知的。通常，细胞培养基由缓冲液、盐、碳水化合物、氨基酸、维生素和微量必需元素构成。“无血清”适用于不含动物血清(如胎牛血清)的细胞培养基。各种组织培养基(包括限定(defined)培养基)是可商购得到的。
本公开通过以下实施例进行进一步说明，以下实施例不应被解释为限制性的。实施例仅是说明性的，而并不打算以任何方式限制本文所述的任何方面。另外，可在不脱离本发明的范围和精神的情况下，对所公开的实施方式进行多种改变和修改，这对本领域技术人员来说将是显而易见的。下列实施例不以任何方式限制本发明。
实施例
实施例1.源自于tau转基因小鼠和人阿尔茨海默氏病脑的新型磷酸化高分子量tau种类的摄取和传播
微管相关蛋白tau的积累和聚集(1)，作为被称作神经原纤维缠结(NFT)的细胞内包涵体，是包括阿尔茨海默氏病(AD)在内的神经退行性疾病的病理性标志(2、3)。AD中的认知缺陷与处于分级模式的NFT的进展最紧密相关，其起始于内嗅皮质(EC)，并在疾病进展期间蔓延整个脑(4、5)。尽管这一特征性tau病理散播的确切机制尚不清楚，在先报道表明了tau蛋白在神经元间的跨突触传递(6-8)。通过开发选择性地在EC中过表达人突变P301Ltau的早期AD的rTgTauEC小鼠模型，先前已证明了聚集的tau在突触连接的下游区(如齿状回(DG))中积累，表明NFT传播通过病理性错误折叠的tau蛋白的跨突触散播发生(9-12)。已报道tau能以活性依赖的方式从完整神经元分泌到细胞外间隙中(13、14)。然而，在先报道均未识别出可被神经元摄取、因而促进tau病理散播的特异性细胞外错误折叠的tau种类。对tau传播分子基础的更好理解是防止从早期轻度记忆损伤进展至完全认知退化和痴呆的关键。
在先报道显示细胞的tau摄取和跨细胞传播在体外和体内的多个系统中发生；然而，参与神经元至神经元传递的tau种类是否是纤维状的，以及其特定属性是什么，均未在任何在先报道中讨论。
在这一实施例中，为了识别负责传播的特定tau种类，本发明人对比了不同tau种类的摄取和传播特性，所述tau种类源自于：tau转基因小鼠品系rTg4510(表达聚集的P301Ltau(0N4R))(15)和rTg21221(表达非聚集的野生型人tau(0N4R))(16)的脑提取物；人散发型AD和其它tau病变(具有P301L或G389R tau突变的两个家族性额颞叶痴呆病例)脑提取物；以及重组野生型全长人tau(2N4R，441aa)。将tau的不同种类经由差速离心和尺寸排阻色谱(SEC)进行分级分离并进行生化表征，并在小鼠原代皮质神经元中对各tau种类的神经元摄取进行评估。对于所有不同来源的tau，使用高分辨率原子力显微镜(AFM)仅观察到了特征为低聚和非纤维状的高分子量(HMW)tau的有效摄取。
使用新开发的微流体神经元培养平台对神经元间tau的转移进行检查，该平台包含三个不同的腔室，所述腔室通过细通道的阵列连接，从而在不同腔室中的神经元间精确地控制轴突生长和突触连接的形成。此外，使用了独特的大孔(1,000kDa截留)探针体内微透析(17、18)来研究HMW tau种类在清醒的、活动自由的小鼠的脑间质液(ISF)中的存在。本文所呈现的发现表明，存在于脑细胞外间隙中的PBS可溶性磷酸化HMW tau种类参与了神经元摄取和传播，并且可以是用于治疗性干预和生物标志物开发的靶点。
结果
被神经元摄取的tau种类的识别和表征
被神经元摄取的tau种类的识别和表征对于理解神经元至神经元的tau传播机制是至关重要的。首先检查了参与神经元摄取的tau种类的分子量(MW)。通过以3,000g、10,000g、50,000g或150,000g离心从过表达人突变P301L tau的rTg4510小鼠制备PBS可溶性脑提取物，并将上清液施用至小鼠原代皮质神经元。通过细胞内人tau的免疫荧光标记对tau的摄取进行评估。24小时后，在经3,000g和10,000g脑提取物(含有HMW蛋白)处理的神经元中对人tau摄取进行检测。没有发生来自50,000g和150,000g提取物(其中HMW tau通过沉降而被耗竭)的摄取(图1A)。在经过更长孵育处理的神经元中，在2天和5天后，观察到来自3,000g提取物的稳健tau摄取；然而，即使在孵育5天后，仅发生来自150,000g提取物的极少摄取(图1B)。
然后，通过尺寸排阻色谱(SEC)对包含在各个脑提取物中的tau种类的MW大小分布进行评估。除占优势的单体/二聚体峰(SEC Frc.13-16，50kDa-150kDa)之外，3,000g脑提取物还具有HMW tau种类的小峰(SEC Frc.2-4)；而来自同一rTg4510小鼠脑的150,000g脑提取物仅具有单体/二聚体峰以及微量的HMW tau种类(图1C和图1D)。通过将各SEC部分与原代神经元进行孵育来验证HMW tau种类在神经元摄取中的参与(图1E)。就HMW部分(Frc.2、Frc.3)而言观察到最大量的tau摄取。基本上未从丰度显著更高的较低MW的部分观察到可检测的摄取，表明HMW tau种类是被摄取的形式。
然后，借助原子力显微镜(AFM)对通过免疫沉淀从HMW脑提取物部分分离的tau进行表征(图1F-图1G)。HMW SEC部分(Frc.3)包含小的低聚但非纤维状的tau聚集体(图1F)。Tau低聚物尺寸分布显示12.1nm±1.5nm(h1)和16.8nm±4.2nm(h2)(高度±s.d.，n＝1206)的颗粒高度(图1G)。Tau粒径很好地对应了由不同全长tau异形体组装而来的tau原纤维(fibrils)的高度(19)。因此，在一些实施方式中，此类含tau颗粒可仅由tau组成。在一些实施方式中，此类含tau颗粒也可包含其它成分，例如蛋白和脂质。
在暴露至rTg4510脑提取物后2-5天，在原代神经元内观察到的人tau种类是Alz50阳性的(图1H，顶部)，但对于硫黄素-S(ThioS)染色呈阴性(图1H，底部)，表明被摄取的tau处于病理性构象的初期。此外，在第3天，被原代神经元摄取的tau种类与亚细胞细胞器标志物(诸如高尔基体和溶酶体)共定位(图1I)。
人tau的摄取以时间和浓度依赖的方式发生(图1J和图1K)。可在孵育12小时后观察到人tau与亚细胞标志物(高尔基体，TGN46)的共定位，并在第10天观察到更高程度的共定位(图1J，白色箭头)。施用不同的人tau浓度，确定了神经元摄取检测所需的来自rTg4510脑提取物的HMW tau的最低浓度为10ng/ml(图1K)，该浓度低于tau转基因小鼠中的tau的ISF水平(约250ng/ml(20))。
神经元摄取磷酸化HMW tau
为了评价tau聚集和磷酸化对于神经元摄取的相关性，从rTg21221小鼠制备3,000g脑提取物，并将该提取物的摄取和生化性质与rTg4510小鼠匀浆物的摄取和生化性质进行了比较。在与rTg4510小鼠相同的启动子下，rTg21221小鼠过表达野生型人tau，并在脑中显示错误折叠和聚集的tau种类的磷酸化，但未显示积累(16)。与rTg4510小鼠的情况不同，在第2天，在原代神经元中未观察到来自rTg21221脑提取物的摄取(图2A，顶部四幅图)，不过，一些摄取在更长的孵育后是明显的(第5天)(图2A，底部四幅图)，表明与P301L突变tau相比，野生型tau形成的种类具有更慢或稳健性更低的摄取动力学。PBS可溶性脑提取物中的人tau水平和总tau水平与rTg4510脑中看到的人tau水平和总tau水平是相当的(图2B和图2C)，而western印迹中tau条带的上移(图2C，箭头)表明rTg4510脑中tau磷酸化的程度更高。
使用10种不同的磷酸化tau表位特异性抗体对rTg4510提取物和rTg21221提取物中的tau磷酸化程度进行比较(图2D)。与获得自rTg21221的tau种类相比，来自rTg4510脑的PBS可提取tau种类具有更高的磷酸化水平，尤其是与一些特定的磷酸化位点(如pT205、pS262、PS400、pS404、pS409和pS422)相关的tau种类。Tau的MW分布的SEC分析表明rTg21221脑提取物(PBS可溶性，3,000g)主要包含LMW种类和非常低水平的HMW tau种类，而rTg4510脑提取物显示HMW峰和LMW峰二者(图2E和图2F)。摄取到原代神经元中的tau的程度与HMW(SECFrc.2-4，>669kDa)tau水平显著相关，但与中等分子量(MMW)(SECFrc.9-10，200kDa-300kDa)tau水平或LMW(SEC Frc.13-16，50kDa-150kDa)tau水平不相关(图2G)。还通过SEC部分的western印迹分析对rTg4510脑提取物和rTg21221脑提取物之间的HMW tau水平的差异进行了评价(图2H)；来自rTg4510脑的HMW tau是高度磷酸化的(图2H，底部)。这些发现表明磷酸化HMW tau种类被神经元摄取。
在模拟神经元至神经元相互作用的微流体神经元培养平台中的tau的细胞间传播
然后，使用微流体神经元培养平台对神经元间的tau传递进行评估。这一平台的设计包括在神经元间形成分层突触连接的三个不同的腔室，将神经元铺在不同的腔室和微槽阵列(通过尺寸而允许专门的轴突生长)上(图3A)。将两组神经元铺在第一腔室和第二腔室中(图3A)。来自第一腔室神经元的轴突在四天内延伸到第二腔室中(图3B，左侧)，来自第二腔室神经元的轴突延伸至第三腔室(图3B，中间)。因此，所得的两组神经元在第二腔室处具有“直列式(in line)”突触连接(图3B，右侧)。用绿色荧光蛋白(GFP)标记第一腔室神经元，并用红色荧光蛋白(RFP)标记第二腔室神经元，用流体静压屏障将不同腔室中的神经元流体隔离(21)。这示出了两个神经元群在第二腔室中彼此相连(图3C)。
源自于rTg4510小鼠脑的tau种类在微流体腔室中的神经元至神经元传递
使用三腔室微流体神经元腔室对源自于rTg4510小鼠脑的tau种类的传播特性进行了评估。将来自rTg4510小鼠的PBS可溶性脑提取物(3,000g，500ng/ml人tau)加入至第一腔室(图4A)。为了确保仅第一腔室神经元暴露至脑提取物，通过反方向的对流(流体静压屏障)阻断各种tau种类的扩散驱动的运输。孵育5天后，在来自第一腔室的神经元的轴突中以及第二腔室中的神经元的胞体中检测到人tau阳性神经元(图4B)，表明第一腔室神经元摄取的人tau种类已通过第一腔室神经元的轴突运输并转移到了第二腔室神经元中。与第一腔室神经元建立较少或未建立轴突-树突连接的神经元(在第二腔室的侧面储存部中)仍对人tau染色呈阴性(图4B，底部)，表明来自第一腔室的轴突输入有利于tau传递。还在从人tau阳性的第二腔室神经元延伸出的轴突和树突中检测到人tau(图4C)，表明tau种类被进一步运输到第三腔室中。
微流体装置中的tau传播是浓度依赖性的；并且，当使用了500ng/ml-600ng/ml的人tau(在第一腔室中)时，在数天的过程中检测到向第二腔室神经元的传播(图4D和图4E)。这些浓度与tau转基因小鼠中的ISFtau水平是类似的(20)。时程分析显示了人tau在第一腔室神经元中的早期摄取(早在第1天时)、5天后传播至第二腔室神经元以及8天后传播至第三腔室中的第二腔室神经元轴突末端(图4E)。第一腔室和第三腔室之间大于1300μm的距离表明，为了在第8天到达第三腔室，tau的运输不能仅依靠扩散。
内化的(internalized)HMW tau的高轴突运输持续性以及稳定性
为了评估摄取后原代神经元中tau的稳定性，将来自rTg4510的脑提取物(3,000g，500ng/ml人tau)加入微流体装置的第一腔室中，并在tau传播至第二腔室神经元之前(在第2天，图4E)或之后(在第5天，图4E)去除过量的tau，进一步将神经元分别培养6天(第2-8天)或9天(第5-14天)(图5A)。出乎意料的是，即使在传播前在从第一腔室去除脑提取物后，在第二腔室中也检测到人tau阳性神经元(第8天，去除过量tau后6天)(图5B)。类似地，在第8天(从第一腔室去除脑提取物后3天)，在第三腔室中观察到人tau阳性轴突(图5C)。这些发现表明，一旦一定量的tau被神经元摄取，即使在去除可传递的细胞外tau种类后，tau也可传播至下一神经元。在从培养基洗掉人tau之后，可在长达6天(第2-8天，图5B)或9天(第5-14天，图5C)的时间中检测到第一腔室神经元摄取的tau种类或传播至第二腔室神经元的tau种类，表明HMW tau种类在培养的神经元中缓慢降解。
源自于人AD脑的磷酸化HMW tau种类的神经元摄取
接下来检查了源自于人AD脑组织和对照脑组织的tau种类的摄取和传播特性。与前面所示的rTg4510脑提取物类似，来自人AD脑的PBS可溶性提取物包含可被小鼠原代神经元摄取的tau种类(图6A)。再次仅在3,000g提取物中发现了这些tau种类(图6A-图6B)。未观察到来自人对照脑提取物的摄取(图6A-图6B)。被神经元摄取的tau种类与高尔基体和溶酶体标志物共定位(图6C)，表明tau的内化和细胞内加工。在7天内，来自AD脑提取物的tau种类也在三腔室微流体装置中的神经元间传播(图6D)。
来自AD脑和对照脑的脑提取物中的总tau水平是类似的，示出AD脑中PBS可溶性tau水平降低的趋势(图6E)。然而，当与对照脑相比时，AD脑提取物(3,000g)包含显著更高水平的磷酸化HMW tau(图6F和图6J)。出乎意料的是，AD脑提取物和对照脑提取物(PBS可溶性，3,000g)在SEC分析上具有总量相当的HMW tau种类(图6G和图6H)，尽管原代神经元从AD提取物和对照提取物中的tau摄取存在明显差异(图6A)。通过将各SEC部分与原代神经元孵育来确认源自于AD脑的HMW tau种类在神经元摄取中的参与(图6I)。即使在以100倍高的浓度(在培养基中，5ng/ml vs.500ng/ml人tau)供给tau时，也几乎没发生较低MW的部分的摄取。
然后对各SEC部分中的tau种类的磷酸化水平进行测量。与来自对照脑的HMW tau种类相比，来自AD脑的HMW tau种类是高度磷酸化的(图6J)。值得注意的是，在HMW部分中检测出了来自PBS可溶性AD脑提取物的大部分的高度磷酸化tau种类(图6J)。这些发现表明磷酸化HMW tau种类存在于来自AD脑组织的PBS可溶性提取物中，并表明这些磷酸化形式可为通过神经元摄取并传播的形式中的至少一种。
Tau的磷酸化与神经元摄取相关
为了检查磷酸化在tau的摄取和传播中的作用，制备了具有P301L tau基因突变和G389R tau基因突变的FTD脑的PBS可溶性提取物(图7A)，该提取物同样包含可被原代神经元摄取的tau种类(图7B，左侧)，但其tau磷酸化状态与AD脑提取物不同(pS396，图7C)。来自这些脑提取物的tau摄取程度比在AD脑提取物中看到的tau摄取程度低(图7B，右侧)并与tau磷酸化水平相关(图7C)。
接下来试图确定对于神经元摄取而言，翻译后修饰或简单而言低聚物的尺寸是否是期望的。为此，从重组人野生型全长tau(441aa)制备了单体-二聚体-低聚物的tau混合物，并通过SEC对其进行分离(图7D)。然后，将该非磷酸化tau混合物的各SEC部分与小鼠原代神经元孵育(图7E)。在原代神经元中，即使从HMW tau部分都未观察到摄取(图7F)。总体而言，不希望受到理论的限制，这些发现表明对于神经元摄取而言，磷酸化、其它翻译后修饰或与tau之外的分子的复合(complexation)可能是需要的，尽管rTg4510小鼠脑或人AD脑和FTD脑中的内源性tau在测试条件下可能采取不同于重组tau蛋白的构象。
原代神经元可摄取脑的细胞外tau种类
已知可溶性tau种类存在于脑的间质液和脑脊液(CSF)中(20)。然而，由于例如微透析探针的限制，先前并未报道死后脑中的本文所述的可溶性HMW tau种类。如图8A中所示，发明人采用了具有推拉式灌注系统的独特的大孔(1,000kDa截留)探针微透析技术，该技术允许从清醒的、活动自由的小鼠的脑ISF中持续收集HMW分子(17，18)。SEC分级分离以及随后的人tau特异性ELISA表明，除了单体/二聚体tau或截短的tau之外，来自rTg4510小鼠的脑ISF还包含HMW tau种类(图8C)。用足以检测tau摄取的40ng/ml总人tau(图8E)孵育3天后，来自rTg4510小鼠的ISF tau被原代神经元摄取(图8D)。这些数据显示存在于清醒的、行为正常的动物的ISF中的分泌的tau可被神经元摄取，因此，不希望受到理论的束缚，可解释在转基因模型中观察到的跨神经系统的tau传播。
讨论
对于理解错误折叠的tau在AD和其它tau病变中传播的机制而言，识别可在神经元间传递的tau种类是必要的。在此，对多种来源的tau的摄取和传播特性进行了表征：来自tau转基因小鼠的脑提取物和ISF、来自死后AD患者和FTD患者的脑提取物、以及重组人tau蛋白。发现仅占试样中全部tau的一小部分的稀有HMW tau种类被神经元稳健地摄取，而单体尺寸/二聚体尺寸的tau的摄取是非常低效的；从微流体神经元培养平台得到的发现显示，这一稀有种类能够独特地在神经元间传播。此外，可在rTg4510动物的脑ISF(当动物清醒且行为正常时获得)中识别出具有类似生化特性的tau，表明tau存在于脑中；这一ISF还可提供可在培养中被神经元摄取的tau。总体而言，这些数据表明：(i)相对稀有的、HMW、磷酸化tau低聚物从神经元释放并在脑ISF中发现；以及(ii)这一种类可被摄取、经轴突运输、分泌，并被突触连接的神经元摄取，并因此“传播”。这些结果可允许对“传播”种类的进一步分子表征，并为在数天内对传播进行体外分析提供技术平台，这与利用转基因小鼠模型(约18个月)(10)或小鼠皮质中的脑匀浆物的注射(1-2个月)(22)进行的分析相比具有显著更快的时间尺度。
来自表达聚集的P301L tau的小鼠(rTg4510)的tau的摄取取决于tau MW，与磷酸化水平相关。这些发现表明低聚化和病理性磷酸化增加了tau的摄取效率。因此，来自表达非聚集野生型人tau的小鼠(rTg21221)的tau(包含少量的HMW tau和较少的磷酸化tau)显示更慢的摄取。HMW tau种类具有病理性错误折叠的构象(对Alz50抗体染色呈阳性)，并在AFM中以低聚结构出现。先前研究报道，合成的tau原纤维(23-26)或提取自tau转基因小鼠脑的纤维状tau种类(22、27)(并非本文所述的可溶性HMW tau种类)能被神经元摄取，并在体外和体内诱导丝状tau病变。本文的发现表明更易溶的、错误折叠的tau低聚物存在于细胞外间隙中，且同样有可能在传播中发挥作用。
本文所述的发现并不完全排除较低MW的tau种类参与了摄取和传播的情况。很有可能这项研究中使用的tau浓度对于LMW tau种类的摄取而言太低(500ng/ml人tau蛋白)，或免疫染色不够灵敏以检测神经元内化的LMW tau。Michel等(28)表明细胞外单体tau(LMWtau种类)以高达1μM(约55μg/ml)的浓度进入SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞。
相较于对照脑，来自人AD脑的PBS可溶性提取物含有类似量的HMW tau，但显示显著更高的tau磷酸化和摄取，表明磷酸化在HMW tau摄取中的作用。此外，从重组tau制备的非磷酸化HMW tau种类的摄取极少。来自具有P301L突变和G389R突变的FTD患者的PBS可溶性脑提取物也含有高度磷酸化的tau，并显示神经元tau摄取。Tau摄取在AD脑皮质提取物中最高，其次是G389R tau突变脑提取物，然后是P301L tau突变脑提取物，这似乎与在各个脑提取物中观察到的tau磷酸化水平的程度一致。虽然P301L明确支持NFT形成(图7A)，但G389R突变与不含丝状tau包涵体的额颞叶痴呆有关，因此，表明可溶性tau种类(而不是丝状聚集体)参与了本文所述的传播现象。不希望受到理论的束缚，磷酸化、聚集或这两者可以是对于HMW tau的传播和摄取而言期望的因素。
Yanamandra等报道了虽然免疫治疗没有改变可溶性部分tau的水平，但抗tau抗体改进了tau转基因小鼠模型中的认知缺陷(与脑不溶性tau种类(70％甲酸部分)的减少相关)(29)。换言之，Yanamandra等没有描述使用抗体来特异性靶向本文所述的可溶性HMWtau种类或可溶性HMW磷酸化tau种类。与丰度高得多的单体/二聚体尺寸的低MW tau种类相反，在本实施例中表征的HMW磷酸化tau种类的量在AD脑提取物中占总PBS可溶性tau的不到1％，且即使在突变tau过表达的rTg4510小鼠脑提取物中也只占总PBS可溶性tau的不到10％。治疗性靶向此类低丰度HMW tau种类可以是更有效的治疗途径。
如本实施例中所示，HMW tau的神经元摄取可在24小时内发生。显示在类似的时间尺度内，tau原纤维经由巨胞饮作用进入细胞(29)。此外，本文发现HMW tau的传播和摄取是浓度依赖性的。值得注意的是，来自HMW SEC部分的tau摄取以相当低的浓度(小于50ng/ml人tau)发生，所述浓度比就tau转基因小鼠而言报道的ISF总tau水平更低(20)。
应当注意的是，tau摄取在微流体装置的第一腔室的神经元中发生后，即使从第一腔室去除全部过量的tau后，tau向第二腔室中的神经元的传播继续进行。在一些实施方式中，这表明试图在AD中阻断tau传播的干预需要在疾病的初期、在实质性tau积累发生之前开始。
长期以来，一直认为不溶性tau聚集体的细胞内积累对神经元是有毒的(30)；然而，最近的报道讨论了不溶性tau聚集体不足以损伤神经元功能(31-34)。此外，细胞外tau可结合并活化神经元毒蕈碱受体(35、36)，表明迄今为止已在很大程度上忽视了tau的细胞外功能。识别细胞外tau种类的正常作用和病理生理学作用可使得开发出针对可溶性tau种类(如可溶性HMW tau种类)的新型高效的治疗策略成为可能。
本文所呈现的发现至少部分地示出了，存在于细胞外间隙中的PBS可溶性HMW磷酸化tau种类参与了神经元间的摄取和传播。进行干预以将此类特异性的细胞外tau种类耗竭可抑制tau传播并由此抑制tau病变中的疾病进展。
实施例1中使用的示例性材料和方法
动物。在该研究中使用了11月龄至13月龄的rTg4510、rTg21221和对照动物。rTg4510(P301L tau)小鼠是良好表征的tau病变模型，该小鼠过表达具有P301L额颞叶痴呆(FTD)突变的全长人四重复tau(0N4R)(15)。rTg21221(野生型tau)小鼠以与rTg4510小鼠相当的水平表达野生型人tau，且未显示tau病变在脑中的积累(16)。使用仅具有激活因子CK-tTA转基因的同窝动物(不过表达tau)作为对照。兼用雄性小鼠和雌性小鼠。所有实验都是在国家(美国国立卫生研究院)规章和机构规章下进行的。
人脑试样。来自以下受试者的额叶皮质的冷冻脑组织例如从Massachusetts阿尔茨海默氏病研究中心脑库(Massachusetts Alzheimer’s Disease Research CenterBrain Bank)获得：患有AD的三个患者、三个非痴呆对照受试者以及两个家族性额颞叶痴呆病例(P301L tau突变和G389R tau突变)。下表2中示出了受试者的人口统计学特征。所有研究受试者或他们的近亲都签署了脑捐献知情同意书，而且Massachusetts总医院机构审查委员会(Massachusetts General Hospital Institutional Review Board)批准了该研究方案。所有AD受试者满足就AD的高可能性而言的NIA-Reagan标准。根据下列部分(脑提取)中所述的，对皮质灰质进行称重和处理。
表2.研究中使用的患有AD、FTD的受试者以及对照受试者的特征
脑提取。用含有蛋白酶抑制剂(蛋白酶抑制剂混合物；Roche，Indianapolis，IN，美国)的冷PBS对小鼠进行灌注，将脑快速切除并冷冻在液氮中，然后在使用前储存于-80℃下。使用Teflon-玻璃匀质器在5体积(wt/vol)的冷PBS中对脑组织进行匀浆。对匀浆物进行短暂超声处理(Fisher Scientific Sonic Dismembrator Model 100，输出2，6×1秒)，并在4℃下以3,000×g离心5min(3,000g提取物)，在4℃下以10,000×g离心15min(10,000g提取物)，在4℃下以50,000×g离心30min(50,000g提取物)，或在4℃下以150,000×g离心30min(150,000g提取物)。收集上清液并在使用前储存于-80℃下。
原代皮质神经元培养。如以前所述(37)并加以修改，从胎龄(E)14-15CD1小鼠胚胎(Charles River实验室)的脑皮质制备原代皮质神经元。将皮质解剖出，并在补充有10％胎牛血清、2mM Glutamax、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的Neuro-basal培养基(LifeTechnologies公司，Gaithersburg，MD，美国)(铺板培养基)中机械离解，以150g离心5min，并重悬于相同的培养基中。将神经元以0.6×105个活细胞的密度铺板在Lab-Tek 8孔分室盖玻片(Nalge Nunc)或微流体装置(参见下面的细胞密度和方案)上过夜，所述盖玻片或微流体装置预先包被有聚-D-赖氨酸(50μg/ml，Sigma)。将培养物保持在37℃、5％CO2条件下的Neuro-basal培养基中，该培养基具有2％(v:v)B27营养物、2mM Glutamax、100U/ml青霉素以及100g/ml链霉素(培养基)。
原代神经元中的tau摄取。使用如下物质对小鼠原代神经元(在体外7天-8天)进行孵育：来自小鼠(rTg4510或rTg21221动物)或人(对照、散发型AD或家族性额颞叶痴呆病例)脑组织的PBS可溶性脑提取物(3,000g、10,000g、50,000g或150,000g离心上清液、或来自3,000g提取物的SEC部分)、来自rTg4510/对照小鼠的微透析液、或重组tau低聚物混合物溶液。将神经元保持在37℃、5％CO2的加湿培养箱中。将每个试样用培养基稀释，以获得指定的人tau浓度(通过人tau ELISA测量)。将神经元用PBS充分洗涤、固定、并用人tau特异性抗体(Tau13)进行免疫染色，以在指定的时间点检测小鼠原代神经元中外源性施加的人tau。对于本实施例中描述的大部分实验，将总(人和小鼠)tau抗体(DAKO)用作神经元标志物。在孵育前将各个试样通过0.2-μm膜过滤器进行过滤，以去除大聚集体和原纤维。
原子力显微镜(AFM)。如以前所述并稍加修改(38)，对来自rTg4510脑提取物的tau进行免疫沉淀(IP)分离以用于AFM分析。简言之，用人tau特异性Tau13抗体包被甲苯磺酰基活化的磁性Dynabeads(#14203，Life Technologies)。对珠子进行洗涤(0.2M Tris，0.1％牛血清白蛋白，pH 8.5)，并在室温(R.T.)下用来自rTg4510小鼠(10,000g，总提取物)的PBS可溶性脑提取物或HMW SEC部分(来自10,000g提取物的Frc.3)试样孵育1小时。用PBS将珠子洗涤三次，并用0.1M甘氨酸(pH 2.8)洗脱，各洗脱部分的pH立即用1M Tris(pH 8.0)调节。如以前所述(19)，对于AFM成像而言，在PBS中，将分离的tau部分吸附到新鲜切割的白云母(muscovite mica)上，并使用振荡模式AFM(Nanoscope III，Di-Veeco，Santa Barbara，CA)和Si3N4悬臂(NPS系列，Di-Veeco)成像。
体内微透析。如以前所述(17、18)，进行脑间质液tau的体内微透析取样。微透析探针具有4mm的轴(shaft)，具有3.0mm、1000kDa分子量截留(MWCO)的聚乙烯(PE)膜(PEP-4-03，Eicom，Kyoto，日本)。该探针包含邻近顶部的通气孔，用于在对大气开放的探针内产生流体的储存部。这一结构使压力最小化，所述压力否则会导致净流灌注液通过大孔膜流出。在使用前，通过使探针短暂浸入乙醇中对其进行调节，然后用经0.2μm孔径的膜过滤的人工脑脊液(aCSF)的灌注缓冲液(以mM计：122NaCl、1.3CaCl2、1.2MgCl2、3.0KH2PO4、25.0NaHCO3)洗涤。使用氟化乙烯丙烯(FEP)管(i.d.)，将经预先调节的探针的出口和入口分别连接至蠕动泵(ERP-10，Eicom，Kyoto，日本)和微量注射泵(ESP-32，Eicom，Kyoto，日本)。
如以前所述(17)并稍加修改，进行探针植入。简言之，用异氟烷对动物进行麻醉，同时将引导套管(PEG-4，Eicom，Kyoto，日本)立体定向地植入海马中(前囟-3.1mm，外侧至中线-2.5mm，腹侧至硬膜-1.0mm)。使用二元牙科粘固粉(binary dental cement)将引导套管固定。
引导套管植入后三天或四天，将小鼠置于标准微透析笼中，经由引导套管插入探针。探针插入后，为了获得稳定的记录，在试样收集之前，将探针和连接管用aCSF以10μl/min的流速灌注180min。以0.5μl/min的流速收集试样，并在4℃下储存于聚丙烯管中。在微透析试样收集期间，小鼠是清醒的并在微透析笼中自由活动，将微透析笼设计成允许动物不受限制地运动而不在探针组件上施加压力(AtmosLM微透析系统，Eicom，Kyoto，日本)。
Tau ELISA。根据制造商的说明，利用Tau(总)人ELISA试剂盒(#KHB0041，LifeTechnologies)和Tau[pS396]人ELISA试剂盒(#KHB7031，Life Technologies)对试样(脑提取物、脑ISF试样、重组人tau溶液和SEC分离试样)中人tau的浓度进行确定。
免疫印迹分析。在用于SDS-PAGE的Tris-甘氨酸SDS电泳缓冲液(LifeTechnologies)中，在4％-20％的Novex Tris-甘氨酸凝胶(LifeTechnologies，GrandIsland，NY，美国)上对脑提取物进行电泳。将凝胶转移至PVDF膜，并在室温下在5％(w:v)BSA/TBS-T中对膜进行封闭60min，然后在4℃下在2％(w:v)BSA/TBS-T中用一级抗体过夜进行探测。使用了下列一级抗体：小鼠单克隆抗体DA9(总tau(aa112-129)，Peter Davies提供，1:5000)、小鼠单克隆抗体PHF1(pS396/pS404tau，Peter Davies提供，1:5000)、小鼠单克隆抗体CP13(pS202tau，Peter Davies提供，1:1000)、来自Life Technologies的兔多克隆抗磷酸化tau抗体(pS199(#44734G)、pT205(#44738G)、pS262(#44750G)、pS396(#44752)、pS400(#44754G)、pS404(#44758G)、pS409(#44760G)和pS422(#44764G))(对于这些抗体，以1:2000稀释)、以及小鼠单克隆抗肌动蛋白抗体(#A4700，Sigma-Aldrich，1:2500)。在PBS-T中洗涤三次后，用HRP缀合的山羊抗小鼠(#172-1011，Bio-Rad)或抗兔(#172-1019，Bio-Rad)IgG二级抗体(1:2000稀释)在室温下将印迹孵育1小时。使用ECL试剂盒(WesternLightning，PerkinElmer，Waltham，MA，美国)使免疫反应性蛋白显色、并在Hyperfilm ECL(GE healthcare，Pittsburgh，PA，美国)上检测。除非另有说明，上样量为15μg蛋白/泳道。使用Image J(美国国立卫生研究院)对扫描的图像进行分析。
尺寸排阻色谱(SEC)。使用AKTA净化器10(GE Healthcare),在磷酸盐缓冲盐水(#P3813，Sigma-Aldrich，经0.2μm膜过滤器过滤)中，以0.5ml/min的流速在单一Superdex200 10/300GL柱(#17-5175-01，GEHealthcare)上通过尺寸排阻色谱(SEC)对脑PBS可溶性提取物、ISF微透析液、低聚物tau(重组hTau-441)混合物溶液进行分离。各个脑提取物用PBS稀释，以在350μl的终体积中含有6000ng人tau，将其通过0.2-μm的膜过滤器过滤，然后加载到SEC柱上。通过ELISA(Tau(总)人ELISA试剂盒，在试剂盒缓冲液中稀释1:50)对由SEC分离的各个部分进行分析。对于ISF试样而言，在经0.2-μm膜过滤后，将来自rTg4510小鼠的400μl微透析液加载到柱上，并通过人tau ELISA对SEC部分进行测量。对于低聚物tau混合物溶液而言，将500μl试样(hTau-441，3.35mg/ml(2mM DTT)，经0.2-μm膜过滤器过滤)加载到柱上，将各SEC部分在试剂盒缓冲液中稀释1:200,000以用于人tau ELISA。
免疫细胞化学。将原代神经元用PBS充分洗涤(三次)，并用4％多聚甲醛(PFA)固定15min。将神经元用PBS洗涤，在PBS中用0.2％Triton X-100透化15min(室温)，在PBS-T中用5％正常山羊血清(NGS)封闭(室温)，然后在2％NGS/PBS-T中用一级抗体在4℃下孵育过夜。使用下列一级抗体来检测tau：小鼠单克隆抗体Tau13(人tau特异性(aa20-35)，#MMS-520R，Covance，1:2000)、兔多克隆抗总tau抗体(识别人tau和小鼠tau，#A0024，DAKO，1:1000)、小鼠单克隆抗体Alz50(构象特异性抗体，Peter Davies提供，Albert Einstein College ofMedicine；1:100)。在室温下，将山羊抗小鼠Alexa488二级抗体和抗兔Alexa555二级抗体(Life Technologies，1:1,000)在PBS-T中施用于2％NGS中1小时。使用CY3标记的抗小鼠IgM二级抗体(Invitrogen，1:200)来检测Alz50。在PBS中洗涤后，将盖玻片用水性封片介质(Vectashield)封片。就用ThioS共染色而言，首先将神经元用兔多克隆抗体TAUY9(人tau特异性(aa12-27)，#BML-TA3119-0025，Enzo Life Sciences，1:200)和山羊抗兔Alexa555二级抗体(Invitrogen，1:200)免疫染色，然后在50％乙醇中用0.025％(w:v)ThioS孵育8min。在80％乙醇中使ThioS分化30s。将神经元用水洗涤3min，并使用封片介质(Vectashield)将盖玻片封片。
通过用以下一级抗体共染色来研究人tau的亚细胞定位：兔多克隆抗TGN46抗体(高尔基体标志物，#ab16059，Abcam，1:200)、兔多克隆抗GRP94抗体(内质网标志物，#ab18055，Abcam，1:100)、兔多克隆抗LAMP2a抗体(溶酶体标志物，#ab18528，Abcam，1:200)、兔多克隆抗Rab5抗体(核内体标志物，#ab13253，Abcam，1:200)、兔多克隆抗过氧化氢酶抗体(过氧化物酶体标志物，#ab1877，Abcam，1:200)。使用山羊抗兔Alexa555二级抗体(Invitrogen，1:200)来检测亚细胞标志物。使用共聚焦显微镜(Zeiss Axiovert 200倒置显微镜，Carl Zeiss)取得图像。
脑切片的免疫染色。将十二月龄的rTg4510小鼠通过CO2窒息安乐死，并用4％PFA(PBS中)灌注。将脑在4℃下于4％PFA中后固定2天，在30％蔗糖(PBS中)孵育2天，然后在冷冻滑动切片机上切成40μm厚的矢状(sagittal)切片。将切片用0.2％Triton-X100(PBS中)透化，在5％NGS(PBS中)中封闭，并在2％NGS(PBS中)中的一级抗体(小鼠多克隆抗体Alz50(Peter Davies提供，1:100)中于4℃下孵育过夜。将CY3标记的抗小鼠IgM二级抗体(Invitrogen，1:200)施用于2％NGS(PBS中)中1小时(室温)。在PBS中洗涤后，将脑切片安装于显微镜载玻片上，并用含有DAPI的封片介质(Vectashield)将盖玻片封片。将NFT在50％乙醇中用0.025％ThioS染色8min。使ThioS在80％乙醇中分化30秒。用水洗涤切片3min，并用封片介质将盖玻片封片。
人脑组织的tau免疫染色。将死后人脑组织用10％福尔马林固定，用90％甲酸处理1小时，然后包埋到石蜡中。切成5μm切片，脱蜡，并在水中水合。根据制造商的说明，用ABCVectastain试剂盒(#PK-4001，Vector Laboratories)对切片进行免疫染色。将切片在正常血清中封闭(在室温下30min)，在TBS中洗涤两次，并用兔多克隆抗tau抗体(#A0024，DAKO，在TBS中1:3000)在室温下孵育1小时。在TBS中洗涤两次后，将切片用生物素化的二级抗体(Vector Laboratories)在室温下孵育30min，在TBS中洗涤两次，并用Vectastain ABC试剂在室温下孵育30min。在TBS中洗涤两次后，将切片用DAB过氧化物酶底物孵育，在水中漂洗，然后用苏木精复染色。使用安装有DP 70Olympus数码相机的Olympus BX51显微镜(20×物镜，UPlanApo)来获得图像。
重组人tau表达。使用tau/pET29b质粒(Adgene)在大肠杆菌BL21DE3中表达人全长野生型tau(2N4R，441aa)。在37℃下，通过加入1mM IPTG在OD＝0.6处诱导表达3.5h。通过如以前所述的热处理和FPLC Mono S色谱法(Amersham Biosciences)(39)进行tau纯化。将细胞的300ml培养物在3ml缓冲液[50mM MES pH 6.8、500mM NaCl、1mM MgCl2、5mM DTT]中煮沸20min。将全细胞裂解物以125,000g超速离心45min，并用20mM MES pH 6.8、50mM NaCl、2mM DTT对上清液进行透析(MWCO 20kDa)。通过BCA分析试剂盒(Pierce)、SEC和Western印迹对蛋白和tau含量进行测定。试样包含单体tau、二聚体tau和低聚重组tau的混合物。
微流体三腔室装置。设计了神经元分层(neuron-layering)微流体平台，其中，所述平台由三个不同的腔室构成，所述腔室使用标准软刻蚀技术(40)通过微槽阵列(3μm×8μm×600μm的高度、宽度和长度)连接。对微槽的长度进行选择，从而使得没有MAP2阳性树突进入邻近腔室(图3B)。Taylor等报道了对于将轴突末端与胞体和树突分离，450μm的微槽是足够长的(21)。将平台冲压在各腔室的两个侧面储存部上，并使其粘合至聚-D-赖氨酸(50μg/ml，Sigma)包被的玻璃底培养皿(#P50G-1.5-30-F，MatTek Corporation)，以增强神经元附着。
首先，以每台装置0.6×105个活细胞(在10μl铺板培养基中)的近似密度，将分离自E15小鼠胚胎的原代皮质神经元铺在第一腔室中。15min后(在此期间第一腔室中的大部分神经元附着至培养皿底部)，经由侧面储存部的其中一者将2μl铺板培养基中的0.3×105个活细胞加载到第二腔室中。在将神经元铺到第二腔室中后，立即将微流体装置设置成在培养箱(5％CO2中、37℃)中倾斜(约80度角)，从而使得神经元通过重力沉降至第三腔室附近的表面。因此，第二腔室中的大部分神经元沿第二腔室的侧壁铺成一行，第二腔室具有连接至第三腔室的微槽。我们凭经验建立了这一方案，使得第二腔室中的大部分神经元的轴突能够延伸进入第三腔室(图3B)。3h后，将装置设置为不倾斜的正常位置，并在37℃下在5％CO2中保持在培养基中。每4天-5天更换培养基。
对于tau摄取和传播分析而言，在7DIV或8DIV，将来自rTg4510脑组织和AD脑组织的PBS可溶性提取物加入到第一腔室(总计10μl)。对第二腔室和第三腔室填充40μl培养基(各储存部中20μl)。腔室之间的体积差产生连续对流(“流体静压屏障”；第一腔室中10μl，第二腔室和第三腔室中40μl)，这防止脑提取物从第一腔室扩散进入其它腔室。孵育指定时间段后，如上所述将神经元洗涤、固定、并进行免疫染色(参见“免疫细胞化学”)。
如下所述在微流体装置内进行GFP和RFP的转染(图3C)：首先，用10μl NeuroBasal中的GFP(0.04μg DNA+0.1μl Lipofectamine 2000(#11668-019，Life Technologies))将第一腔室神经元(7DIV)转染3h。如上所述，通过流体静压屏障防止DNA从第一腔室扩散至第二腔室。在将来自第一腔室的含DNA(GFP)的培养基洗涤之后(用NeuroBasal洗涤三次)，将第二腔室神经元用RFP(在10μl NeuroBasal中，0.04μg DNA+0.1μl Lipofectamine 2000)转染3h。通过流体静压屏障防止DNA从第二腔室扩散至第一腔室和第三腔室(在第一腔室和第三腔室中有40μl培养基)。在将来自第二腔室的含DNA(RFP)的培养基洗涤之后(用NeuroBasal洗涤三次)，将装置在37℃下在5％CO2中保持在培养基中。两天后检查GFP和RFP的表达。
使用装配有Zeiss LSM 510META(Zeiss，Jena，德国)共聚焦扫描头(使用488-nm和543-nm激光)的Zeiss Axiovert 200倒置显微镜(Carl Zeiss)对微流体装置中的神经元进行检查。使用25×APO-Plan Neoflu镜头或63×1.2NA C-APO-Plan Neoflu镜头(CarlZeiss)取得所有图像。
统计分析。将所有数据表示为平均值±S.E.M。通过学生t检验进行两组比较。通过方差分析(ANOVA)以及随后的Tukey-Kramer多范围检验进行三个以上组之间的平均值比较。用Spearman秩检验对相关性进行分析。P值小于0.05被认为显著。
实施例2.去除内源性tau不会防止tau传播而且是神经保护性的
神经原纤维缠结(NFT)形成是包括阿尔茨海默氏病和额颞叶痴呆在内的多种神经退行性紊乱的关键特征(1、2)。AD中的进行性缠结出现遵循高度一致的模式：起始于内嗅皮质(EC)，然后NFT病理“散播”至连接的区域(3、4)。在小鼠中，人突变P301L tau表达限于EC(ECrTgTau模型)揭示了错误折叠的tau的跨突触传送(5-7)。Tau错误折叠的“朊病毒样”进展(其中，异常折叠的tau跨突触传播，然后在下游细胞中招募初始的内源性小鼠tau并作为毒性聚集模板)被普遍视为tau病理散播的可能性机制(8-10)。内源性小鼠tau可与人tau共聚集(5、11)。表达突变tau的神经元最终死亡，可能是由于细胞内tau聚集体的积累。
在这一实施例中，本发明人试图确定tau散播和毒性是否依赖于通过错误折叠的“种子”损坏内源性tau的朊病毒样机制。与基于朊病毒相似性的普遍观念相反，本发明人示出了突触tau传递出乎意料地独立于内源性tau在突触后细胞中发生。在内源性小鼠tau存在(ECrTgTau)或不存在(ECrTgTau-Mapt0/0)的条件下，对在EC中表达人P301L tau的18月龄小鼠进行比较，发现从EC传播到海马的人tau的量是类似的。转基因tau的神经元至神经元传递因此可独立于内源性tau发生，并因此与朊病毒样模板化的错误折叠不同。出乎意料的是，与ECrTgTau小鼠相比，ECrTgTau-Mapt0/0小鼠具有显著更少的tau磷酸化、缺乏病理性错误折叠、并表现出更少的胶质细胞增生。此外，在整个皮质中具有P301L tau表达的小鼠(rTg4510模型)在小鼠tau存在(rTg4510)和不存在(rTg4510-Mapt0/0)的条件下均发展出缠结，但在Mapt0/0背景下，在9月龄和12月龄的Tg4510小鼠中观察到的明显的转基因tau诱导的脑萎缩和神经元损失得到了缓解。这些数据表明，内源性tau的缺乏保护神经元免受与突变tau表达和聚集相关的毒性，因此体内tau传播、聚集和毒性没有关系。
在内源性tau缺乏的情况下转基因tau的跨突触传播
聚集tau的神经元至神经元传播(随后是初始内源性tau的模板化错误折叠)已被报道为能够使得NFT病理在AD和其它tau病变中进展的机制。通过类比朊病毒蛋白错误折叠的散播，初始tau的缺乏将使tau的散播停止(12)。鉴于通常认为错误折叠的tau聚集体是有毒的，防止神经元间的tau传递还将消除tau诱导的毒性散播。为了检验这一假设，生成了在内嗅皮质中表达人P301L tau且缺乏内源性小鼠tau的转基因小鼠(ECrTgTau-Mapt0/0)(图10A和图15A)，并检测了tau是否沿穿质通路(perforant pathway)从EC向齿状回(DG)中的神经元传播。出乎意料的是，通过使用人tau N-末端特异性抗体(Tau13和TauY9；图10B)对水平脑切片的免疫染色，ECrTgTau-Mapt0/0小鼠显示出转基因tau向DG神经元的稳健传播。我们发现，与在小鼠tau的存在下表达P301L tau的小鼠相比(ECrTgTau；图10C，n＝4，p＝0.58)，DG中含有人tau的神经元的数量是类似的。在ECrTgTau-Mapt0/0小鼠和ECrTgTau小鼠中，EC(p＝0.29)提取物和HPC(p＝0.14)提取物中转基因tau的水平也是相当的(图10D，图15B-图15C)。在ECrTgTau-Mapt0/0小鼠中用tau C-末端特异性抗体(DAKO，识别小鼠tau和人tau)进行的共标记(图16A)显示N-末端tau和C-末端tau的共同传播，表明全长突变tau的传播在内源性tau缺乏的条件下发生。如在这一品系中所预期的，原位杂交还显示出具有人tau蛋白的DG颗粒细胞不表达人tau mRNA(图16B)。这些结果与朊病毒假说的普遍观念形成对比，在朊病毒假说中，错误折叠的朊病毒蛋白(PrPsc)的传播需要内源性朊病毒蛋白(PrPc)的存在。在ECrTgTau小鼠中报道的突变tau的传播(5、7)因此依赖于已错误折叠的tau的稳健跨突触传递。
在没有内源性tau的情况下tau的过磷酸化和聚集降低
磷酸化对tau的许多细胞功能进行调节，例如微管结合(13)、与突触蛋白的相互作用(14)以及tau的聚集(15)。为了确定磷酸化是否与跨突触tau传递相关，使用tau磷酸化位点特异性抗体对表达tau的EC神经元和接收tau的海马神经元中的tau磷酸化进行了比较(16)。ECrTgTau小鼠(图11A)和ECrTgTau-Mapt0/0小鼠(图11B)均在EC神经元的胞体中显示经CP13(pS202/pT205)和PHF1(pS396/pS404)标记的磷酸化tau，但仅在包含人tau的DG神经元的子集和其过程中显示磷酸化tau；这一发现可部分地通过区别磷酸化的tau的跨突触运输或后突触神经元中的去磷酸化/磷酸化来解释。在脑裂解物中，与ECrTgTau-Mapt0/0小鼠相比，ECrTgTau小鼠在EC(图11E)和HPC(图11F)中均始终显示更高水平的不同磷酸化tau种类(图11C-图11D)。出乎意料的是，野生型(WT)小鼠中的磷酸化tau水平与ECrTgTau小鼠是相当的(图11E-图11F；及图17A-图17C)，表明在ECrTgTau小鼠中小鼠tau磷酸化对总的高磷酸化tau水平具有主要贡献。对ECrTgTau小鼠相对于ECrTgTau-Mapt0/0小鼠的tau传播效率进行估计，发现ECrTgTau-Mapt0/0小鼠中人tau和PHF1tau的HPC:EC比例类似，但CP13tau的HPC:EC比例显著降低(图11G)。有趣的是，虽然表达转基因tau的所有EC神经元都对PHF1和CP13呈阳性(图11A-图11B)，但两个小鼠品系均在中间分子层中显示EC轴突末端区的强烈的突触前PHF1标记，而非CP13标记(图11A-图11B；MML)，表明在pS394/pS404(PHF1)处的tau磷酸化高于pS202/pT205(CP13)可将tau靶向至轴突末端(17)。在18月龄的ECrTgTau小鼠中，EC和DG中的神经元以及MML中的轴突末端包含“错误折叠的”(Alz50-阳性)tau(图11A)(5)。然而，在18个月时，未能在ECrTgTau-Mapt0/0小鼠的任何脑区域中检测到Alz50染色(图11B)。在EcrTgTau小鼠的EC和DG细胞体中发现了经缠结染料噻嗪红(ThiaRed)染色的聚集的tau，但未在ECrTgTau-Mapt0/0小鼠中发现(图18A-图18B)。本文所呈现的发现显示，tau传播可在内源性tau缺乏的情况下发生并独立于明显(overt)聚集，从而将传播现象与NFT形成分离开来。
在ECrTgTau小鼠中内源性tau缺乏的情况下神经毒性降低
接下来试图确定在小鼠tau缺乏的情况下，降低的tau聚集是否伴随着降低的神经毒性。在18月龄时，未检测到细胞死亡或突触蛋白(突触蛋白-1)损失(图19A-图19B)。然而，可将胶质细胞增生和神经丝蛋白的磷酸化增加作为炎症和神经元损伤的早期间接征象(18)。与WT小鼠相比，在ECrTgTau小鼠的EC中存在显著更高数量的小胶质细胞和水平增加的Iba1，这在ECrTgTau-Mapt0/0小鼠中得到部分挽救(图12A)。因此，与ECrTgTau动物相比，在ECrTgTau-Mapt0/0动物中，EC提取物和HPC提取物中的GFAP水平显著降低(图12B)。免疫染色显示出ECrTgTau小鼠EC中强烈的神经丝蛋白磷酸化(SMI312)以及轴突投射；ECrTgTau-Mapt0/0中的SMI312标记与WT小鼠和Mapt0/0小鼠相当(图12C)。这些数据显示轴突变化和胶质细胞应答先于明显的神经退行性变(19)，并显示小鼠tau的缺乏使早期病理性变化减弱且可能是tau毒性所需要的。
内源性tau的去除挽救了P301L tau诱导的脑萎缩
虽然经常将聚集和毒性视为相关的现象，但在先报道讨论了tau聚集形成与急性神经元死亡(20)或功能改变(21、22)没有关系。在此，本发明人通过利用人P301L tau皮质广泛表达的小鼠模型(23)(rTg4510)(该模型发展出稳健的晚期NFT病理和脑萎缩)，进一步探讨了小鼠tau敲除背景是否影响tau聚集和/或毒性，并将此rTg4510小鼠品系与小鼠tau敲除小鼠杂交(rTg4510-Mapt0/0)。在9月龄时，与WT小鼠和Mapt0/0小鼠相比，rTg4510小鼠的全脑重量显著降低了≈16％(n＝6；p＝0.0002)，且皮质(CTX)厚度降低了≈26％(n＝3只小鼠，p＝0.009)(图13A-图13B)。在12月龄时，rTg4510小鼠中的脑重量和皮质厚度更进一步降低。出乎意料的是，在9个月的rTg4510-Mapt0/0小鼠中，脑物质的这一大幅损失得到完全挽救(脑重量：≈96％，n＝5；CTX厚度：≈96％，n＝3)，且在12月龄的ECrTgTau-Mapt0/0小鼠中仅发生轻微萎缩。在rTg4510-Mapt0/0动物中，rTg4510的CA1中的神经元和体积损失得到部分挽救(图20A-图20B)。因此，本文所述的发现显示，在小鼠tau缺乏的情况下，神经元的健康和存活得到极大改善。
接下来试图确定在内源性tau缺乏的情况下NFT病理是否也得到挽救。在9个月的rTg4510-Mapt0/0小鼠的CTX和CA1中，磷酸化tau阳性(PHF1)缠结样tau包涵体的数量明显降低(图13C)，而且，有趣的是，PHF1tau在rTg4510-Mapt0/0小鼠中仍存在于CA1轴突中，但在rTg4510小鼠中完全凝聚到了胞体中。在12月龄时，PHF1阳性tau在两个小鼠品系中均凝聚到胞体中。12月龄小鼠的Gallyas银染色(24)(图13D)示出了类似的模式：与rTg4510小鼠相比，在rTg4510-Mapt0/0小鼠中具有更健康的神经纤维网(更少的轴突染色和树突染色)。
在NFT存在的情况下内源性tau的去除改善了神经元存活
为了评估缠结病理对神经元损失的影响，接下来测定了皮质神经元(NeuN阳性细胞)和缠结(硫黄素-S阳性)的数量。与WT小鼠相比，在rTg4510小鼠中，皮质神经元的数量在9个月时减少了≈33％(n＝3只小鼠，p＝0.002)，在12个月时减少了≈37％(n＝3只小鼠，p＝0.0001)。与Mapt0/0小鼠相比，rTg4510-Mapt0/0小鼠在9个月时没有神经元损失，在12个月时神经元数量轻微降低(≈12％，n＝3，不显著)(图14A)。9月龄和12月龄的rTg4510小鼠和rTg4510-Mapt0/0小鼠具有总数类似的皮质缠结(随年龄增加)(ThioS染色，n＝3只小鼠/组；图14B)。由于rTg4510-Mapt0/0小鼠显示相同数量的缠结但神经元损失降低，与rTg4510小鼠相比，rTg4510-Mapt0/0动物具有显著更低(p＝0.029)百分数的含缠结神经元(图14C)。总体而言，这些数据有趣地表明，可通过消除内源性小鼠tau来减少由突变tau过表达导致的神经元损失。此外，尽管rTg4510小鼠和rTg4510-Mapt0/0小鼠的CTX中ThioS阳性缠结的总数类似，但只有rTg4510动物具有明显的神经元死亡和神经纤维网退行性变，表明在内源性tau缺乏的情况下缠结毒性降低(图14D和图20C)。因此，这些数据表明在rTg4510-Mapt0/0动物中，tau聚集和毒性之间没有关系。
总而言之，本文所呈现的数据对关于tau散播、聚集和毒性的两种假说提出了挑战。首先，朊病毒蛋白的在先经典研究显示，与朊病毒毒性一样，PrPsc的散播依赖于内源性PrPc的存在(12、25)。已基于以下观察报道了tau是“类朊病毒”的：错误折叠的蛋白的跨突触散播以及在接收神经元中损坏内源性tau蛋白的能力。相反，本文所呈现的发现表明，与朊病毒蛋白相反，在内源性tau缺乏的情况下tau跨突触传播，表明tau的神经元至神经元传递并不强制性(obligatorily)依赖于模板化的错误折叠。因此，对tau传播的类朊病毒假说的修正似乎是必要的。
其次，在本文所述的tau-空白表型的上下文中，tau错误折叠、聚集和神经毒性之间通常假定的关联似乎被改变：Mapt0/0动物得到保护而免受神经元损伤的最早征象，如胶质细胞增生和轴突改变(在18个月的ECrTgTau小鼠中)，并免受在广泛散播的NFT病理的情况中发生的晚期神经元损失(在9月龄和12月龄的rTg4510小鼠中)。面对持续的tau聚集，令人出乎意料的稳健神经保护和炎症减少表明对于tau病变和AD中的神经元健康而言，降低tau可以是非常有益的。
示例性材料和方法
动物。为了研究人突变tau(0N4R P301L tau)的散播，如以前所述(5)，通过使专门在EC-II中表达四环素调控的反式激活因子(tTa)的(C57BL/6J)B6.TgEC-tTA小鼠(30)与FVB-Tg(tetO-TauP301L)4510小鼠(23)杂交，来产生ECrTgTau小鼠。对反式激活因子和应答转基因均呈阳性的小鼠在EC中表达人P301L突变0N4R tau，而将缺乏人tau转基因的小鼠作为tau阴性对照(WT)。为了产生缺乏内源性小鼠tau(由Mapt基因编码)的ECrTgTau-Mapt0/0小鼠，从Jackson Laboratory获得B6.Mapttm1(EGFP)Kit小鼠(Mapt0/0)(29)。为了确保表达或缺乏内源性小鼠tau的小鼠在相同的(B6×FVB)F1背景上，生产了FVB.Mapttm1(EGFP)Kit同类(congenic)品系。将TgEC-tTA转基因转移至B6.Mapt0背景上，并将Tg(tetO-tauP301L)4510转基因转移至FVB.Mapt0背景上；使这两个品系杂交产生了ECrTgTau-Mapt0/0小鼠，ECrTgTau-Mapt0/0小鼠的遗传背景与表达小鼠tau的ECrTgTau小鼠的遗传背景相同。对来自这些品系的性别混合的18月龄动物的脑进行分析。类似地，将CK-tTA转基因(驱动前脑兴奋性神经元中的表达)(31)转移至B6.Mapt0背景，使得能够生产rTg4510小鼠和rTg4510-Mapt0/0小鼠，以用于萎缩、神经元损失和缠结分析。所有的动物实验都符合美国国立卫生研究院的规章，并均由Massachusetts总医院和McLaughlin研究机构的机构动物管理及使用委员会(Institutional Animal Care and Use Committees of MassachusettsGeneral Hospital and McLaughlin Research Institute)批准。
RT-PCR分析。为了验证小鼠基因型，用Trizol(Sigma-Aldrich)从冷冻脑组织提取RNA，并使用Agilent RNA6000Pico试剂盒(AgilentTechnologies)对RNA质量进行检验。对于RT-PCR而言，使用靶向人tau转基因产物(5'-CCC AAT CAC TGC CTA TAC CC-3′和5′-CCACGAGAA TGC GAAGGA-3′)以及小鼠tau外显子7(5′-CACCAAAATCCGGAGAACGA-3′和5′-CTTTGCTCAGGTCCACCGGC-3′)的引物，用III逆转录酶(Life Sciences)将1μgRNA提取物转录成cDNA。使用RT2qPCR引物分析对人tau RNA和小鼠tau RNA的转录物数量进行定量，并使其归一化至GAPDH(5′-TGG TGA AGC AGGCAT CTG AG-3′和5′-TGC TGT TGAAGT CGC AGG AG-3′)。使用双尾t检验对统计显著性(p≤0.05)进行检验。
免疫组织化学。将小鼠处死，用PBS进行心脏内灌注，使脑半球在4％多聚甲醛(PFA)(PBS中)中在4℃下液滴固定(drop-fixed)72h，然后在蔗糖中低温保护，冷冻包埋在M1封片介质中，切成10μm厚的水平切片，安装于载玻片上，并储存于-80℃下。对于免疫荧光标记而言，使切片重新固定于PFA中，在PBS中用0.1％Triton透化，在5％正常山羊血清(NGS)(PBS中)中封闭1h。将一级抗体(如下所示)在5％NGS中稀释，并在4℃下施用过夜。在PBS中洗涤后，将二级抗体(1:500)在室温下在5％NGS中处理1h。用Cy3(Jackson免疫研究实验室)或AlexaFluor647(Life Technologies)对抗小鼠或抗兔二级抗体进行荧光标记。对于用噻嗪红进行的染色缠结而言，在用NGS封闭之前，将脑切片孵育在0.025％噻嗪红(Sigma Aldrich)(PBS中)中。使用含有DAPI的抗衰减封片介质(Vectashield)对切片进行封片，并在装配有Coolsnap数码相机和Axio-VisionV4.8的Zeiss AxioImager显微镜上记录图像。
抗体。对于脑切片的免疫荧光标记而言，使用下列一级抗体：兔抗人tau(N-末端)TauY9(稀释1:500，Enzo Lifescience)、小鼠抗人tau(N-末端)Tau13(1:1000，Covance)、兔抗小鼠tau和人tau(C-末端；1:1000，DAKO)、小鼠抗磷酸化tau CP13(pS202/sT205)以及PHF1(pS396/pS404)(1:1000，Peter Davies提供)、兔抗“错误折叠的”tau Alz50(1:500，Peter Davies)、小鼠抗胶质纤维酸性蛋白(GFAP；1:1000，Abcam)、兔抗Iba1(用于ICC；1:500，WAKO)、小鼠抗磷酸化神经丝蛋白SMI312(1:1000，Covance)、小鼠抗NeuN(1:1000，Millipore)。Western印迹额外使用的抗体是：兔抗磷酸化tau pT205(1:1000，ThermoScientific)和12e8(pS262/pS356；1:1000，Elan Pharmaceuticals)、兔抗Iba1(用于WB；1:500，WAKO)以及小鼠抗突触蛋白-1(1:100，EMS)。
荧光免疫/原位杂交(免疫-FISH)。如以前所述(5)，进行FISH连同免疫组织化学。通过RT-PCR生成与人Mapt(NM_016835；核苷酸2773-3602)相匹配的地高辛标记的RNA探针，并用抗地高辛辣根过氧化物酶标记的抗体(Roche)和Alexa568标记的酪胺(Invitrogen)对该探针进行检测(32)。使用一级抗体TauY9和Alexa647缀合的山羊抗兔二级抗体对人tau进行免疫标记。
细胞计数、体视学(stereology)和皮质厚度。为了对HPC中活化的星形胶质细胞(GFAP)、EC的层2/3中的小胶质细胞(Iba1)(图12A-图12C)以及EC的层2/3中的细胞核(DAPI)(图19A-图19B)进行计数，在DAPI通道中标出每个切片各自的ROI轮廓(每只小鼠3-4个10μm厚切片；3只小鼠/组)，然后使用ImageJ手动对每个ROI各自的细胞/细胞核染色进行计数，并确定每个脑结构的细胞密度(数量/mm2)。
对于CTX(图14A-图14D)和CA1(图20A-图20C)中的神经元(NeuN)和缠结(ThioS)的体视学计数而言，在相匹配的脑区域的四个10μm厚水平切片中对细胞进行取样。切片各自间隔100μm，从而相对于每只小鼠，跨越了4×100μm＝400μm总深度的脑组织。将整个CTX(层1、层2/3和层4/5)或整个CA1定义为ROI。
Western印迹。将EC和HPC从冷冻脑解剖出，并在包含蛋白酶抑制剂(Complete，Roche)和磷酸酶抑制剂(PhosphoStop，Roche)的RIPA缓冲液(Sigma Aldrich)中均质化，将10μg总蛋白加载到10％Bis-TrisSDS-聚丙烯酰胺凝胶(Life Technologies)上，并用MOPS缓冲液分离。在点样到硝酸纤维素膜上并在Odyssey封闭缓冲液(LI-COR)中封闭之后，将封闭缓冲液中的一级抗体在4℃下施用过夜。在0.05％(v/v)Tween-20(TBS中)中洗涤后，用山羊抗兔-IRDye680和抗鼠-IRDye800(Rockland)在室温下将印迹孵育1h。使用Odyssey成像系统(LI-COR)将蛋白条带可视化，并使用ImageJ(可在http://rsb.info.NIH.gov/nih-image/上在线得到)对强度进行分析。
脑重量。在用15ml的室温PBS进行心脏内灌注后，对来自9月龄和12月龄的rTg4510小鼠、rTg4510-Mapt0/0小鼠、WT小鼠和Mapt0/0小鼠的全脑湿重(包含小脑和嗅球)进行测定。
缠结的Gallyas银染色和硫黄素-S染色。如以前所述(24)，在PFA灌注的脑的30μm厚自由漂浮的冠状切片上，对12月龄的rTg4510小鼠、rTg4510-Mapt0/0小鼠和对照小鼠中的缠结进行银染色。将切片在5％高碘酸中孵育5min，用水漂洗5min(两次)，然后用碱性碘化银溶液(1MNaOH、0.6M KI、0.053％(w/v)AgNO3)处理1min，并在0.5％醋酸中洗涤10min。通过将溶液B和溶液C逐滴加入溶液A并孵育20min，使溶液A(5％(w/v)Na2CO3)、溶液B(24mMNH4NO3、12mM AgNO3、3mM钨硅酸)以及溶液C(24mM硝酸铵、12mM AgNO3、3mM钨硅酸、0.25％(w/v)甲醛)以2:1:1的比例混合，使染色显色。然后将切片在0.5％醋酸中洗涤3次并在水中洗涤1次。在金色调(gold tone)中孵育3min-4min后，在水中漂洗，然后在1％(w/v)Na2S2O3中漂洗5分钟并再次在水中漂洗，将切片安装在载玻片上。将神经元(Nissl物质)在甲酚紫(Cresyl violet)染色中复染30秒，然后浸入50％、70％、95％和100％的乙醇中，然后置于100％二甲苯中直至澄清，并在封片介质中封片。对于在9月龄和12月龄的rTg4510脑和rTg4510-Mapt0/0脑中对缠结进行硫黄素-S(ThioS)染色(33)而言，将PFA固定的脑的10μm厚冷冻切片解冻，在去离子水中漂洗，在0.05％(w/v)ThioS(50％(v/v)乙醇中)中于黑暗中孵育8min。通过在80％乙醇中洗涤10秒(两次)使ThioS染色分化，然后在去离子水中短暂洗涤切片，并使用抗衰减封片介质(无DAPI)将其封片在显微镜载玻片上。
统计分析。为了比较ECrTgTau、ECrTgTau-Mapt0/0以及对照中的细胞数(对人tau、NeuN、GFAP、Iba1、ThioS呈阳性)，我们从3个-4个脑切片测定了每只小鼠的平均细胞密度(细胞数/μm2)，每组使用3只小鼠。对于western印迹分析而言，对于每个基因型组，对3只小鼠的脑提取物进行分析。使用GraphPad Prism 5、采用具有95％置信区间的非配对学生T检验进行组之间差异的统计分析。将数值表示为平均值±SEM。
实施例3.Tau增强β淀粉样蛋白诱导的神经元内在凋亡级联
阿尔茨海默氏病(AD)脑的特征在于淀粉样蛋白斑中的聚集的β淀粉样蛋白(Aβ)的沉积以及神经原纤维缠结(NFT)中的异常磷酸化tau的沉积。Aβ和tau的可溶性低聚形式均与突触损失相关(Alpar等，2006；DaRocha-Souto等，2012；Hudry等，2012；Knafo等，2009；Koffie等，2009；Kopeikina等，2013a；Kopeikina等，2013b；Spires等，2005；Wu等，2010；Wu等，2012；Rapoport等，2002；Roberson等，2007；Shipton等，2011；Vossel等，2010；Zempel等，2013)，但棘损失的机制是未知的。此外，已知阿尔茨海默氏病涉及Aβ和tau的改变，但是否存在协同通路或平行通路是未知的(Ittner和Gotz，2011)。在此实施例中，本发明人示出了对于Aβ诱导的突触毒性而言，tau是关键协作者。使tau与Aβ诱导的线粒体变化相关联的这一分子通路代表了我们在神经元培养、转基因小鼠模型和人脑中观察到的神经退行性变的新型凋亡相关程序。
为了理解Aβ诱导的棘损失的机制以及tau与Aβ诱导的棘损失的关系，使来自野生型小鼠或tau空白小鼠的原代神经元培养物暴露至可溶性Aβ，并对caspase活化和棘损失进行监测。使用一系列分子探针和药理学探针来解析这些事件发生的顺序以及tau在各步骤中的作用。发现Aβ处理引起内在(线粒体)caspase通路的活化以及tau易位至线粒体。在内在线粒体凋亡相关级联的引发和进展中，这似乎是至关重要的步骤，该级联最终以(亚凋亡)caspase 9活化和caspase 3活化以及棘损失为标记。在相较于野生型小鼠的APP/PS1小鼠中以及相较于对照的人AD中，发现tau与暴露至可溶性Aβ的培养的神经元中的线粒体相关。这些数据表明tau易位至线粒体和Aβ毒性的早期步骤之间的机制性联系，在更宽泛的背景下，表明tau在caspase活化级联中的出乎意料的协作性。
结果
Aβ诱导caspase 3活化
已报道长时程突触抑制和棘损失与非凋亡caspase活化有关(Jiao和Li，2011；Li等，2010，参见Spires-Jones和Hyman的综述)。由于幼龄Tg2576APP小鼠显示非凋亡水平的caspase 3活化(D'Amelio等，2011)，本文试图确定使培养中的神经元暴露至Aβ是否活化caspases。从Tg2576培养物(TgCM)或野生型培养物(WtCM)收获条件培养基，并将其施用到野生型皮质神经元培养物24小时。将3:1稀释的TgCM施用到培养物，使得通过Aβ40ELISA测量的终浓度为4nM。处理后，制备细胞裂解物，以通过Western印迹进行分析。用对切割的caspase 3具有特异性的抗体对印迹进行探测，所述抗体对从邻近Asp175切割所得的活化caspase-3的大片段(17/19kDa)进行检测，并不识别全长caspase 3或其它切割的caspases(图21A-图21B)。在24小时后，相对于未改变的caspase3的总水平，暴露至含有Aβ的TgCM(相对于WtCM)的神经元的免疫印迹显示caspase 3活化显著增加(图21A-图21B，p<0.0001)。
为了确定来自TgCM处理的结果是否是由于培养基中存在的Aβ，通过使用6E10(高效价小鼠单克隆Aβ抗体)实现来自TgCM的Aβ的免疫耗竭(TgCM-ID)。如通过ELISA所测量的，使用6E10的免疫耗竭使Aβ40降低至～0.1nM。与用WtCM处理的培养物相比，用免疫耗竭的培养基处理的培养物中的切割的caspase 3水平没有区别(图21A-图21B，p＝0.1115)；与用TgCM处理的培养物相比，用免疫耗竭的培养基处理的培养物中的caspase 3活化显著降低(图21A-图21B，p<0.0001)。这表明Aβ(而非CM中的另一因素)负责caspase 3的活化。
还通过使用针对tau-Δ421新表位的抗体(TauC3)(Gamblin等，2003)对tau(caspase 3底物)是否在Asp421处被切割进行了检查(图21A，图21C)。用TgCM(相对于WtCM)孵育没有改变tau的总水平(p＝0.1426；图21A中示出了代表性印迹，图28中示出了定量)，但如TauC3western印迹所测量的，所述孵育确实导致了tau的切割增加(图21A、图21C，p＝0.0105)。另外，与TgCM处理的培养物相比，当将Aβ从培养基中免疫耗竭时，截短的tau降低(p＝0.0107)。
为了确定caspase活化是否响应于TgCM处理而负责tau的切割，使用泛caspase抑制剂zVAD-FMK。用20μM zVAD处理的TgCM暴露神经元未显示活性caspase 3增加(图21A、图21B，p<0.0001)或TauC3水平增加(图21A、图21C，p＝0.0439)。作为caspase活化的阳性对照，还用星形孢菌素(STS，1μM)(凋亡的有效诱导物)对神经元培养物进行孵育。在STS处理的细胞中，caspase抑制还降低了caspase 3活化(图21A-图21B，p<0.0001)，并降低了tau切割(图21A、图21C，p＝0.0097)。因此，在TgCM处理的原代神经元中，可将TauC3用作caspase活化的替代读出(readout)。
在用来自野生型神经元的条件培养基(WtCM)处理24小时的神经元以及未处理神经元(数据未示出)之间，未检测到切割的caspase 3和截短tau的水平的显著变化。总之，这些数据表明，如通过在Asp421处tau的截短以及切割的caspase 3的存在这二者所测量的，TgCM中的可溶性Aβ种类促进了caspase 3的活化。
Aβ促进非凋亡caspase 3活化
鉴于caspases是由Aβ处理活化的，接下来试图确定用TgCM处理的神经元是否经历凋亡。聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)被caspase 3切割是细胞凋亡的关键指标(Nicholson，1995；Oliver；1998)。切割的PARP的免疫印迹显示，24小时的TgCM处理并未导致切割的PARP增加，而STS暴露6小时诱导了PARP切割(图29A)。类似地，使用Toxilight分析(测量腺苷酸激酶从受损细胞的释放)对细胞毒性的评估显示，与对照相比，Aβ处理未引起显著的细胞死亡(图29B，p＝n.s.)。类似地，使用Toxilight分析(测量腺苷酸激酶从受损细胞的释放)对细胞毒性的评估显示，与对照相比，Aβ处理未引起显著的细胞死亡(图29B，p＝n.s.)。通过比较，细胞死亡由STS处理诱导(图29B，p<0.0001)，并被zVAD阻断(p<0.0001)。这些结果表明用Aβ(～4nm)孵育在神经元中引起非凋亡caspase活化。此外，相较于Aβ，暴露至STS(神经元凋亡的诱导物)更大程度地活化了内在线粒体通路的组分，表明Aβ对该通路的活化更精细或更局部化(localized)，且可能不一定导致细胞死亡。
Aβ经由线粒体内在通路促进caspase活化
接下来试图确定Aβ是否经由经典内在通路活化caspases，所述通路涉及：BAD的去磷酸化、BAX向线粒体的易位、细胞色素c(cyt c)的释放、caspase 9和caspase 3的活化(Chipuk等，2006；Goping等，1998；Wang等，1999；Wolter等，1997)。使用针对切割的caspase9(Asp353)的抗体对caspase 9活化进行检测，该抗体检测仅在天冬氨酸353处切割后的小鼠caspase 9的37kDa亚基的内源性水平，且不与全长caspase 9或其它caspases交叉反应(图21D和图21E)。在TgCM处理(相对于WtCM处理)后，相对于总caspase 9水平，切割的caspase 9的水平存在显著增加(图21E，p<0.0001)。通过zVAD-FMK处理(p<0.0001)或Aβ免疫耗竭(p<0.0001)阻断了Aβ诱导的caspase 9活化。还活化了内在通路的其它标志物。与WtCM处理相比，在TgCM处理后，磷酸化BAD(pBAD)显著降低(图21D、图21F，p<0.0001)，并且这一效果被Aβ免疫耗竭阻断(p＝0.0455)。zVAD-FMK对caspase的抑制没有阻止BAD的去磷酸化(图21D、图21F，p＝0.7051)。
为了进一步研究Aβ处理后内在通路的活化，将来自神经元的线粒体和胞质溶胶部分分离，并在胞质溶胶部分和线粒体沉淀中对VDAC、CytC和BAX的水平进行分析。胞质溶胶部分中缺乏线粒体外膜蛋白VDAC(图22A)，线粒体沉淀中富含线粒体外膜蛋白VDAC(图22B)。通过胞质溶胶中的水平增加(图22A、图22C，p<0.0001)和线粒体沉淀中的水平降低(图22B、图22D，p<0.0001)显示，与WtCM处理相比，TgCM处理诱导了细胞色素c从线粒体释放。在TgCM处理的培养物中，caspase抑制剂zVAD-FMK没有改变胞质溶胶(图22A、图22C，p＝0.3968)或线粒体沉淀(图22B、图22D，p＝n.s.)中细胞色素c的水平，表明细胞色素c释放是Aβ处理后的caspase活化的上游事件。此外，在TgCM处理的培养物(相对于WtCM处理的培养物)中，在线粒体沉淀中检测到BAX的总水平增加(图22B、图22E，p<0.0001)。总之，在Aβ处理后细胞色素c的释放和BAX向线粒体的易位表明凋亡的内在通路的活化。
钙调磷酸酶活化是Aβ诱导的线粒体内在通路活化的早期步骤
Caspase抑制没有阻止BAD去磷酸化、BAX易位至线粒体或细胞色素c释放，表明这些事件在caspase活化的上游。钙调磷酸酶活化和BAD去磷酸化是导致caspase-9(活化caspase 3的引发caspase)活化的上游前线粒体信号转导事件。据推测，与最近的观察(Hudry等，2012；Wu等，2010；Wu等，2012)相符，钙调磷酸酶活化是响应于Aβ而导致线粒体内在通路活化的上游事件。通过在WtCM、TgCM或STS的加入之前施用20分钟，FK506抑制了钙调磷酸酶活化。与单独的TgCM相比，将TgCM处理的培养物用FK506孵育降低了caspase 3活化(图23A、图23B，p<0.0001)、tau切割(图23A、图23C，p<0.0444)、caspase 9活化(图23D、图23E，p<0.0001)以及BAD的去磷酸化(图23D、图23F，p<0.0001)。在WtCM处理的培养物中，FK506没有效果。这些数据表明，钙调磷酸酶活化是Aβ介导的caspase活化和毒性中的早期事件。
Aβ诱导的棘损失被caspase抑制阻断
接下来检查这些生化标志物与棘损失的关系。对经WtCM或TgCM处理24小时的GFP转染的神经元中的棘密度进行评估。相对于WtCM处理的神经元，TgCM处理的神经元显示降低的棘密度(图24A、图24C，p<0.0001)。通过Aβ免疫耗竭降低了TgCM处理的培养物中的这一棘损失(p＝0.0005)。用Aβ免疫耗竭的培养基处理与用WtCM处理没有区别(p＝n.s.)。为了检查caspase活化的药理性阻断是否足以防止Aβ诱导的棘密度降低，对TgCM处理的神经元中zVAD-FMK的作用进行了探讨，发现zVAD-FMK完全阻断了TgCM触发的棘损失(p<0.0001)。然而，WtCM暴露神经元的zVAD-FMK处理也促进棘密度显著增加(p＝0.0088)。
作为突触改变的第二测量，测量了突触后密度蛋白PSD95，该蛋白高度富集在树突棘中并与棘稳定性相关。对TgCM处理后的PSD95水平进行测定，检测到与WtCM培养物相比，PSD95水平显著降低(与棘损失一致)(图24B、图24D，p<0.0001)。当暴露至TgCM的神经元用zVAD-FMK共同处理时(p<0.0001)，或当从TgCM将Aβ免疫耗竭时(p<0.0001)，PSD95水平保持不变。用WtCM处理24小时的神经元和未处理的神经元间的棘密度和PSD95水平没有变化。这些数据表明Aβ通过caspase活化诱导了突触毒性，该毒性通过降低的PSD95以及棘密度示出。此外，不希望受到理论的限制，这表明可通过内源性、非凋亡caspase活化对野生型神经元中的棘周转(turnover)进行调节。
出乎意料的是，与从非痴呆对照分离的突触神经小体相比，从人脑AD病例分离的突触神经小体显示切割的caspase 3水平显著增加(图30A-图30B，p＝0.0046)。同时，与对照相比，检测到来自AD脑的突触神经小体部分中的tau增加(图30C-图30D，p＝0.0019)。总之，这可表明Aβ和tau在突触中局部地活化caspases以诱导AD中的突触毒性的作用。
内源性tau水平的降低保护神经元免受Aβ触发的caspase活化和棘损失
已报道tau与Aβ介导的棘损失相关(Roberson等，2007)。为了探讨tau在caspase活化级联诱导的棘损失中的位置，将来自tau空白(Tau-/-)小鼠的神经元暴露至Aβ，并对以上开发的中间读出组的非凋亡caspase活化和棘损失进行监测(图25A-图25H)。当用TgCM处理时，tau空白神经元(Tau-/-)显示caspase 3活化显著降低(图25A、图25C，p<0.0001)，而caspase 9活化和pBAD去磷酸化未发生改变(分别为图25B、图25D，p＝n.s.以及图25B、图25E，p＝0.9694)，表明在tau缺乏的情况下，非凋亡caspase通路活化被阻断。通过比较，杂合的tau(Tau+/-)神经元和野生型tau(Tau+/+)神经元均显示Aβ诱导的切割的caspase 3增加(p<0.0001)。Tau+/+神经元(而非Tau+/-神经元)还具有显著增加的切割的caspase 9(p<0.0001)并展现出pBAD去磷酸化(p<0.0001)。
为了确定在防止线粒体内在通路的诱导中tau的缺乏是否是关键变量，使用腺相关病毒(AAV)介导的基因递送将全长野生型tau(Tau4R)引入Tau-/-神经元。在TgCM施用后，与仅表达GFP的神经元相比，经Tau4R转导的神经元显示显著的caspase 3活化(图25F、图25I，p<0.001)。在用WtCM处理的表达Tau4R的神经元和表达GFP的神经元之间未发现caspase 3活化存在区别(p＝0.6186)。另外，与野生型(Tau+/+)神经元相比，tau敲除的神经元(图30C，p<0.0001)和杂合神经元(p<0.0001)也不易受到STS诱导的细胞死亡的影响。这与tau的内源性水平促进caspase活化的可能性相一致。
与这些生化观察相符，在用含有Aβ的培养基处理之后，仅观察到表达Tau+/+的神经元(图25G，图25H，p＝0.001)(而非Tau-/-(p＝n.s.)或Tau+/-(p＝n.s.))具有降低的棘密度。这些结果表明，tau的表达降低可防止Aβ暴露的中间生化后果和Aβ诱导的棘损失，并表明tau对于在神经元中引发线粒体caspase级联而言是关键的。
线粒体内在通路在APP/PS1小鼠中得到活化并依赖于tau
为了研究Aβ是否还在体内导致内在caspase级联的活化，对获得自APPswePS1d9双转基因小鼠(APP/PS1)(具有丰富的细胞外淀粉样蛋白斑病理的阿尔茨海默氏病小鼠模型)的脑胞质溶胶部分和线粒体沉淀中的cyt c水平进行了测量(图26A、图26D、图26B、图26F)。与年龄匹配的对照小鼠相比，在6月龄的APP/P1小鼠中发现胞质溶胶中的cyt c水平增加(图26A、图26D，p＝0.0001)，线粒体沉淀中的cyt c水平降低(图26B、图26F，p＝0.006)。另外，检测到BAX线粒体易位增加(图26A、图26C、图26B、图26E)。BAX在胞质溶胶中显著降低(图26C，p＝0.011)，并在线粒体中显著增加(图26E，p＝0.0341)。这与Aβ可在体内引起内在线粒体通路的活化的推测相一致。
为了研究tau降低是否可在体内防止Aβ诱导的变化，对获得自下列小鼠的脑胞质溶胶部分中的细胞色素c的水平进行了测量：APP/PS1小鼠、APP/PS1-Tau+/-小鼠和Tau+/-小鼠。发现通过使APP/PS1小鼠与Tau+/-小鼠杂交来降低tau水平，释放到胞质溶胶中的细胞色素c与单独的APP/PS1小鼠相比得到降低(图26G、图26I，p＝0.016)，且与对照小鼠相比没有显著差异(p＝0.4755)。与单独的APP/PS1小鼠相比，来自APP/PS1-Tau+/-小鼠的突触神经小体还具有降低的切割的caspase 3(图31A、图31B，p＝0.0322)。此外，为了评估突触改变是否与caspase 3活化相关，测量了突触神经小体中的PSD95，发现与对照小鼠相比，APP/PS1小鼠中的PSD95水平显著降低(图26H、图26J，p＝0.0022)，而PSD95突触水平在APP/PS1-Tau+/-小鼠中保持不变且与非转基因小鼠水平没有区别(p＝0.4901)。总体而言，这些数据表明tau降低防止了Aβ诱导的内在线粒体通路的活化，并可在体内防止Aβ诱导的突触功能障碍。
在体内和在体外进行Aβ处理之后tau定位至线粒体
接下来将线粒体从Aβ处理的野生型神经元分离，发现与暴露至WtCM的神经元中的水平相比，TgCM处理的神经元的线粒体沉淀中的tau水平增加(图27A、图27D，p＝0.0104)。为了确定tau在体内是否还被定位至线粒体，将线粒体从APP/PS1小鼠、从人额叶皮质分离(图27B、图27E)。与年龄匹配的对照小鼠相比，在来自APP/PS1小鼠脑的线粒体中，tau定位增加(图27B、图27E，p＝0.0087)。重要的是，在人中观察到相同的结果：与年龄匹配的对照相比，来自AD脑的线粒体中的tau水平增加(图27C、图27F，p<0.0001；表3中人试样的特征)。这可表明tau向线粒体的定位是AD疾病病理学的特征。
表3.定量研究中使用的AD影响的脑和对照脑的特征。连同性别和死亡年龄示出了指定为对照(C)和阿尔茨海默氏病影响(AD)的试样。还示出了临床诊断和神经原纤维缠结的死后Braak阶段(0，无；I-II，内嗅；III-IV，边缘；V-VI，同形皮质)。将试样用于图27C和图30A-图30D。
讨论
在此，本发明人检查了从Aβ暴露发展至棘损失的分子通路，并发现了(1)内在(线粒体)caspase级联的亚凋亡活化的明显证据；以及(2)tau经由内在线粒体通路作为caspase活化的至关重要的介导者方面的出乎意料的作用。在本文所述的这一实施例中，含有Aβ的TgCM借助钙调磷酸酶依赖的线粒体内在通路的关键介导者，致使非凋亡caspase活化并最终导致棘损失。Tau的基因敲除保护神经元免受非凋亡caspase活化，并在Aβ暴露后防止棘损失。如本文所呈现的，还在阿尔茨海默氏病(AD)的转基因小鼠模型中以及人AD病例中发现了这一非凋亡caspase活化的证据。此外，发现在体外和体内的疾病病症下，tau均与线粒体相关。
本文所述的发现是有意义的，因为这些发现描述了Aβ、tau和突触毒性之间的关系。在先报道讨论了，tau降低具有的神经保护作用可能是tau明确参与到分子信号传导级联中的结果，该级联涉及正常LTD和Aβ诱导的突触变化(Ittner等，2010；Rapoport等，2002；Roberson等，2007；Shipton等，2011；Vossel等，2010)。然而，由于tau易位至线粒体伴随了细胞色素c释放和突触损失，本文所呈现的数据表明了在神经元中tau在线粒体内在通路介导的caspase级联中的更广泛作用。
在一些实施方式中，可对caspase活化进行限制，以防止凋亡级联的完全表达和神经元死亡。在一些实施方式中，tau定位至线粒体对于增强内在级联引发可以是期望的或必需的或足够的。在一些实施方式中，可存在使tau与线粒体相关联的特异性信号。在一些实施方式中，tau切割和截短tau产物的形成可以是caspase活化的至关重要的中间媒介或结果。新型的tau-线粒体相互作用可促进理解tau在阿尔茨海默氏病理生物学中的作用。例如，tau似乎在肌动蛋白稳定化中发挥作用，其中磷酸化tau对肌动蛋白的误调节可导致改变的线粒体动力学(DuBoff等，2012)。不希望受到理论的束缚，在一些实施方式中，可诱导线粒体内在通路活化的这一tau-肌动蛋白相互作用还有待研究。此外，先前报道了在APP转基因小鼠中，除caspase 3之外，caspase 2也可经由RhoA通路在树突棘周转中发挥至关重要的作用(Pozueta等，2013)。这表明对于Aβ介导的棘去除而言，神经元具有替代机制。此外，除了诸如天冬酰胺内肽酶的其它蛋白酶之外，还报道了caspase 6切割tau(Zhang等，2014)。因此，可以预期的是，其它caspases或蛋白酶可具有截短tau的能力，且一种或多种此类形式的截短tau还可调节凋亡通路和棘密度。
这一实施例表明，在原代神经元、tau病变的小鼠模型和人AD脑(其中，tau定位至线粒体似乎促进内在凋亡级联)中，tau定位至线粒体是非凋亡突触毒性中的至关重要的中间媒介。不希望受到理论的束缚，这对于在多种情况下tau抑制具有的明显神经保护作用而言是一种机制性解释。因此，本文所述的发现显示了tau在神经退行性变疾病中可以是有效的治疗靶点，并提供了tau和Aβ突触毒性之间的联系。
示例性实验程序
动物。对于这些实验，使用了下列小鼠品系：(1)Tg2576(Tg)雄性小鼠(CharlesRiver实验室)、过表达人淀粉样前体蛋白APP(含有双Swedish突变K670N、M671L)的转基因小鼠(Hsiao等，1996)、B6SJLF1雌性小鼠(Charles River实验室)；(2)C57BL/6(Tau+/+)(Charles River实验室)；(3)tau敲除(Tau-/-)小鼠(具有靶向破坏的tau外显子1)(Jackson实验室)(Tucker等，2001)；(4)杂合tau小鼠(使tau敲除小鼠和C57BL/6小鼠杂交产生的Tau+/-)；(5)APPswe；PS1d9双转基因小鼠(APP/PS1)获得自Jackson实验室(BarHarbor，ME)，在4月龄或6月龄时将其用于实验(Jankowsky等，2001)；使APP/PS1小鼠与Tau-/-小鼠杂交以产生APP/PS1-Tau+/-小鼠，该小鼠在6月龄时使用；(6)CD1小鼠(CharlesRiver实验室)。所有实验都根据机构动物管理及使用委员会批准的动物方案进行，并符合NIH规章。
原代神经元培养物。如以前所述(DaRocha-Souto等，2012；Wu等，2010)并加以修改，原代神经元培养物源自于妊娠第16天的小鼠胚胎的脑皮质。将皮质切出，轻轻切碎，并用Neurobasal培养基洗涤。在室温下将神经元以6×105个活细胞/35-mm培养皿的密度接种，该培养皿预先包被聚-D-赖氨酸(100μg/ml)至少2小时。使培养物保持在37℃、5％CO2的条件下，补充以neurobasal培养基，该培养基具有2％B27营养物、2mM L-谷氨酰胺、青霉素(100单位/ml)和链霉素(100μg/ml)(所有培养基组分均从Invitrogen获得)。该培养物在第14天或15天在体外(DIV)使用。
为了生产条件培养基，通过使半合子Tg2576雄性与B6SJLF1雌性杂交，培育出定时怀孕的雌性。将获得自该杂交的胚胎的神经元各自铺板，并分别进行基因型分析。使Tg2576(Tg)神经元、B6SJLF1神经元或野生型(Wt)神经元在体外培养14天(DIV)。将Tg2576培养物用于产生条件培养基(conditioned media，CM)，该条件培养基包含高水平的Aβ低聚物种类(从二聚体至六聚体)(先前表征的(DaRocha-Souto等，2012；Wu等，2010))，与在获得自AD患者脑的TBS部分中发现的Aβ类似(DaRocha-Souto等，2012；Shankar等，2008；Wu等，2010)。将来自14DIV B6SJLF1或非转基因同窝动物(在此称为野生型(Wt))神经元的CM用作对照。为了保持细胞外Aβ的升高的水平，在14天培养期间不改变这些培养物的培养基，然后将其收集以处理Tau-/-神经元、Tau+/-神经元、Tau+/+神经元以及获得自CD1小鼠胚胎的14DIV WT神经元。
从胚胎(来自使tau半合子小鼠(Tau+/-)杂交而产生的定时怀孕的雌性)获得Tau-/-神经元、Tau+/-神经元和Tau+/+神经元，并将其各自铺板，分别进行基因型分析。在提取自试样尾部的DNA上通过PCR来确定动物的基因型，所述试样尾部在各胚胎的脑皮质解剖后获取。
AβELISA分析。通过夹心ELISA试剂盒(Wako)从培养基对Aβ水平进行分析。TgCM中的Aβ40浓度总计约为12nM(人和鼠)，WtCM具有0.5nM的鼠Aβ40。
神经元培养物的处理。将野生型(来自CD1小鼠)皮质神经元、Tau-/-皮质神经元、Tau+/-皮质神经元和Tau+/+皮质神经元培养在标准NB/B27无血清培养基中，并在14DIV将培养基用来自TgCM(对应于4nM Aβ)或WtCM(0.16nM鼠Aβ40)的1:3稀释的CM替换，并进一步孵育24小时。为了诱导凋亡，用终浓度为1μM的星形孢菌素(Enzo Life Sciences)处理培养物，并在处理4小时后收获培养物。在zVAD-FMK(Sigma Aldrich)实验中，在暴露至WtCM、TgCM或STS之前，向培养物施用20μM抑制剂20分钟。为了抑制钙调磷酸酶，在暴露至WtCM、TgCM或STS之前，施用1μM FK506(Enzo Life Sciences)20分钟。然后，吸出培养基，并向各个孔加入含有磷酸酶和蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液。刮下细胞以制备用于Western印迹的裂解物。
免疫耗竭。通过使用6E10(Signet)实现来自TgCM的Aβ的免疫耗竭(TgCM-ID)，6E10是对β淀粉样蛋白的氨基酸残基1-16具有反应性的高效价小鼠单克隆Aβ抗体。表位位于β淀粉样蛋白的氨基酸3-8(EFRHDS)内。通过以10,000rpm离心30min，将Protein G-Sepharose(150μl)4Fast Flow珠子(Pharmacia Biotech，Uppsala，Sweden)在1ml Neurobasal中洗涤3次。对1ml TgCM进行预清洗，向1ml TgCM加入50μl洗过的珠子，并在4℃下以1,000rpm离心30min。将预清洗的TgCM以10,000rpm离心10min，并转移到干净的管中，然后加入9μg6E10抗体和100μl预先清洗的珠子，并在4℃下以1,000rpm离心6小时，以10,000rpm离心10min。收集免疫耗竭的TgCM上清液，以用于通过ELISA对Aβ定量进行后续分析，并施用到神经元培养物。
病毒载体构建和生产。将含有Tau4R-441或GFP的质粒亚克隆到AAV骨架中，该AAV骨架含有鸡β肌动蛋白(CBA)启动子和旱獭肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)。在HEK293细胞的三重转染后，产生高效价AAV血清型2/5载体。通过测序对AAV-Tau4R-441构建体和对照AAV-GFP构建体进行验证。通过以相同的感染复数(MOI)加入病毒对神经元进行转导。在转导三天后收获神经元，并通过western印迹对其进行分析。
线粒体分离。如以前所述(Ofengeim等，2012)，通过离心将线粒体从铺于10cm培养皿中的神经元(经WtCM和TgCM处理)分离并纯化。例如，对于神经元培养物，在冷PBS中刮拭10cm的板(每个实验重复三次，对于每个实验而言，每个条件使用n＝3块板)，并以2,000×g离心5min，使用冰冷的分离缓冲液(250mM蔗糖、20mM HEPES pH 7.2、1mM EDTA、0.5％BSAwt/vol以及蛋白酶和磷酸酶抑制剂)对沉淀进行均质化。将细胞均质化(用均质器进行七次；Wheaton)，收集小份试样(aliquot)(全细胞部分)，将剩余物质以1,300×g离心以将核物质沉淀(核部分)。在高速下对上清液进行离心(13,000×g、4℃下进行10min)；将上清液(胞质溶胶部分)和沉淀(线粒体部分)冷冻在干的冰上，并储存在-80℃下直至使用。在加入含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂(Roche)的RIPA缓冲液(Sigma)后，对全部部分进行超声处理，并以5,000×g离心5min以去除不溶性碎片。通过BCA分析(Thermo Scientific)测定所有部分中的蛋白浓度，将这一浓度用于就western印迹分析而言的凝胶上样。使用相同的方法，使0.2g组织在1.5mL冰冷分离缓冲液中均质化，来制备从小鼠脑组织或人脑组织分离的线粒体。
Western印迹。将蛋白裂解物在由LDS试样缓冲液和还原剂组成的试样缓冲液中煮沸，在含有抗氧化剂的MES-SDS电泳缓冲液中，在4％-12％Bis-Tris聚丙烯酰胺预制凝胶上进行解析。对于大多数分析而言，上样20μg/泳道。在含有20％甲醇的转移缓冲液中将凝胶转移到硝酸纤维素膜(Whatman)上。使印迹在Odyssey封闭缓冲液(Li-Cor biosciences)中封闭，接着用一级抗体孵育：小鼠β-肌动蛋白(Sigma；1:10,000)、兔切割的caspase 3(CellSignaling；1:1,000)、兔caspase 3(Cell Signaling；1:1,000)、小鼠TauC3(Dr LesterBinder提供，1:300)、兔多克隆总Tau(Dako；1:10,000)、兔PSD95(1:1,000；CellSignaling)、兔切割的caspase9(1:1,000；Cell Signaling)、小鼠caspase 9(1:1,000；Cell Signaling)、兔pBAD(1:1,000；Cell Signaling)、兔BAD(1:1,000；Cell Signaling)、VDAC(1:1,000；Cell Signaling)、小鼠细胞色素c(1:1,000；BD Pharmingen)、小鼠BAX(1:1,000；Santa Cruz)、兔切割的PARP(1:1,000；Cell Signaling)、兔PARP(1:1,000；CellSignaling)。施用缀合至IRDye 680或IRDye 800的抗小鼠或抗兔IgG二级抗体(1:10,000，Li-Cor biosciences)，并用Li-CorOdyssey红外成像系统扫描印迹。用Image J软件进行密度(densitometric)分析。将用于western印迹分析的神经元铺于6孔培养皿中，在三个独立的培养实验中，每个条件使用3个孔来进行实验。对于每个实验而言，对三次平行实验进行平均以得到n＝3。
棘密度和棘形态的分析。将铺于35mm玻璃底培养皿(MatTek)中的培养神经元在7DIV用绿色荧光蛋白(GFP)(Clontech)转染，并在15DIV成像。使用具有25×水浸物镜(数字变焦＝3-5)的Zeiss LSM510共聚焦显微镜，在488nm的激发激光下获取高分辨率数字图像。用NeuronStudio软件(CNIC，Mount Sinai School of Medicine)分析图像。根据以前发表的方案(Wu等，2010)并加以修改，将棘密度定义为每微米树突长度的棘数量。在四个独立的培养实验中，每个条件从30个至40个神经元对树突棘密度进行计算。对于各个条件，对就每个神经元而言测量的棘密度进行平均；然后对来自多个神经元的平均值进行平均，以获得就神经元群而言的平均值±s.e.m.。
ToxiLight生物分析。使用Toxilight生物分析试剂盒(Lonza，Rockland，ME)在培养基中进行毒性分析，所述培养基收集自铺于96孔板的野生型神经元、Tau+/-神经元和Tau-/-神经元(15DIV)。根据制造商的方案进行细胞提取物的制备和细胞毒性分析。离心后，将每孔50μl试样转移到不透明的白色微滴定板上。向各个孔加入100μl腺苷酸激酶检测试剂，并使板在室温下孵育5min。5min后，在Wallac读板仪中对发光进行测量。将结果表示为任意相对光单位(AU)。为了达到100％的细胞裂解(阳性对照)，将神经元用10％triton-X-100处理。100％裂解获得的读数与用1μM星形孢菌素处理6小时获得的读数是相当的(数据未示出)。在四个独立的培养实验中，将用于Toxilight分析的神经元铺于96孔板中，每个条件使用3个孔并进行2个平行试验。
统计分析。使用Windows的GraphPad Prism软件版本4.03(GraphPadSoftware，SanDiego)进行统计分析。将数据报告为平均值±平均值的标准误。将统计显著性定义为p<0.05。除了棘密度测量以外(图24B)，按照Shapiro-Wilk检验所评估的，所有数据是正态分布的。两个组的正态分布数据通过双尾学生t检验进行分析。多于两个组的正态分布数据通过单因素ANOVA或双因素ANOVA进行分析(tau敲除和APP/PS1实验)。在所有情况中，总体ANOVA统计显著性<0.05，并在组之间进行计划比较(planned comparisons)。以用于多重比较的Bonferroni校正报道事后比较(post-hoc comparison)p值。对于非参数数据而言，进行Kruskal-WallisANOVA，并以用于多重比较的Dunn校正报道p值。
实施例1的参考文献
1.Mandelkow EM，et al.(1995)Tau domains，phosphorylation，andinteractions with microtubules.Neurobiology of aging 16(3)：355-362；discussion362-353.
2.Iqbal K，Liu F，Gong CX，&Grundke-Iqbal I(2010)Tau in Alzheimerdisease and related tauopathies.Current Alzheimer research 7(8)：656-664.
3.Braak H&Braak E(1991)Neuropathological stageing of Alzheimer-related changes.Acta neuropathologica 82(4)：239-259.
4.Hyman BT，Van Hoesen GW，Damasio AR，&Barnes CL(1984)Alzheimer′sdisease：cell-specific pathology isolates the hippocampal formation.Science(New York，N.Y.)225(4667)：1168-1170.
5.Serrano-Pozo A，et al.(2013)Examination of the clinicopathologiccontinuum of Alzheimer disease in the autopsy cohort of the NationalAlzheimer Coordinating Center.Journal of neuropathology and experimentalneurology72(12)：1182-1192.
6.Pooler AM，et al.(2013)Propagation of tau pathology in Alzheimer′sdisease：identification of novel therapeutic targets.Alzheimer′s research&therapy 5(5)：49.
7.Medina M&Avila J(2014)The role of extracellular Tau in thespreading of neurofibrillary pathology.Frontiers in cellular neuroscience8：113.
8.Walker LC，Diamond MI，Duff KE，&Hyman BT(2013)Mechanisms of proteinseeding in neurodegenerative diseases.JAMA neurology 70(3)：304-310.
9.Polydoro M，et al.(2013)Reversal of neurofibrillary tangles and tau-associated phenotype in the rTgTauEC model of early Alzheimer′s disease.TheJournal of neuroscience：the official journal of the Society for Neuroscience33(33)：13300-13311.
10.de Calignon A，et al.(2012)Propagation of tau pathology in a modelof early Alzheimer′s disease.Neuron 73(4)：685-697.
11.Liu L，et al.(2012)Trans-synaptic spread of tau pathology invivo.PloS one 7(2)：e31302.
12.Harris JA，et al.(2012)Human P301L-mutant tau expression in mouseentorhinal-hippocampal network causes tau aggregation and presynapticpathology but no cognitive deficits.PloS one 7(9)：e45881.
13.Pooler AM，Phillips EC，Lau DH，Noble W，&Hanger DP(2013)Physiologicalrelease of endogenous tau is stimulated by neuronal activity.EMBO reports 14(4)：389-394.
14.Yamada K，et al.(2014)Neuronal activity regulates extracellular tauin vivo.The Journal of experimental medicine211(3)：387-393.
15.Santacruz K，et al.(2005)Tau suppression in a neurodegenerativemouse model improves memory function.Science(New York，N.Y.)309(5733)：476-481.
16.Hoover BR，et al.(2010)Tau mislocalization to dendritic spinesmediates synaptic dysfunction independently of neurodegeneration.Neuron 68(6)：1067-1081.
17.Takeda S，et al.(2013)Brain interstitial oligomeric amyloid betaincreases with age and is resistant to clearance from brain in a mouse modelof Alzheimer′s disease.FASEB journal：official publication of the Federationof American Societies for Experimental Biology 27(8)：3239-3248.
18.Takeda S，et al.(2011)Novel microdialysis method to assessneuropeptides and large molecules in free-moving mouse.Neuroscience186：110-119.
19.Wegmann S，et al.(2010)Human Tau isoforms assemble into ribbon-likefibrils that display polymorphic structure and stability.The Journal ofbiological chemistry 285(35)：27302-27313.
20.Yamada K，et al.(2011)In vivo microdialysis reveals age-dependentdecrease of brain interstitial fluid tau levels in P301S human tau transgenicmice.The Journal of neuroscience：the official journal of the Society forNeuroscience 31(37)：13110-13117.
21.Taylor AM，et al.(2005)A microfluidic culture platform for CNSaxonal injury，regeneration and transport.Nature methods 2(8)：599-605.
22.Ahmed Z，et al.(2014)A novel in vivo model of tau propagation withrapid and progressive neurofibrillary tangle pathology：the pattern of spreadis determined by connectivity，not proximity.Acta neuropathologica 127(5)：667-683.
23.Guo JL&Lee VM(2011)Seeding of normal Tau by pathological Tauconformers drives pathogenesis of Alzheimer-like tangles.The Journal ofbiological chemistry 286(17)：15317-15331.
24.Wu JW，et al.(2013)Small misfolded Tau species are internalized viabulk endocytosis and anterogradely and retrogradely transported inneurons.The Journal of biological chemistry 288(3)：1856-1870.
25.Frost B，Jacks RL，&Diamond MI(2009)Propagation of tau misfoldingfrom the outside to the inside of a cell.The Journal of biological chemistry284(19)：12845-12852.
26.Iba M，et al.(2013)Synthetic tau fibrils mediate transmission ofneurofibrillary tangles in a transgenic mouse model of Alzheimer′s-liketauopathy.The Journal of neuroscience：the official journal of the Society forNeuroscience 33(3)：1024-1037.
27.Clavaguera F，et al.(2009)Transmission and spreading of tauopathyin transgenic mouse brain.Nature cell biology 11(7)：909-913.
28.Michel CH，et al.(2014)Extracellular monomeric tau protein issufficient to initiate the spread of tau protein pathology.The Journal ofbiological chemistry 289(2)：956-967.
29.Holmes BB，et al.(2013)Heparan sulfate proteoglycans mediateinternalization and propagation of specific proteopathic seeds.Proceedings ofthe National Academy of Sciences of the United States of America 110(33)：E3138-3147.
30.Ghoshal N，et al.(2002)Tau conformational changes correspond toimpairments of episodic memory in mild cognitive impairment and Alzheimer′sdisease.Experimental neurology 177(2)：475-493.
31.Kuchibhotla KV，et al.(2014)Neurofibrillary tangle-bearing neuronsare functionally integrated in cortical circuits in vivo.Proceedings of theNational Academy of Sciences of the United States of America 111(1)：510-514.
32.Kopeikina KJ，Hyman BT，&Spires-Jones TL(2012)Soluble forms of tauare toxic in Alzheimer′s disease.Translational neuroscience 3(3)：223-233.
33.Polydoro M，et al.(2014)Soluble pathological tau in the entorhinalcortex leads to presynaptic deficits in an early Alzheimer′s diseasemodel.Acta neuropathologica127(2)：257-270.
34.Fox LM，et al.(2011)Soluble tau species，not neurofibrillaryaggregates，disrupt neural system integration in a tau transgenicmodel.Journal of neuropathology and experimental neurology 70(7)：588-595.
35.Gomez-Ramos A，et al.(2009)Characteristics and consequences ofmuscarinic receptor activation by tau protein.Europeanneuropsychopharmacology：the journal of the European College ofNeuropsychopharmacology 19(10)：708-717.
36.Gomez-Ramos A，Diaz-Hernandez M，Rubio A，Miras-Portugal MT，&Avila J(2008)Extracellular tau promotes intracellular calcium increase through M1and M3 muscarinic receptors in neuronal cells.Molecular and cellularneurosciences 37(4)：673-681.
37.Danzer KM，et al.(2011)Heat-shock protein 70 modulates toxicextracellular alpha-synuclein oligomers and rescues trans-synaptictoxicity.FASEB journal：official publication of the Federation of AmericanSocieties for Experimental Biology 25(1)：326-336.
38.Lasagna-Reeves CA，et al.(2012)Alzheimer brain-derived tauoligomers propagate pathology from endogenous tau.Scientific reports 2：700.
39.Barghorn S，Biernat J，&Mandelkow E(2005)Purification of recombinanttau protein and preparation of AIzheimer-paired helical filaments invitro.Methods in molecular biology (Clifton，N.J.)299：35-51.
40.Cho H，Hamza B，Wong EA，&Irimia D(2014)On-demand，competing gradientarrays for neutrophil chemotaxis.Lab on a chip 14(5)：972-978.
实施例2的参考文献
1.P.V.Arriagada，J.H.Growdon，E.T.Hedley-Whyte，B.T.Hyman，Neurofibrillary tangles but not senile plaques parallel duration and severityof Alzheimer′s disease.Neurology 42，631(Mar，1992).
2.V.M.Lee，M.Goedert，J.Q.Trojanowski，Neurodegenerativetauopathies.Annu Rev Neurosci 24，1121(2001).
3.H.Braak，E.Braak，Neuropathological stageing of Alzheimer-relatedchanges.Acta neuropathologica 82，239(1991).
4.B.T.Hyman，G.W.Van Hoesen，A.R.Damasio，C.L.Barnes，Alzheimer′sdisease：cell-specific pathology isolates the hippocampalformation.Science225，1168(Sep 14，1984).
5.A.de Calignon et al.，Propagation of tau pathology in a model ofearly Alzheimer′s disease.Neuron73，685(Feb23，2012).
6.J.A.Harris et al.，Human P301L-mutant tau expression in mouseentorhinal-hippocampal network causes tau aggregation and presynapticpathology but no cognitive deficits.PLoS One 7，e45881(2012).
7.L.Liu et al.，Trans-synaptic spread of tau pathology in vivo.PLoSOne 7，e31302(2012).
8.F.Clavaguera，M.Goedert，M.Tolnay，[Induction and spreading of taupathology in a mouse model of Alzheimer′s disease].Medecine sciences：M/S 26，121(Feb，2010).
9.D.W.Sanders et al.，Distinct tau prion strains propagate in cellsand mice and define different tauopathies.Neuron 82，1271(Jun 18，2014).
10.L.C.Walker，M.I.Diamond，K.E.Duff，B.T.Hyman，Mechanisms of proteinseeding in neurodegenerative diseases.JAMA neurology 70，304(Mar 1，2013).
11.A.Van der Jeugd et al.，Cognitive defects are reversible ininducible mice expressing pro-aggregant full-length human Tau.Actaneuropathologica 123，787(Jun，2012).
12.S.Brandner et al.，Normal host prion protein necessary for scrapie-induced neurotoxicity.Nature 379，339(Jan 25，1996).
13.T.Timm，A.Marx，S.Panneerselvam，E.Mandelkow，E.M.Mandelkow，Structureand regulation of MARK，a kinase involved in abnormal phosphorylation of Tauprotein.BMC neuroscience9 Suppl 2，S9(2008).
14.L.M.Ittner et al.，Dendritic function of tau mediates amyloid-betatoxicity in Alzheimer′s disease mouse models.Cell 142，387(Aug 6，2010).
15.A.C.Alonso，I.Grundke-Iqbal，K.Iqbal，Alzheimer′s diseasehyperphosphorylated tau sequesters normal tau into tangles of filaments anddisassembles microtubules.Nature medicine 2，783(Jul，1996).
16.J.C.Augustinack，A.Schneider，E.M.Mandelkow，B.T.Hyman，Specific tauphosphorylation sites correlate withseverity of neuronal cytopathology inAlzheimer′s disease.Acta neuropathologica 103，26(Jan，2002).
17.H.C.Tai et al.，The synaptic accumulation of hyperphosphorylatedtau oligomers in Alzheimer disease is associated with dysfunction of theubiquitin-proteasome system.Am J Pathol 181，1426(Oct).
18.A.Serrano-Pozo，M.P.Frosch，E.Masliah，B.T.Hyman，Neuropathologicalalterations in Alzheimer disease.Cold Spring Harbor perspectives in medicine1，a006189(Sep，2011).
19.Y.Yoshiyama et al.，Synapse loss and microglial activation precedetangles in a P301Stauopathy mouse model.Neuron 53，337(Feb 1，2007).
20.A.de Calignon et al.，Caspase activation precedes and leads totangles.Nature464，1201(Apr22，2010).
21.K.V.Kuchibhotla et al.，Neurofibrillary tangle-bearing neurons arefunctionally integrated in cortical circuits in vivo.Proc Natl Acad Sci USA111，510(Jan7，2014).
22.N.Rudinskiy et al.，Tau pathology does not affect experience-drivensingle-neuron and network-wide Arc/Arg3.1 responses.Acta neuropathologicacommunications2，63(2014).
23.K.SantaCruz et al.，Tau suppression in a neurodegenerative mousemodel improves memory function.Science 309，476(Jul 15，2005).
24.F.Gallyas，Silver staining of Alzheimer′s neurofibrillary changesby means of physical development.Acta Morphol Acad Sci Hung 19，1(1971).
25.P.E.Fraser，Prions and Pdon-like Proteins.J Biol Chem 289，19839(Jul18，2014).
26.S.Kumar et al.，Stages and Conformations of the Tau Repeat Domainduring Aggregationand Its Effect on Neuronal Toxicity.J Biol Chem 289，20318(Jul18，2014).
27.M.Rapoport，H.N.Dawson，L.I.Binder，M.P.Vitek，A.Ferreira，Tau isessential to beta-amyloid-induced neurotoxicity.Proc Natl Acad Sci USA 99，6364(Apr 30，2002).
28.E.D.Roberson et al.，Reducing endogenous tau ameliorates amyloidbeta-induced deficits in an Alzheimer′s disease mouse model.Science 316，750(May 4，2007).
29.K.L.Tucker，M.Meyer，Y.A.Barde，Neurotrophins are required for nervegrowth during development.Nat Neurosci 4，29(Jan，2001).
30.M.Yasuda，M.R.Mayford，CaMKII activation in the cntorhinal cortexdisrupts previously encoded spatial memory.Neuron 50，309(Apr 20，2006).
31.M.Mayford，J.Wang，E.R.Kandel，T.J.O′Dell，CaMKII regulates thefrequency-response function of hippocampal synapses for the production ofboth LTD and LTP.Cell 81，891(Jun 16，1995).
32.N.Schaeren-Wiemers，A.Gerfin-Moser，A single protocol to detecttranscripts of various types and expression levels in neural tissue andcultured cells：in situ hybridization using digoxigenin-labelled cRNAprobes.Histochemistry 100，431(Dec，1993).
33.A.Sun，X.V.Nguyen，G.Bing，Comparative analysis of an improvedthioflavin-s stain，Gallyas silver stain，and immunohistochemistry forneurofibrillary tangle demonstration on the same sections.The journal ofhistochemistry and cytochemistry：official journal of the HistochemistrySociety 50，463(Apr，2002).
实施例3的参考文献
Alpar，A.，Ueberham，U.，Bruckner，M.K.，Seeger，G.，Arendt，T.，and Gartner，U.(2006).Different dendrite and dendritic spine alterations in basal and apicalarbors in mutant human amyloid precursor protein transgenic mice.Brain Res1099，189-198.
Chipuk，J.E.，Bouchier-Hayes，L.，and Green，D.R.(2006).Mitochondrialouter membrane permeabilization during apoptosis：the innocent bystanderscenario.Cell death and differentiation 13，1396-1402.
D′Amelio，M.，Cavallucci，V.，Middei，S.，Marchetti，C.，Pacioni，S.，Ferri，A.，Diamantini，A.，De Zio，D.，Carrara，P.，Battistihi，L.，et al.(2011).Caspase-3triggers early synaptic dysfunction in a mouse model of Alzheimer′sdisease.Nat Neurosci 14，69-76.
D′Amelio，M.，Sheng，M.，and Cecconi，F.(2012).Caspase-3in the centralnervous system：beyond apoptosis.Trends Neurosci 35，700-709.
DaRocha-Souto，B.，Coma，M.，Perez-Nievas，B.G.，Scotton，T.C.，Siao，M.，Sanchez-Ferrer，P.，Hashimoto，T.，Fan，Z.，Hudry，E.，Barroeta，I.，et al.(2012).Activation of glycogen synthase kinase-3 beta mediates beta-amyloid inducedneuritic damage in Alzheimer′s disease.Neurobiol Dis 45，425-437.
DuBoff，B.，Gotz，J.，and Feany，M.B.(2012).Tau promotes neurodegenerationvia DRP1mislocalization in vivo.Neuron 75，618-632.
Gamblin，T.C.，Chen，F.，Zambrano，A.，Abraha，A.，Lagalwar，S.，Guillozet，A.L.，Lu，M.，Fu，Y.，Garcia-Sierra，F.，LaPointe，N.，et al.(2003).Caspase cleavageof tau：linking amyloid and neurofibrillary tangles in Alzheimer′sdisease.Proc Natl Acad Sci USA 100，10032-10037.
Goping，I.S.，Gross，A.，Lavoie，J.N.，Nguyen，M.，Jemmerson，R.，Roth，K.，Korsmeyer，S.J.，and Shore，G.C.(1998).Regulated targeting of BAX tomitochondria.The Journal of cell biology 143，207-215.
Hsieh，H.，Boehm，J.，Sato，C.，Iwatsubo，T.，Tomita，T.，Sisodia，S.，andMalinow，R.(2006).AMPAR removal underlies Abeta-induced synaptic depressionand dendritic spine loss.Neuron 52，831-843.
Hudry，E.，Wu，H.Y.，Arbel-Ornath，M.，Hashimoto，T.，Matsouaka，R.，Fan，Z.，Spires-Jones，T.L.，Betensky，R.A.，Bacskai，B.J.，and Hyman，B.T.(2012).Inhibitionof the NFAT pathway alleviates amyloid beta neurotoxicity in a mhouse modelof Alzhcimer′s disease.J Neurosci 32，3176-3192.
Ittner，L.M.，and Gotz，J.(2011).Amyloid-beta and tau--a toxic pas dedeux in Alzheimer′s disease.Nature reviews Neuroscience 12，65-72.
Ittner，L.M.，Ke，Y.D.，Delerue，F.，Bi，M.，Gladbach，A.，van Eersel，J.，Wolfing，H.，Chieng，B.C.，Christie，M.J.，Napier，I.A.，et al.(2010).Dendriticfunction of tau mediates amyloid-beta toxicity in Alzheimer′s disease mousemodels.Cell 142，387-397.
Jankowsky，J.L.，Slunt，H.H.，Ratovitski，T.，Jenkins，N.A.，Copeland，N.G.，and Borchelt，D.R.(2001).Co-expression of multiple transgenes in mouse CNS：acomparison of strategies.Biomolecular engineering 17，157-165.
Jiao，S.，and Li，Z.(2011).Nonapoptotic function of BAD and BAX in long-term depression of synaptic transmission.Neuron 70，758-772.
Johnson-Wood，K.，Lee，M.，Motter，R.，Hu，K.，Gordon，G.，Barbour，R.，Khan，K.，Gordon，M.，Tan，H.，Games，D.，et al.(1997).Amyloid precursor protein processingand A beta42 deposition in a transgenic mouse model of Alzheimer disease.ProcNatl Acad Sci USA 94，1550-1555.
Knafo，S.，Alonso-Nanclares，L.，Gonzalez-Soriano，J.，Merino-Serrais，P.，Fernaud-Espinosa，I.，Ferrer，I.，and DeFelipe，J.(2009).Widespread changes indendritic spines in a model of Alzheimer′s disease.Cereb Cortex 19，586-592.
Koffie，R.M.，Meyer-Luehmann，M.，Hashimoto，T.，Adams，K.W.，Mielke，M.L.，Garcia-Alloza，M.，Micheva，K.D.，Smith，S.J.，Kim，M.L.，Lee，V.M.，et al.(2009).Oligomeric amyloid beta associates with postsynaptic densities andcorrelates with excitatory synapse loss near senile plaques.Proc Natl AcadSci USA 106，4012-4017.
Kopeikina，K.J.，Polydoro，M.，Tai，H.C.，Yaeger，E.，Carlson，G.A.，Pitstick，R.，Hyman，B.T.，and Spires-Jones，T.L.(2013a).Synaptic alterations in therTg4510mouse model of tauopathy.The Journal of comparative neurology521，1334-1353.
Kopeikina，K.J.，Wegmann，S.，Pitstick，R.，Carlson，G.A.，Bacskai，B.J.，Betensky，R.A.，Hyman，B.T.，and Spires-Jones，T.L.(2013b).Tau causes synapse losswithout disrupting calcium homeostasis in the rTg4510 model of tauopathy.PloSone 8，e80834.
Li，Z.，Jo，J.，Jia，J.M.，Lo，S.C.，Whitcomb，D.J.，Jiao，S.，Cho，K.，and Sheng，M.(2010).Caspase-3 activation via mitochondria is required for long-termdepression and AMPA receptor internalization.Cell 141，859-871.
Li，Z.，Okamoto，K.，Hayashi，Y.，and Sheng，M.(2004).The importance ofdendritic mitochondria in the morphogenesis and plasticity of spines andsynapses.Cell 119，873-887.Rapoport，M.，Dawson，H.N.，Binder，L.I.，Vitek，M.P.，andFerreira，A.(2002).Tau is essential to beta-amyloid-induced neurotoxicity.ProcNatl Acad Sci USA 99，6364-6369.
Roberson，E.D.，Scearce-Levie，K.，Palop，J.J.，Yan，F.，Cheng，I.H.，Wu，T.，Gierstein，H.，Yu，G.Q.，and Mucke，L.(2007).Reducing endogenous tau amelioratesamyloid beta-induced deficits in an Alzheimer′s disease mouse model.Science316，750-754.
Shankar，G.M.，Li，S.，Mehta，T.H.，Garcia-Munoz，A.，Shepardson，N.E.，Smith，I.，Brett，F.M.，Farrell，M.A.，Rowan，M.J.，Lemere，C.A.，et al.(2008).Amyloid-betaprotein dimers isolated directly from Alzheimer′s brains impair synapticplasticity and memory.Nat Med 14，837-842.
Shipton，O.A.，Leitz，J.R.，Dworzak，J.，Acton，C.E.，Tunbridge，E.M.，Denk，F.，Dawson，H.N.，Vitek，M.P.，Wade-Martins，R.，Paulsen，O.，et al.(2011).Tau protein isrequired for amyloid {beta}-induced impairment of hippocampal long-termpotentiation.J Neurosci 31，1688-1692.
Spires，T.L.，Meyer-Luehmann，M.，Stern，E.A.，McLean，P.J.，Skoch，J.，Nguyen，P.T.，Bacskai，B.J.，and Hyman，B.T.(2005).Dendritic spine abnormalities inamyloid precursor protein transgenic mice demonstrated by gene transfer andintravital multiphoton microscopy.J Neurosci 25，7278-7287.
Spires-Jones，T.L.，and Hyman，B.T.(2014).The intersection of amyloidbeta and tau at synapses in Alzheimer′s disease.Neuron82，756-771.
Tucker，K.L.，Meyer，M.，and Barde，Y.A.(2001).Neurotrophins are requiredfor nerve growth during development.Nat Neurosci 4，29-37.
Vossel，K.A.，Zhang，K.，Brodbeck，J.，Daub，A.C.，Sharma，P.，Finkbeiner，S.，Cui，B.，and Mucke，L.(2010).Tau reduction prevents Abeta-induced defects inaxonal transport.Science 330，198.
Wang，H.G.，Pathan，N.，Ethell，I.M.，Krajewski，S.，Yamaguchi，Y.，Shibasaki，F.，McKeon，F.，Bobo，T.，Franke，T.F.，and Reed，J.C.(1999).Ca2+-induced apoptosisthrough calcineurin dephosphorylation of BAD.Science 284，339-343.
Wolter，K.G.，Hsu，Y.T.，Smith，C.L.，Nechushtan，A.，Xi，X.G.，and Youle，R.J.(1997).Movement of Bax from the cytosol to mitochondria during apoptosis.TheJournal of cell biology 139，1281-1292.
Wu，H.Y.，Hudry，E.，Hashimoto，T.，Kuchibhotla，K.，Rozkalne，A.，Fan，Z.，Spires-Jones，T.，Xie，H.，Arbel-Ornath，M.，Grosskreutz，C.L.，et al.(2010).Amyloidbeta induces the morphological neurodegenerative triad of spine loss，dendritic simplification，and neuritic dystrophies through calcineurinactivation.J Neurosci 30，2636-2649.
Wu，H.Y.，Hudry，E.，Hashimoto，T.，Uemura，K.，Fan，Z.Y.，Berezovska，O.，Girosskreutz，C.L.，Bacskai，B.J.，and Hyman，B.T.(2012).Distinct dendritic spineand nuclear phases of calcineuriinactivation after exposure to amyloid-betarevealed by a novel fluorescence resonance energy transfer assay.J Neurosci32，5298-5309.
Zempel，H.，Luedtke，J.，Kumar，Y.，Biernat，J.，Dawson，H.，Mandelkow，E.，andMandelkow，E.M.(2013).Amyloid-beta oligomers induce synaptic damage via Tau-dependent microtubule severing by TTLL6and spastin.The EMBO journal 32，2920-2937.
在尚未指示的范围内，本领域普通技术人员将理解的是，可对本文所描述和说明的多个实施方式中的任何一者进行进一步修改，以并入本文所公开的其它实施方式中的任何一者中示出的特征。因此，其它实施方式在本发明的范围和精神内。此外，尽管以上描述涉及本发明，所述描述可包括多于一个发明。
出于所有目的，将在本文中标明的所有专利和其它出版物通过引用的方式明确地并入本文。这些出版物仅因为它们的公开早于本申请的申请日而提供。在这方面的任何内容不应视为承认发明人没有权利借助于先前的发明或因为任何其它原因而将此类公开提前。关于这些文件的内容的所有表述或日期的所有声明是基于申请人可得的信息，并且不构成关于这些文件的内容或日期的正确性的任何承认。

Claims (61)

1.一种包含可溶性高分子量tau种类的组合物，其中，所述可溶性高分子量tau种类是非纤维状的，具有至少669kDa的分子量；并且其中，所述组合物不含可溶性低分子量tau种类，所述可溶性低分子量tau种类具有不超过200kDa的分子量。
2.如权利要求1所述的组合物，其中，所述可溶性高分子量tau种类具有669kDa至1000kDa的分子量。
3.如权利要求1所述的组合物，其中，所述可溶性高分子量tau种类处于颗粒的形式。
4.如权利要求3所述的组合物，其中，所述颗粒的粒径范围为10nm至30nm。
5.如权利要求1-4中任一项所述的组合物，其中，所述可溶性高分子量tau种类为磷酸化的。
6.如权利要求1-4中任一项所述的组合物，其中，所述可溶性高分子量tau种类在磷酸盐缓冲盐水中是可溶的。
7.如权利要求1-4中任一项所述的组合物，其中，与所述可溶性低分子量tau种类的神经元摄取和神经元至神经元的运输相比，所述可溶性高分子量tau种类优先被神经元摄取并从神经元经轴突运输至突触连接的神经元。
8.如权利要求1-4中任一项所述的组合物，所述组合物进一步包含佐剂，所述佐剂用于针对所述可溶性高分子量tau种类产生抗体。
9.一种分离的抗体或其抗原结合部分，所述分离的抗体或其抗原结合部分特异性地结合可溶性高分子量tau种类，且不结合可溶性低分子量tau种类，其中，所述高分子量tau种类是非纤维状的，具有至少669kDa的分子量；并且其中，所述低分子量tau种类具有不超过200kDa的分子量。
10.如权利要求9所述的分离的抗体或其抗原结合部分，所述分离的抗体或其抗原结合部分降低由神经元摄取的所述可溶性高分子量tau种类。
11.如权利要求9所述的分离的抗体或其抗原结合部分，所述分离的抗体或其抗原结合部分降低从神经元经轴突运输至突触连接的神经元的所述可溶性高分子量tau种类。
12.如权利要求9所述的分离的抗体或其抗原结合部分，其中，所述可溶性高分子量tau种类具有669kDa至1000kDa的分子量。
13.如权利要求9所述的分离的抗体或其抗原结合部分，其中，所述可溶性高分子量tau种类处于颗粒的形式。
14.如权利要求13所述的分离的抗体或其抗原结合部分，其中，所述颗粒的粒径范围为10nm至30nm。
15.如权利要求9-14中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合部分，其中，所述可溶性高分子量tau种类为磷酸化的。
16.如权利要求9-14中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合部分，其中，所述可溶性高分子量tau种类在磷酸盐缓冲盐水中是可溶的。
17.可溶性高分子量tau种类的拮抗剂在制备用于防止病理性tau蛋白在突触连接的神经元间传播的药物中的用途，所述药物选择性地降低与突触连接的神经元接触的可溶性高分子量tau种类的细胞外水平，其中，所述可溶性高分子量tau种类是非纤维状的，具有至少669kDa的分子量；其中，所述可溶性高分子量tau种类的水平降低使得病理性tau蛋白在突触连接的神经元间的传播降低。
18.如权利要求17所述的用途，其中，在所述选择性地降低期间，可溶性低分子量tau种类的细胞外水平不降低，其中，所述可溶性低分子量tau种类具有不超过200kDa的分子量。
19.如权利要求17所述的用途，其中，通过微透析来选择性地降低所述可溶性高分子量tau种类。
20.如权利要求17-19中任一项所述的用途，其中，通过使与突触连接的神经元接触的细胞外间隙或流体与所述可溶性高分子量tau种类的拮抗剂接触，来选择性地降低所述可溶性高分子量tau种类。
21.如权利要求20所述的用途，其中，所述高分子量tau种类的拮抗剂选自于由以下物质所组成的组：抗体、转录阻抑因子、核酸抑制剂、小分子、基因编辑组合物，以及它们的组合。
22.如权利要求20所述的用途，其中，所述高分子量tau种类的拮抗剂为锌指核酸酶。
23.如权利要求20所述的用途，其中，所述高分子量tau种类的拮抗剂为适体。
24.可溶性高分子量tau种类的拮抗剂在制备用于降低受试者中的tau相关神经退行性变的药物中的用途，所述药物选择性地降低经确定患有或有风险患tau相关神经退行性变的受试者的脑中的可溶性高分子量tau种类的水平，其中，所述可溶性高分子量tau种类是非纤维状的，具有至少669kDa的分子量；其中，所述可溶性高分子量tau种类的水平降低使得tau相关神经退行性变降低。
25.如权利要求24所述的用途，其中，所述药物不会降低所述受试者中的可溶性低分子量tau种类的水平，其中，所述可溶性低分子量tau种类具有不超过200kDa的分子量。
26.如权利要求24所述的用途，其中，所述可溶性高分子量tau种类的至少一部分存在于所述受试者的脑间质液中。
27.如权利要求24所述的用途，其中，所述可溶性高分子量tau种类的至少一部分存在于所述受试者的脑脊液中。
28.如权利要求24-27中任一项所述的用途，其中，通过脑微透析来选择性地降低所述受试者的脑中的所述可溶性高分子量tau种类。
29.如权利要求24-27中任一项所述的用途，其中，通过向所述受试者的脑给予所述可溶性高分子量tau种类的拮抗剂，来选择性地降低所述可溶性高分子量tau种类。
30.如权利要求29所述的用途，其中，所述高分子量tau种类的拮抗剂选自于由以下物质所组成的组：抗体、转录阻抑因子、核酸抑制剂、小分子、基因编辑组合物，以及它们的组合。
31.如权利要求29所述的用途，其中，所述高分子量tau种类的拮抗剂为锌指核酸酶。
32.如权利要求29所述的用途，其中，所述高分子量tau种类的拮抗剂为适体。
33.如权利要求24-27中任一项所述的用途，所述受试者选自如下受试者，所述受试者经确定具有以高于参考水平的水平存在于脑中的可溶性高分子量tau种类。
34.如权利要求24-27中任一项所述的用途，其中，所述tau相关神经退行性变是阿尔茨海默氏病、帕金森氏病或额颞叶痴呆。
35.如下试剂在制备用于诊断tau相关神经退行性变的药剂中的用途，其中，
在对来自受试者的脑间质液或脑脊液的试样进行分级分离后；用所述试剂对所述试样中的可溶性高分子量tau种类进行检测，从而确定所述可溶性高分子量tau种类的存在和量，其中，所述可溶性高分子量tau种类是非纤维状的，具有至少669kDa的分子量；以及当所述试样中的所述可溶性高分子量tau种类的水平与参考水平相同或高于参考水平时，将所述受试者识别为患有或有风险患tau相关神经退行性变；或者当所述可溶性高分子量tau种类的水平低于参考水平时，将所述受试者识别为不太可能患有tau相关神经退行性变。
36.如权利要求35所述的用途，其中，所述试样不含可溶性低分子量tau种类，其中，所述可溶性低分子量tau种类具有不超过200kDa的分子量。
37.如权利要求35所述的用途，其中，所述试样包含可溶性低分子量tau种类，其中，所述可溶性低分子量tau种类具有不超过200kDa的分子量。
38.如权利要求37所述的用途，所述试剂进一步用于对所述试样中的所述可溶性低分子量tau种类的量进行检测。
39.如权利要求38所述的用途，其中，如果所述可溶性高分子量tau种类与可溶性低分子量tau种类的比例与参考水平比例相同或高于参考水平比例，将所述受试者识别为患有或有风险患tau相关神经退行性变；或者，如果所述可溶性高分子量tau种类与所述可溶性低分子量tau种类的比例低于所述参考水平比例，将所述受试者识别为不太可能患有tau相关神经退行性变，
其中，所述可溶性低分子量tau种类具有不超过200kDa的分子量。
40.如权利要求35-38中任一项所述的用途，其中，通过尺寸排阻进行所述分级分离。
41.如权利要求35-38中任一项所述的用途，其中，所述检测进一步包括检测所述可溶性高分子量tau种类的磷酸化。
42.如权利要求35-38中任一项所述的用途，其中，所述tau相关神经退行性变是阿尔茨海默氏病、帕金森氏病或额颞叶痴呆。
43.一种对有效降低错误折叠的tau蛋白的跨突触散播的试剂进行识别的方法，所述方法包括：
(a)使神经元培养装置第一腔室中的第一神经元与可溶性高分子量tau种类接触，其中，所述可溶性高分子量tau种类具有至少669kDa的分子量，其中，所述第一神经元与所述神经元培养装置第二腔室中的第二神经元通过轴突连接，并且其中，所述第二神经元不与所述可溶性高分子量tau种类接触；
(b)使所述第一腔室中的来自(a)的所述第一神经元与候选试剂接触；
(c)检测所述可溶性高分子量tau种类从所述第一神经元向所述第二神经元的运输，从而基于检测所述第二神经元的胞体和/或轴突中的所述可溶性高分子量tau种类的存在，来识别用于降低错误折叠的tau蛋白的跨突触散播的有效试剂。
44.如权利要求43所述的方法，其中，所述神经元培养装置是微流体装置。
45.如权利要求44所述的方法，其中，所述微流体装置包含用于放置第一神经元的第一腔室和用于放置第二神经元的第二腔室，其中，所述第一腔室和所述第二腔室通过至少一个微通道相互连接，所述微通道专门经尺寸设计以允许轴突生长。
46.如下试剂在制备用于降低tau病变诱导的神经损伤或神经退行性变的药物中的用途，所述试剂抑制经确定患有tau病变的受试者中的内源性细胞内tau蛋白的至少50％的表达水平，从而在神经原纤维缠结的存在下降低神经毒性和/或增加神经元存活，其中，所述内源性细胞内tau蛋白是可溶性高分子量tau种类，所述可溶性高分子量tau种类具有至少669kDa的分子量。
47.如权利要求46所述的用途，其中，所述试剂抑制所述受试者中的内源性细胞内tau蛋白的至少70％的表达水平。
48.如权利要求46所述的用途，其中，所述试剂抑制所述受试者中的内源性细胞内tau蛋白的至少90％的表达水平。
49.如权利要求46所述的用途，其中，所述试剂抑制所述受试者中的内源性细胞内tau蛋白的至少95％的表达水平。
50.如权利要求46-49中任一项所述的用途，其中，所述试剂扰乱微管相关蛋白tau基因的表达。
51.如权利要求46-49中任一项所述的用途，其中，所述试剂抑制微管相关蛋白tau基因的转录。
52.如权利要求46-49中任一项所述的用途，其中，所述试剂选自于由以下试剂所组成的组：抗体、转录阻抑因子、核酸抑制剂、小分子、基因编辑组合物，以及它们的组合。
53.如权利要求46-49中任一项所述的用途，其中，所述试剂为锌指核酸酶。
54.如权利要求46-49中任一项所述的用途，其中，所述试剂为适体。
55.如权利要求46-49中任一项所述的用途，其中，经由载体向脑给予所述试剂。
56.如权利要求55所述的用途，其中，所述载体是腺相关病毒。
57.如权利要求55所述的用途，其中，进一步确定受试者的脑具有β淀粉样蛋白斑，并且，所述给予在β淀粉样蛋白的存在下降低神经毒性和/或增加神经元存活。
58.如权利要求46-49中任一项所述的用途，其中，所述tau病变是阿尔茨海默氏病、帕金森氏病或额颞叶痴呆。
59.一种固体支持物，所述固体支持物包含固定于其上的可溶性高分子量tau多肽，所述支持物没有低分子量tau，其中，所述可溶性高分子量tau多肽具有至少669kDa的分子量，其中，所述低分子量tau具有不超过200kDa的分子量。
60.一种可溶性高分子量tau多肽的制剂，所述制剂在一个或多个tau多肽单体之间包含共价交联，其中，所述可溶性高分子量tau多肽具有至少669kDa的分子量。
61.一种组合物，所述组合物包含共价缀合至载体多肽或佐剂的可溶性高分子量tau，其中，所述可溶性高分子量tau具有至少669kDa的分子量。
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Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2014248515B2 (en) 2013-03-13 2019-03-07 Prothena Biosciences Limited Tau immunotherapy
CA3022673A1 (en) 2016-05-02 2017-11-09 Prothena Biosciences Limited Tau immunotherapy
CU24537B1 (es) 2016-05-02 2021-07-02 Prothena Biosciences Ltd Anticuerpos monoclonales que compiten por unirse a tau humano con el anticuerpo 3d6
US11504389B2 (en) * 2016-12-01 2022-11-22 Sangamo Therapeutics, Inc. Tau modulators and methods and compositions for delivery thereof
SG11201907422RA (en) 2017-02-17 2019-09-27 Denali Therapeutics Inc Anti-tau antibodies and methods of use thereof
CU24636B1 (es) 2017-05-02 2022-12-12 Prothena Biosciences Ltd Anticuerpos que reconocen tau en los residuos 257-271 o 320-334 de la seq id no: 1
ES2972698T3 (es) * 2017-12-11 2024-06-14 Nmi Naturwissenschaftliches Und Medizinisches Institut An Der Univ Tuebingen Dispositivo para la exploración de neuronas
EP3860618A4 (en) * 2018-10-02 2022-06-08 Sangamo Therapeutics, Inc. METHODS AND COMPOSITIONS FOR MODULATING TAU PROTEINS
KR20210134943A (ko) 2019-03-03 2021-11-11 프로테나 바이오사이언시즈 리미티드 타우 인식 항체
US20230088509A1 (en) * 2020-05-20 2023-03-23 St. Jude Children's Research Hospital Detection of alzheimer's disease using specific biomarkers
CN113817728A (zh) * 2020-06-19 2021-12-21 四川大学华西医院 一种有效干扰Tau蛋白表达的重组慢病毒及其应用
WO2024094597A1 (en) * 2022-10-31 2024-05-10 Ecole Polytechnique Federale De Lausanne (Epfl) Method of preparation of amyloidogenic protein aggregates and uses thereof

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1496404A (zh) * 2001-01-15 2004-05-12 ����˹���ѧ���»� 与神经变性疾病中蛋白聚集相关的物质和方法
WO2011026031A1 (en) * 2009-08-28 2011-03-03 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Antibodies that bind tau oligomers
CN102596221A (zh) * 2009-06-10 2012-07-18 纽约大学 病理tau蛋白的免疫靶向

Family Cites Families (61)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US4485045A (en) 1981-07-06 1984-11-27 Research Corporation Synthetic phosphatidyl cholines useful in forming liposomes
GB8308235D0 (en) 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4544545A (en) 1983-06-20 1985-10-01 Trustees University Of Massachusetts Liposomes containing modified cholesterol for organ targeting
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
US5013556A (en) 1989-10-20 1991-05-07 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
ATE300615T1 (de) 1990-08-29 2005-08-15 Genpharm Int Transgene mäuse fähig zur produktion heterologer antikörper
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
EP0564531B1 (en) 1990-12-03 1998-03-25 Genentech, Inc. Enrichment method for variant proteins with altered binding properties
ATE297465T1 (de) 1991-11-25 2005-06-15 Enzon Inc Verfahren zur herstellung von multivalenten antigenbindenden proteinen
US5580748A (en) 1993-05-03 1996-12-03 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Diagnostic tests for alzheimers disease
US5635388A (en) 1994-04-04 1997-06-03 Genentech, Inc. Agonist antibodies against the flk2/flt3 receptor and uses thereof
US5641870A (en) 1995-04-20 1997-06-24 Genentech, Inc. Low pH hydrophobic interaction chromatography for antibody purification
US5739277A (en) 1995-04-14 1998-04-14 Genentech Inc. Altered polypeptides with increased half-life
GB9603256D0 (en) 1996-02-16 1996-04-17 Wellcome Found Antibodies
WO1998058964A1 (en) 1997-06-24 1998-12-30 Genentech, Inc. Methods and compositions for galactosylated glycoproteins
WO1999022764A1 (en) 1997-10-31 1999-05-14 Genentech, Inc. Methods and compositions comprising glycoprotein glycoforms
US6602684B1 (en) 1998-04-20 2003-08-05 Glycart Biotechnology Ag Glycosylation engineering of antibodies for improving antibody-dependent cellular cytotoxicity
CA2359067C (en) 1999-01-15 2017-03-14 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
EP2180044A1 (en) 2001-08-03 2010-04-28 GlycArt Biotechnology AG Antibody glycosylation variants having increased anti-body-dependent cellular cytotoxicity
JP2005532253A (ja) 2001-10-25 2005-10-27 ジェネンテック・インコーポレーテッド 糖タンパク質組成物
US20030170678A1 (en) 2001-10-25 2003-09-11 Neurogenetics, Inc. Genetic markers for Alzheimer's disease and methods using the same
US20040093621A1 (en) 2001-12-25 2004-05-13 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd Antibody composition which specifically binds to CD20
JP4968498B2 (ja) 2002-01-23 2012-07-04 ユニバーシティ オブ ユタ リサーチ ファウンデーション ジンクフィンガーヌクレアーゼを用いる、標的化された染色体変異誘発
CA2479858A1 (en) 2002-03-21 2003-10-02 Monika Liljedahl Methods and compositions for using zinc finger endonucleases to enhance homologous recombination
JP2006502748A (ja) 2002-09-05 2006-01-26 カリフォルニア インスティテュート オブ テクノロジー 遺伝子ターゲッティングを誘発するキメラヌクレアーゼの使用方法
CA2501091A1 (en) * 2002-10-01 2004-04-15 Northwestern University Amyloid beta-derived diffusible ligands (addls), addl-surrogates, addl-binding molecules, and uses thereof
US7361740B2 (en) 2002-10-15 2008-04-22 Pdl Biopharma, Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
US20050106667A1 (en) 2003-08-01 2005-05-19 Genentech, Inc Binding polypeptides with restricted diversity sequences
US8409861B2 (en) 2003-08-08 2013-04-02 Sangamo Biosciences, Inc. Targeted deletion of cellular DNA sequences
US7888121B2 (en) 2003-08-08 2011-02-15 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for targeted cleavage and recombination
EP1694816B1 (en) 2003-11-07 2013-08-28 Ciphergen Biosystems, Inc. Biomarkers for alzheimer's disease
CA2579677A1 (en) 2004-09-16 2006-03-30 Sangamo Biosciences, Inc. Compositions and methods for protein production
US7771937B2 (en) 2005-05-20 2010-08-10 University Of Washington Methods for predicting late onset Alzheimer disease in an individual
US7595167B2 (en) 2005-10-11 2009-09-29 Blanchette Rockefeller Neurosciences Institute Alzheimer's disease-specific alterations of the Erk1/Erk2 phosphorylation ratio
GB0605337D0 (en) * 2006-03-17 2006-04-26 Genomica Sau Treatment of CNS conditions
CN101516401A (zh) 2006-08-21 2009-08-26 诺瓦提斯公司 阿尔茨海默病进展的生物标记
US20080318220A1 (en) 2007-06-20 2008-12-25 Fina Biotech, S.L. Method for the diagnosis and/or prognosis of alzheimer's disease
WO2009009457A1 (en) 2007-07-06 2009-01-15 University Of Louisville Research Foundation, Inc. Alzheimer's disease-specific micro-rna microarray and related methods
JP2010538611A (ja) * 2007-09-07 2010-12-16 ザ トラスティーズ オブ コロンビア ユニヴァーシティ イン ザ シティ オブ ニューヨーク タウタンパク質スクリーニングアッセイ
US8563314B2 (en) 2007-09-27 2013-10-22 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for modulating PD1
US20110312059A1 (en) * 2008-08-20 2011-12-22 Oligomerix Inc. Tau protease compositions and methods
WO2010048497A1 (en) 2008-10-24 2010-04-29 Genizon Biosciences Inc. Genetic profile of the markers associated with alzheimer's disease
KR20100080068A (ko) 2008-12-31 2010-07-08 주식회사 툴젠 신규한 징크 핑거 뉴클레아제 및 이의 용도
US20110239315A1 (en) 2009-01-12 2011-09-29 Ulla Bonas Modular dna-binding domains and methods of use
US8871905B2 (en) 2009-03-20 2014-10-28 Sangamo Biosciences, Inc. Modification of CXCR4 using engineered zinc finger proteins
US8772008B2 (en) 2009-05-18 2014-07-08 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for increasing nuclease activity
US8956828B2 (en) 2009-11-10 2015-02-17 Sangamo Biosciences, Inc. Targeted disruption of T cell receptor genes using engineered zinc finger protein nucleases
CA2783351C (en) 2009-12-10 2021-09-07 Regents Of The University Of Minnesota Tal effector-mediated dna modification
US20130195866A1 (en) 2010-01-19 2013-08-01 Brian J. Bacskai Methods to inhibit neurodegeneration
US9567573B2 (en) 2010-04-26 2017-02-14 Sangamo Biosciences, Inc. Genome editing of a Rosa locus using nucleases
WO2013103972A1 (en) * 2012-01-06 2013-07-11 Gencia Corporation Treatment of frailty syndrome and symptoms thereof
EP4043564A1 (en) 2012-05-25 2022-08-17 The Regents of The University of California Methods and compositions for rna-directed target dna modification and for rna-directed modulation of transcription
US8697359B1 (en) 2012-12-12 2014-04-15 The Broad Institute, Inc. CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products
WO2014131833A1 (en) 2013-02-27 2014-09-04 Helmholtz Zentrum München Deutsches Forschungszentrum Für Gesundheit Und Umwelt (Gmbh) Gene editing in the oocyte by cas9 nucleases

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1496404A (zh) * 2001-01-15 2004-05-12 ����˹���ѧ���»� 与神经变性疾病中蛋白聚集相关的物质和方法
CN102596221A (zh) * 2009-06-10 2012-07-18 纽约大学 病理tau蛋白的免疫靶向
WO2011026031A1 (en) * 2009-08-28 2011-03-03 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Antibodies that bind tau oligomers

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Are tau aggregates toxic or protective in tauopathies?;Catherine M. Cowan et al.;《frontiers in NEUROLOGY》;20130813;第4卷;第2页"SMALL SOLUBLE OLIGOMER"

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Santuccione et al. Active vaccination with ankyrin G reduces β-amyloid pathology in APP transgenic mice
Yue et al. Synthetic amyloid-β oligomers drive early pathological progression of Alzheimer’s disease in nonhuman primates
Zahola et al. Secretagogin expression in the vertebrate brainstem with focus on the noradrenergic system and implications for Alzheimer’s disease
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Torre-Muruzabal et al. Chronic nigral neuromodulation aggravates behavioral deficits and synaptic changes in an α-synuclein based rat model for Parkinson’s disease
Cheung et al. Creation of a novel CRISPR‐generated allele to express HA epitope‐tagged C 1 QL 1 and improved methods for its detection at synapses
Siegel et al. Tomoregulin‐2 is found extensively in plaques in Alzheimer's disease brain
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