CN106000101B - 一种分离苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸消旋体的方法 - Google Patents
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Abstract
一种分离苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸消旋体的方法，涉及一种分离D，L‑氨基酸消旋体的分离方法，该方法以Cu和L‑组氨酸作手性选择剂，以β‑环糊精为分离介质，磷酸氢二钠为缓冲溶液，运用配体交换法，使Cu、L‑组氨酸和拉唑药物左右旋分别形成三元配合物，在分离介质β‑环糊精作用下，通过毛细管电泳仪使对映体实现分离，运用配体交换毛细管电泳法分离D,L‑氨基酸消旋体，其所用的手性选择剂是Cu、L‑组氨酸和β‑环糊精，其中以β‑环糊精为分离介质，本发明操作简单，手性选择剂价廉易得且样品和试剂用量少，可用于此类氨基酸的体内分析和产品光学纯度检测。
Description
技术领域
本发明涉及一种分离D，L-氨基酸消旋体的方法，，特别是涉及一种分离苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸消旋体的方法。
背景技术
毛细管电泳因其具有高效、快速、简便等优点又称为高效毛细管电泳。它是以高压直流电场为驱动力，以荷电粒子按其分配系数的不同在毛细管内进行分离的一种电泳新技术，具有它具有分离模式多、分离柱效高、分析速度快、操作简便、样品和试剂消耗量少、环境污染小等优点，因而在手性分离研究中备受青睐。
该方法手性选择剂种类多，常见的选择剂有环糊精、手性冠醚、大环糖肽类抗生素、线性多糖、蛋白质、手性表面活性剂及配体交换复合物等，还可以同时使用多个手性选择剂，利用其协同作用加强分离效果，而且方法简单、快速，成本低。目前，国内外没有采用双手性选择剂毛细管电泳法分离D，L-氨基酸消旋体的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种分离苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸消旋体的方法，该方法采用双手性选择剂毛细管电泳法，为此类单一氨基酸研究开发和应用提供技术支持和保障。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种分离苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸消旋体的方法，该方法以Cu和L-组氨酸作手性选择剂，以β-环糊精为分离介质，磷酸氢二钠为缓冲溶液，运用配体交换法，使Cu、L-组氨酸和氨基酸消旋体的D，L型分别形成三元配合物，在分离介质β-环糊精作用下，通过毛细管电泳仪使对映体实现分离，运用配体交换毛细管电泳法分离拉唑药物对映体，其所用的手性选择剂是Cu、L-组氨酸和β-环糊精，其中以β-环糊精为分离介质，
具体分离步骤如下：
a．样品的配置：样品储备溶液的配置，分别精密称取苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸消旋体样品粉末10 mg，置10 mL棕色容量瓶中，以过滤后的甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，得样品浓度均为1 mg/mL的储备液，-20 oC冰箱保存；样品供试溶液的配制，精密量取样品储备液1 mL分别至10 mL棕色容量瓶中，以甲醇定容至刻度，摇匀，得100 μg/mL供试液，4 oC冰箱保存；
b．分离条件：运行缓冲液，5 mmol/L磷酸二氢钠、8 mmol/Lβ-环糊精、13 mmol/LL-组氨酸、10 mmol/L醋酸铜、pH 5.0，然后经0.45 μm的滤膜过滤后超声脱气；毛细管柱：总长53 cm，有效长度45 cm，内径50 μm；洗柱方式：毛细管柱依次用0.1 mol/L氢氧化钠溶液、二次蒸馏水、运行缓冲液各冲洗10 min后进样；进样间用二次蒸馏水、运行缓冲液各冲洗5min后进行下次进样；进样方式：虹吸进样，正极进样负极检测；进样高度差：10 cm；进样时间：10 s；柱温：室温。
所述的一种分离苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸消旋体的方法，其样品操作：运行缓冲液和样品均经0.45 μm微孔滤膜过滤，并超声脱气，样品用甲醇溶解，4℃冰箱保存备用。
所述的一种分离苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸消旋体的方法，其所述电泳分离条件：运行缓冲液：5 mmol/L磷酸二氢钠含8 mmol/Lβ-CD 、13 mmol/L L-组氨酸和10 mmol/L醋酸铜，调至pH 5.0；分离电压：15 kV；紫外检测波长：250 nm。
所述的一种分离苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸消旋体的方法，其所述分离拉唑类药物对映体所选用的配体是Cu，手性选择剂是L-组氨酸，它们配位比是1：1.3。
所述的一种分离苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸消旋体的方法，其所述分离苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸消旋体的毛细管总长53 cm，有效长度45 cm，内径：50 mm；每次分析前依次用10%HCl、1mol/LNaOH、二次蒸馏水和运行缓冲液各冲洗10 min；进样间依次用运行缓冲液和二次蒸馏水各冲柱5 min，然后进行下一次进样。
所述的一种分离苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸消旋体的方法，其所述分离苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸消旋体时运行缓冲液中添加8 mmol/Lβ-CD作为分离介质。
本发明的优点与效果是：
1. 本发明提供了分离苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸消旋体的换毛细管电泳法，用Cu和L-组氨酸作手性选择剂，在分离介质β-环糊精作用下，通过毛细管电泳仪实现药物对映体分离，本发明使用多个手性选择剂，利用其协同作用得到更高的分离效果，操作简单，手性选择剂价廉易得且样品和试剂用量少。
2. 本发明可以用于此类氨基酸的体内分析和光学纯度检测，为研发此类单一对映体氨基酸的质量控制提供技术支持与保障。
附图说明
图1为分离苯丙氨酸消旋体的色谱图；
图2为分离酪氨酸消旋体色谱图；
图3为分离色氨酸消旋体色谱图。
具体实施方式
下面参照附图对本发明进行详细说明。
图1-3为分离D,L-氨基酸消旋体的色谱图，分离分析时间在15分钟内，分离度大于3。
实施例：
1. 精密称取苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸消旋体各10 mg，分别置10 mL棕色容量瓶中，以甲醇溶解并定容至刻度，摇匀。得各样品浓度均为1 mg/mL的储备液，-20 oC冰箱保存。精密量取各样品储备液1 mL分别至10 mL棕色容量瓶中，以甲醇定容至刻度，摇匀，得100μg/mL供试液，经0.45μm微孔滤膜过滤后备用。
2. 配制5 mmol/LNaH2PO4含8 mmol/Lβ-环糊精、10 mmol/L醋酸铜和13 mmol/LL-组氨酸作运行缓冲液，用H3PO4和NaOH调至pH 5.0，经0.45μm微孔滤膜过滤，并超声脱气备用。毛细管柱依次用0.1 mol/LNaOH、二次蒸馏水和上述运行缓冲液各冲洗10 min后走基线，待基线平稳后（2 min左右）采用虹吸进样，进样高度10 cm，进样时间10 s，正极进样负极检测，记录电泳图。进样间依次用二次蒸馏水和运行缓冲液各冲柱5 min，走基线2 min左右，然后进下一个样品。分离电压：15 kV，紫外检测波长：290 nm。分离电泳图如图1-3，苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸消旋体均达基线分离。
Claims (1)
1.一种分离苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸消旋体的方法，其特征在于，该方法以Cu和L-组氨酸作手性选择剂，以β-环糊精为分离介质，磷酸氢二钠为缓冲溶液，运用配体交换法，使Cu、L-组氨酸和氨基酸消旋体的D，L型分别形成三元配合物，在分离介质β-环糊精作用下，通过毛细管电泳仪使对映体实现分离，运用配体交换毛细管电泳法分离拉唑药物对映体，其所用的手性选择剂是Cu、L-组氨酸和β-环糊精，其中以β-环糊精为分离介质；
具体分离步骤如下：
a．样品的配置：样品储备溶液的配置，分别精密称取苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸消旋体样品粉末10 mg，置10 mL棕色容量瓶中，以过滤后的甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，得样品浓度均为1 mg/mL的储备液，-20℃冰箱保存；样品供试溶液的配制，精密量取样品储备液1mL分别至10 mL棕色容量瓶中，以甲醇定容至刻度，摇匀，得100μg/mL供试液，4℃冰箱保存；
b．分离条件：运行缓冲液，5mmol/L磷酸二氢钠、8 mmol/Lβ-环糊精、13mmol/L L-组氨酸、10mmol/L醋酸铜、pH5.0，然后经0.45μm的滤膜过滤后超声脱气；毛细管柱：总长53cm，有效长度45cm，内径50μm；洗柱方式：毛细管柱依次用0.1 mol/L氢氧化钠溶液、二次蒸馏水、运行缓冲液各冲洗10min后进样；进样间用二次蒸馏水、运行缓冲液各冲洗5min后进行下次进样；进样方式：虹吸进样，正极进样负极检测；进样高度差：10cm；进样时间：10s；柱温：室温；分离电压：15 kV；紫外检测波长：250 nm。
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