CN106011065B - 人眼球结膜胬肉干细胞细胞株 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了人眼球结膜胬肉干细胞细胞株，属于细胞的体外培养领域。此细胞株采用人眼的胬肉组织，分离培养获得的体外细胞株。本发明建立了一套分离、培养和鉴定人眼胬肉干细胞株的方法，通过H16的自发成球的干性鉴定、干细胞诱导成球实验、细胞免疫荧光染色分析、干细胞多向诱导分化实验和H16诱导前后干性标志物表达量分析等方法鉴定人眼胬肉体外干细胞株的建立成功。人眼胬肉体外干细胞株的建立对相关疾病的发生、发展机制及干细胞的生物学研究具有重要价值，在减少疾病的发生、减缓疾病的进展、提高治疗的安全性和有效性等方面具有广泛的应用潜能。
Description
技术领域
本发明属于细胞的体外培养领域，更具体的，本发明涉及一种人眼球结膜胬肉来源的干细胞株的建立。
背景技术
胬肉（pterygium）又称翼状胬肉，是一种起始于边缘不断地向心生长，最终侵入角膜造成视力减退的眼部组织的异常增生。在胬肉的发生和发展的过程中伴随着一系列的结膜表面的变化，如增生、炎症发生、新血管生成以及基底膜的破坏等。胬肉发生的病因和发病机制尚不明了,研究报道胬肉的发生可能与中波紫外线照射、P53的异常表达和人类乳头状病毒的感染有关。
干细胞（stem cell）是一种来源于胚胎组织或是成体组织器官的尚未成熟且未充分分化的，具有一定的自我更新能力（self–renew）和多向分化（multipledifferentiation）潜能的细胞群体。根据干细胞所处的发育阶段可以将其分为胚胎干细胞和成体干细胞，根据干细胞的分化潜能可以将其分为全能干细胞、多能干细胞和专能干细胞。干细胞存在于胚胎、骨、脂肪、血液、脐带等多种组织器官。在体外可以诱导分化成为各种发育成熟的组织细胞，如成骨细胞、脂肪细胞、横纹肌及平滑肌细胞以及神经和神经胶质细胞等。干细胞存在范围广，易于获得，增殖和分化能力强。目前，干细胞成为细胞工程和基因治疗中理想的工具。
发明内容
基于此本专利提供了一种人眼球结膜胬肉干细胞株H16，现保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。保藏单位地址：北京市朝阳区北辰北路1号院3号。保藏编号：CGMCC No.11799。保藏时间：2015年12月29号。
上述人眼球结膜胬肉干细胞株H16的构建方法，按照下述步骤进行：
（1）手术获取人眼球结膜胬肉组织；
（2）H16细胞培养：在无菌条件下取出胬肉组织，4℃预冷的PBS(phosphate buffersaline,磷酸盐缓冲液)冲洗3遍，去除胬肉组织中的血细胞。PBS中添加抗生素（青霉素、链霉素各100U/ml）后浸泡30min。利用眼科剪将胬肉组织剪成2*2*2mm3大小的组织块。PBS冲洗3次后将上清连同组织一起转移至离心管中，颠倒震荡2min离心后弃上清，重复2到3 次去除组织中的脂肪颗粒，提高组织的培养效率。DMEM/F-12（Dulbecco's Modified EagleMedia: Nutrient Mixture F-12）完全培养基（DMEM/F-12完全培养液为DMEM/F-12培养液中含10%FBS（v/v），青、链霉素100U/mL）重悬细胞，置于5%（v/v）CO2、饱和湿度、37℃二氧化碳培养箱培养；
（3）H16细胞自发形成的干细胞球的免疫荧光干性鉴定：H16细胞传至P5代后，在培养上清中出现大量的漂浮的细胞球，收集细胞球至24孔板中，待细胞球贴壁后，利用4%（w/v）4℃预冷的多聚甲醛固定细胞4℃过夜，PBS洗涤10min/3次。5%（w/v）BSA（（Bovine SerumAlbumin，牛血清白蛋白）封闭和Triton-100（曲拉通，用于细胞膜打孔，促进抗体与细胞内的抗原结合）破膜打孔后与一抗4℃孵育过夜，PBS洗涤5min/3次，二抗37℃避光孵育1h，PBS洗涤5min/3次，DAPI（2-(4-Amidinophenyl)-6-indolecarbamidine dihydrochloride,DAPI细胞核染料）室温染核5min，PBS洗涤10min/3次。荧光显微镜下观察干细胞标志物SOX2、NESTIN、P63、VIMENTIN和CD44的表达情况；
（4）H16细胞成球：H16细胞传代后，更换干细胞成球培养基后显微镜下观察细胞形态变化；
（5）H16细胞成球后免疫荧光染色：H16诱导形成细胞球后，轻轻的吸取细胞球，种植于24孔板中。4%（w/v）的预冷的多聚甲醛固定细胞4℃过夜，PBS洗涤10min/3次。5%（w/v）BSA封闭和Triton破膜打孔后与一抗4℃孵育过夜，PBS洗涤5min/3次，二抗37℃避光孵育1h，PBS洗涤5min/3次，DAPI室温染核5min，PBS洗涤10min/3次。荧光显微镜下观察干细胞标志物SOX2（sex determining region Y-box2，性别决定区域Y-2，胚胎干细胞和神经干细胞标志物）、NESTIN（神经巢蛋白，神经干细胞标志物）、P63（上皮干细胞标志物）、VIMENTIN（波形蛋白，间质干细胞标志物）和CD44（细胞粘附分子、干细胞巢受体，间质干细胞标志物）的表达情况；
（6）免疫荧光染色：H16细胞铺满24孔板底后， 4%（w/v）的预冷的多聚甲醛固定细胞4℃过夜，PBS洗涤10min/3次。5%（w/v）BSA封闭和Triton打孔后与一抗4℃孵育过夜，PBS洗涤5min/3次，二抗37℃避光孵育1h，PBS洗涤5min/3次，DAPI室温染核5min，PBS洗涤10min/3次。荧光显微镜下观察SOX2、NESTIN、P63、VIMENTIN和CD44的表达情况;
（7）H16的多向诱导分化：H16 细胞传代贴壁后及时地去除上层未贴壁细胞同时更换诱导神经和诱导骨组织的分化诱导培养基，免疫荧光染色或化学染色鉴定诱导效果；
（8）H16诱导前后干性标志物表达量分析：H16细胞在诱导神经和诱导骨组织的诱导培养基中培养4天后，分别提取细胞的总蛋白，利用western blot（蛋白免疫印迹）检测干细胞标志物的表达情况，以β-actin（β肌动蛋白，在细胞中表达稳定）蛋白为内参照；
在其中的一个实例中，步骤（2）中抗生素的应用浓度为青霉素100U/ml和链霉素100U/ml，
浸泡30min后PBS洗涤3次后弃上清，利用眼科剪将胬肉组织剪成2*2*2mm3大小的组织块。PBS冲洗3次后将上清连同组织一起转移至离心管中，颠倒震荡2min离心后弃上清，重复2到3 次去除组织中的脂肪，提高组织的培养效率。DMEM/F-12完全培养基重悬细胞，置于5%CO2、饱和湿度、37℃二氧化碳培养箱培养；
在其中的一个实例中，步骤（2）中通过胬肉组织的原代培养得到了人眼球结膜胬肉来源的干细胞株H16；
在其中的一个实例中，步骤（4）中的成球诱导培养基的成分是DMEM/F-12培养基、2%B27（v/v）、20ng/mlEGF（Epidermal Growth Factor 表皮生长因子）、20ng/mlbFGF（Basicfibroblast growth factor 碱性成纤维细胞生长因子）。且EGF和bFGF每24小时添加一次，培养基每三天更换一次；
在其中的一个实例中，步骤（7）中的诱导神经培养基成分是神经细胞培养基（Neurobasol）、10%胎牛血清、3.3µM全反式维甲酸（ATRA）、500nM曲古抑菌素A（TSA）、20ng/ml神经生长因子（NGF）、2%B27和2mM谷氨酰胺；
在其中的一个实例中，步骤（7）中的诱导骨组织培养基的成分是：DMEM/F-12培养基、10%胎牛血清、1µM地塞米松（Dexamethasome）、10mMβ-甘油磷酸钠和500mg/L维生素C；
在其中的一个实例中，步骤（3-8）通过H16的自发成球的干性鉴定、干细胞诱导成球实验、细胞免疫荧光染色分析、干细胞多向诱导分化实验和H16诱导前后干性标志物表达量分析等方法鉴定H16干细胞株的建立是成功的。
本发明的优点：本发明属于细胞的体外培养领域，更具体的，本发明涉及一种人眼球结膜胬肉来源的干细胞株的建立。首先，H16的发现和鉴定，对胬肉的临床治疗有显著的指导意义，可以依据其干细包的特性采取一系列的治疗措施，例如可以诱导其中的干细胞定向分化，降低细胞的增值能力来延缓胬肉的病程。同时，在胬肉手术后，减少其中残留的干细胞数量，可以降低胬肉的复发机率。最后，由于胬肉中来源的干细胞的多向分化潜能和干细胞在组织损伤修复中发挥越来越重要的作用，H16干细胞的发现和鉴定，定能为其以后的应用提供必要的理论基础。
附图说明
图1为倒置相差显微镜观察本发明培养的H16细胞（a、胬肉组织的原代培养。b、H16细胞的传代培养）；
图2为H16细胞自发形成的干细胞球中免疫荧光检测干细标志物的表达情况（a、sox2 b、 nestin c 、p63 d 、vimentin e、 CD44）；
图3为H16细胞诱导形成的干细胞球；
图4为H16细胞诱导成球后免疫荧光检测干细胞标志物的表达情况（a、 sox2 b、nestin c 、p63 d 、vimentin e、 CD44）；
图5为H16细胞中免疫荧光检测干细胞标志物的表达情况（a、 sox2 b、 nestin c、p63 d 、vimentin e、 CD44）；
图6为H16细胞多向诱导分化后的免疫荧光和化学染色结果（A、神经分化（神经丝NF-200）B、骨分化茜素红染色）；
图7为H16细胞诱导前后干细胞标志物表达量变化结果。
具体实施方式
以下实例所使用的主要材料和来源分别如下；
新鲜的人眼结膜胬肉组织（江苏大学附属医院眼科提供）；
H16培养试剂 高糖DMEM/F-12、胎牛血清（Gibco公司产品）、胰蛋白酶（Sigma公司产品）；
anti-sox2、anti-nestin、anti-P63、anti-vimentin、anti-CD44抗体购自武汉博士德公司；
二氧化碳培养箱(Forma公司) ,倒置显微镜，生物显微镜，超净工作台，台式离心机，电热恒温水浴箱，凝胶成像分析系统（SYNGENE BIO IMAGING SYSTTEMS），深低温冰箱，液氮罐，全自动消毒锅FASC Calibar)；
实例1，对本发明具体实施步骤描述如下
（1）人眼球结膜胬肉组织培养：手术室手术切取人眼胬肉组织，将人眼胬肉组织放入预冷的DMEM/F-12（含100U/ml青霉素和100U/ml链霉素）中转移至无菌细胞操作台中。在细胞操作台里，用冷的PBS冲洗组织，去除组织中的血细胞。PBS中添加抗生素后浸泡30min，利用眼科剪在PBS中将胬肉组织剪成2*2*2mm3大小的组织块。PBS冲洗3次后将上清连同组织一起转移至离心管中，颠倒震荡2min离心后弃上清，重复2到3 次去除组织中的脂肪颗粒，提高组织的培养效率。DMEM/F-12完全培养基（DMEM/F-12完全培养液为DMEM/F-12培养液中含10%FBS（v/v），青、链霉素100U/mL）重悬细胞，置于5%（v/v）CO2、饱和湿度、37℃二氧化碳培养箱培养。5天后更换新鲜完全培养基，去除未贴壁细胞，以后每周换液2次。当贴壁细胞形成融合层时，用0.25%（w/v）的胰蛋白酶消化，见细胞皱缩，加入与蛋白酶等量的完全培养基终止消化，轻轻吹打使贴壁的细胞脱落，收集蛋白酶消化后的细胞悬液至离心管，800rpm/5min。离心后添加适量的PBS重悬细胞，再次离心后，添加DMEM/F-12完全培养基重悬细胞并按照适当的比例接种传代。倒置显微镜观察记录细胞形态和增殖情况。
（2）H16细胞的自发成球：在H16细胞的培养过程中，发现在细胞培养上清中存在大量的类似于干细胞球的细胞团块。
（3）H16细胞的自发成球的干性鉴定：在培养上清中出现大量的漂浮的细胞球，收集细胞球至24孔板中，待细胞球刚刚贴壁后，利用4%（w/v）预冷的多聚甲醛固定细胞4℃过夜，PBS洗涤10min/3次。5%BSA封闭和Triton破膜打孔后与一抗4℃孵育过夜，PBS洗涤5min/3次，二抗37℃避光孵育1h，PBS洗涤5min/3次，DAPI室温染核5min，PBS洗涤10min/3次。荧光显微镜下观察干细胞标志物SOX2、NESTIN、P63、VIMENTIN和CD44的表达情况；结果显示：在H16细胞自发形成的细胞团块中，存在大量明显表达SOX2、NESTIN、P63、VIMENTIN和CD44干细胞标志物的细胞，H16自发形成的团块是细胞中的干细胞自发形成的干细胞球。
（4）H16细胞成球实验：H16细胞在贴壁更换诱导成球培养基3至5天后形成大量形态相似、大小不一的细胞球
（5）H16细胞的诱导成球的干性鉴定：：H16诱导形成细胞球后，轻轻的吸取细胞球，种植于24孔板中。待细胞球刚刚贴壁后，利用4%（w/v）的预冷的多聚甲醛固定细胞4℃过夜，PBS洗涤10min/3次。5%（v/v）BSA封闭和Triton破膜打孔后与一抗4℃孵育过夜，PBS洗涤5min/3次，二抗37℃避光孵育 1h，PBS洗涤5min/3次，DAPI室温染核5min，PBS洗涤10min/3次。荧光显微镜下观察干细胞标志物SOX2、NESTIN、P63、VIMENTIN和CD44的表达情况；结果显示：在H16细胞诱导形成的细胞团块中，明显表达SOX2、NESTIN、P63、VIMENTIN和CD44干细胞标志物。
（6）免疫荧光染色：：培养的H16细胞，4%（w/v）的预冷的多聚甲醛固定细胞4℃过夜，PBS洗涤10min/3次。5%（v/v）BSA封闭和Triton破膜打孔后与一抗4℃孵育过夜，PBS洗涤5min/3次，二抗37℃避光孵育 1h，PBS洗涤5min/3次，DAPI室温染核5min，PBS洗涤10min/3次。荧光显微镜下观察；结果显示：H16细胞 SOX2、NESTIN、P63、VIMENTIN和CD44干细胞标志物呈阳性表达。
（7）H16的多向诱导分化：H16细胞正常传代培养贴壁后更换诱导神经、诱导脂肪和诱导骨组织诱导培养基，培养诱导2周后，免疫荧光及化学染色结果显示：诱导后的H16细胞NF-200有阳性表达、诱导骨组织的H16细胞茜素红染色阳性。结果显示：H16细胞具有向神经组织和骨组织多向分化的潜能。
（8）H16诱导前后干性标志物表达量分析：严格按照试验要求及步骤提取细胞总蛋白，配置12%的聚丙烯酰胺凝胶。加样后以80v恒压电泳至目的蛋白到合适位置，350mA恒流转膜2小时，使蛋白质横向转移至PVDF（polyvinylidene fluoride聚偏二氟乙烯膜）膜上。5%（w/v）的脱脂牛奶封闭1小时后，4℃孵育一抗过夜，TBST漂洗10min/3次。HRP标记的二抗37℃孵育1小时后，TBST(Tris-buffered saline and Tween-20)漂洗10min/3次后成像分析。结果显示：干细胞的标志物在H16中的表达量高，但是在细胞被诱导后，干细胞的标志物的表达量降低。
通过细胞H16的自发成球的干性鉴定、干细胞诱导成球实验、细胞免疫荧光染色分析、干细胞多向诱导分化实验和H16诱导前后干性标志物表达量分析等方法鉴定人眼胬肉干细胞株H16细胞株的建立成功。
图1为倒置相差显微镜观察本发明培养的H16细胞（a、胬肉组织的原代培养。b、H16细胞的传代培养）；图2为H16细胞自发形成的干细胞球中免疫荧光检测干细标志物的表达情况（a、 sox2 b、 nestin c 、p63 d 、vimentin e、 CD44）；图3为H16细胞诱导形成的干细胞球；图4为H16细胞诱导成球后免疫荧光检测干细胞标志物的表达情况（a、 sox2 b、nestin c 、p63 d 、vimentin e、 CD44）；图5为H16细胞中免疫荧光检测干细胞标志物的表达情况（a、 sox2 b、 nestin c 、p63 d 、vimentin e、 CD44）； 图6为H16细胞多向诱导分化后的免疫荧光和化学染色结果（A、神经分化（神经丝NF-200）B、骨分化茜素红染色）；图7为H16细胞诱导前后干细胞标志物表达量变化结果。
上述一种人眼球结膜胬肉干细胞株H16，现保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。保藏单位地址：北京市朝阳区北辰北路1号院3号。保藏编号：CGMCCNo.11799。保藏时间：2015年12月29号。
以上所述实例仅表达了本发明的几种实施方法，其描述较为具体和详细，但不能因此理解为本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可做出若干的变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，对本发明的保护应当以权力保护书为准。
Claims (1)
1.人眼球结膜胬肉干细胞株，保藏编号：CGMCC No.11799。
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