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CN106011019A - 一种噬菌蛭弧菌制剂的生产方法 - Google Patents

一种噬菌蛭弧菌制剂的生产方法 Download PDF

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CN106011019A CN201610513338.6A CN201610513338A CN106011019A CN 106011019 A CN106011019 A CN 106011019A CN 201610513338 A CN201610513338 A CN 201610513338A CN 106011019 A CN106011019 A CN 106011019A
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Abstract

本发明公开了一种噬菌蛭弧菌制剂的生产方法，包括如下步骤：(1)宿主菌混悬液的制备：以光合细菌中的浑球红假单胞菌P4或沼泽红假单胞菌101与E.Coli600，作为生产培养噬菌蛭弧菌的混合宿主菌；(2)配制培养液；(3)噬菌蛭弧菌的发酵工艺；本发明所制得噬菌蛭弧菌制剂中活菌数明显提高，可以产生大量的噬菌斑，提高了噬菌蛭弧菌制剂的使用效果，增强了噬菌蛭弧菌的裂解活性和稳定性及防治病害效果。

Description

一种噬菌蛭弧菌制剂的生产方法
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种噬菌蛭弧菌制剂的生产方法。
背景技术
国内外在水产养殖及动物疾病防治中，目前主要使用抗生素等化学制剂，这些制剂的副作用，如药物残留、病原菌的抗药性、抑制有益菌群等，给人类健康及畜牧水产生产带来的不良影响越来越明显。近年来微生物生态制剂的研究开发受到各方关注，特别是噬菌蛭弧菌的研究受到人们的青睐。
噬菌蛭弧菌自1963年被发现以来，因其是一种寄生菌，能裂解大肠杆菌、沙门氏菌、嗜水气单胞菌、弧菌等动物致病菌，而其本身对人和动物无毒无害，还可以改善环境等，日益受到人们的关注。在研究开发中，人们都用大肠杆菌作为宿主菌。用活的大肠杆菌培养生产噬菌蛭弧菌，受多种技术条件的限制，很难进行大规模工业化生产，同时影响生态环境。因而有人提出用高温(70～150℃)或化学药物(氯仿等)将大肠杆菌杀死，制造灭活的宿主菌，用来生产噬菌蛭弧菌。实践证明，用这种方法生产的噬菌蛭弧菌制剂，会降低噬菌蛭弧菌对活的宿主菌的裂解能力，甚至降到无裂解能力，因此，对防治动物细菌性疾病效果不稳定，同时该制剂保存时间短，使制剂开发应用受到限制，在水产养殖中更受到制约。在专利ZL200610039346.8中申请人研制成功用浑球红假单胞菌等为宿主的生产方法，近十年来所生产的噬菌蛭弧菌制剂，深受用户的欢迎，但是其噬菌蛭弧菌制剂依然存在着一些缺陷，例如产生的噬菌斑数较少，菌数不够稳定，为了克服这些不足，我们对单一的宿主菌进行改进。
发明内容
发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供一种噬菌蛭弧菌制剂的生产方法，本发明制得噬菌蛭弧菌制剂中活菌数明显提高，可产生大量的噬菌斑，进一步提高了噬菌蛭弧菌制剂的使用效果，为噬菌蛭弧菌的工业化生产提供一种新的复合活性宿主菌。
技术方案：为了实现上述目的，如本发明所述一种噬菌蛭弧菌制剂的生产方法，包括如下步骤：
1、一种噬菌蛭弧菌制剂的生产方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)宿主菌混悬液的制备：将培养好的光合细菌混悬液静置24～96小时(培养方法见中国微生态学杂志P.78.1990.3)，除去上清液，加入与除去上清液等体积量的质量分数0.2％～0.85％NaCl溶液，摇匀，再静置24～72小时，除去上清液，再加入质量分数0.2％～0.85％NaCl溶液，配成原光合细菌混悬液体积1/2～2/3的宿主菌混悬液A，按宿主菌混悬液A体积的5％～15％加入灭活E.Coli600的菌悬液(菌种购买于江苏省卫生防疫站)，二液混匀后制得宿主菌混悬液B，备用。
(2)配制培养液：将pH6.5～8.0的磷酸盐缓冲液用水稀释，然后加入CaCl2和MgCl2，制成培养液。
(3)噬菌蛭弧菌的发酵工艺：在培养液中加入宿主菌混悬液B，体积比为100：(5～30)，得混悬液C，在混悬液C中加入噬菌蛭弧菌液(菌种包括Bd1或Bd6，购买于江苏省卫生防疫站；培养方法见动物微生态研究进展p190，2000年，中国农业大学出版社)，体积比为100：(2～3)，在28～30℃温度，150-180rpm条件下培养72～120小时，即制成噬菌蛭弧菌制剂。
作为优选，步骤(1)所述光合细菌为浑球红假单胞菌P4或沼泽红假单胞菌101(菌种购买于上海交通大学生物技术所)。使用光合细菌作为宿主，提高了噬菌蛭弧菌的裂解活性和稳定性，提高了防治病害效果。
作为优选，步骤(1)所述光合细菌混悬液为培养到稳定期的光合细菌混悬液。
作为优选，步骤(1)所述宿主菌混悬液A的含菌量为30～300亿/mL。
作为优选，步骤(1)所述灭活E.Coli600的菌悬液为培养到稳定期的灭活E.Coli600的菌悬液。
作为优选，步骤(2)所述CaCl2和MgCl2含量均为10～100mg/L。培养液中加入少量的CaCl2和MgCl2有助于促进后面的噬菌蛭弧菌的生长
作为优选，步骤(2)所述CaCl2和MgCl2含量均为20mg/L。
作为优选，步骤(3)所述噬菌蛭弧菌液含菌量大于105pfu/mL。
本发明使用光合细菌本身是水产养殖和改善水质的有益菌，且与噬菌蛭弧菌具有协同作用，因此本发明中采取光合细菌中的浑球或沼泽红假单胞菌可作为生产培养噬菌蛭弧菌的新宿主菌。
有益效果：与现有技术相比较，本发明具有如下优点：本发明中采用光合细菌中的浑球红假单胞菌P4或沼泽红假单胞菌101作为生产培养噬菌蛭弧菌的宿主菌，再加入适量的灭活E.Coli600的菌悬液制得宿主菌混悬液；本发明制得的噬菌蛭弧菌制剂中活菌数明显提高，可以产生大量的噬菌斑，提高了噬菌蛭弧菌制剂的使用效果，增强了噬菌蛭弧菌的裂解活性和稳定性及防治病害效果。
本发明制得的噬菌蛭弧菌制剂在改善水质方面效果明显，使水体PH值稳定，降低水体中化学需氧量、氨态氮以及亚硝酸盐含量等。中国水产研究院淡水渔业研究中心实验表明，使用噬菌蛭弧菌后，氨态氮由0.35降为0.22(mg/L)，COD由6.4降为4.2(mg/L)。本制剂对防治雏鸡白痢，仔猪黄白痢等幼畜禽下痢也有显著效果。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
1、宿主菌混悬液的制备：将培养到稳定期的光合细菌浑球红假单胞菌P4混悬液，静置24小时，除去占全部溶液体积1/2上清液；加入与除去上清液等体积量的质量分数0.2％NaCl溶液，摇匀，再静置24小时，除去占全部溶液体积1/2的上清液，再加入质量分数0.2％NaCl溶液，配成原光合细菌混悬液体积1/2的宿主菌混悬液A，含菌量30亿/ml，再加入宿主菌混悬液A体积5％的培养到稳定期的灭活E.Coli600菌悬液，获得的宿主菌混悬液B，备用。
2.、配制培养液：将pH6.5的磷酸盐缓冲液(PBS)用水10倍稀释，然后加入10mg/L CaCl2和MgCl2制成培养液。
3.、噬菌蛭弧菌的发酵工艺：在培养液中加入宿主菌混悬液B，体积比为100：5，得混悬液C，在混悬液C中加入噬菌蛭弧菌液含菌量5x105pfu/ml，体积比为100：2，在28℃温度，150rpm条件下培养120小时，即制成噬菌蛭弧菌制剂。
实施例2
1、宿主菌混悬液的制备：将培养到稳定期的光合细菌浑球红假单胞菌P4混悬液，静置60小时，除去占全部溶液体积2/3上清液；加入与除去上清液等体积量的质量分数0.5％NaCl溶液，摇匀，再静置48小时，除去占全部溶液体积2/3的上清液，再加入质量分数0.5％NaCl溶液，配成原光合细菌混悬液体积2/3的宿主菌混悬液A，含菌量170亿/ml，再加入宿主菌混悬液A体积10％的培养到稳定期的灭活E.Coli600菌悬液，获得的宿主菌混悬液B，备用。
2、配制培养液：将pH7.5的磷酸盐缓冲液(PBS)用水10倍稀释，然后加入60mg/L CaCl2和MgCl2制成培养液。
3、噬菌蛭弧菌的发酵工艺：在培养液中加入宿主菌混悬液B，体积比为100：18，得混悬液C，在混悬液C中加入噬菌蛭弧菌液含菌量7x105pfu/ml，体积比为100：3，在30℃温度，160rpm条件下培养96小时，即制成噬菌蛭弧菌制剂。
实施例3
1、宿主菌混悬液的制备：将培养到稳定期的光合细菌沼泽红假单胞菌101混悬液，静置96小时，除去占全部溶液体积1/2上清液；加入与除去上清液等体积量的质量分数0.85％NaCl溶液，摇匀，再静置72小时，除去占全部溶液体积1/2的上清液，再加入质量分数0.85％NaCl溶液，配成原光合细菌混悬液体积1/2的宿主菌混悬液A，含菌量300亿/ml，再加入宿主菌混悬液A体积15％的培养到稳定期的灭活E.Coli600菌悬液，获得的宿主菌混悬液B,备用。
2、配制培养液：将pH8.0的磷酸盐缓冲液(PBS)用水10倍稀释，然后加入100mg/L CaCl2和MgCl2制成培养液。
3、噬菌蛭弧菌的发酵工艺：在培养液中加入宿主菌混悬液B，体积比为100：30，得混悬液C，在混悬液C中加入噬菌蛭弧菌液含菌量9x105pfu/ml，体积比为100：3，在30℃温度，180rpm条件下培养72小时，即制成噬菌蛭弧菌制剂。
实施例4
1、宿主菌混悬液的制备：将培养到稳定期的光合细菌浑球红假单胞菌P4混悬液，静置48小时，除去占全部溶液体积1/2上清液；加入与除去上清液等体积量的质量分数0.5％NaCl溶液，摇匀，再静置48小时，除去占全部溶液体积1/2的上清液，再加入质量分数0.5％NaCl溶液，配成原光合细菌混悬液体积1/2的宿主菌混悬液A，含菌量300亿/ml，再加入宿主菌混悬液A体积10％的培养到稳定期的灭活E.Coli600的菌悬液，获得的宿主菌混悬液B，备用。
2、配制培养液：将pH7.0的磷酸盐缓冲液(PBS)用水10倍稀释，然后加入20mg/L CaCl2和MgCl2制成培养液。
3、噬菌蛭弧菌的发酵工艺：在培养液中加入宿主菌混悬液B，体积比为100：18，得混悬液C，在混悬液C中加入噬菌蛭弧菌液含菌量7x105pfu/ml，体积比为100：3，在30℃温度，180rpm条件下培养72小时，即制成噬菌蛭弧菌制剂。
试验例1
对本发明的实施例的生产的噬菌蛭弧菌制剂，先后抽取5个批次，分别检测产生噬菌斑情况，结果见表1。
对比例1用浑球红假单胞菌P4作为宿主不加入灭活E.Coli600菌悬液，其他与实施例3方法相同。
对比例2用沼泽红假单胞菌101作为宿主不加入灭活E.Coli600菌悬液，其他与实施例3方法相同。
表1噬菌蛭弧菌制剂产生的噬菌斑情况
光合细菌中的浑球红假单胞菌P4或沼泽红假单胞菌101与E.Coli600，作为生产培养噬菌蛭弧菌的混合宿主菌，培养制成的噬菌蛭弧菌制剂中活菌数明显提高。我们对培养制剂先后抽样检测5次，由表1结果表明，对比例1用单一浑球红假单胞菌P4菌液培养所得噬菌蛭弧菌制剂平均产生噬菌斑数为3.7×105.4pfu/ml，对比例2用单一沼泽红假单胞菌101菌液培养所得噬菌蛭弧菌制剂平均产生噬菌斑数为4.5×105，而实施例1，实施例2，实施例3，实施例4所得噬菌蛭弧菌制剂平均产生噬菌斑数分别为4.2×106、2.5×106.1、2.8×106.1，3.5×106.4pfu/ml，实施例噬菌斑数较对比例显著提高。
试验例2
使用本发明实施例制成的噬菌蛭弧菌制剂，进行对虾养殖试验，研究防治对虾疾病，每次用量5ppm，洒入水池，10～15天使用一次，本发明实施例对虾平均成活率达90％以上，而空白对照仅为70％(空白对照为按常规饲养管理，不使用噬菌蛭弧菌制剂)，使用单一浑球红假单胞菌P4或沼泽红假单胞菌101的噬菌蛭弧菌制剂成活率不到80％，证实本发明所生产的噬菌蛭弧菌制剂对防治鱼虾疾病，改善水质均有显著效果。

Claims (8)

1.一种噬菌蛭弧菌制剂的生产方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)宿主菌混悬液的制备：将培养好的光合细菌混悬液静置24～96小时，除去上清液，加入与除去上清液等体积量的质量分数为0.2％～0.85％NaCl溶液，摇匀，静置24～72小时，除去上清液，再加入质量分数为0.2％～0.85％NaCl溶液，配成原光合细菌混悬液体积1/2～2/3的宿主菌混悬液A，按宿主菌混悬液A体积的5％～15％加入灭活E.Coli600的菌悬液，二液混匀后制得宿主菌混悬液B，备用；
(2)配制培养液：将pH6.5～8.0的磷酸盐缓冲液用水稀释，然后加入CaCl2和MgCl2，制成培养液；
(3)噬菌蛭弧菌的发酵工艺：在培养液中加入宿主菌混悬液B，体积比为100：(5～30)，得混悬液C，在混悬液C中加入噬菌蛭弧菌液，体积比为100：(2～3)，在28～30℃温度，150-180rpm条件下培养72～120小时，即制成噬菌蛭弧菌制剂。
2.根据权利要求1所述噬菌蛭弧菌制剂的生产方法，其特征在于，步骤(1)所述光合细菌为浑球红假单胞菌P4或沼泽红假单胞菌101。
3.根据权利要求1所述噬菌蛭弧菌制剂的生产方法，其特征在于，步骤(1)所述光合细菌混悬液为培养到稳定期的光合细菌混悬液。
4.根据权利要求1所述噬菌蛭弧菌制剂的生产方法，其特征在于，步骤(1)所述宿主菌混悬液A的含菌量为30～300亿/mL。
5.根据权利要求1所述噬菌蛭弧菌制剂的生产方法，其特征在于，步骤(1)所述灭活E.Coli600的菌悬液为培养到稳定期的灭活E.Coli600的菌悬液。
6.根据权利要求1所述噬菌蛭弧菌制剂的生产方法，其特征在于，步骤(2)所述CaCl2和MgCl2含量均为10～100mg/L。
7.根据权利要求5所述噬菌蛭弧菌制剂的生产方法，其特征在于，步骤(2)所述CaCl2和MgCl2含量均为20mg/L。
8.根据权利要求1所述噬菌蛭弧菌制剂的生产方法，其特征在于，步骤(3)所述噬菌蛭弧菌液含菌量大于105pfu/mL。
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