CN106030288A - 荧光分析器 - Google Patents

Abstract

在对未知浓度的试样进行分析时，有时会因动态范围不足而频发需要进行再分析的状况。为此提出了一种荧光分析器的方案：利用像分割元件将一个物体像分割为荧光强度不同的多个像，并对所得的多个像在同一检测面内的不同区域同时进行检测。

Description

荧光分析器

技术领域

本发明涉及在核酸或蛋白质等的分析中使用的荧光分析器。

背景技术

在一种荧光分析器中具有毛细管电泳装置。毛细管电泳装置主要用于确定DNA的碱基序列和碱基长度。对于毛细管电泳而言，是在被称为毛细管的细管中填充凝胶等的泳动介质，使样本的DNA片段在该毛细管内泳动。并且，通过计测样本以一定距离(通常是从毛细管的一端到另一端)完成泳动所需的时间来调查DNA片段长度。以荧光色素标识各样本即各DNA片段，并利用置于毛细管末端部的光学检测器，来检测进行泳动的样本的荧光信号。

在向多个毛细管照射激光的方式中有一种是专利文献1记载的多聚焦(multi-focus)方式。就该方式而言，是向位于在平面基板上并列的多个毛细管所构成的毛细管阵列的一侧或两侧的端部上的毛细管照射激光。并且，所照射的激光在邻接的毛细管之间逐次传播并横穿毛细管阵列。利用光检测器对在毛细管阵列中产生的发光进行检测。将含有以荧光色素标识的DNA的试样导入毛细管内，并以在排成一列的多个毛细管之间传播的方式照射激光。利用向毛细管照射的激光使经荧光标识的DNA发出荧光。通过对各毛细管发出的荧光进行测定，能够对各毛细管中导入的试样进行DNA分析。在对蛋白质等进行分析的场合也是同样的。

上述装置的荧光检测是将向毛细管末端部照射特定波长的激光而得到的各荧光色素的荧光利用衍射光栅分离为波长成分，并利用CCD等二维检测器检测空间方向和波长方向的图像。检测器拍摄的图像被作为特定的毛细管的光谱数据保存并用于数据分析。专利文献2记载的荧光分光器，是利用衍射光栅使取得的荧光连续地分散，并计测光谱(实际上像素之间是离散的)来进行分析。

当前，采用荧光检测器的分析设备正在从研究型市场向应用型市场扩展，因此需要应对浓度不同的(检测强度差异较大的)样本。上述的毛细管电泳装置也是其中之一。当前使用的主流型荧光检测器是用一个检测器来检测荧光。其动态范围或检测范围取决于荧光样本的激励效率、相机镜头的NA、二维检测器的性能自身。

在需要较宽的动态范围或检测范围的设备中可采用以下方法：在光路的途中设置分光器、滤波器来分割检测像并由多个检测器取得荧光强度不同的多个像。但是，由于需要多个昂贵的检测器而存在装置成本增加、检测单元大型化等缺点。

另外，荧光强度取决于照射检测时间和照射强度。因此，通过对照射侧的参数进行控制，能够取得强度不同的数据。因此在使用单一检测器的分析中也提出了这样一种方法：使照射时间或检测时间进行长短变化来取得荧光强度不同的数据。但是在以时序取得数据的装置中，存在因单位时间内的测定点数减少而导致取得数据所需的采样点数不足的情况。

现有技术文献

专利文献

专利文献1:美国专利第5582705号

专利文献2:美国专利第6690467号

发明内容

发明所要解决的课题

以下记述了本发明人着力研究所揭示的现有技术存在的问题。通常在毛细管电泳装置中是对调整了DNA量的样本进行分析。但是可以预见的是今后毛细管电泳装置的用途会向临床诊断、DNA鉴定等应用型市场扩展。在此情况下，要求毛细管电泳装置具备处理未知浓度样本的能力。但是，如果动态范围不足则有可能频发如下状况：在高浓度样本的分析中发生检测信号值的饱和；在低浓度样本的分析中无法检出检测信号。该情况下，分析者需要在进行浓度再调整之后重新进行分析。

例如在专利文献1记载的方法中，为了同时测定多个样本而将样本浓度限定在装置的动态范围内。通常在采用电泳的基因序列分析中，会在电泳的前处理工序中为试样的精制花费时间，并在调整为大致均匀的试样浓度之后进行分析。例如在使用RNA进行浓度检查之后将样本投入电泳装置。

但是，如果将现有的电泳装置应用于临床用的基因功能分析的领域时，则未经充分的前处理工序的样本也会成为测定对象。例如在进行浓度检查时因样本量少而无法确认浓度就直接投入电泳装置的样本，或者是为了进行发现分析而预先达到高浓度的样本等也会成为测定对象。该情况下，会发生分析中的测定信号值超过检测界限范围的情况。为此，分析者需要对样本注入时的电压、时间进行调整，并且控制样本注入量，重新进行分析。

此外，在实际的分析方法中有一种是设置两种类型的激励光照射时间并将其中信号强度不饱和的一种用于分析。但是，有时会因对采样时间设置两种类型的照射时间而无法充分确保数据的处理传输时间等。例如在采样时间是150毫秒的情况下，如果对一个数据处理设置40毫秒，则作为两种类型的照射时间仅能够确保合计70毫秒。由此可知：在为了保持原有的灵敏度而作为激励光的照射时间需要100毫秒的情况下则本方法不适用。另外，也有设置两台检测器来测定两种类型的激励光照射时间的方法，但是装置昂贵。

用于解决课题的方案

为了解决上述课题，在本发明的荧光分光器中提出了一种方法：利用像分割元件将一个物体像分割为荧光强度不同的多个像，并对所得的多个像在同一检测面内的不同区域同时进行检测。

发明效果

根据本发明，对于同一样本同时计测荧光强度不同的信号，因此能够在表观上增大动态范围。上述以外的课题、结构和效果可以通过以下对实施方式的说明更加明了。

附图说明

图1是表示在各实施例中使用的基因分析装置的概略结构的图。

图2是表示在实施例1中使用的电泳装置的照射部的概略结构的图。

图3是表示在实施例1中使用的电泳装置的荧光分析器的概略结构的图。

图4是表示在实施例1中使用的荧光分析器的详细结构的图。

图5是表示在实施例1中使用的基因分析装置的处理流程的图。

图6A是表示现有的成像系统的光线追迹的图。

图6B是表示实施例的成像系统的光线追迹的图。

图6C是说明像分割棱镜的各要素的图。

图7是表示在实施例1中使用的像分割棱镜的概略图的图。

图8是表示在实施例1中使用的像分割棱镜的具体例的图。

图9A是表示利用θ15°的棱镜进行像分割的特征的图。

图9B是表示利用θ5°的棱镜进行像分割的特征的图。

图10是表示实施例1的像分割效果的图。

图11是表示在实施例2中使用的荧光分析器的具体结构的图。

图12是表示在实施例3中使用的荧光分析器的具体结构的图。

图13是表示在实施例3中使用的荧光分析器的具体结构的图。

图14是表示在实施例4中使用的荧光分析器的具体结构的图。

图15是表示在实施例4中使用的荧光分析器的具体结构的图。

具体实施方式

首先对将在后述各实施例中说明的荧光分析器的概略结构进行说明。各实施例的荧光分析器的共同点在于：都是利用像分割元件将一个物体像分割为荧光强度不同的多个像，并在同一检测面内的不同区域同时对所得的多个像进行检测。另外，荧光分析器将上述的像分割元件和分光元件组合使用。

所有的荧光分析装置都对同一样本同时计测荧光强度不同的多个信号，因此能够在表观上增大动态范围。例如能够取得信号强度相差10倍的强弱两种类型的像，能够对浓度相差10倍的样本进行分析。例如在高浓度样本的情况下荧光强度较强，有时因检测器上的像发生饱和而无法进行准确的分析。在此情况下，使用荧光强度较弱的一方的像进行分析。在低浓度样本的情况下，使用荧光强度较强的像进行分析。即使浓度相差10倍，也能够通过区分使用检测器上的强弱两种类型的数据来进行分析。

荧光检测器构成为包含：用于使激励光与荧光分离的光学滤波器；用于取得像的聚光透镜；用于对荧光进行分光的分光元件(衍射光栅、棱镜、光学滤波器)；用于分割像的光学元件(棱镜、分光器)；成像透镜；用于取得分光的像作为数据的二维检测器(CCD或CMOS等)。

光学滤波器在物体面与聚光透镜之间和聚光透镜的后方配置。并且，用于对荧光进行分光的分光元件和用于分割像的光学元件在聚光透镜后的准直的光路上配置。成像透镜在进行分光和像分割后的光路、二维检测器的近前配置。

用于分割像的像分割元件(例如棱镜)的构造是构成为包含：与准直的荧光光轴(光路)垂直的平面；与分割光路的数量相同数量的平面。这些进行像分割的面相对于与垂直于准直的荧光光轴的平面平行的面倾斜几度至十几度。例如在1°～小于20°的范围倾斜。因此，光轴会在棱镜的像分割面上发生变化。以像分割面的数量生成多个荧光光路来分割像。如果在各分割面上形成介电膜或蒸镀膜而使透射率可变，则能够对所分割的像的荧光强度进行控制。或者，也可以通过改变各分割面的面积比率来控制各像的荧光强度。

并且，具有其它构造的像分割元件(例如分光器)是平板状并利用透射和反射来分割光路。透射和反射的比例能够控制。像分割元件与准直的荧光光轴倾斜45°地配置。透射光轴和反射光轴具有90°的较大的角度，因此在透射光路或反射光路上配置全反射镜而使分割的光路大致平行。

以下对荧光分析器内的像分割和多个像的成像的机制进行说明。在各实施例的荧光分析器的情况下也与现有技术同样地向毛细管等照射激光而对样本中的荧光色素进行激励。对激励的荧光利用光学滤波器等防止激励光成分并使分析所需的荧光透射并利用透镜聚光、准直。再次利用光学滤波器从准直的荧光去除无用成分并利用衍射光栅进行分光。经衍射光栅分光的光可分为零次光、一次光、二次光各成分。在实施例的荧光分析器中，是在分光后信号强度最高的一次光的光路上配置像分割元件。衍射光栅后的光也保持准直的状态。

在像分割棱镜上，光轴通过与光轴垂直的棱镜面且在不与该面平行而是相对于平行面倾斜几度的面上发生变化。光在棱镜与空气的界面上按照斯内尔定律发生折射。如果具有多个倾斜面，则按照该面的数量产生新的光路，射入棱镜的一个像被分割以形成多个像。此时，如果在用于像分割的各面上蒸镀介电体膜来控制透射率，则能够分割为信号强度不同的像。

最后用相机镜头等使分光以及多个像即分割为多个光路的荧光成像于二维检测器。使分割的多个物体和分光的像在二维检测器上成像。在分割为多个光路时成像的信号强度取决于分割面的光量。并且如后所述，检测器不限于二维检测器，也可以通过对所使用的像分割元件与分光元件进行组合而使用一维检测器。

以下参照附图对实施例进行说明。但是需要注意的是：本实施例仅为用于实现本发明的一个例子而并不限定本发明的技术范围。并且，在各图中对通用结构附加同一参考编号。

[实施例1]

图1示出在荧光检测中使用毛细管电泳装置的基因分析装置的结构例。另外，该装置结构对于后述各实施例也是通用的。基因分析装置是荧光分析器的一个例子。

基因分析装置100由数据分析装置128和电泳装置101构成。电泳装置101构成为包含：用于对样本进行光学检测的检测部116；用于将毛细管保持恒温的恒温槽118；用于向毛细管阴极端搬送各种容器的搬送机125；用于向毛细管施加高电压的高压电源104；用于检测从高压电源提供的电流的第一电流计105；用于检测流过阳极侧电极的电流的第二电流计112；由单个或多个毛细管102构成的毛细管阵列117；用于向毛细管注入聚合物的泵机构103。

毛细管阵列117是包含多根(例如四根)毛细管的交换部件，且包含装载头129、检测部116、毛细管头。在变更测定方法时置换毛细管阵列117并调节毛细管102的长度。并且，当发现毛细管破损或品质劣化时则更换为新的毛细管阵列。

毛细管102由内径为几十到几百微米而外径为几百微米的玻璃管构成，为了提高强度而以聚酰亚胺涂覆表面。但是，照射激光的光照射部则为了避免内部的发光泄漏到外部而形成除去了聚酰亚胺被膜的构造。毛细管102的内部填充用于在电泳时提供泳动速度差的分离介质。分离介质有流动性和非流动性的两类，在本实施例中采用流动性的聚合物。

检测部116是取得与试样有关的信息的部件，照射激励光而放出依赖于试样的波长的光。在光学平面上将四根毛细管的光照射部附近以高度为几微米的精度排列固定。电泳时从两侧照射大致同轴的2束激光且连续地透射全部的光照射部。利用该激光从试样产生信息光(具有与试样有关的波长的荧光)，并从光照射部向外部放出。利用光学检测器115检测该信息光来分析试样。

毛细管阴极端127分别通过金属制的空心电极126而固定，成为毛细管前端从空心电极126突出0.5mm左右的状态。并且，每个毛细管所装备的空心电极全部成为一体而装设于装载头129。另外，全部的空心电极126与装置本体所搭载的高压电源104导通，在电泳或样本导入等需要施加电压时作为阴极电极工作。

与毛细管阴极端127相反侧的毛细管端部(另一端部)利用毛细管头集束成为一体，能贯通毛细管头并保持束状且耐压气密地在模块107上装拆。在模块107内的一条流路上连接有注射器106，利用该注射器106从上述另一端部侧向毛细管内填充新的聚合物。为了提高测定性能，毛细管中的聚合物的换装可与每次测定一并实施。

泵机构103由注射器106和用于对该注射器加压的机构系统构成。并且，模块107是用于使注射器106、毛细管阵列117、阳极缓冲剂容器110、聚合物容器109分别连通的连接部。光学检测部由用于照射检测部116的光源114、和用于对检测部116内的发光进行检测的光学检测器115构成。在对毛细管中的因电泳而分离的样本进行检测时，利用光源114照射毛细管的光照射部，并利用光学检测器115检测光照射部的发光。

恒温槽118为了使恒温槽内保持恒定温度而覆以隔热材料并利用加热冷却机构120控制温度。并且，风扇119搅拌恒温槽内的空气使其循环，使得毛细管阵列117的温度在各位置上均匀且保持恒定。搬送机125具备3个电动马达和线性驱动器而能够在上下、左右以及进深方向的三个轴上移动。并且，能够在搬送机125的移动载台130上载置至少一个以上的容器。在移动载台130上还具备电动的夹具131而能够抓取放置各容器。因此，搬送机125能够根据需要使用夹具131将阴极缓冲剂容器121、清洗容器122、废液容器123和样本容器124向阴极端搬送。另外，不需要的容器则保管于装置内的预定的存放处。

电泳装置101在利用通信线缆与数据分析装置128连接的状态下使用。操作者利用数据分析装置128来控制装置所具有的功能，并能够收发利用装置内的检测器检测的数据。

图2示意地表示了基因分析装置100的光学系统激光照射部、毛细管阵列117的检测部附近的结构、激光的导入路径。激光用的闸门、滤波器等是本领域的公知事项，且并非本发明的直接对象，因此为了简化而没有表示。(a)图是激光照射部的概略侧视图，(b)图是概略主视图。但是，(a)图和(b)图中的配置关系并不表示制图上的配置关系。

从光源即固体激光器201射出的激光202经由反射镜203和分光器205向毛细管阵列照射。毛细管阵列是将四根毛细管102在基准台座209上排列固定而成的。将基准台座209上的四根毛细管102的中心轴形成的平面和使该平面在全空间延长而成的假想平面称为毛细管配列平面。并且，以下将在毛细管配列平面上与四根毛细管轴垂直地贯穿检测部中央的假想直线称为照射光轴基本轴210。

从毛细管阵列的两端导入的激光202与毛细管配列平面平行，并与照射光轴基本轴210同轴。毛细管102是石英玻璃管被聚合物薄膜(聚酰亚胺)覆盖而成的，但是在检测部上成为除去聚合物被膜而露出石英的状态。石英管的内径和外径分别是50μm和320μm，包含聚合物薄膜的毛细管外径是363μm。毛细管102的间距等于毛细管外径即363μm，毛细管阵列的宽度是8.7mm(＝363μm×4)。

从阵列的一侧的侧面向毛细管阵列的荧光检测部(石英露出的部分)照射激光202，并对从检测部发出的荧光进行观测来检测DNA。激光202经激光聚光透镜206(f＝60mm)聚光。以下将位于毛细管阵列的端部并导入激光的毛细管102称为第一毛细管。激光聚光透镜206与第一毛细管的距离是62mm，导入第一毛细管的激光向邻接的毛细管逐次传播而横穿四根毛细管。

为了在激光202到达毛细管102之前将激光202的直线偏光变为圆偏光，在毛细管阵列的两端位置上配置波阻片(λ/4)207。经一侧的波阻片207成为圆偏光的激光202通过另一侧的波阻片207再次成为直线偏光。此时，两次通过波阻片207的直线偏向的直线偏光方向相对于导入最初的波阻片207之前的直线偏光方向使偏光方向旋转90度。并且，为了解决返回光的问题，在固体激光器201的正后方配置偏光镜204。偏光镜204是偏光板或称为偏光立方体的仅使一个方向的偏光透射的光学元件。由于两次通过波阻片207的激光被偏光镜204遮挡而不会到达光源。

使用图3对照射部和检测部的配置进行说明。如前所述，将多根毛细管102(例如四根)在平坦的表面即陶瓷制的基准台座209上排列固定而形成毛细管阵列。在图示例中，是将四根毛细管102在毛细管保持面上排列，并压覆硅制的平板掩模301，使用粘接剂等进行固定而形成毛细管阵列。

将基准台座209上的四根毛细管的中心轴形成的平面和使该平面在全空间延长而成的假想平面称为毛细管配列平面。并且，将与照射光轴基本轴210垂直且与毛细管配列平面也垂直的直线称为检测光轴基本轴310。从毛细管阵列的两端导入的激光202与毛细管配列平面平行，并与照射光轴基本轴210同轴。一根一根的毛细管102是石英玻璃管覆以聚合物薄膜而成的，但是激光照射部302(检测部位)成为除去聚合物被膜而露出石英的状态。

在图3的(b)图中示出了将检测部的一部分沿与毛细管正交的面切断的剖面的示意图。毛细管102是四根，激光202先向最靠近端部的毛细管102照射并在通过该毛细管102之后照射下一个毛细管102。这样，激光202逐次通过多个毛细管，并从相反侧一端的毛细管102射出。毛细管102呈圆筒形状并在其中填充有聚合物，从而提供与凸透镜同样的聚光功能。由此抑制激光202的发散。通过从毛细管阵列的左右两方向照射激光202，能够向大致全部的毛细管102照射均匀强度的激光202。因此，能够在保持激光强度的前提下同时照射四个样本。荧光检测器303在检测光轴基本轴310上配置而能够高效地使四个样本的荧光同时聚光。即能够对全部样本在保持高灵敏度的前提下同时进行检测。

图4示出了荧光检测器303的具体结构。图4的(a)图表示由毛细管102的轴和检测光轴基本轴310形成的面上的图，图4的(b)图是其侧视图即由照射光轴基本轴210和检测光轴基本轴310形成的平面上的图。但是在(b)图中为了容易说明而对衍射光栅405以后的光学系统的配置加以修正。而原本则需要与(a)图的配置相应地使(b)图中的薄型棱镜(也称为“像分割棱镜”)409、成像透镜406等倾斜地进行表示。

荧光检测器303构成为包含：用于使激励光与荧光分离的第一光学滤波器402和第二光学滤波器404；用于取得像的聚光透镜403；用于对荧光进行分光的衍射光栅405；用于分割像的薄型棱镜409；形成像的成像透镜406；用于取得分光的像作为数据的二维检测器407(CCD或CMOS等)。

以下对光学元件的具体配置、检测器内的像分割和多个像的成像的机制进行说明。向毛细管102照射激光202而对样本中的荧光色素进行激励。第一光学滤波器402、聚光透镜403、第二光学滤波器404、衍射光栅405在检测光轴基本轴310上配置。与现有技术同样地，利用第一光学滤波器402将来自毛细管102的发光分离为激励光和所需的荧光成分，并利用聚光透镜403进行聚光和准直。准直的荧光再次向第二光学滤波器404入射而去除无用成分。去除了无用成分的荧光由衍射光栅405进行分光。经衍射光栅405分光后的光分为零次光、一次光、二次光各成分。在本实施例中，将分光后信号强度最高的一次光的光路作为分光后检测光轴410，并在其上配置：像分割元件即薄型棱镜409、形成像的成像透镜406、用于取得分光的像作为数据的二维检测器407(CCD或CMOS等)。

薄型棱镜409的构造由与准直的荧光光轴(光路)—检测光轴基本轴310垂直的平面、和与分割光路的数量相同数量的平面构成。这些进行像分割的面相对于与垂直于准直的荧光光轴的平面平行的面倾斜几度至十几度(将在后面参照图6进行叙述)。因此，光轴会在薄型棱镜409的像分割面上发生变化。在本实施例中，具有面积相等的两个像分割面，生成两个荧光光路411、412来分割像。在像分割棱镜上，光轴通过与光轴垂直的棱镜面且在不与该面平行而是相对于平行面倾斜几度的面上发生变化。光在棱镜与空气的界面上按照斯内尔定律发生折射。如果具有多个倾斜面，则按照其数量产生新的光路，射入棱镜的一个像被分割以形成多个像。通过在各分割面上形成介电膜或蒸镀膜而使透射率可变，能够控制所分割的像的荧光强度。在本实施例中，配置具有透射率为90％的像分割面和透射率为10％的像分割面的薄型棱镜409。

最后利用成像透镜406使分光以及多个像即分割为光路的荧光在二维检测器407上成像。在构成二维检测器407的同一检测面的多个区域上形成分割特定的分光(一次光)的多个物体像。在分割为多个光路时，成像的物体像的信号强度取决于分割面的光量。

在荧光光路411上通过的荧光会在透射率90％的像分割面上透射，因此会在二维检测器407上形成信号强度较强的第一像(强)。在荧光光路412上通过的荧光会在透射率10％的像分割面上透射，因此会在二维检测器407上形成信号强度较弱的第二像(弱)。第一像和第二像的信号强度比与透射率之比相同而大致为9：1。即在二维检测器407上同时取得第一像(强)和第二像(弱)这两种类型的数据。

以下主要参照图5对电泳分析的基本步骤进行说明。在进行电泳来对任意的样本进行分析之前，每当更换毛细管时即进行波长校正(500)。在进行波长校正时，是使按照进行分析的色素群、例如四色的荧光色素进行了校正的已知的DNA样本泳动，取得作为基准的光谱数据。在因毛细管102的劣化而导致分析性能降低、因分析需要而变更毛细管102的长度时，波长校正是在更换毛细管阵列后必然进行的作业。

电泳分析的基本步骤大致包括：预先准备、泳动介质填充(503)、预备泳动(506)、试样导入(509)和利用电泳(512)进行的分析。首先对电泳开始前的准备进行说明。操作者在开始测定之前将如下各项安放到装置上。即安放：盛有缓冲液的阴极缓冲剂容器121；盛有毛细管清洗用的纯水的清洗容器122；用于将毛细管中的聚合物排出的废液容器123；盛有作为分离介质的聚合物的聚合物容器109；盛有将要进行测定的样本的样本容器124。

在阳极缓冲剂容器110中盛满使电极(GND)111和连通管双方充分浸渍的程度的缓冲剂。缓冲液使用市售的各品牌的电泳用电解质液。并且，向样本容器124的凹穴分注作为分析对象的试样。试样例如是DNA的PCR产物。并且，向清洗容器122分注用于清洗毛细管阴极端127的清洗溶液。清洗溶液例如是纯水。并且，在注射器106内注入用于使试样进行电泳的分离介质。泳动介质例如是市售的各品牌的电泳用聚丙烯酰胺类分离凝胶(以下称为聚合物)。

此时，在安放于样本容器124内的样本中，除了作为分析对象的DNA的实际样本之外，还有阳性对照组、阴性对照组、等位基因分型标准物(AllelicLadder)，分别在不同的毛细管中进行电泳。阳性对照组例如是包含已知的DNA的PCR产物，是用于确认利用PCR使DNA正确扩增的情况的对照实验用的样本。阴性对照组是不含DNA的PCR产物，是用于确认在PCR的扩增物上没有发生操作者的DNA或灰尘等的沾污的情况的对照实验用的样本。

并且，阴极缓冲剂容器121盛满使空心电极126和毛细管阴极端127充分浸渍的程度的缓冲剂。这是因为如果在缓冲剂的液量不足或者阴极缓冲剂容器121空置的状态下开始测定，则存在当施加高电压时会在高电位的阴电极、和电位较低的其它部位之间引起放电的危险。进而优选双方的缓冲剂液位相同。这是为了避免因高低差产生的压力而导致毛细管内的聚合物发生移动。并且，用于电泳的流路、或者在该流路中用于搬送聚合物的流路都需要在测定开始前预先充满聚合物。通常在连续使用装置时，上述的流路充满聚合物。并且，在更换毛细管阵列、对流路内进行清洗等之后以聚合物对流路进行再置换时，操作者对装置的泵机构进行操作或者手动操作注射器等以聚合物在流路内进行再置换。其后，操作者要目视确认流路内没有残留气泡或混入异物。并且，在预先准备完成后，操作者操作本装置开始分析。该分析在这里是指向电泳路施加高电压这样的分析。

本装置按照数据分析装置128发出的命令开始分析(501)。首先，装置为了向毛细管注入聚合物而利用搬送机125将废液容器向毛细管阴极端搬运(502)。其后，利用泵机构103向毛细管注入聚合物。即开始填充泳动介质(503)。该步骤既可以在分析开始后自动地进行，也可以逐次按照从数据分析装置128发出的控制信号来执行。泳动介质填充是向毛细管102内填充新的泳动介质来形成泳动路的步骤。

在本实施例的泳动介质填充(503)中，首先利用搬送机125将废液容器123向装载头129的正下方搬运，从而能够盛放从毛细管阴极端527排出的用过的泳动介质。然后，驱动注射器106向毛细管102填充新的泳动介质并废弃用过的泳动介质。最后，将毛细管阴极端127浸入到清洗容器122内的清洗溶液中，对被泳动介质污染的毛细管阴极端127进行清洗。

当预定量的泳动介质填充结束后，则搬送机125将清洗容器122向毛细管阴极端127搬送，将毛细管阴极端127浸渍到清洗容器内的纯水中进行清洗(504)。接下来，搬送机125将阴极缓冲剂容器121向毛细管阴极端127搬送(505)。

接下来进行预备泳动(506)。该步骤既可以自动地执行，也可以逐次按照从数据分析装置128发出的控制信号来执行。施加预定的电压开始预备泳动(506)。所谓预备泳动，是在从样本导入起到进行电泳的正式分析工序之前的期间，使毛细管内的聚合物的状态成为适于分析的状态的步骤。在预备泳动中通常施加几分钟至几十分钟且几千伏至几十千伏左右的电压。

当预备泳动结束后，则再次利用清洗容器对毛细管阴极端127进行清洗(507)，然后将样本容器124向毛细管阴极端搬送(508)。并且，在样本容器124所容纳的样本液中向毛细管阴极端127施加几千伏程度的电压时，则会在从上述样本液到阳极侧电极之间产生电场。利用该电场将样本液中的样本导入毛细管内(509)。当样本导入结束后，则利用清洗容器对毛细管阴极端127进行清洗(510)，然后再次将阴极缓冲剂容器121向毛细管阴极端127搬送(511)。其后，施加预定的电压开始电泳(512)。

接下来进行电泳(512)。该步骤既可以自动地进行，也可以逐次按照从数据分析装置128发出的控制信号来执行。电泳(512)是利用在阴极和阳极的缓冲剂之间产生的电场的作用向毛细管中的样本赋予移动性，并利用与样本性质有关的移动性差异使样本分离的步骤。在本实施例的电泳(512)中，首先利用搬送机125将毛细管阴极端127浸入到阴极缓冲剂容器121内的缓冲液中而形成通电路。接下来利用高压电源104向通电路施加15kV左右的高电压而在泳动路中产生电场。利用所产生的电场使泳动路内的各样本成分以与各样本成分的性质有关的速度向检测部116移动。即样本成分利用其移动速度的差异被分离。并且，从到达检测部116的样本成分开始顺次进行检测。

例如在样本含有多个碱基长度不同的DNA的情况下，会因该碱基长度而产生移动速度的差异，从碱基长度较短的DNA起顺次到达检测部116。在各DNA上附有与其末端碱基序列有关的荧光色素。如果从光源114向检测部116照射激励光，则会从样本产生信息光(具有与样本有关的波长的荧光)并向外部放出。利用光学检测器115对该信息光进行检测。在泳动分析中，利用光学检测器115以一定的时间间隔对该信息光进行检测并将图像数据向数据分析装置128发送。或者为了减少发送的信息量，也可以不发送图像数据而仅发送图像数据中的部分区域的亮度。例如也可以对每个毛细管仅发送一定间隔的波长位置的亮度值。最后，从开始施加电压经过预定的时间，取得预定的数据之后即停止施加电压而结束电泳(513)。以上是一系列的测定顺序。

参照图6A～图6C对分割强弱2像的原理和像分割棱镜构造进行说明。在图6A～图6B中省略了衍射光栅405的分光的效果而仅示出成像系统。在图6A中示出了现有技术的荧光分光器的成像系统。由于排列有毛细管102，经第二聚光透镜404A准直的荧光的光线追迹601，通过成像透镜406在二维检测器407上形成一个像602。在一对一的成像系统的情况下形成与物体像相同的像。

图6B示出了本实施例的光线追迹。在本实施例的情况下，在现有的荧光分光器的结构基础上配置像分割棱镜409。透过该像分割棱镜409后的荧光会在像分割棱镜409的像分割面与空气的界面上发生折射。由于分割面有两个，从一点发出的光线向两个方向折射，形成两个光线追迹603和604。通过成像透镜406分别形成605、606这两个像。

以下对从像分割棱镜409出射的光线的角度、和用于避免两个像重叠的棱镜设计进行叙述。各尾标示出了以下值。

f1：聚光透镜的焦点距离

f2：成像透镜的焦点距离

Y：像高(物体面)(阵列宽度的一半)

Y’：像高(成像面)

接下来，对聚光透镜等上的角度进行以下定义。

θ1：聚光透镜上的入射角

θ'1：棱镜上的入射角

θ2：棱镜上的出射角

θ：棱镜的倾斜角(顶角＝2π－2θ)

首先计算像高(成像面)Y'。Y'由下式提供。

Y'＝tanθ2×f2/f1×f2

为了避免两个分割像重叠而需要满足下式的条件。

Tanθ2×f2＝Y'＞2Y…(1)式

(注意：是f1＝f2的1:1成像系统的情况)

并且，由于Y/f1＝tanθ1，因此θ1由下式提供。

θ1＝tan^-1(Y/f1)

这里，如果棱镜材质的折射率为n、棱镜内的光路角度为θ3～θ4(参照图6C)，则θ1和θ2的关系按照斯内尔定律满足下式。

n×sinθ'2＝sinθ1

另外，由图6C成立下式。

θ'3＝θ'2+θ

＝sin^-1(sinθ1/n)+θ

并且，在像分割面上，再次按照斯内尔定律成立下式。

n×sinθ'3＝sinθ'4

由图6C求出θ'4则成立下式。

θ'4＝sin^-1(n×sinθ'3)

＝sin^-1(n×sin(sin^-1(sinθ1/n)+θ))

另外，像分割棱镜409上的出射角θ2满足成立下式。

θ2＝θ'4－θ

＝sin^-1(n×sin(sin^-1(sinθ1/n)+θ))－θ…(2)式

能够以满足该(1)式和(2)式为条件从原物体像Y求出像分割棱镜409的倾斜角θ。

图7概略表示像分割棱镜409。经聚光透镜403准直的荧光从图示的入射面入射。像分割棱镜409以入射面为基准，使从与其平行的面倾斜角度θ的两个面构成为分割面。像分割棱镜409的顶角α具有等于π－2θ的特征。像分割棱镜409的材质例如是BK7(折射率1.517)。

图8示出了像分割棱镜409的具体例。例如在由8根毛细管102构成毛细管阵列的情况下，毛细管102的间距是与毛细管外径相等的363μm，阵列的宽度是2.96mm(＝363μm×8)，从中心起的像高(物体面)是阵列宽度的一半即1.5mm。如果使聚光透镜403、成像透镜406的焦点距离为50mm，则入射角θ1＝1.72°、出射角θ2＝6.47°。物体侧的像高是6.7mm，与毛细管阵列宽度2.96mm相比足够大，因此能够在检测器上取得所分割的各像。

虽然没有图示，但是在各毛细管间隔足够大的情况(例如是毛细管外径以上的情况)下，也能够使第一像与第二像以毛细管间隔的距离错开，在第一像的毛细管间形成第二像的毛细管像来进行摄像。

图9A示出了像分割棱镜409的倾斜角θ为15°时的光线追迹图和二维检测器上的成像状态。例如在使用三根毛细管102的情况下，在光线追迹(全部毛细管)901上以微妙的角度差异各自表现三束的光线。在像分割棱镜409之后分割为第一像的光线追迹(第一毛细管)902～(第二毛细管)904。同样地，第二像的光线追迹也存在相应的3束。第一像的光线追迹(第一毛细管)902～(第二毛细管)904、第二像的光线追迹到达二维检测器上，分别显示毛细管像。由于倾斜角较大，因此能够在二维检测器上取得分离的第一像和第二像。

另一方面，图9B示出了像分割棱镜409的倾斜角θ为5°时的光线追迹图和二维检测器上的成像状态。倾斜角θ相对于三根毛细管102是确切的值，能够在二维检测器上得到大致相邻的第一像和第二像。因此，在本例的情况下，如果将像分割棱镜409的倾斜角θ设定为5°，则具有能够无浪费地使用检测器区域的效果。

以下参照图10对在图4中取得强弱两种类型的信号强度的像的效果进行说明。在图10的(a)图中示出了在二维检测器上成像的第一像(强)和第二像(弱)的例子。纵轴表示毛细管的空间方向即毛细管编号，横轴表示波长分散方向。这里着眼于二维检测器上的A点(例如第二毛细管、波长600nm)。

图10的(b)图示出了第一像和第二像的各A点的时序数据。横轴表示时间，纵轴表示信号强度。如果有DNA片段流过，即能够检出表示被激光激励而发出的荧光的强度的信号并按照时序作为峰值进行观测。通常峰值发生的时间会因应DNA的片段长度而有所不同，因此能够观测多个峰值。在样本浓度调整为确切值的情况下，通常能够观测全部的DNA片段。

另一方面，在对未知的样本进行处理的情况下，需要对浓度浓的DNA片段进行分析。此时，有时会导致信号强度超过饱和限界值(在图中是“12”)而无法检出准确的值。第一像的“信号值的饱和状态”所示部位是这种情况。为此，如果着眼于第二像，则相较地减小了信号强度而取得数据，因此未超过饱和限界值而能够取得相同的DNA片段的数据。不必再次进行分析，也不会导致样本的浪费或分析成本增加，而能够高效地进行分析。通过区分使用第一像、第二像，能够一次性对浓度不同的样本进行分析。

第一像、第二像的信号强度比对应于像分割棱镜的各分割面的透射率。通过使透射率为1：10等，能够对浓度相差10倍的样本进行处理。能够按照装置系统决定将第一像、第二像的哪一个用作通常模式，在本实施例中也能够取得任一方的数据。通过在操作画面上设置以时序显示第一像、第二像等(未图示)供使用者进行预先检查的功能，也能够在进行分析时由使用者选择。

在本实施例中，利用一台检测器进行表观上两种类型的分析。在现有技术中，例如在改变照射检测时间、照射强度进行多次分析时，与在一次分析中执行长短两种类型的照射检测时间的情况是同义的。这样，本实施例的荧光分析器具有就好像是具备构成该装置的各零件或性能相同的两个检测器的功能。即、能保持能够进行分析的SN比/灵敏度，在表观上扩大了装置的动态范围。

这样，通过在表观上扩大动态范围，就本实施例的荧光分析器而言，能够最大程度地减少在分析过程中因测定信号值相对于检测范围发生饱和所引起的再测定。特别是在同时测定多个样本时，即使各样本的浓度差异较大，也能够同时进行测定。并且，在对浓度未知的样本进行测定时也是有效的。

并且，本实施例的荧光检测器能够利用一个检测器同时取得强弱多个检测像，因此能够提供小型低价而具有非常宽广的检测范围的装置。例如在毛细管型基因检查装置中能够使动态范围比以往扩大10倍以上。并且，通过同时取得强弱多个检测像，能够维持测定点数并进行高精度的分析。

[实施例2]

接着，对适用于毛细管电泳装置的荧光分析器的第二实施例进行说明。在实施例1的荧光分析器中是将薄型棱镜409用作像分割元件。该实施例1的棱镜的像分割面的面积相等(参照图4)，并通过使透射率变化来控制分割像的荧光强度。但是，在像分割面上蒸镀具有不同特性的介电多层膜的做法存在如下缺点：

1)由于在制造上经过多个蒸镀工序而成本较高。

2)降低透射率而导致原有聚光光量的浪费。

因此，在实施例2中使用以像分割面的面积比来控制荧光强度的棱镜。图11示出了在本实施例中使用的荧光检测器303的详细结构。主要结构与实施例1相同，但是对进行像分割的光学元件使用了具有面积比不同的像分割面的像分割棱镜1109。

在本实施例中，使经衍射光栅405分光的荧光通过具有面积不同的多个像分割面的像分割棱镜1109，并按照通过面积的差异分割为信号强度不同的多个像。在实施例1中，如使用图6B说明的那样，由于光轴会在像分割面与空气的边界面上发生折射，因此荧光的光线方向会发生变化。与像分割面的面积成比例的光线量成为成像时的荧光强度。即、与像分割面的面积比对应地决定由二维检测器407检出的信号强度。

在图11的情况下，像分割棱镜1109的两个像分割面的面积比是9：1，因此能够与实施例1同样地取得具有9：1的信号强度的两个像。在本实施例的荧光分析器的情况下，无需在像分割面上蒸镀不同的介电多层膜，仅在整个面上施加透射率较高的AR涂层即可。并且，不会损失原有光量便能够将两个像的信号强度分割为9：1，并保持较高的SN比和灵敏度。

[实施例3]

接着，对适用于毛细管电泳装置的荧光分析器的第3实施例进行说明。在实施例1的荧光分析器中是将薄型的棱镜用作像分割元件。但是，棱镜是一种波长分散元件，与衍射光栅同样地具有使聚光的荧光成分按照波长分散的功能。因此，棱镜的波长分散多少会对像分割方向产生一定的影响。根据应用或检测像的种类，有时微小的波长分散也会对分析产生影响。

为此，在本实施例中是由分光器(半反射镜)和全反射镜构成像分割元件。由于是不使用棱镜的像分割，因此避免了如实施例1、实施例2那样受到像分割棱镜的波长分散的影响。

以下参照图12对实施例3的荧光分析器的具体结构进行说明。实施例3的基因分析装置的结构与图1所示的结构相同。如前所述，在本实施例中，作为像分割元件使用将入射光分割为透射光和反射光的像分割光学元件(例如半反射镜、分光器)和全反射镜的组合构造。以下将分光器1209用作像分割光学元件。

在本实施例的情况下，将分光器1209和全反射镜1210配置在聚光透镜403与第二光学滤波器404之间。如图12所示，分光器1209相对于检测光轴基本轴310成大致45°进行配置，全反射镜1210相对于检测光轴基本轴310成45°以下(例如43～44°)进行配置。

分光器1209是平板状的光学元件，利用透射和反射将光路分割为两个。即、控制透射率(或反射率)而以预定的分割比将入射光分割为两路光。在分割时，不是如分色镜那样透射/反射的特性取决于波长而有所不同的情况，而是在某个波长区域上唯一地决定透射率和反射率。作为偏光的种类有非偏光型、无偏光型、偏光型，在本实施例中也包含入射光的偏光状态而使用非偏光型。

发光点401的荧光经聚光透镜403准直以45°入射角向分光器1209入射。例如设分光器1209的透射率：反射率为90％：10％，则聚光的光量的9成透射而1成反射。9成的光如荧光光路(强)411所示，与检测光轴基本轴310平行，经衍射光栅405分光，在二维检测器407上成像。另一方面，反射的1成的光如荧光光路(弱)412所示，经全反射镜1210与检测光轴基本轴310大致平行地返回。此时，全反射镜1210配置为相对于检测光轴基本轴310成45°以下(例如43～44°)，荧光光路(弱)412以1～2°的角度入射而并非与检测光轴基本轴310完全平行。

在经衍射光栅405分光之后，也与检测光轴基本轴310保持角度地通过成像透镜406在二维检测器407上成像。此时，由于是在与荧光光路(强)411的像不同的位置上成像，因此会在二维检测器407上形成两个像。聚光的光量的9成进行成像的荧光光路(强)411的像的信号强度高，荧光光路(弱)412的信号强度低。各信号强度比因分光器1209的透射率：反射率为90％：10％而成为9：1。与实施例1同样地能够取得强弱两种类型的数据。

这里，分光器1209也能够采用立方体型分光器。由于完全没有透射光的折射，并且入射角条件是垂直入射，因此不必像平板型那样以45°入射，具有对准作业容易的优点。

如以上所述，就本实施例的荧光分析器而言，是利用分光器1209将经聚光透镜403聚光的荧光分割为2路，一路荧光直接聚光于二维检测器407，而另一路荧光则是经全反射镜1210反射之后在二维检测器407上聚光。由于是利用分光器1209将聚光像分为两个，因而不会发生波长分散。

另外，由分光器1209和全反射镜1210构成的光学系统的配置位置不限于图12所示的配置位置。例如图13所示，也可以将由分光器1209和全反射镜1210构成的光学系统配置在衍射光栅405与成像透镜406之间的分光后检测光轴410上。该情况下，分光器1209配置为相对于分光后检测光轴410成大致45°。全反射镜1210配置为相对于分光后检测光轴410成45°以下(例如43°～44°)。

[实施例4]

接着，对适用于毛细管电泳装置的荧光分析器的第4实施例进行说明。对于实施例1～3的荧光分析器而言，作为波长分散元件(分光元件)采用了衍射光栅405。在本实施例中，对不用衍射光栅405的实施例进行说明。具体而言，采用高速地切换仅透射对各荧光色素灵敏度最高的波长区域的滤波器的方法，或者采用具备按照荧光色素的数量使摄像元件与该各荧光色素对应的滤波器而同时拍摄各荧光色素的方法。本实施例的方法相当于在与各荧光色素对应的样本位置上对光谱进行采样。

图14示出了本实施例中使用的荧光检测器303的详细结构。如图14所示，本实施例的荧光检测器303具有进行高速旋转的滤波器转轮1301。滤波器转轮1301具备多个仅透射与各荧光色素对应的灵敏度最高的波长区域的荧光滤波器1302。荧光滤波器1302与检测光轴基本轴310垂直地配置。在本实施例中与实施例3同样地，利用分光器1209和全反射镜1210实施像分割。分割的荧光向荧光滤波器1302入射，按照位于光路上的荧光滤波器1302的透射特性分光，在二维检测器407上成像。

在本实施例的情况下，由于是利用荧光滤波器1302的切换来进行分光，因此检测器能够采用一维的线检测器而不必采用二维检测器。并且，由于检测区域狭窄且不使用衍射光栅，因此避免了像失真等的影响。

并且，在本实施例的情况下，由分光器1209和全反射镜1210构成的光学系统的配置位置也不限于图14所示的配置位置。例如也可以如图15所示，将由分光器1209和全反射镜1210构成的光学系统配置在滤波器转轮1301与成像透镜406之间的分光后检测光轴410上。

[其它实施例]

以上对本发明的实施例进行了说明，但是本发明不限于此，本领域人员能够在请求范围记载的发明的范围内进行各种变更。对各实施例进行适当组合的实施方式也包含于本发明的范围。

符号说明

100—基因分析装置；101—电泳装置；102—毛细管；103—泵机构；104—高压电源；105—第一电流计；106—注射器；107—模块；109—聚合物容器；110—阳极缓冲剂容器；111—电极(GND)；112—第二电流计；113—电动阀门；114—光源；115—光学检测器；116—检测部；117—毛细管阵列；118—恒温槽；119—风扇；120—加热冷却机构；121—阴极缓冲剂容器；122—清洗容器；123—废液容器；124—样本容器；125—搬送机；126—空心电极；127—毛细管阴极端；128—数据分析装置；129—装载头；130—移动载台；131—夹具；201—固体激光器；202—激光；203—反射镜；204—偏光镜；205—分光器；206—激光聚光透镜；207—波阻片(λ/4)；209—基准台座；210—照射光轴基本轴；301—平板掩模；302—激光照射部；303—荧光检测器；310—检测光轴基本轴；401—发光点；402—第一光学滤波器；403—聚光透镜；404—第二光学滤波器；404A—第二聚光透镜；405—衍射光栅；406—成像透镜；407—二维检测器；409—薄型棱镜(像分割棱镜)；410—分光后检测光轴；411—荧光光路(强)；412—荧光光路(弱)；601—现有技术的光线追迹；602—现有技术的成像；603—第一光线追迹；604—第二光线追迹；605—第一成像；606—第二成像；901—光线追迹(全部毛细管)；902—光线追迹(第一毛细管)；903—光线追迹(第二毛细管)；904—光线追迹(第三毛细管)；905—成像(第一毛细管)；906—成像(第二毛细管)；907—成像(第三毛细管)；1109—像分割棱镜(面积比)；1209—分光器；1210—全反射镜；1301—滤波器转轮；1302—荧光滤波器；1303—滤波器旋转轴。

Claims (16)

1.一种荧光分析器，具有：

光源，其向试样照射激励光；

透镜，其使从上述试样产生的荧光聚光；

分光元件，其射入聚光后的荧光而进行分光；

像分割元件，其将聚光后的荧光分割为强度不同的多个像；

成像元件，其针对特定的分光使上述多个像在同一检测面内的不同区域成像；以及

检测器，其在上述同一检测面内的不同区域同时检测与不同的荧光强度对应的多个像。

2.根据权利要求1所述的荧光分析器，其特征在于，

上述像分割元件是棱镜，该棱镜具有：入射面，其输入通过了上述分光元件的荧光；第一射出面，其使第一荧光成分透射；以及第二射出面，其使第二荧光成分透射。

3.根据权利要求2所述的荧光分析器，其特征在于，

上述第一射出面及第二射出面分别形成有透射率不同的蒸镀膜。

4.根据权利要求2所述的荧光分析器，其特征在于，

上述第一射出面及第二射出面的至少一方相对于上述入射面在几度至十几度的范围内倾斜。

5.根据权利要求2所述的荧光分析器，其特征在于，

上述检测器是二维检测器。

6.根据权利要求2所述的荧光分析器，其特征在于，

上述第一射出面及第二射出面的透射率不同。

7.根据权利要求2所述的荧光分析器，其特征在于，

作为上述第一射出面及第二射出面的边界线而赋予的棱线与泳动方向平行地配置。

8.根据权利要求2所述的荧光分析器，其特征在于，

作为上述第一射出面及第二射出面的边界线而赋予的棱线与激光射出方向垂直地配置。

9.根据权利要求2所述的荧光分析器，其特征在于，

作为上述第一射出面及第二射出面的边界线而赋予的棱线与分光方向垂直地配置。

10.根据权利要求2所述的荧光分析器，其特征在于，

上述第一射出面及第二射出面具有彼此不同的倾斜角，上述倾斜角的差异为几度至十几度。

11.根据权利要求2所述的荧光分析器，其特征在于，

上述第一射出面及第二射出面具有不同的面积。

12.根据权利要求1所述的荧光分析器，其特征在于，

上述像分割元件具有：分光器，其使从上述透镜输入的荧光以第一透射率透射而向上述分光元件输出；以及反射镜，其使从上述分光元件输入的上述荧光中被上述分光器反射的荧光成分反射而向上述分光元件输出。

13.根据权利要求1所述的荧光分析器，其特征在于，

上述像分割元件具有：分光器，其使从上述分光元件输入的分光以第一透射率透射而向上述检测器输出；以及反射镜，其使从上述分光元件输入的上述分光中被上述分光器反射的分光反射而向上述检测器输出。

14.根据权利要求12或13所述的荧光分析器，其特征在于，

上述分光器的透射率和反射率的值不同。

15.根据权利要求13或14所述的荧光分析器，其特征在于，

上述检测器是二维检测器。

16.根据权利要求13或14所述的荧光分析器，其特征在于，

上述分光元件是能够切换多个透射特性的滤波器机构，

上述检测器是线检测器。