CN106039293A - 一种修复皮肤溃疡的组合物及其制备方法 - Google Patents
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本发明属于医药领域，具体涉及一种修复皮肤溃疡的组合物及其制备方法。本发明所述组合物以胶原蛋白凝胶为基质，混合脐带间充质干细胞培养液中的各类因子以及裂解后的干细胞成分，同时添加蜂胶成分，达到更为快速而高效的溃疡处愈合。实验表明本发明组合物对皮肤溃疡的修复效果明显优于现有技术方案。
Description
技术领域
本发明属于医药领域，具体涉及一种修复皮肤溃疡的组合物及其制备方法。
背景技术
皮肤溃疡是中医外科常见病、多发病，是以皮肤溃疡为主要临床表现长期不能愈合为临床特征，皮肤组织缺损液化感染坏死的一种体表疾病，皮肤溃疡一般是由外伤微生物感染、肿瘤循环障碍和神经功能障碍、免疫功能异常或先天皮肤缺损等引起的局限性皮肤组织缺损。由于疮面难以愈合且消耗甚大，给患者造成了很大的心理压力和经济损失，严重影响患者的身体健康及生活质量。
及时有效的创面修复是治疗溃疡性疾病的核心。近年来，随着对干细胞研究的深入，在皮肤溃疡类创面修复中，干细胞的作用也日益被挖掘。间充质干细胞(MSC)是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层和外胚层，属于多能干细胞，MSC最初在骨髓中发现，因其具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点而日益受到人们的关注。间充质干细胞广泛存在于人体各部位的一类多功能干细胞，特别是脂肪间充质干细胞、脐带间充质干细胞，来源广，取材方便、免疫原性低等。间充质干细胞连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复。间充质干细胞能够分泌多种细胞因子，如血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞因子(FGF)、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、肾上腺髓质素等，在促进细胞增殖、分化中发挥作用，同时在损伤修复中也发挥重要作用。而结合富血小板血浆(PRP)的修复功能，在各类溃疡损伤修复的应用具有非常大的前景。
目前主要采用培养间充质干细胞，培养至P3-P5代；制备富血小板裂解液；混匀间充质干细胞、富血小板裂解液和法舒地尔溶液得到最终制剂用于皮肤溃疡的修复。然而静脉注射上述制剂后其中的大部分干细胞和PRP裂解成分会在全身各部位停留，只有部分会回到损伤部位，发挥修复功能很弱。而且添加的PRP成份需采集自身外周血来进行制备，同时制剂的静脉回输都需符合医疗资质要求，并且具有一定的创伤性。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于针对现有技术的问题，提供一种组合物用于修复皮肤溃疡。本发明所述组合物改进现有的具有治疗慢性皮肤溃疡的干细胞制剂，以胶原蛋白凝胶为基质，混合脐带间充质干细胞培养液中的各类因子以及裂解后的干细胞成分，同时添加蜂胶成分，达到更为快速而高效的溃疡处愈合。
为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：
一种组合物，包括脐带间充质干细胞裂解液、脐带间充质干细胞上清液冻干粉、胶原蛋白、蜂胶。
其中胶原蛋白是动物结缔组织中的主要成分，也是哺乳动物体内含量最多、分布最广的功能性蛋白，占蛋白质总量的25％～30％。与组织的形成、成熟、细胞间信息的传递，以及关节润滑、伤口愈合、钙化作用、血液凝固和衰老等有着密切的关系。胶原蛋白为生物高分子，也是生物科技产业最具关键性的原材料之一，在医学材料、化妆品、食品工业等均有着广泛应用。
蜂胶是蜜蜂从植物芽孢或树干上采集的树脂，将其混入其上腭腺、蜡腺的分泌物加工而成的一种具有芳香气味的胶状固体物，有润肤生肌，消炎止痛的功效，可治疗胃溃疡、口腔溃疡、烧烫伤、皮肤裂痛等，蜂胶具有的抗菌、美容养颜、促进细胞再生的作用。蜂胶不但能消灭真菌感染，还能够分解色素、平复皱纹、减缓衰老，加快组织细胞的再生和伤口的愈合，对痘痘遗留下的痘疤痘印也有很好疗效。
干细胞培养过程中，分泌众多生长因子，对损伤部位的细胞具有激活和促增值作用，而这些因子主要游离在培养液中，通过收集上清液的各类因子以及裂解干细胞后获得内部成分，可获得具有修复功能的生长因子。本发明所述组合物以胶原蛋白凝胶为基质，混合脐带间充质干细胞培养液中的各类因子以及裂解后的干细胞成分，同时添加蜂胶成分，达到更为快速而高效的溃疡处愈合。
优选的，每10ml组合物中含有：
在一些实施方案中，每10ml组合物中含有：
在一些实施方案中，每10ml组合物中含有：
在一些实施方案中，每10ml组合物中含有：
其中，所述脐带间充质干细胞裂解液的制备方法为脐带间充质干细胞加0.25％胰酶消化1-2min，收集后离心5-10min，弃上清，加生理盐水清洗；加HClO4裂解、离心，取上清液；上清液加KOH中和，离心，取上清液；加活性炭吸附干细胞内部成分，再分别加中性双蒸水和碱性溶液洗涤、抽滤、抽提，加生理盐水得到干细胞裂解液。
本发明所述组合物中，所述脐带间充质干细胞上清液冻干粉的制备方法为脐带间充质干细胞上清液依次经0.45μm、0.22μm滤膜过滤，浓缩，冻干。
本发明所述组合物中的胶原蛋白可以通过商业渠道购买的得到，也可以自行制备。
在一些实施例中，所述胶原蛋白的制备方法为动物胶原溶解于0.1％冰醋酸，0.22μm滤膜过滤，39-41℃恒温1min。
在一些实施方案中，所述组合物还包括羊毛脂，以滋润，软化皮肤，使皮肤光滑柔嫩。
优选的，每10ml中含有羊毛脂1-3g。
在一些实施例中，每10ml中含有羊毛脂3g。
在一些实施例中，每10ml中含有羊毛脂2g。
本发明还提供了所述组合物的制备方法，将脐带间充质干细胞裂解液、脐带间充质干细胞上清液冻干粉、胶原蛋白和蜂胶混合，4℃恒温条件下调节至pH为6.5-7.0。
进一步的，在一些实施方案中，所述制备方法在调节pH后还包括加入羊毛脂的步骤。
本发明采用相同月龄SD免疫缺陷小鼠建立皮肤损伤模型(面积10cm2)10、考察本发明所述组合物对皮肤溃疡的影响，结果显示本发明所述组合物对皮肤溃疡的修复效果明显优于现有技术方案。因此本发明提供了所述组合物在制备修复皮肤溃疡的药物中的应用。
本发明所述组合物可以与常用辅料混合制成药学上常用的外用制剂，如软膏、乳剂等。
由上述技术方案可知，本发明提供了一种用于修复皮肤溃疡的组合物及其制备方法。本发明所述组合物以胶原蛋白凝胶为基质，混合脐带间充质干细胞培养液中的各类因子以及裂解后的干细胞成分，同时添加蜂胶成分，达到更为快速而高效的溃疡处愈合。实验表明本发明组合物对皮肤溃疡的修复效果明显优于现有技术方案。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1实施例7处理后5d各处理组伤口修复面积统计图；
图2实施例7处理后10d各处理组伤口修复面积统计图；
图3实施例7处理后15d各处理组伤口修复面积统计图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
为了进一步理解本发明，下面结合具体实施例对本发明进行详细阐述。其中胶原、蜂胶、羊毛脂均可以通过商业渠道购买得到。
实施例1脐带间充质干细胞分离培养：
1.取健康孕妇脐带一根，PBS+200U/ml的双抗溶液(青霉素和链霉素)冲洗3遍；
2.脐带剪成2cm长小段，剥去动、静脉管和外膜，中间华氏胶剪碎成1-2mm2小块，均匀贴附于10cm培养皿，37℃5％CO2培养箱内倒放1-2h；
3.加入完全培养基(X-VIVO15无血清培养基+10ng/ml的EGF)5ml，2-3天后半量换液，培养6-8天，待细胞从组织块中爬出，弃去组织块继续培养。
4.待生长至80％融合，倒去培养液，PBS清洗一遍，加0.25％胰酶消化1-2min，加FBS终止消化，收集细胞400g离心5min
5.加完全培养基重悬，根据计数结果接种2-3皿。
6.待细胞生长至80％融合后继续传代，收集P2和P3代脐带间充质干细胞上清液。
实施例2脐带间充质干细胞裂解
1.取P2-P3代脐带间充质干细胞，加0.25％胰酶消化1-2min，收集后离心5-10min，弃上清，加生理盐水清洗两遍；
2.加HClO4裂解、离心，取上清液；
3.上清液加KOH中和，离心，取上清液；
4.加活性炭吸附干细胞内部成分，再分别加中性双蒸水和碱性溶液洗涤、抽滤、抽提，加生理盐水得到干细胞裂解液。
实施例3脐带间充质干细胞上清液冻干粉制备
1.收集P2和P3代脐带间充质干细胞上清液，经0.45μm滤膜过滤除去大颗粒物质；
2.滤液再经0.22μm滤膜过滤，除去3KDa以下小颗粒物质，两种滤膜循环过滤3h，采用Slice200切向流器浓缩，收集浓缩液；
3.浓缩液用冻干机制成冻干粉，备用。
实施例4修复皮肤溃疡的组合物
配方：每10ml中含脐带间充质干细胞裂解液2ml(5×106个细胞的裂解成分)、脐带间充质干细胞上清液冻干粉2mg、胶原蛋白20mg、蜂胶30mg、羊毛脂1g；
制备方法：
1.动物胶原溶解于0.1％冰醋酸，制成溶液，0.22μm滤网过滤除菌，39-41℃恒温1min；
2.加入干细胞裂解液、实施例3制得的脐带间充质干细胞上清液冻干粉和蜂胶，4℃恒温条件下缓慢加入1mol/L的NaOH溶液调节至pH为6.5-7.0成胶；
3.添加羊毛脂，调节粘稠度制得软膏。
实施例5修复皮肤溃疡的组合物
配方：每10ml中含脐带间充质干细胞裂解液4ml(1×107个细胞的裂解成分)、脐带间充质干细胞上清液冻干粉2mg、胶原蛋白100mg、蜂胶20mg、羊毛脂3g；
制备方法：
1.动物胶原溶解于0.1％冰醋酸，制成溶液，0.22μm滤网过滤除菌，39-41℃恒温1min；
2.加入干细胞裂解液、实施例3制得的脐带间充质干细胞上清液冻干粉和蜂胶，4℃恒温条件下缓慢加入1mol/L的NaOH溶液调节至pH为6.5-7.0成胶；
3.添加羊毛脂，调节粘稠度制得软膏。
实施例6修复皮肤溃疡的组合物
配方：每10ml中含脐带间充质干细胞裂解液4ml(1×107个细胞的裂解成分)、脐带间充质干细胞上清液冻干粉10mg、胶原蛋白50mg、蜂胶30mg、羊毛脂2g。
制备方法：
1.动物胶原溶解于0.1％冰醋酸，制成溶液，0.22μm滤网过滤除菌，39-41℃恒温1min；
2.加入干细胞裂解液、实施例3制得的脐带间充质干细胞上清液冻干粉和蜂胶，4℃恒温条件下缓慢加入1mol/L的NaOH溶液调节至pH为6.5-7.0成胶；
3.添加羊毛脂，调节粘稠度制得软膏。
实施例7效果实验
取相同月龄SD免疫缺陷小鼠20只，雌雄各10只，分别进行化学方法灼伤建立皮肤损伤模型(面积10cm2)。随机分为5组，分别进行静脉注射和局部涂抹，具体分组及操作如下：
对照组：静脉注射或局部外喷生理盐水；
实验组1：静脉注射脐带间充质干细胞+PRP裂解液；
实验组2：局部涂抹实施例4的制剂；
实验组3：局部涂抹实施例5的制剂；
实验组4：局部涂抹实施例6的制剂；
分别在处理后5d、10d、15d观察伤口修复面积(平均数±标准差)，结果见表1和图1-3。
表1 5d、10d、15d伤口修复面积
| 分组 | 5d | 10d | 15d |
| 对照组(cm2) | 1.2±0.08 | 2.7±0.14 | 3.8±0.20 |
| 实验组1(cm2) | 2.6±0.15 | 3.8±0.18 | 6.9±0.21 |
| 实验组2(cm2) | 5.5±0.12 | 7.9±0.11 | 10 |
| 实验组3(cm2) | 5.8±0.16 | 8.2±0.15 | 10 |
| 实验组4(cm2) | 5.6±0.20 | 8.4±0.12 | 10 |
结果显示实验组2-4的对皮肤溃疡的修复效果明显优于实验组1，且在第15天基本达到痊愈。表明本发明所述组合物在皮肤溃疡性损伤修复能力明显优于现有方案。
Claims (10)
1.一种组合物，包括脐带间充质干细胞裂解液、脐带间充质干细胞上清液冻干粉、胶原蛋白、蜂胶。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，每10ml中含有：
3.根据权利要求1或2所述的组合物，其特征在于，所述脐带间充质干细胞裂解液的制备方法为脐带间充质干细胞加0.25％胰酶消化1-2min，收集后离心5-10min，弃上清，加生理盐水清洗；加HClO4裂解、离心，取上清液；上清液加KOH中和，离心，取上清液；加活性炭吸附干细胞内部成分，再分别加中性双蒸水和碱性溶液洗涤、抽滤、抽提，加生理盐水得到干细胞裂解液。
4.根据权利要求1或2所述的组合物，其特征在于，所述脐带间充质干细胞上清液冻干粉的制备方法为脐带间充质干细胞上清液依次经0.45μm、0.22μm滤膜过滤，浓缩，冻干。
5.根据权利要求1或2所述的组合物，其特征在于，所述胶原蛋白的制备方法为动物胶原溶解于0.1％冰醋酸，0.22μm滤膜过滤，39-41℃恒温1min。
6.根据权利要求1或2所述的组合物，其特征在于，还包括羊毛脂。
7.根据权利要求6所述的组合物，其特征在于，每10ml中含有羊毛脂1-3g。
8.权利要求1所述组合物的制备方法，其特征在于，将脐带间充质干细胞裂解液、脐带间充质干细胞上清液冻干粉、胶原蛋白和蜂胶混合，4℃恒温条件下调节至pH为6.5-7.0。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，在调节pH后还包括加入羊毛脂的步骤。
10.权利要求1-4任意一项所述组合物在制备修复皮肤溃疡的药物中的应用。
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