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CN105916985A - 具有甘露聚糖酶活性的多肽和编码它们的多核苷酸 - Google Patents

具有甘露聚糖酶活性的多肽和编码它们的多核苷酸 Download PDF

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CN105916985A
CN105916985A CN201480050969.8A CN201480050969A CN105916985A CN 105916985 A CN105916985 A CN 105916985A CN 201480050969 A CN201480050969 A CN 201480050969A CN 105916985 A CN105916985 A CN 105916985A
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CN201480050969.8A
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K.B.R.M.克罗
N.斯波德斯伯格
K.戈里
P.冯弗赖埃斯莱本
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Novo Nordisk AS
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Abstract

本发明涉及具有甘露聚糖酶活性、催化结构域和碳水化合物结合模块的多肽，以及编码这些多肽、催化结构域和碳水化合物结合模块的多核苷酸。本发明还涉及包括这些多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞以及生产和使用这些多肽、催化结构域、以及碳水化合物结合模块的方法。

Description

具有甘露聚糖酶活性的多肽和编码它们的多核苷酸
对序列表的引用
本申请含有计算机可读形式的序列表，将该序列表通过引用结合在此。
发明背景
发明领域
本发明涉及具有甘露聚糖酶活性、催化结构域和碳水化合物结合模块的多肽，以及编码这些多肽、催化结构域和碳水化合物结合模块的多核苷酸。本发明还涉及包括这些多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞以及生产和使用这些多肽、催化结构域、以及碳水化合物结合模块的方法。
相关技术说明
甘露聚糖是占软木中高达25％的木材干重的一类半纤维素，但是还发现于其他植物材料中，尤其是各种种子中。甘露聚糖是具有β-1,4-连接的D-吡喃甘露糖基残基的主链的多糖，它可以包含半乳糖或乙酰基取代，并且可以在主链中具有葡萄糖残基。参与甘露聚糖降解的主要酶类型是内切-1,4-β-甘露聚糖酶(EC 3.2.1.78)，它水解在甘露聚糖主链中的内部糖苷键。
因此，在其中需要降解甘露聚糖的应用中可以有利的是使用内切甘露聚糖酶。其中可以使用甘露聚糖酶的实例是在从软木(瓦尔纳伊(Várnai)等人，(2011)“木聚糖酶和甘露聚糖酶的协同作用改进了软木的完全水解(Synergistic action of xylanase andmannanase improves the total hydrolysis of softwood)”，生物资源技术(Bioresource tech.)，102(19)，第9096-104页)和棕榈仁滤饼(约根森等人，(2010)“通过棕榈仁滤饼的高干物质水解和发酵生产乙醇和饲料(Production of ethanoland feed by high dry matter hydrolysis and fermentation of palm kernel presscake)”，应用生物化学和生物技术(Applied Biochem.Biotech.)，161(1-8)，第318-32页)生产生物乙醇中，以用于改进动物饲料(蔡(Cai)等人，(2011)，“来自嗜松青霉C1的酸性β-甘露聚糖酶：克隆、表征及对其用于动物饲料应用的潜力的评估(Acidic β-mannanasefrom Penicillium pinophilum C1:Cloning,characterization and assessment of itspotential for animal feed application)”，生物科学和生物工程杂志(J.Biosci.Bioeng.)，112(6)，第551-557页)，并且所述实例还在于在咖啡提取物的水解中(努内斯(Nunes)等人，(2006)，“烘烤咖啡饮料中半乳甘露聚糖衍生物的表征(Characterization of Galactomannan Derivatives in Roasted Coffee Beverages)”，农业化学和食品化学杂志(J. Agricultural Food Chem.)，54(9)，第3428-3439页)。此外，瓜尔胶用于很多食物产品中，并且所以甘露聚糖酶可以用于洗涤剂中以除去含甘露聚糖的污渍。
根据CAZy(www.cazy.org)，内切-1,4-β-甘露聚糖酶可以发现于糖苷水解酶家族5、26和113中。库蒂里耶(Couturier)等人已经在(2013)，“来自柄孢霉的糖苷水解酶家族5和26-(1,4)-甘露聚糖酶的结构的和生物化学的分析揭示在甘露糖-寡糖催化时的差异(Structural and Biochemical Analyses of Glycoside Hydrolase Families 5 and26-(1,4)-Mannanases from Podospora anserina Reveal Differences upon Manno-oligosaccharide Catalysis)”，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)，288(20):14624-14635中报道了分别具有与SEQ ID NO:3和6的56.1％和76.4％一致性的来自柄孢霉的GH26甘露聚糖酶。
然而，目前在文献中没有报道描述GH26甘露聚糖酶可以用于降解高度取代的甘露聚糖。此外，存在非常少的真菌GH26甘露聚糖酶的实例。本发明提供了具有甘露聚糖酶活性的多肽和编码在降解不同类型的甘露聚糖时有高度活性并且因此可以用于前述应用的多肽的多核苷酸。
发明概述
本发明涉及选自下组的具有甘露聚糖酶活性的多肽，该组由以下各项组成：
(a)与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少60％序列一致性的多肽；
(b)与SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:5的成熟多肽具有至少81％序列一致性的多肽；
(c)由如下多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸在非常低严格条件、低严格条件、中严格条件、中-高严格条件、高严格条件或非常高严格条件下与以下项杂交：
(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列，
(ii)其cDNA序列，或
(iii)(i)或(ii)的全长互补体；
(d)由如下多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸在中严格条件、中-高严格条件、高严格条件或非常高严格条件下与以下项杂交：
(i)SEQ ID NO:4的成熟多肽编码序列，
(ii)其cDNA序列，或
(iii)(i)或(ii)的全长互补体；
(e)由与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列或其cDNA序列具有至少60％序列一致性的多核苷酸编码的多肽；
(f)由与SEQ ID NO:4的成熟多肽编码序列或其cDNA序列具有至少81％序列一致性的多核苷酸编码的多肽；
(g)SEQ ID NO:3的变体或SEQ ID NO:2的成熟多肽，该变体或该成熟多肽在一个或多个(例如若干个)位置处包括取代、缺失、和/或插入；
(h)SEQ ID NO:6的变体或SEQ ID NO:5的成熟多肽，该变体或该成熟多肽在一个或多个(例如若干个)位置处包括取代、缺失、和/或插入；以及
(i)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)或(h)的多肽的片段，该片段具有甘露聚糖酶活性。
本发明还涉及包含选自下组的催化结构域的多肽，该组由以下各项组成：
(a)与SEQ ID NO:2的氨基酸128至446具有至少65％的序列一致性的催化结构域；
(b)与SEQ ID NO:5的氨基酸135至448具有至少87％的序列一致性的催化结构域；
(c)由如下多核苷酸编码的催化结构域，该多核苷酸在非常低严格条件、低严格条件、中严格条件、中-高严格条件、高严格条件或非常高严格条件下与以下项杂交：
(i)SEQ ID NO:1的核苷酸490至1446，
(ii)其cDNA序列，或
(iii)(i)或(ii)的全长互补体；
(d)由如下多核苷酸编码的催化结构域，该多核苷酸在中-高严格条件、高严格条件或非常高严格条件下与以下项杂交：
(i)SEQ ID NO:4的核苷酸599至1651，
(ii)其cDNA序列，或
(iii)(i)或(ii)的全长互补体；
(e)由与SEQ ID NO:1的核苷酸490至1446或其cDNA序列具有至少65％序列一致性的多核苷酸编码的催化结构域；
(f)由与SEQ ID NO:4的核苷酸599至1651或其cDNA序列具有至少87％序列一致性的多核苷酸编码的催化结构域；
(g)在一个或多个(例如若干个)位置处包括取代、缺失、和/或插入的SEQ ID NO:2的氨基酸128至446的变体；以及
(h)在一个或多个(例如若干个)位置处包括取代、缺失、和/或插入的SEQ ID NO:5的氨基酸135至448的变体；以及
(i)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)或(h)的催化结构域的片段，该片段具有甘露聚糖酶活性。
本发明还涉及包括可操作地连接至催化结构域的碳水化合物结合模块的 多肽，其中该结合模块选自下组，该组由以下各项组成：
(a)与SEQ ID NO:2的氨基酸1至124具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性的碳水化合物结合模块；
(b)与SEQ ID NO:2的氨基酸508至541具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性的碳水化合物结合模块；
(c)与SEQ ID NO:5的氨基酸1至130具有至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性的碳水化合物结合模块；
(d)与SEQ ID NO:5的氨基酸492至526具有至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性的碳水化合物结合模块；
(e)由如下多核苷酸编码的碳水化合物结合模块，该多核苷酸在非常低严格条件、低严格条件、中严格条件、中-高严格条件、高严格条件或非常高严格条件下与以下项杂交：
(i)SEQ ID NO:1的核苷酸61至480，
(ii)其cDNA序列，或
(iii)(i)或(ii)的全长互补体；
(f)由如下多核苷酸编码的碳水化合物结合模块，该多核苷酸在中严格条件、中-高严格条件、高严格条件或非常高严格条件下与以下项杂交：
(i)SEQ ID NO:1的核苷酸1630至1731，
(ii)其cDNA序列，或
(iii)(i)或(ii)的全长互补体；
(g)由如下多核苷酸编码的碳水化合物结合模块，该多核苷酸在中严格条件、中-高严格条件、高严格条件或非常高严格条件下与以下项杂交：
(i)SEQ ID NO:4的核苷酸82至586，
(ii)其cDNA序列，或
(iii)(i)或(ii)的全长互补体；
(h)由如下多核苷酸编码的碳水化合物结合模块，该多核苷酸在中严格 条件、中-高严格条件、高严格条件或非常高严格条件下与以下项杂交：
(i)SEQ ID NO:4的核苷酸1781至1885，
(ii)其cDNA序列，或
(iii)(i)或(ii)的全长互补体；
(i)由与SEQ ID NO:1的核苷酸61至480或其cDNA序列具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性的多核苷酸编码的碳水化合物结合模块；
(j)由与SEQ ID NO:1的核苷酸1630至1731或其cDNA序列具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性的多核苷酸编码的碳水化合物结合模块；
(k)由与SEQ ID NO:4的核苷酸82至586或其cDNA序列具有至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性的多核苷酸编码的碳水化合物结合模块；
(l)由与SEQ ID NO:4的核苷酸1781至1885或其cDNA序列具有至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性的多核苷酸编码的碳水化合物结合模块；
(m)在一个或多个(例如若干个)位置处包括取代、缺失、和/或插入的SEQ ID NO:2的氨基酸1至124的变体；以及
(n)在一个或多个(例如若干个)位置处包括取代、缺失、和/或插入的SEQ ID NO:2的氨基酸508至541的变体；以及
(o)在一个或多个(例如若干个)位置处包括取代、缺失、和/或插入的SEQ ID NO:5的氨基酸1至130的变体；以及
(p)在一个或多个(例如若干个)位置处包括取代、缺失、和/或插入的SEQ ID NO:5的氨基酸492至526的变体；以及
(q)具有碳水化合物结合活性的(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)、(j)、(k)、(l)、(m)、(n)、(o)或(p)的碳水化合物结合模块的片段。
本发明还涉及包含本发明的多肽的组合物和本发明的多肽在降解甘露聚 糖、控制钻井液的粘度、用于洗涤或清洁纺织品和/或硬表面的用途；用于降解甘露聚糖的方法，这些方法包括将包含本发明的多肽的组合物施加至甘露聚糖；用于使用本发明的多肽产生咖啡提取物的方法；以及用于降解纤维素材料、用于生产发酵产物和用于发酵纤维素材料的方法。
本发明还涉及编码本发明的多肽的多核苷酸；核酸构建体；重组表达载体；包含这些多核苷酸的重组宿主细胞；以及产生这些多肽的方法。
此外，本发明进一步涉及包括这些多肽的全培养液配制品或细胞培养组合物。
本发明还涉及根据第一方面所述的多肽用于从物品上防止、减少或除去生物膜的用途。
序列表综述
SEQ ID NO:1是如从Ascobolus stictoideus分离的甘露聚糖酶的DNA序列。
SEQ ID NO:2是如从SEQ ID NO:1推导的氨基酸序列。
SEQ ID NO:3是从Ascobolus stictoideus分离的成熟甘露聚糖酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO:4是如从绿毛壳分离的甘露聚糖酶的DNA序列。
SEQ ID NO:5是如从SEQ ID NO:4推导的氨基酸序列。
SEQ ID NO:6是从绿毛壳分离的成熟甘露聚糖酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO:7是引物F-P335AW。
SEQ ID NO:8是引物R-P335AW。
SEQ ID NO:9是引物F-P335AV。
SEQ ID NO:10是引物R-P335AV。
SEQ ID NO:11是来自里氏木霉(SWISSPROT:Q99036)的GH5甘露聚糖酶的氨基酸序列。
定义
辅助活性(Auxiliary Activity)9：术语“辅助活性9”或“AA9”意指分类为溶解性多糖单加氧酶(lytic polysaccharide monooxygenase)(昆兰(Quinlan)等人，2011，美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)208:15079-15084；菲利普斯(Phillips)等人，2011，ACS化学生物学(ACS Chem.Biol.)6:1399-1406；林(Lin)等人，2012，结构(Structure)20:1051-1061)的多肽。根据亨利萨特(Henrissat)，1991，生物化学杂志(Biochem.J.)280:309-316；以及亨利萨特和贝洛赫(Bairoch)，1996，生物化学杂志316:695-696，AA9多肽之前被分类为糖苷水解酶家族61 (GH61)。
等位基因变体：术语“等位基因变体”意指占据同一染色体基因座的基因的两种或更多种可替代形式中的任一种。等位基因变异由突变天然产生，并且可以导致群体内的多态性。基因突变可以是沉默的(在所编码的多肽中没有改变)或可编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因变体是由基因的等位基因变体编码的多肽。
β-1,3-半乳聚糖酶：术语“β-1,3-半乳聚糖酶”意指特异性水解β-1,3-半乳聚糖和β-1,3-低聚半乳糖的酶。该酶可以主要具有内切-β-1,3-半乳聚糖酶活性(EC 3.2.1.181)，或它可以具有外切活性(EC 3.2.1.145)。可以使用由莱韦尔(Lever)(1972)，分析化学(Anal.Biochem.)47:273-279,1972开发的比色测定，使用还原糖测定(PAH-BAH测定)量化β-1,3-半乳聚糖酶活性。
β-葡糖苷酶：术语“β-葡糖苷酶”意指β-D-葡糖苷葡糖水解酶(E.C.3.2.1.21)，其催化末端非还原β-D-葡萄糖残基的水解，并释放β-D-葡萄糖。可以根据文丘里(Venturi)等人，2002，基础微生物学杂志(J.Basic Microbiol.)42:55-66的程序使用对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷作为底物来测定β-葡糖苷酶活性。一个单位的β-葡糖苷酶定义为在25℃、pH4.8下，在含有0.01％20的50mM柠檬酸钠中从作为底物的1mM对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷每分钟产生1.0微摩尔的对硝基苯酚阴离子。
生物膜：术语“生物膜”意指在表面上，例如纺织品、餐具或硬表面上，细胞彼此粘附在一起的任何群组的微生物。这些粘附细胞经常包埋在胞外高聚物(EPS)的自身产生的基质内。生物膜EPS是一般由细胞外的DNA、蛋白、和多糖组成的聚合物团块。生物膜可以形成在活的或非活的表面上。在生物膜中生长的微生物细胞与同一有机体的浮游细胞(相比之下，浮游细胞是可以在液体培养基中漂浮或浮游的单个细胞)是在生理上不同的。
生活在生物膜中的细菌通常具有与同一物种的自由漂浮细菌显著不同的特性，因为被膜的密集并且受保护的环境允许它们以不同方式协作和相互作用。这一环境的一个作用是增加对洗涤剂和抗生素的抗性，因为，密集的细胞外基质和细胞的外层保护群落的内部。
在衣物上，会发现产生生物膜的细菌是在以下物种中：不动杆菌属物种、气微菌属物种、短波单胞菌属物种、微杆菌属物种、滕黄微球菌、假单胞菌属物种、表皮葡萄球菌、和寡养单胞菌属物种。
碳水化合物结合模块：术语“碳水化合物结合模块”意指提供碳水化合物结合活性的碳水化合物活性酶内的区域(布拉斯顿(Boraston)等人，2004，生物化学杂志(Biochem.J.)383:769-781)。大多数已知的碳水化合物结合模块(CBM)是具有离散折叠的连续氨基酸序列。碳水化合物结合模块(CBM)典型地发现于酶的N-末端处或C-末端的端点处。已知一些CBM具 有针对纤维素的特异性。
催化结构域：术语“催化结构域”意指酶的包含该酶的催化机器的区域。
cDNA：术语“cDNA”意指可以通过从得自真核或原核细胞的成熟的、剪接的mRNA分子进行反转录而制备的DNA分子。cDNA缺乏可以存在于对应基因组DNA中的内含子序列。早先的初始RNA转录本是mRNA的前体，其在呈现为成熟的剪接的mRNA之前要经一系列的步骤进行加工，包括剪接。
纤维素分解酶或纤维素酶：术语“纤维素分解酶”或“纤维素酶”是指一种或多种(例如若干种)水解纤维素材料的酶。这类酶包括一种或多种内切葡聚糖酶、一种或多种纤维二糖水解酶、一种或多种β-葡糖苷酶、或其组合。用于测量纤维素分解酶活性的两种基本方法包括：(1)测定总纤维素分解酶活性，以及(2)测定单独的纤维素分解酶活性(内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶)，如在张(Zhang)等人，2006，生物技术进展(Biotechnology Advances)24:452-481中所述的。可使用不溶性底物，包括沃特曼(Whatman)№1滤纸、微晶纤维素、细菌纤维素、藻类纤维素、棉花、预处理的木质纤维素等，测量总纤维素分解酶活性。最常用的总纤维素分解活性测定是使用沃特曼№1滤纸作为底物的滤纸测定。该测定法是由国际纯粹与应用化学联合会(IUPAC)建立的(高斯(Ghose)，1987，纯粹与应用化学(Pure Appl.Chem.)59:257-68)。
可以通过测量在以下条件下与未添加纤维素分解酶蛋白的对照水解相比，在一种或多种纤维素分解酶对纤维素材料的水解过程中产生/释放的糖的增加来测定纤维素分解酶活性：1-50mg的纤维素分解酶蛋白/g于预处理的玉米秸秆(PCS)中的纤维素(或其他预处理的纤维素材料)，在适合的温度(如40℃-80℃，例如50℃、55℃、60℃、65℃或70℃)和适合的pH(如4-9，例如，5.0、5.5、6.0、6.5或7.0)下持续3-7天。典型条件为：1ml反应，洗涤或未洗涤的PCS，5％不溶性固形物(干重)，50mM乙酸钠(pH 5)，1mM MnSO4，50℃、55℃、或60℃，72小时，通过HPX-87H柱(伯乐实验室有限公司，美国加州赫拉克勒斯)进行的糖分析。
纤维素材料：术语“纤维素材料”意指含有纤维素的任何材料。生物质的初生细胞壁中的主要多糖是纤维素，第二丰富的是半纤维素，而第三丰富的是果胶。细胞停止生长后产生的次生细胞壁也包含多糖，并且它通过与半纤维素共价交联的聚合木质素得到强化。纤维素是脱水纤维二糖的均聚物，因此是线性β-(l-4)-D-葡聚糖，而半纤维素包括多种化合物，如具有一系列取代基以复杂支链结构存在的木聚糖、木葡聚糖、阿拉伯糖基木聚糖、以及甘露聚糖。尽管纤维素一般为多态的，但发现其在植物组织中主要以平行葡聚糖链的不溶性晶体基质存在。半纤维素通常氢键合至纤维素以及其他半纤维 素，这有助于稳定细胞壁基质。
纤维素通常见于例如植物的茎、叶、壳、皮、以及穗轴，或树的叶、枝、以及木材中。纤维素材料可以是，但不限于：农业废弃物、草本材料(包括能源作物)、城市固体废物、纸浆和造纸厂废弃物、废纸、和木材(包括林业废弃物)(参见例如维塞劳格尔(Wiselogel)等人，1995，生物乙醇手册(Handbook on Bioethanol)(查尔斯E.怀曼(Charles E.Wyman)，编著)中，第105-118页，泰勒-弗朗西斯出版集团(Taylor&Francis)，华盛顿特区；怀曼(Wyman)，1994，生物资源技术(Bioresource Technology)50:3-16；林德(Lynd)，1990，应用生物化学与生物技术(Applied Biochemistry and Biotechnology)24/25:695-719；马塞尔(Mosier)等人，1999，木质纤维素的生物转化的最近进展，生物化学工程/生物技术进展(Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology)，斯卡皮尔(T.Scheper)，总编辑，第65卷，第23-40页，施普林格出版公司(Springer-Verlag)，纽约)。在此应该理解的是，纤维素可以处于木素纤维素，在混合基质中含有木质素、纤维素、和半纤维素的植物细胞壁材料的形式。在一方面，该纤维素材料是任何生物质材料。在另一方面，该纤维素材料是木质纤维素，该木质纤维素包括纤维素、半纤维素、以及木质素。
在一个实施例中，该纤维素材料是农业废弃物、草本材料(包括能源作物)、城市固体废物、纸浆和造纸厂废弃物、废纸或木材(包括林业废弃物)。
在另一实施例中，该纤维素材料是芦竹、甘蔗渣、竹子、玉米芯、玉米纤维、玉米秸秆、芒属、稻秸、柳枝稷或麦秸。
在另一实施例中，该纤维素材料是山杨、桉树、冷杉、松树、白杨、云杉或柳树。
在另一实施例中，该纤维素材料是海藻纤维素、细菌纤维素、棉短绒、滤纸、微晶纤维素(例如，)、或经磷酸处理的纤维素。
在另一个实施例中，该纤维素材料是一种水生生物质。如在此所用的，术语“水生生物质(aquatic biomass)”意指在水生环境中通过光合作用过程产生的生物质。水生生物质可以是藻类、挺水植物、浮叶植物、或沉水植物。
纤维素材料可以按原样使用或可以使用本领域已知的常规方法进行预处理，如在此所描述。在优选方面中，对该纤维素材料进行预处理。
编码序列：术语“编码序列”是指直接指定多肽氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界一般由开放阅读框架决定，该开放阅读框架从起始密码子(如ATG、GTG或TTG)开始并且以终止密码子(如TAA、TAG或TGA)结束。编码序列可以是基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。
控制序列：术语“控制序列”意指对于表达编码本发明的成熟多肽的多核苷酸所必需的核酸序列。每个控制序列对于编码该多肽的多核苷酸来说可以是天然的(即，来自相同基因)或外源的(即，来自不同基因)，或相对于彼此是天然的或外源的。此类控制序列包括但不限于前导子、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列、以及转录终止子。至少，控制序列包括启动子，以及转录和翻译终止信号。出于引入有利于将这些控制序列与编码多肽的多核苷酸的编码区连接的特异性限制酶切位点的目的，这些控制序列可以提供有多个接头。
深度清洁：术语“深度清洁”意指生物膜或生物膜的组分，例如多糖、蛋白、DNA、污垢或生物膜中存在的其他组分的破坏或除去。
洗涤剂组分：在此将术语“洗涤剂组分”定义为意指可以用于洗涤剂组合物中的化学品的类型。洗涤剂组分的实例是表面活性剂、助水溶剂、助洗剂、共助洗剂、螯合剂(chelator)或螯合试剂(chelating agent)、漂白系统或漂白组分、聚合物、织物调色剂、织物调理剂、增泡剂、抑泡剂、分散剂、染料转移抑制剂、荧光增白剂、香料、光学增亮剂、杀细菌剂、杀真菌剂、污垢悬浮剂、污垢释放聚合物、抗再沉积剂、酶抑制剂或稳定剂、酶激活剂、抗氧化剂以及增溶剂。该洗涤剂组合物可以包括一种或多种任何类型的洗涤剂组分。
洗涤剂组合物：术语“洗涤剂组合物”是指用于从有待清洁的物品(例如纺织品、餐具和硬表面)去除不希望的化合物的组合物。该洗涤剂组合物可以用于例如清洁纺织品、餐具以及硬表面，用于家用清洁剂和工业清洁二者。这些术语涵盖选择用于希望的具体类型的清洁组合物和产品的形式(例如，液体、凝胶、粉末、颗粒、糊状、或喷雾组合物)的任何材料/化合物，并且包括但不限于洗涤剂组合物(例如，液体和/或固体衣物洗涤剂和精细织物洗涤剂；硬表面清洁配制品，例如用于玻璃、木材、陶瓷以及金属台面和窗户；地毯清洁剂；炉灶清洁剂；织物清新剂；织物柔软剂；以及纺织品和衣物预去污剂(pre-spotter)，连同餐具洗涤剂)。除了包含本发明的GH9内切葡聚糖酶和/或本发明的黄原胶裂解酶之外，该洗涤剂配制品还可以包含一种或多种另外的酶(例如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、角质酶、纤维素酶、内切葡聚糖酶、木葡聚糖酶、果胶酶、果胶裂解酶、黄原胶酶、过氧化物酶、卤代加过氧酶(haloperoxygenase)、过氧化氢酶以及甘露聚糖酶，或其任何混合物)，和/或组分，例如表面活性剂、助洗剂、螯合剂(chelator)或螯合试剂(chelating agent)、漂白系统或漂白组分、聚合物、织物调理剂、泡沫促进剂、泡沫抑制剂、染料、香料、晦暗抑制剂、光学增亮剂、杀细菌剂、杀真菌剂、污垢悬浮剂、防蚀剂、酶抑制剂或稳定剂、酶激活剂、一种或多种转移酶、水解酶、氧化还原酶、上蓝剂以及荧光染料、抗氧化剂、和增溶 剂。
餐具洗涤：术语“餐具洗涤”是指所有形式的洗涤餐具，例如手动或自动餐具洗涤。洗涤餐具包括但不限于，清洁所有形式的陶器，例如盘子、杯子、玻璃杯、碗，所有形式的用餐工具，例如匙、刀、叉，以及上菜用具连同陶瓷，塑料，金属，瓷器，玻璃及丙烯酸酯。
餐具洗涤组合物：术语“餐具洗涤组合物”是指用于清洁硬表面的所有形式的组合物。本发明不局限于任何具体类型的餐具洗涤组合物或任何具体洗涤剂。
表达：术语“表达”包括涉及多肽产生的任何步骤，包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰以及分泌。
表达载体：术语“表达载体”意指线性或环状DNA分子，该分子包含编码多肽的多核苷酸并且该多核苷酸可操作地与提供用于其表达的控制序列相连接。
片段：术语“片段”是指具有不存在于成熟多肽或结构域的氨基和/或羧基末端的一个或多个(例如，若干个)氨基酸的多肽或催化模块或碳水化合物结合模块；其中该片段具有甘露聚糖酶的或碳水化合物结合的活性。在一方面，片段包含至少521个氨基酸残基(例如，SEQ ID NO:2的氨基酸11至531)、或至少531个氨基酸残基(例如，SEQ ID NO:2的氨基酸6至536)，其中该片段具有甘露聚糖酶活性。在另一方面，片段包含至少506个氨基酸残基(例如，SEQ ID NO:5的氨基酸11至516)、或至少516个氨基酸残基(例如，SEQ ID NO:5的氨基酸6至521)，其中该片段具有甘露聚糖酶活性。
硬表面清洁：在此将术语“硬表面清洁”定义为清洁硬表面，其中硬表面可以包括地板、桌子、墙壁、屋顶等，连同硬物体的表面，例如汽车(汽车洗涤)和餐具(餐具洗涤)。餐具洗涤包括但不限于，清洁盘子、杯子、玻璃杯、碗、及刀具(例如匙、刀、叉)、上菜用具、陶瓷、塑料、金属、瓷器、玻璃及丙烯酸酯。
半纤维素分解酶或半纤维素酶：术语“半纤维素分解酶”或“半纤维素酶”意指水解半纤维素材料的一种或多种(例如，若干种)酶。参见例如，沙鲁姆(Shallom)和沙哈姆(Shoham)，微生物学当前观点(Current Opinion In Microbiology)，2003,6(3):219-228)。半纤维素酶是在植物生物质的降解中的关键组分。半纤维素酶的实例包括但不限于，乙酰基甘露聚糖酯酶、乙酰基木聚糖酯酶、阿拉伯聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、香豆酸酯酶、阿魏酸酯酶、半乳糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶、葡糖醛酸酯酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、木聚糖酶以及木糖苷酶。这些酶的底物半纤维素是支链和直链多糖的异质性组，其可通过氢键与植物细胞壁中的纤维素微纤维相结合，交联成坚固的网络。半纤维素还共价附接至木质素，从而与纤维素一起 形成高度复杂的结构。半纤维素的可变结构和组织要求许多酶的协同作用以使其完全降解。半纤维素酶的催化模块是水解糖苷键的糖苷水解酶(GH)，或是水解乙酸或阿魏酸侧基的酯键的碳水化合物酯酶(CE)。这些催化模块基于它们一级序列的同源性，可以被分配到GH和CE家族中。具有总体相似的折叠的一些家族可以进一步被分组为以字母标记的氏族(例如，GH-A)。这些和其他碳水化合物活性酶的最具信息性和最新的分类可在碳水化合物活性酶(Carbohydrate-Active Enzymes)(CAZy)数据库中获得。可以根据高斯(Ghose)和比赛亚(Bisaria)，1987，纯粹与应用化学(Pure&AppI.Chem.)59:1739-1752，在合适的温度(如40℃-80℃，例如50℃、55℃、60℃、65℃或70℃)以及合适的pH(如4-9，例如5.0、5.5、6.0、6.5、或7.0)下测量半纤维素分解酶活性。
宿主细胞：术语“宿主细胞”意指易于用包含本发明的多核苷酸的核酸构建体或表达载体转化、转染、转导等的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间发生的突变而与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。
分离的：术语“分离的”意指处于自然界中不存在的形式或环境中的物质。分离的物质的非限制性实例包括(1)任何非天然存在的物质，(2)包括但不限于任何酶、变体、核酸、蛋白、肽或辅因子的任何物质，该物质至少部分地从与其本质相关的一种或多种或所有天然存在的成分中去除；(3)相对于天然发现的物质通过人工修饰的任何物质；或(4)通过相对于与其天然相关的其他组分，增加物质的量而修饰的任何物质(例如宿主细胞中的重组产生；编码该物质的基因的多个拷贝；以及比与编码该物质的基因天然相关联的启动子更强的启动子的使用)而修饰的任何物质。通过培养表达本发明的多核苷酸的重组宿主细胞产生的发酵液将包含处于分离形式的本发明的多肽。
洗衣：术语“洗衣”涉及家用洗衣和工业洗衣两者并且意指用包含本发明的清洁或洗涤剂组合物的溶液处理纺织品的过程。洗衣过程可以例如使用例如家用或工业洗衣机进行或可以手动进行。
甘露聚糖酶：术语“甘露聚糖酶”意指具有催化甘露聚糖、半乳甘露聚糖、葡甘露聚糖中的1,4-β-D-甘露糖苷键的水解的甘露聚糖内切-1,4-β-甘露糖苷酶活性(EC3.2.1.78)的多肽。甘露聚糖内切-1,4-β-甘露糖苷酶的别名是：1,4-β-D-甘露聚糖的甘露聚糖水解酶；内切-1,4-β-甘露聚糖酶；内切-β-1,4-甘露聚糖酶；β-甘露聚糖酶B；β-1,4-甘露聚糖4-甘露聚糖水解酶；内切-β-甘露聚糖酶；和β-D-甘露聚糖酶。出于本发明的目的，可使用如实验部分中所述的还原端测定来确定甘露聚糖酶活性。在一方面，本发明的这些多肽具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的和/或SEQ ID NO:5的成熟多肽的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％ 或至少100％的甘露聚糖酶活性。
成熟多肽：术语“成熟多肽”意指在翻译和任何翻译后修饰例如N-末端加工、C-末端截短、糖基化作用、磷酸化作用等之后处于其最终形式的多肽。在一方面，成熟多肽是SEQID NO:2的氨基酸1至541或SEQ ID NO:3的氨基酸1至541。SEQ ID NO:2的氨基酸1至20是信号肽。在一方面，成熟多肽是SEQ ID NO:2的氨基酸121至541。在另一方面，成熟多肽是SEQID NO:5的氨基酸1至525或SEQ ID NO:6的氨基酸1至525。SEQ ID NO:5的氨基酸-26至-1是信号肽。
在优选方面，成熟多肽是SEQ ID NO:5的氨基酸1至526或SEQ ID NO:6的氨基酸1至526。
本领域已知，一个宿主细胞可以产生由同一多核苷酸表达的两种或更多种不同成熟多肽(即，具有不同C-末端和/或N-末端氨基酸)的混合物。本领域还已知，不同的宿主细胞不同地加工多肽，并且因此表达多核苷酸的宿主细胞当与另表达相同多核苷酸的宿主细胞相比时可以产生不同的成熟多肽(例如，具有不同的C-末端和/或N-末端氨基酸)。
成熟多肽编码序列：术语“成熟多肽编码序列”是指编码具有甘露聚糖酶活性的成熟多肽的多核苷酸。在一方面，基于预测SEQ ID NO:1的核苷酸1至60编码信号肽的SignalP(尼尔森等人，1997，同上)程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:1的核苷酸61至1731或其cDNA序列。在另一方面，基于预测SEQ ID NO:4的核苷酸1至63编码信号肽的SignalP程序(尼尔森等人，1997，同上)，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:1的核苷酸79至1885或其cDNA序列。
恶臭：术语“恶臭”意指在清洁物品上不希望的气味。清洁的物品应气味清新并且干净，而没有附着在该物品上的恶臭。恶臭的一个实例是具有使人不愉快的气味的化合物，这些化合物可以是微生物产生的。另一实例是附着至已经与人类或动物接触的物品的汗水或体味。恶臭的另一实例可以是来自多种香料的气味，例如附着至物品(例如一件纺织品)的咖喱或其他外来香料。测量物品附着恶臭的能力的一个方式是通过使用恶臭测定。
核酸构建体：术语“核酸构建体”意指单链-或双-链的核酸分子，该核酸分子是从天然存在的基因中分离的，或以本来不存在于自然界中的方式被修饰成含有核酸的区段，或是合成的，该核酸分子包括一个或多个控制序列。
可操作地连接：术语“可操作地连接”意指如下的构造，其中，控制序列相对于多核苷酸的编码序列安置在适当位置，从而使得该控制序列指导该编码序列的表达。
预处理的玉米秸杆：术语“预处理的玉米秸杆”或“PCS”意指通过热和稀硫酸处理、碱预处理、中性预处理、或本领域已知的任何预处理从玉米 秸杆得到的纤维素材料。
序列一致性：两个氨基酸序列之间或者两个核苷酸序列之间的关联度通过参数“序列一致性”来描述。出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件，赖斯(Rice)等人，2000，遗传学趋势(Trends Genet.)16:276-277)(优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔程序中所实施的尼德尔曼-翁施算法(尼德尔曼(Needleman)和翁施(Wunsch)，1970，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)48:443-453)来确定两个氨基酸序列之间的序列一致性。所使用的参数是空位开放罚分10，空位延伸罚分0.5，以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。尼德尔标注的“最长的一致性”的输出(使用-非简化选项获得)被用作百分比一致性，并且计算如下：
(一致的残基×100)/(比对长度-比对中的空位总数)
出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件，赖斯(Rice)等人，2000，同上)(优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔程序中所实施的尼德尔曼-翁施算法(尼德尔曼(Needleman)和翁施(Wunsch)，1970，同上)来确定两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列一致性。所使用的参数是空位开放罚分10，空位延伸罚分0.5，以及EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版)取代矩阵。尼德尔标注的“最长的一致性”的输出(使用-非简化选项获得)被用作百分比一致性，并且计算如下：
(一致的脱氧核糖核苷酸×100)/(比对长度-比对中的空位总数)
严谨度条件严格：不同的严格条件定义如下。
术语“非常低严格条件”意指对于至少100个核苷酸长度的探针，按照标准DNA印迹程序在42℃于5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切和变性的鲑精DNA和25％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用1.6X SSC、0.2％SDS，在60℃下洗涤三次，每次15分钟。
术语“低严格条件”意指对于至少100个核苷酸长度的探针，按照标准DNA印迹程序在42℃于5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切和变性的鲑精DNA和25％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用0.8X SSC、0.2％SDS，在60℃下洗涤三次，每次15分钟。
术语“中严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下于5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA以及35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用0.8X SSC、0.2％SDS，在65℃下洗涤三次，每次15分钟。
术语“中-高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下于5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切 并变性的鲑鱼精子DNA以及35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用0.4X SSC、0.2％SDS，在65℃下洗涤三次，每次15分钟。
术语“高严格条件”意指对于至少100个核苷酸长的探针来说，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下于5×SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切且变性的蛙鱼精子DNA以及50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用0.2X SSC、0.2％SDS，在65℃下洗涤三次，每次15分钟。
术语“非常高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用0.2X SSC、0.2％SDS，在70℃下洗涤三次，每次15分钟。
子序列：术语“子序列”是指具有从成熟多肽编码序列的5’和/或3’端缺失的一个或多个(例如，若干个)核苷酸的多核苷酸；其中该子序列编码具有甘露聚糖酶活性的片段。在一方面，子序列包含至少1611个核苷酸(例如SEQ ID NO:1的核苷酸91至1701或其cDNA序列)，或至少1641个核苷酸(例如SEQ ID NO:1的核苷酸76至1716或其cDNA序列)。在另一方面，子序列包含至少1747个核苷酸(例如SEQ ID NO:4的核苷酸109至1855或其cDNA序列)，或至少1777个核苷酸(例如SEQ ID NO:4的核苷酸94至1870或其cDNA序列)。
纺织品：术语“纺织品”意指包括纱线、纱线中间体、纤维、非机织物材料、天然材料、合成材料、以及任何其他纺织品材料的任何纺织品材料，这些材料制造的织物和由这些织物制成的产品(例如服装和其他物品)。该纺织品或织物可以处于针织品、机织物、牛仔布、非机织物、毡、纱线、以及毛巾布的形式。这些纺织品可以是纤维素基的，如天然纤维素，包括棉布、亚麻/亚麻布、黄麻、苎麻、剑麻或椰壳纤维或者人造纤维素(例如，来源于木浆)，包括纤维胶/人造丝、苎麻、醋酸纤维素纤维(三胞)、莱赛尔纤维(lyocell)或其共混物。纺织品或织物也可以不基于纤维素，如天然聚酰胺，包括羊毛、驼毛、羊绒、马海毛、兔毛和蚕丝或合成聚合物如尼龙、芳族聚酰胺、聚酯、丙烯酸、聚丙烯和氨纶/弹性纤维(spandex/elastane)、或其共混物其以及基于纤维素和不基于纤维素的纤维的共混物。共混物的例子是棉和/或人造丝/纤维胶与一种或多种伴随材料的共混物，该伴随材料例如是羊毛、合成纤维(例如聚酰胺纤维、丙烯酸纤维、聚酯纤维、聚乙烯醇纤维、聚氯乙烯纤维、聚亚胺酯纤维、聚脲纤维、芳族聚酰胺纤维)以及含纤维素的纤维(例如人造丝/纤维胶、苎麻、亚麻/亚麻布、黄麻、醋酸纤维素纤维、莱赛尔纤维)。织物可以是常规的可洗涤衣物，例如玷污的家居衣物。当使用术语织物或服装时，旨在也包括广义术语纺织品。
变体：术语“变体”意指在一个或多个(若干个)位置包含改变(即， 一个或多个(若干个)氨基酸残基取代、插入和/或缺失)的具有蛋白酶活性的多肽。取代意指用一个不同氨基酸置换占用一个位置的氨基酸；缺失意指去除占据一个位置的氨基酸；并且插入意指邻近占据一个位置的氨基酸添加1-3个氨基酸。本发明的这些变体具有SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:6的多肽或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:5的成熟多肽的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少100％的甘露聚糖酶活性。
本发明详细说明
具有甘露聚糖酶活性的多肽
本发明涉及与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性的多肽，这些多肽具有甘露聚糖酶活性。
本发明进一步涉及与SEQ ID NO:3具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性的多肽，这些多肽具有甘露聚糖酶活性。
在一个实施例中，这些多肽与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少70％一致性。
在一个实施例中，这些多肽与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少75％一致性。
在一个实施例中，这些多肽与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少80％一致性。
在一个实施例中，这些多肽与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少81％一致性。
在一个实施例中，这些多肽与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少82％一致性。
在一个实施例中，这些多肽与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少83％一致性。
在一个实施例中，这些多肽与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少84％一致性。
在一个实施例中，这些多肽与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少85％一致性。
在一个实施例中，这些多肽与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少86％一致性。
在一个实施例中，这些多肽与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少87％一致性。
在一个实施例中，这些多肽与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少88％一致性。
在一个实施例中，这些多肽与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少89％一致性。
在一个实施例中，这些多肽与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少90％一致性。
在一个实施例中，这些多肽与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少91％一致性。
在一个实施例中，这些多肽与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少92％一致性。
在一个实施例中，这些多肽与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少93％一致性。
在一个实施例中，这些多肽与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少94％一致性。
在一个实施例中，这些多肽与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少95％一致性。
在一个实施例中，这些多肽与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少96％一致性。
在一个实施例中，这些多肽与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少97％一致性。
在一个实施例中，这些多肽与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少98％一致性。
在一个实施例中，这些多肽与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少99％一致性。
在一方面，这些多肽与SEQ ID NO:3的多肽相差不多于三十个氨基酸，例如，相差二十五个氨基酸、相差二十个氨基酸、相差十五个氨基酸、相差十二个氨基酸、相差十个氨基酸、相差九个氨基酸、相差八个氨基酸、相差七个氨基酸、相差六个氨基酸、相差五个氨基酸、相差四个氨基酸、相差三个氨基酸、相差两个氨基酸、以及相差一个氨基酸。在另一方面，这些多肽与SEQ ID NO:2的成熟多肽相差不多于三十个氨基酸，例如，相差二十五个氨基酸、相差二十个氨基酸、相差十五个氨基酸、相差十二个氨基酸、相差十个氨基酸、相差九个氨基酸、相差八个氨基酸、相差七个氨基酸、相差六 个氨基酸、相差五个氨基酸、相差四个氨基酸、相差三个氨基酸、相差两个氨基酸、以及相差一个氨基酸。
在一个实施例中，该多肽已经被分离。本发明的多肽优选地包括SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的氨基酸序列或其等位基因变体或由其组成；或为其具有甘露聚糖酶活性的片段。在另一方面，该多肽包括SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:2的成熟多肽或由其组成。在另一方面，该多肽包括SEQ ID NO:2的氨基酸1至541或SEQ ID NO:3的氨基酸1至541或由其组成。
本发明进一步涉及与SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少81％，例如至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性的多肽，这些多肽具有甘露聚糖酶活性。
本发明进一步涉及与SEQ ID NO:5具有至少81％，例如至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性的多肽，这些多肽具有甘露聚糖酶活性。
在一个实施例中，这些多肽与SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:5的成熟多肽具有至少82％一致性。
在一个实施例中，这些多肽与SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:5的成熟多肽具有至少83％一致性。
在一个实施例中，这些多肽与SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:5的成熟多肽具有至少84％一致性。
在一个实施例中，这些多肽与SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:5的成熟多肽具有至少85％一致性。
在一个实施例中，这些多肽与SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:5的成熟多肽具有至少86％一致性。
在一个实施例中，这些多肽与SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:5的成熟多肽具有至少87％一致性。
在一个实施例中，这些多肽与SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:5的成熟多肽具有至少88％一致性。
在一个实施例中，这些多肽与SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:5的成熟多肽具有至少89％一致性。
在一个实施例中，这些多肽与SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:5的成熟多肽具有至少90％一致性。
在一个实施例中，这些多肽与SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:5的成熟多肽 具有至少91％一致性。
在一个实施例中，这些多肽与SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:5的成熟多肽具有至少92％一致性。
在一个实施例中，这些多肽与SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:5的成熟多肽具有至少93％一致性。
在一个实施例中，这些多肽与SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:5的成熟多肽具有至少94％一致性。
在一个实施例中，这些多肽与SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:5的成熟多肽具有至少95％一致性。
在一个实施例中，这些多肽与SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:5的成熟多肽具有至少96％一致性。
在一个实施例中，这些多肽与SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:5的成熟多肽具有至少97％一致性。
在一个实施例中，这些多肽与SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:5的成熟多肽具有至少98％一致性。
在一个实施例中，这些多肽与SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:5的成熟多肽具有至少99％一致性。
在一方面，这些多肽与SEQ ID NO:6的多肽相差不多于三十个氨基酸，例如，相差二十五个氨基酸、相差二十个氨基酸、相差十五个氨基酸、相差十二个氨基酸、相差十个氨基酸、相差九个氨基酸、相差八个氨基酸、相差七个氨基酸、相差六个氨基酸、相差五个氨基酸、相差四个氨基酸、相差三个氨基酸、相差两个氨基酸、以及相差一个氨基酸。在另一方面，这些多肽与SEQ ID NO:5的成熟多肽相差不多于三十个氨基酸，例如，相差二十五个氨基酸、相差二十个氨基酸、相差十五个氨基酸、相差十二个氨基酸、相差十个氨基酸、相差九个氨基酸、相差八个氨基酸、相差七个氨基酸、相差六个氨基酸、相差五个氨基酸、相差四个氨基酸、相差三个氨基酸、相差两个氨基酸、以及相差一个氨基酸。
在一个实施例中，该多肽已经被分离。本发明的多肽优选地包括SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6的氨基酸序列或其等位基因变体或由其组成；或为其具有甘露聚糖酶活性的片段。在另一方面，该多肽包括SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:5的成熟多肽或由其组成。在另一方面，该多肽包括SEQ ID NO:5的氨基酸1至541或SEQ ID NO:6的氨基酸1至541或由其组成。
在另一实施例中，本发明涉及由以下多核苷酸编码的具有甘露聚糖酶活性的多肽，该多核苷酸在非常低严格条件、低严格条件、中严格条件、中-高严格条件、高严格条件、或非常高严格条件下与以下各项杂交：(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列，(ii)其cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补体 (萨姆布鲁克(Sambrook)等人，1989，分子克隆实验指南(Molecular Cloning,A Laboratory Manual)，第二版，冷泉港(Cold SpringHarbor)，纽约)。在一个实施例中，该多肽已经被分离。
在另一实施例中，本发明涉及由以下多核苷酸编码的具有甘露聚糖酶活性的多肽，该多核苷酸在中严格条件、中-高严格条件、高严格条件、或非常高严格条件下与以下各项杂交：(i)SEQ ID NO:4的成熟多肽编码序列，(ii)其cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补体(萨姆布鲁克(Sambrook)等人，1989，分子克隆实验指南(Molecular Cloning,ALaboratory Manual)，第二版，冷泉港(Cold Spring Harbor)，纽约)。在一个实施例中，该多肽已经被分离。
可以使用SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4或其子序列，连同SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6的多肽或其片段来设计核酸探针以便根据本领域熟知的方法鉴定和克隆编码来自不同属或物种的菌株的具有甘露聚糖酶活性的多肽的DNA。具体而言，可以遵循标准DNA印迹程序，使用此类探针与感兴趣的细胞的基因组DNA或cDNA杂交，以便鉴定和分离其中的对应基因。此类探针可以明显短于完整序列，但是长度应为至少15，例如至少25、至少35、或至少70个核苷酸。优选地，核酸探针的长度为至少100个核苷酸，例如长度为至少200个核苷酸、至少300个核苷酸、至少400个核苷酸、至少500个核苷酸、至少600个核苷酸、至少700个核苷酸、至少800个核苷酸或至少900个核苷酸。DNA和RNA探针二者均可使用。典型地将探针进行标记(例如，用32P、3H、35S、生物素、或抗生物素蛋白)，以检测相应的基因。本发明涵盖此类探针。
可以针对与以上描述的探针杂交并且编码具有甘露聚糖酶活性的多肽的DNA对由这类其他菌株制备的基因组DNA或cDNA库进行筛选。来自此类其他菌株的基因组DNA或其他DNA可以通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳、或其他分离技术来分离。来自文库的DNA或分离的DNA可转移到并固定在硝酸纤维素或其他适合的载体材料上。为了鉴定与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4或其子序列杂交的克隆或DNA，将载体材料用于DNA印迹中。
出于本发明的目的，杂交是指，在非常低到非常高严格条件下，多核苷酸杂交到对应于以下的标记的核酸探针上：(i)SEQ ID NO:1；(ii)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列；(iii)其cDNA序列，(iv)其全长互补体；或(v)其子序列；该杂交是在非常低至非常高严格条件下进行，或杂交到(i)SEQ ID NO:4；(ii)SEQ ID NO:4的成熟多肽编码序列；(iii)其cDNA序列，(iv)其全长互补体；或(v)其子序列；该杂交是在非常高严格条件下进行。可以使用例如X-射线胶片或本领域已知的任何其他检测手段来检测在这些条件下核酸探针杂交的分子。
在一方面，核酸探针是SEQ ID NO:1的核苷酸91至1701或核苷酸76至1716或其cDNA序列。在另一方面，核酸探针是编码以下项的多核苷酸：SEQ ID NO:2的多肽；其成熟多肽；或其片段。在另一方面，核酸探针是SEQ ID NO:1或其cDNA序列。在另一方面，核酸探针是SEQ ID NO:4的核苷酸109至1885或核苷酸94至1870或其cDNA序列。在另一方面，核酸探针是编码以下项的多核苷酸：SEQ ID NO:5的多肽；其成熟多肽；或其片段。在另一方面，核酸探针是SEQ ID NO:4或其cDNA序列。
在另一实施例中，本发明涉及具有甘露聚糖酶活性的多肽，该多肽由与SEQ IDNO:1的成熟多肽编码序列具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性的多核苷酸编码。在另外的实施例中，该多肽已经被分离。
在另一实施例中，本发明涉及具有甘露聚糖酶活性的多肽，该多肽由与SEQ IDNO:4的成熟多肽编码序列具有至少81％，例如至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性的多核苷酸编码。在另外的实施例中，该多肽已经被分离。
在另一实施例中，本发明涉及在一个或多个(例如若干个)位置处包含取代、缺失、和/或插入的SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:2的成熟多肽的变体。在一个实施例中，引入SEQ IDNO:2的成熟多肽中的氨基酸取代、缺失和/或插入的数目多达10个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个。在一个实施例中，引入SEQ ID NO:3的氨基酸取代、缺失和/或插入的数目多达10个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个。在另一实施例中，本发明涉及在一个或多个(例如若干个)位置处包含取代、缺失、和/或插入的SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:5的成熟多肽的变体。在一个实施例中，引入SEQ ID NO:5的成熟多肽中的氨基酸取代、缺失和/或插入的数目多达10个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个。在一个实施例中，引入SEQ ID NO:6的氨基酸取代、缺失和/或插入的数目多达10个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个。这些氨基酸变化可以具有微小性质，即，不会显著地影响蛋白的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入；小缺失，典型地为1-30个氨基酸；小的氨基-末端的或羧基末端的延伸，例如氨基端甲硫氨酸残基；高达20-25个残基的小连接肽；或通过改变净电荷或另一功能，例如聚组氨酸段、抗原表位或结合域，有利于纯化的小的延伸。
保守取代的实例是在下组的范围内：碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸及组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸及缬氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸)及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸及甲硫氨酸)。一般不会改变比活性的氨基酸取代是本领域已知的并且例如由H.诺伊拉特(Neurath)和R.L.希尔(Hill)，1979在蛋白质(The Proteins)，学术出版社(Academic Press)，纽约中描述。常见的取代是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、和Asp/Gly。
可替代地，氨基酸改变具有这样的性质：改变多肽的物理化学特性。例如，氨基酸改变可以改进多肽的热稳定性、改变底物特异性、改变最适pH，等。
可以根据本领域中已知的程序，如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(Cunningham(坎宁汉)和Wells(威尔斯)，1989，Science(科学)244:1081-1085)来鉴定多肽中的必需氨基酸。在后一项技术中，在该分子中的每一残基处引入单个丙氨酸突变，并且对所得突变体分子的甘露聚糖酶活性进行测试以鉴别对于该分子的活性至关重要的氨基酸残基。还参见希尔顿(Hilton)等人，1996，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)，271:4699-4708。也可结合假定接触位点氨基酸的突变，如通过以下技术例如核磁共振、结晶学、电子衍射、或光亲和标记进行确定的对结构进行物理学分析，从而确定酶的活性位点或其他生物学相互作用。参见，例如德沃斯(de Vos)等人，1992，科学(Science)255:306-312；史密斯(Smith)等人，1992，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)224:899-904；乌乐达维尔(Wlodaver)等人，1992，欧洲生物化学学会联盟通讯(FEBS Lett.)309:59-64。还可以从与相关多肽的比对推断鉴定必需氨基酸。必需氨基酸位于SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的氨基酸序列1至541中的位置Glu293和Glu386，以及位于SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6的氨基酸序列1至525中的位置Glu299和Glu389。
可以做出单个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入并且使用诱变、重组和/或改组的已知方法进行测试，随后进行相关筛选程序，如由里德哈尔-奥尔森(Reidhaar-Olson)和萨奥尔(Sauer)，1988，科学(Science)241:53-57；博维(Bowie)和萨奥尔，1989，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)86:2152-2156；WO 95/17413；或WO 95/22625披露的那些。可以使用的其他方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如，洛曼(Lowman)等人，1991，生物化学(Biochemistry)30:10832-10837；美国专利号5,223,409；WO 92/06204)以及区域定向诱变(德比什尔(Derbyshire)等人，1986，基 因(Gene)46:145；内尔(Ner)等人，1988，DNA7:127)。
可以结合诱变/改组方法与高通量自动化筛选方法来检测由宿主细胞表达的克隆的、诱变的多肽的活性(内斯(Ness)等人，1999，自然生物技术(Nature Biotechnology)17:893-896)。编码活性多肽的诱变的DNA分子可以回收自宿主细胞，并且使用本领域的标准方法对其进行迅速测序。这些方法允许迅速确定多肽中单个氨基酸残基的重要性。
该多肽可以是杂合多肽，其中一种多肽的区域在另一种多肽的区域的N-末端或C-末端处融合。
该多肽可以是融合多肽或可裂解的融合多肽，其中另一种多肽在本发明多肽的N-末端或C-末端处融合。通过将编码另一多肽的多核苷酸融合到本发明的多核苷酸而产生融合多肽。用于产生融合多肽的技术在本领域是已知的，并且包括连接编码多肽的编码序列，这样使得它们在框内并且使得融合多肽的表达处于相同的一个或多个启动子和终止子的控制下。融合多肽还可以使用内含肽技术来构建，其中融合多肽在翻译后产生(库珀(Cooper)等人，1993，欧洲分子生物学学会杂志(EMBO J.)12:2575-2583；道森(Dawson)等人，1994，科学(Science)266:776-779)。
融合多肽可以在两种多肽之间进一步包括切割位点。在融合蛋白分泌之时，该位点被裂解，从而释放出这两种多肽。切割位点的实例包括但不限于以下各项中披露的位点：马丁(Martin)等人，2003，工业微生物学与生物技术杂志(J.Ind.Microbiol.Biotechnol.)3:568-576；斯韦蒂纳(Svetina)等人，2000，生物技术杂志(J.Biotechnol.)76:245-251；拉斯马森(Rasmussen)-威尔逊(Wilson)等人，1997，应用环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)63:3488-3493；华德(Ward)等人，1995，生物技术(Biotechnology)13:498-503；以及孔特拉斯(Contreras)等人，1991，生物技术9:378-381；伊顿(Eaton)等人，1986，生物化学(Biochemistry)25:505-512；柯林斯(Collins)-莱斯(Racie)等人，1995，生物技术13:982-987；卡特(Carter)等人，1989，蛋白：结构、功能和遗传学(Proteins：Structure，Function，and Genetics)6:240-248；以及史蒂文斯(Stevens)，2003，世界药物发现(Drug Discovery World)4:35-48。
具有甘露聚糖酶活性多肽的来源
本发明的具有甘露聚糖酶活性的多肽可以从任何属的微生物获得。出于本发明的目的，如在此结合给定的来源使用的术语“从…中获得”应意指由多核苷酸编码的多肽是由该来源或者由其中已经插入来自该来源的多核苷酸的菌株产生的。在一方面，从给定来源获得的多肽被分泌到细胞外。
该多肽可以是一种真菌多肽。例如，该多肽可以是来自一个门，例如子囊菌门内的具有甘露聚糖酶活性的多肽。在一方面，该多肽是来自盘菌纲的 真菌的甘露聚糖酶，例如来自盘菌目，或来自粪盘菌科，或来自粪盘菌属，或来自Ascobolus stictoideus种。
在另一方面，该多肽可以是来自一个门，例如子囊菌门内的具有甘露聚糖酶活性的多肽。在一方面，该多肽是来自粪壳菌纲的真菌的甘露聚糖酶，例如来自粪壳菌目，或来自毛壳菌科，或来自毛壳属，或来自绿毛壳种。
将理解的是，对于上述种类而言，本发明涵盖完全状态和不完全状态两者、以及其他分类学等效物，例如无性型，而忽略它们为人所知的种类名称。本领域的普通技术人员将容易地识别适当等效物的身份。
这些物种的菌株对公众来说是易于在一些培养物保藏中心得到的，如美国典型培养物保藏中心(ATCC)、德意志微生物保藏中心(DSMZ)、真菌菌种保藏中心(CBS)和农业研究服务专利培养物保藏所，北方地区研究中心(NRRL)。
可以使用以上提到的探针从其他来源，包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分离的微生物或直接从自然材料(例如，土壤、堆肥、水等)获得的DNA样品鉴定和获得该多肽。用于从自然生活环境中直接分离微生物和DNA的技术是本领域熟知的。然后可以通过类似地筛选另一微生物的基因组DNA或cDNA文库或混合的DNA样品来获得编码该多肽的多核苷酸。一旦用一种或多种探针检测到编码多肽的多核苷酸，就可以通过使用本领域普通技术人员已知的技术分离或克隆该多核苷酸(参见例如，萨姆布鲁克(Sambrook)等人，1989，同上)。
催化结构域
在一个实施例中，本发明还涉及与SEQ ID NO:2的氨基酸128至446具有至少65％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性的催化结构域。在一方面，这些催化结构域包括的氨基酸序列与SEQ ID NO:2的氨基酸128至446具有多达10个(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、或10个)氨基酸的差异。
该催化结构域优选地包括或其组成为SEQ ID NO:2的氨基酸128到446或其等位基因变体；或为其具有甘露聚糖酶活性的片段。
在另一个实施例中，本发明还涉及在非常低严格条件、低严格条件、中严格条件、中-高严格条件、高严格条件、或非常高严格条件下(如上所定义)与(i)SEQ ID NO:1的核苷酸490到1446、(ii)其cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补体杂交的多核苷酸编码的催化结构域(萨拉布鲁克等人，1989，同上)。
在另一实施例中，本发明还涉及由与SEQ ID NO:1的核苷酸490至1446或其cDNA序列具有至少65％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性的多核苷酸编码的催化结构域。
在另一个实施例中，本发明还涉及SEQ ID NO:2的氨基酸128至446的催化结构域变体，这些变体在一个或多个(例如若干个)位置处包括取代、缺失、和/或插入。在一方面，引入SEQ ID NO:2的氨基酸128至446的序列中的氨基酸取代、缺失和/或插入的数目多达10个，例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、8个、9个、或10个。
在第二个实施例中，本发明还涉及与SEQ ID NO:5的氨基酸135至448具有至少87％，例如至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性的催化结构域。在一方面，这些催化结构域包括的氨基酸序列与SEQ ID NO:5的氨基酸135至448具有多达10个(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、或10个)氨基酸的差异。
该催化结构域优选地包括或其组成为SEQ ID NO:5的氨基酸128到446或其等位基因变体；或为其具有甘露聚糖酶活性的片段。
在另一实施例中，本发明还涉及由在中-高严格条件、高严格条件或非常高严格条件(如以上所定义)下与(i)SEQ ID NO:4的核苷酸599到1651、(ii)其cDNA序列、或(iii)(i)或(ii)的全长互补体杂交的多核苷酸所编码的催化结构域(萨姆布鲁克等，1989，同上)。
在另一实施例中，本发明还涉及由与SEQ ID NO:4的核苷酸599至1651或其cDNA序列具有至少65％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性的多核苷酸编码的催化结构域。
在另一个实施例中，本发明还涉及SEQ ID NO:5的氨基酸135至448的催化结构域变体，这些变体在一个或多个(例如若干个)位置处包括取代、缺失、和/或插入。在一方面，引入SEQ ID NO:5的氨基酸135至448的序列中的氨基酸取代、缺失和/或插入的数目多达10个，例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、8个、9个、或10个。
结合结构域
在一个实施例中，本发明还涉及与SEQ ID NO:2的氨基酸1至124具有至 少65％，例如至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性的碳水化合物结合模块。在一方面，这些碳水化合物结合模块包括的氨基酸序列与SEQ ID NO:2的氨基酸1到124具有多达10个(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、或10个)氨基酸的差异。
该碳水化合物结合模块优选包括或其组成为SEQ ID NO:2的氨基酸1至124或其等位基因变体；或为其具有碳水化合物结合活性的片段。
在另一个实施例中，本发明还涉及在非常低严格条件、低严格条件、中严格条件、中-高严格条件、高严格条件、或非常高严格条件下(如上所定义)与(i)SEQ ID NO:1的核苷酸61到480、(ii)其cDNA序列或(iii)(i)或(ii)的全长互补体杂交的多核苷酸编码的碳水化合物结合模块(萨拉布鲁克等人，1989，同上)。
在另一个实施例中，本发明还涉及由与SEQ ID NO:1的核苷酸61至480或其cDNA序列具有至少65％，例如至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性的多核苷酸编码的碳水化合物结合模块。
在另一个实施例中，本发明还涉及SEQ ID NO:2的氨基酸1到124的碳水化合物结合模块变体，这些变体在一个或多个(例如，若干个)位置处包含取代、缺失和/或插入。在一方面，引入SEQ ID NO:2的氨基酸1至124的序列中的氨基酸取代、缺失和/或插入的数目多达10个，例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、8个、9个、或10个。
在一个实施例中，本发明还涉及与SEQ ID NO:2的氨基酸508到541具有至少80％，例如至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性的碳水化合物结合模块。在一方面，这些碳水化合物结合模块包括的氨基酸序列与SEQ ID NO:2的氨基酸508到541具有多达10个(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、或10个)氨基酸的差异。
该碳水化合物结合模块优选包括或其组成为SEQ ID NO:2的氨基酸508至541或其等位基因变体；或为其具有碳水化合物结合活性的片段。
在另一实施例中，本发明还涉及由在中严格条件、中-高严格条件、高严 格条件或非常高严格条件(如以上所定义)下与(i)SEQ ID NO:1的核苷酸61到480、(ii)其cDNA序列、或(iii)(i)或(ii)的全长互补体杂交的多核苷酸所编码的碳水化合物结合模块(萨姆布鲁克等，1989，同上)。
在另一实施例中，本发明还涉及由与SEQ ID NO:1的核苷酸1630到1731或其cDNA序列具有至少80％，例如至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性的多核苷酸编码的碳水化合物结合模块。
在另一个实施例中，本发明还涉及SEQ ID NO:2的氨基酸1630到1731的碳水化合物结合模块变体，这些变体在一个或多个(例如，若干个)位置处包含取代、缺失和/或插入。在一方面，引入SEQ ID NO:2的氨基酸508至541的序列中的氨基酸取代、缺失和/或插入的数目多达10个，例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、8个、9个、或10个。
在一个实施例中，本发明还涉及与SEQ ID NO:5的氨基酸1到130具有至少82％，例如至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性的碳水化合物结合模块。在一方面，这些碳水化合物结合模块包括的氨基酸序列与SEQ ID NO:5的氨基酸1到130具有多达10个(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、或10个)氨基酸的差异。
该碳水化合物结合模块优选包括或其组成为SEQ ID NO:5的氨基酸1至130或其等位基因变体；或为其具有碳水化合物结合活性的片段。
在另一实施例中，本发明还涉及由在中严格条件、中-高严格条件、高严格条件或非常高严格条件(如以上所定义)下与(i)SEQ ID NO:4的核苷酸82到586、(ii)其cDNA序列、或(iii)(i)或(ii)的全长互补体杂交的多核苷酸所编码的碳水化合物结合模块(萨姆布鲁克等，1989，同上)。
在另一实施例中，本发明还涉及由与SEQ ID NO:4的核苷酸82至586或其cDNA序列具有至少82％，例如至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性的多核苷酸编码的碳水化合物结合模块。
在另一个实施例中，本发明还涉及SEQ ID NO:5的氨基酸1到130的碳水化合物结合模块变体，这些变体在一个或多个(例如，若干个)位置处包含取代、缺失和/或插入。在一方面，引入SEQ ID NO:5的氨基酸1至130的序列中的氨基酸取代、缺失和/或插入的数目多达10个，例如1个、2个、3个、4 个、5个、6个、8个、9个、或10个。
在一个实施例中，本发明还涉及与SEQ ID NO:5的氨基酸492到526具有至少81％，例如至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性的碳水化合物结合模块。在一方面，这些碳水化合物结合模块包括的氨基酸序列与SEQ ID NO:5的氨基酸492到526具有多达10个(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、或10个)氨基酸的差异。
该碳水化合物结合模块优选包括或其组成为SEQ ID NO:5的氨基酸492至526或其等位基因变体；或为其具有碳水化合物结合活性的片段。
在另一个实施例中，本发明还涉及在非常低严格条件、低严格条件、中严格条件、中-高严格条件、高严格条件、或非常高严格条件下(如上所定义)与(i)SEQ ID NO:4的核苷酸1781到1885、(ii)其cDNA序列或(iii)(i)或(ii)的全长互补体杂交的多核苷酸编码的碳水化合物结合模块(萨拉布鲁克等人，1989，同上)。
在另一实施例中，本发明还涉及由与SEQ ID NO:4的核苷酸1781至1885或其cDNA序列具有至少81％，例如至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性的多核苷酸编码的碳水化合物结合模块。
在另一个实施例中，本发明还涉及SEQ ID NO:5的氨基酸492到526的碳水化合物结合模块变体，这些变体在一个或多个(例如，若干个)位置处包含取代、缺失和/或插入。在一方面，引入SEQ ID NO:5的氨基酸492至526的序列中的氨基酸取代、缺失和/或插入的数目多达10个，例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、8个、9个、或10个。
可操作地连接到该碳水化合物结合模块的催化结构域可以来自水解酶、异构酶、连接酶、裂解酶、氧化还原酶或转移酶，例如氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变位酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶或β-木糖苷酶。编码催化结构域的多核苷酸可以从任何原核、真核或其他来源获得。
多核苷酸
本发明还涉及编码如在此所述的本发明的多肽、催化结构域或碳水化合 物结合模块的多核苷酸。在一个实施例中，编码本发明的多肽、催化结构域、或碳水化合物结合模块的多核苷酸已经被分离。
用于分离或克隆多核苷酸的技术是本领域中已知的并且包括从基因组DNA或cDNA、或其组合进行分离。可以例如通过使用熟知的聚合酶链反应(PCR)或表达文库的抗体筛选来检测具有共有结构特征的克隆DNA片段，实现从基因组DNA克隆多核苷酸。参见例如，伊尼斯(Innis)等人，1990，PCR：方法和应用指南(PCR:A Guide to Methods andApplication)，学术出版社(Academic Press)，纽约。可以使用其他核酸扩增程序例如连接酶链式反应(LCR)、连接激活转录(LAT)和基于多核苷酸的扩增(NASBA)。这些多核苷酸可以克隆自粪盘菌属的菌株或相关有机体，并且因此，例如可以是该多核苷酸多肽编码区的等位变体或物种的变体。可替代地，这些多核苷酸可以克隆自毛壳属的菌株或相关有机体，并且因此，例如可以是该多核苷酸多肽编码区的等位变体或物种的变体。
编码本发明多肽的多核苷酸的修饰对于合成基本上类似于该多肽的多肽可以是必需的。术语“基本上类似”于该多肽是指该多肽的非天然存在的形式。这些多肽可能以某种工程化方式而不同于从其天然来源分离的多肽，例如在比活性、热稳定性、最优pH等方面不同的变体。这些变体可以基于以SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4的成熟多肽编码序列、或其cDNA序列(例如其子序列)形式呈现的多核苷酸，和/或通过引入不会改变该多肽的氨基酸序列，但对应于预定用于产生该酶的宿主有机体的密码子用法的核苷酸取代，或通过引入可以产生不同氨基酸序列的核苷酸取代来构建。对于核苷酸取代的一般描述，参见例如福德(Ford)等人，1991，蛋白表达与纯化(Protein Expression and Purification)2:95-107。
核酸构建体
本发明还涉及核酸构建体，这些核酸构建体包含可操作地连接至一个或多个控制序列的本发明的多核苷酸，在与控制序列相容的条件下，这些控制序列指导编码序列在合适的宿主细胞中的表达。
该多核苷酸可以按各种方式操纵以提供该多肽的表达。取决于表达载体，在其插入载体以前操纵多核苷酸可以是希望的或必需的。用于利用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术是本领域熟知的。
该控制序列可以是启动子，即，被宿主细胞识别以对编码本发明的多肽的多核苷酸进行表达的多核苷酸。该启动子包含转录控制序列，这些序列介导了该多肽的表达。该启动子可以是在宿主细胞中显示出转录活性的任何多核苷酸，包括突变型、截短型及杂合型启动子，并且可以是由编码与该宿主细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因获得。
用于在细菌宿主细胞中指导本发明的核酸构建体的转录的合适启动子的 实例是从以下基因中获得的启动子：解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、嗜热脂肪芽孢杆菌麦芽糖淀粉酶基因(amyM)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、苏云金杆菌cryIIIA基因(阿盖塞(Agaisse)和勒尔克吕(Lereclus)，1994，分子微生物学(MolecularMicrobiology)13:97-107)、大肠杆菌lac操纵子、大肠杆菌trc启动子(埃贡(Egon)等人，1988，基因(Gene)69:301-315)、天蓝链霉菌琼脂水解酶基因(dagA)、以及原核β-内酰胺酶基因(维拉-卡马洛夫(Villa-Kamaroff)等人，1978，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)75:3727-3731)以及tac启动子(德波尔(DeBoer)等人，1983，美国国家科学院院刊80:21-25)。其他启动子描述在吉尔伯特(Gilbert)等人，1980，科学美国人(Scientific American)242:74-94的“来自重组细菌的有用蛋白质(Useful proteinsfrom recombinant bacteria)”；以及在萨姆布鲁克(Sambrook)等人，1989，同上。串联启动子的实例披露在WO 99/43835中。
在丝状真菌宿主细胞中，用于指导本发明的核酸构建体的转录的合适启动子的实例是获得自以下各项的基因的启动子：构巢曲霉乙酰胺酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡萄糖淀粉酶(glaA)、米曲霉TAKA淀粉酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、尖镰孢胰蛋白酶-样蛋白酶(WO 96/00787)、镶片镰孢菌淀粉葡糖苷酶(WO 00/56900)、镶片镰孢菌Daria(达莉亚)(WO 00/56900)、镶片镰孢菌Quinn(奎恩)(WO 00/56900)、米黑根毛霉脂肪酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉木聚糖酶III、里氏木霉β-木糖苷酶，以及里氏木霉翻译延伸因子，连同NA2-tpi启动子(来自编码中性α-淀粉酶的曲霉属基因的修饰的启动子，其中已经用来自编码丙糖磷酸异构酶的曲霉属基因的未翻译的前导子替换未翻译的前导子；非限制性实例包括来自编码中性α-淀粉酶的黑曲霉基因的修饰的启动子，其中已经用来自编码丙糖磷酸异构酶的构巢曲霉或米曲霉基因的未翻译的前导子替换未翻译的前导子)；及其突变的、截短的、和杂交的启动子。其他启动子在美国专利号6,011,147中描述。
在酵母宿主中，有用的启动子从以下的基因获得：酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH1、ADH2/GAP)、酿酒酵母丙糖磷酸异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)、以及和酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。罗马诺斯(Romanos)等人，1992，酵母(Yeast)8:423-488描述了酵母宿主细胞的其 他有用的启动子。
控制序列还可以是由宿主细胞识别以终止转录的转录终止子。该终止子可操作地连接到编码该多肽的多核苷酸的3'-末端。在该宿主细胞中起作用的任何终止子都可以用于本发明中。
用于细菌宿主细胞的优选终止子是从克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprH)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(amyL)以及大肠杆菌核糖体RNA(rrnB)的基因获得。
用于丝状真菌宿主细胞的优选终止子是从以下各项的基因获得：构巢曲霉乙酰胺酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉木聚糖酶III、里氏木霉β-木糖苷酶以及里氏木霉翻译延长因子。
用于酵母宿主细胞的优选终止子是从以下各项的基因获得：酿酒酵母烯醇酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)以及酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶。用于酵母宿主细胞的其他有用的终止子由罗马诺斯(Romanos)等人，1992，同上。
该控制序列还可以是在启动子下游并且在基因编码序列上游的mRNA稳定子区域，它增加该基因的表达。
适合的mRNA稳定子区的实例是从以下获得的：苏云金杆菌cryIIIA基因(WO 94/25612)和枯草芽孢杆菌SP82基因(化(Hue)等人，1995，细菌学杂志(Journal ofBacteriology)177:3465-3471)。
该控制序列还可以是一个前导子，一种对宿主细胞翻译很重要的非翻译mRNA区域。该前导子可操作地连接到编码该多肽的多核苷酸的5'-末端。可以使用在宿主细胞中具有功能的任何前导子。
用于丝状真菌宿主细胞的优选前导子是从米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶的基因获得。
适用于酵母宿主细胞的前导子从以下各项的基因获得：酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α因子、以及酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)。
控制序列还可以是聚腺苷酸化序列，可操作地连接至该多核苷酸的3’-末端并且当转录时由宿主细胞识别为将聚腺苷酸残基添加至所转录的mRNA的信号的序列。可以使用在宿主细胞中起作用的任何多腺苷酸化序列。
用于丝状真菌宿主细胞的优选多腺苷酸化序列是从以下各项的基因中获得的：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合成酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷 酶、米曲霉TAKA淀粉酶以及尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。
Guo(郭)和Sherman(谢尔曼)，1995，Mol.Cellular Biol.(《分子与细胞生物学杂志》)15:5983-5990描述了酵母宿主细胞的有用的多腺苷酸化序列。
控制序列也可以是编码与多肽的N-端连接并指导多肽进入细胞的分泌通路的信号肽的信号肽编码区。多核苷酸的编码序列的5’-端可以固有地包括在翻译阅读框架中与编码多肽的编码序列的区段天然地连接的信号肽编码序列。可替代地，编码序列的5’-端可以包括对于该编码序列而言是外源的信号肽编码序列。在编码序列不天然地包含信号肽编码序列的情况下，可能需要外源信号肽编码序列。可替代地，外源信号肽编码序列可简单地替换天然的信号肽编码序列以便增强该多肽的分泌。然而，可以使用指导所表达多肽进入宿主细胞的分泌通路的任何信号肽编码序列。
用于细菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从以下各项的基因获得的信号肽编码序列：芽孢杆菌属NCIB 11837产麦芽糖淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)以及枯草芽孢杆菌prsA。西蒙纳(Simonen)和帕尔瓦(Palva)，1993，微生物学评论(Microbiological Reviews)57:109-137描述了另外的信号肽。
用于丝状真菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是获得自以下项的基因的信号肽编码序列：黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特异腐质霉纤维素酶、特异腐质霉内切右旋糖酐酶V、柔毛腐质霉脂肪酶以及米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶。
对于酵母宿主细胞有用的信号肽获得自以下项的基因：酿酒酵母α-因子和酿酒酵母转化酶。罗马诺斯(Romanos)等人，1992，同上，描述了其他有用的信号肽编码序列。
该控制序列还可以是编码位于多肽的N-末端处的前肽的前肽编码序列。生成的多肽被称为前体酶(proenzyme)或多肽原(或在一些情况下被称为酶原(zymogen))。多肽原通常是无活性的并且可以通过催化切割或自身催化切割来自多肽原的前肽而转化为活性多肽。前肽编码序列可以从以下各项的基因获得：枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、嗜热毁丝霉漆酶(WO 95/33836)、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、以及酿酒酵母α-因子。
在信号肽序列和前肽序列二者都存在的情况下，该前肽序列定位成紧邻多肽的N-末端并且该信号肽序列定位成紧邻该前肽序列的N-末端。
还可能希望地是添加调节序列，这些调节序列相对于宿主细胞的生长来调节多肽的表达。调节序列的实例是使得基因的表达响应于化学或物理刺激 (包括调节化合物的存在)而开启或关闭的那些序列。原核系统中的调节序列包括lac、tac以及trp操纵子系统。在酵母中，可以使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、米曲霉TAKAα-淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子、里氏木霉纤维二糖水解酶I启动子以及里氏木霉纤维二糖水解酶II启动子。调节序列的其他实例是允许基因扩增的那些。在真核系统中，这些调节序列包括在甲氨蝶呤存在下被扩增的二氢叶酸还原酶基因以及用重金属扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况中，编码多肽的多核苷酸将与调节序列可操作地连接。
表达载体
本发明还涉及包含本发明的多核苷酸、启动子、以及转录和翻译终止信号的重组表达载体。不同的核苷酸和控制序列可以连接在一起以产生一个重组表达载体，这一重组表达载体可以包括一个或多个便利的限制酶切位点以允许在这些位点处插入或取代编码该变体的多核苷酸。可替代地，该多核苷酸可以通过将该多核苷酸或包括该多核苷酸的核酸构建体插入用于表达的适当载体中来表达。在产生该表达载体时，该编码序列是位于该载体中，这样使得该编码序列与该供表达的适当控制序列可操作地连接。
重组表达载体可以是任何载体(例如，质粒或病毒)，其能够方便地进行重组DNA程序，并且能够引起多核苷酸的表达。载体的选择将典型地取决于该载体与有待引入该载体的宿主细胞的相容性。该载体可以是线性的或闭合的环状质粒。
该载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如，质粒、染色体外元件、微染色体或人工染色体。该载体可包含任何用以保证自我复制的要素。可替代地，该载体可以是这样载体，当它被引入该宿主细胞中时，被整合到基因组中并且与其中已整合了它的一个或多个染色体一起复制。此外，可以使用单一载体或质粒或两个或更多个载体或质粒(这些载体或质粒共同含有待引入宿主细胞的基因组中的总DNA)或转座子。
该载体优选包含一个或多个允许方便地选择转化细胞、转染细胞、转导细胞等细胞的选择性标记。选择性标记是这样一种基因，该基因的产物提供了杀生物剂抗性或病毒抗性、重金属抗性、营养缺陷型的原养型等。
细菌性选择性标记的实例是地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌dal基因，或赋予抗生素抗性(例如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素、新霉素、大观霉素或四环素抗性)的标记。用于酵母宿主细胞的适合的标记包括但不限于ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1、以及URA3。用于在丝状真菌宿主细胞中使用的选择性标记包括但不限于，adeA(磷酸核糖酰氨基咪唑-琥珀羧胺合酶)、adeB(磷酸核糖酰-氨基咪唑合酶)、amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨 酸氨甲酰基转移酶)、bar(草丁膦乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷基转移酶)、以及trpC(邻氨基苯甲酸合酶)、连同其等效物。优选在曲霉属细胞中使用的是构巢曲霉或米曲霉amdS和pyrG基因以及吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)bar基因。优选在木霉属细胞中使用的是adeA、adeB、amdS、hph以及pyrG基因。
选择性标记可以是在WO 2010/039889中描述的双选择性标记系统。在一个方面中，双选择性标记是hph-tk双选择性标记系统。
载体优选含有允许载体整合到宿主细胞的基因组中或载体在细胞中独立于基因组自主复制的一个或多个元件。
对于整合到该宿主细胞基因组中，该载体可以依靠编码该多肽的多核苷酸序列或者用于通过同源或非同源重组整合到该基因组中的该载体的任何其他元件。可替代地，该载体可以包含用于指导通过同源重组而整合到宿主细胞基因组中的一个或多个染色体中的一个或多个精确位置处的另外的多核苷酸。为了增加在精确位置整合的可能性，这些整合的元件应包含足够数量的核酸，例如100至10,000个碱基对、400至10,000个碱基对、以及800至10,000个碱基对，这些碱基对与对应的靶序列具有高度的序列一致性以提高同源重组的可能性。这些整合元件可以是与宿主细胞的基因组内的靶序列同源的任何序列。此外，这些整合元件可以是非编码多核苷酸或编码多核苷酸。另一个方面，该载体可以通过非同源重组整合到宿主细胞的基因组中。
对于自主复制，载体可以进一步包含使该载体能够在所讨论的宿主细胞中自主复制的复制起点。复制起点可以是在细胞中起作用的介导自主复制的任何质粒复制子。术语“复制起点(origin of replication)”或“质粒复制子(plasmid replicator)”意指使得质粒或载体可在体内复制的多核苷酸。
细菌复制起点的实例是允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177、以及pACYC184的复制起点，以及允许在芽孢杆菌属中复制的质粒pUB110、pE194、pTA1060、以及pAMβ1的复制起点。
用于在酵母宿主细胞中使用的复制起点的实例是2微米复制起点ARS1、ARS4、ARS1与CEN3的组合以及ARS4与CEN6的组合。
在丝状真菌细胞内有用的复制起点的实例是AMA1和ANS1(格姆斯(Gems)等人，1991，基因(Gene)98:61-67；卡伦(Cullen)等人，1987，核酸研究(Nucleic Acids Res.)15:9163-9175；WO 00/24883)。AMA1基因的分离和包含该基因的质粒或载体的构建可以根据披露于WO 00/24883中的方法来完成。
可以将本发明的多核苷酸的多于一个的拷贝插入到宿主细胞中以增加多肽的产生。通过将序列的至少一个另外的拷贝整合到宿主细胞基因组中或者 通过包含与该多核苷酸一起的可扩增的选择性标记基因可以获得多核苷酸的增加的拷贝数目，其中通过在适当的选择性试剂的存在下培养细胞可以选择包含选择性标记基因的经扩增的拷贝的细胞、以及由此该多核苷酸的另外的拷贝。
用于连接以上所描述的元件以构建本发明的重组表达载体的程序是本领域的普通技术人员熟知的(参见，例如，萨姆布鲁克(Sambrook)等人，1989，同上)。
宿主细胞
本发明还涉及重组宿主细胞，这些重组宿主细胞包含本发明的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至一个或多个控制序列，该一个或多个控制序列指导本发明的多肽的产生。将包含多核苷酸的构建体或载体引入到宿主细胞中，这样使得该构建体或载体被维持作为染色体整合体或作为自主复制的染色体外载体，如早前所描述。术语“宿主细胞”涵盖由于复制过程中发生的突变与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。宿主细胞的选择在很大程度上取决于编码该多肽的基因及其来源。
该宿主细胞可以是有用于重组产生本发明的多肽的任何细胞，例如原核细胞或真核细胞。
原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括但不限于：芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、土芽孢杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、海洋芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属以及链霉菌属。革兰氏阴性细菌包括但不限于：弯曲杆菌属、大肠杆菌、黄杆菌属、梭杆菌属、螺杆菌属、泥杆菌属、奈瑟球菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属、以及脲原体属。
细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌细胞，包括但不限于：嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚硬芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、以及苏云金杆菌细胞。
细菌宿主细胞还可以是任何链球菌属细胞，包括但不限于：似马链球菌、酿脓链球菌、乳房链球菌以及马链球菌兽瘟亚种细胞。
细菌宿主细胞还可以是任何链霉菌细胞，包括但不局限于不产色链霉菌、除虫链霉菌、天蓝链霉菌、灰链丝菌、以及浅青紫链霉菌细胞。
将DNA引入芽孢杆菌属细胞中可通过以下来实现：原生质体转化(参见例如，张(Chang)和科恩(Cohen)，1979，分子遗传学与基因组学(Mol.Gen.Genet.)168:111-115)、感受态细胞转化(参见，例如，杨格(Young)和斯皮宰曾(Spizizen)，1961，细菌学杂志(J.Bacteriol.)81: 823-829；或杜拜努(Dubnau)以及大卫杜夫-阿贝尔森(Davidoff-Abelson)，1971，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)56:209-221)、电穿孔(参见，例如，茂川(Shigekawa)和道尔(Dower)，1988，生物技术(Biotechniques)6:742-751)、或者接合(参见，例如克勒(Koehler)和索恩(Thorne)，1987，细菌学杂志169:5271-5278)。将DNA引入大肠杆菌细胞中可通过以下来实现：原生质体转化(参见例如，哈纳汗(Hanahan)，1983，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)166:557-580)或电穿孔(参见例如，道尔(Dower)等人，1988，核酸研究(Nucleic Acids Res.)16:6127-6145)。将DNA引入链霉菌属细胞中可通过以下来实现：原生质体转化、电穿孔(参见例如，贡(Gong)等人，2004，叶线形微生物学(FoliaMicrobiol.)(Praha(布拉格))49:399-405)、接合(参见例如，马佐迪耶(Mazodier)等人，1989，细菌学杂志(J.Bacteriol.)171:3583-3585)、或转导(参见例如，伯克(Burke)等人，2001，美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)98:6289-6294)。将DNA引入假单孢菌属细胞中可通过以下来实现：电穿孔(参见例如，蔡(Choi)等人，2006，微生物学方法杂志(J.Microbiol.Methods)64:391-397)或接合(参见例如，皮内多(Pinedo)和斯梅茨(Smets)，2005，应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)71:51-57)。将DNA引入链球菌属细胞中可通过以下来实现：天然感受态(参见例如，佩里(Perry)和藏满(Kuramitsu)，1981，感染与免疫(Infect.Immun.)32:1295-1297)、原生质体转化(参见，例如，凯特(Catt)和乔力克(Jollick)，1991，微生物学(Microbios)68:189-207)、电穿孔(参见，例如，巴克利(Buckley)等人，1999，应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)65:3800-3804)、或者接合(参见，例如，克莱威尔(Clewell)，1981，微生物学评论(Microbiol.Rev.)45:409-436)。然而，可以使用本领域已知的用于将DNA引入宿主细胞中的任何方法。
宿主细胞还可以是真核细胞，如哺乳动物、昆虫、植物、或真菌细胞。
宿主细胞可以是真菌细胞。如在此使用的“真菌”包括子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)、以及接合菌门(Zygomycota)、连同卵菌门(Oomycota)和全部有丝分裂孢子真菌(如由霍克斯沃思(Hawksworth)等人在安斯沃思和拜斯比真菌词典(Ainsworth and Bisby’s Dictionary of The Fungi)，第8版，1995，国际应用生物科学中心(CAB International)，大学出版社(University Press)，英国剑桥(Cambridge，UK)中进行定义的)。
该真菌宿主细胞可以是酵母细胞。如在此使用的“酵母”包括产子嚢酵母(内孢霉目)、产担子酵母和属于半知菌类(芽孢纲)的酵母。由于酵母的分类在将来可能有变化，出于本发明的目的，酵母应如酵母生物学和活动 性(Biology and Activities of Yeast)(斯金纳(Skinner)、帕斯莫尔(Passmore)、以及达文波特(Davenport)编辑，应用细菌学学会讨论会(Soc.App.Bacteriol.Symposium)系列第9期，1980)所述地进行定义。
酵母宿主细胞可以是假丝酵母属、汉逊酵母属、克鲁弗酵母属、毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母属、或耶氏酵母属细胞，如乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、卡尔酵母、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克鲁弗酵母、诺地酵母、卵形酵母或解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)细胞。
真菌宿主细胞可以是丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门的亚门(如由霍克斯沃思等人，1995，见上文所定义)的所有丝状形式。丝状真菌通常的特征在于由壳多糖、纤维素、右旋糖酐、壳聚糖、甘露聚糖、以及其他复杂多糖构成的菌丝体壁。营养生长是通过菌丝延长，而碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母(如酿酒酵母)的营养生长是通过单细胞菌体的出芽(budding)，而碳分解代谢可以是发酵的。
丝状真菌宿主细胞可以是枝顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属(Bjerkandera)、拟腊菌属、金孢子菌属、鬼伞属、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属、线黑粉菌科(Filibasidium)、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、新美鞭菌属、链孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属、射脉菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属、篮状菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属(Trametes)或木霉属细胞。
例如，丝状真菌宿主细胞可以是泡盛曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、黑刺烟管菌(Bjerkandera adusta)、干拟蜡菌(Ceriporiopsisaneirina)、卡内基拟蜡菌(Ceriporiopsis caregiea)、浅黄拟蜡孔菌(Ceriporiopsisgilvescens)、潘诺希塔拟蜡菌(Ceriporiopsis pannocinta)、环带拟蜡菌(Ceriporiopsisrivulosa)、微红拟蜡菌(Ceriporiopsis subrufa)、虫拟蜡菌(Ceriporiopsissubvermispora)、狭边金孢子菌(Chrysosporium inops)、嗜角质金孢子菌、卢克诺文思金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)、粪状金孢子菌(Chrysosporium merdarium)、租金孢子菌、女王杜香金孢子菌(Chrysosporium queenslandicum)、热带金孢子菌、褐薄金孢子菌(Chrysosporium zonatum)、灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)、毛革盖菌(Coriolushirsutus)、杆孢状镰孢、谷类镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾谷镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢、镶片镰孢、特异腐质霉、柔毛腐质霉、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙链孢菌、产紫青霉、黄孢平 革菌(Phanerochaete chrysosporium)、射脉菌(Phlebia radiata)、刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)、土生梭孢壳霉、长域毛栓菌(Trametes villosa)、变色栓菌(Trametes versicolor)、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉、或绿色木霉细胞。
可以将真菌细胞通过涉及原生质体形成、原生质体转化、以及细胞壁再生的方法以本身已知的方式转化。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的适合程序描述于EP 238023和约尔顿(Yelton)等人，1984，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)81:1470-1474，和克里斯滕森(Christensen)等人，1988，生物/技术(Bio/Technology)6:1419-1422中。用于转化镰孢属物种的适合方法由马拉迪尔(Malardier)等人，1989，基因(Gene)78:147-156和WO 96/00787描述。酵母可以使用以下各文献中所描述的程序转化：贝克尔(Becker)和古伦特(Guarente)，在艾本尔森J.N.(Abelson,J.N.)和塞蒙M.I.(Simon,M.I.)编辑，酵母遗传学与分子生物学指南(Guide to Yeast Genetics and MolecularBiology)，酶学方法(Methods in Enzymology)，第194卷，第182-187页，学术出版社有限公司，纽约；埃托(Ito)等人，1983，细菌学杂志(J.Bacteriol.)153:163；及辛伦(Hinnen)等人，1978，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)75:1920。
生产方法
本发明还涉及产生本发明的多肽的方法，包含(a)在有益于产生该多肽的条件下培养细胞，该细胞以其野生型形式产生该多肽；并且可任选地(b)回收该多肽。在一方面，该细胞是粪盘菌属细胞。在另一方面，该细胞是Ascobolus stictoideus细胞。在另一方面，该细胞是毛壳属细胞。在另一方面，该细胞是绿毛壳细胞。
本发明还涉及产生本发明多肽的方法，该方法包括：(a)在有益于产生该多肽的条件下培养本发明的重组宿主细胞；并且可任选地(b)回收该多肽。
这些宿主细胞是在适合于使用本领域中已知的方法产生该多肽的营养培养基中培养的。例如，可以通过在适合的培养基中和在允许表达和/或分离该多肽的条件下，进行摇瓶培养，或者在实验室或工业发酵罐中进行小规模或大规模发酵(包括连续，分批，分批补料，或固态发酵)来培养细胞。该培养是使用本领域中已知的程序，在一种适合营养培养基中发生，该培养基包含碳和氮来源及无机盐。适合的培养基可从商业供应商获得或可以根据公开的组成(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)制备。如果多肽分泌到该营养培养基中，那么可直接从培养基中直接回收多肽。如果多肽不分泌，那么其可从细胞裂解液中进行回收。
可以使用特异性针对该多肽的本领域已知的方法来检测该多肽。这些检测方法包括但不限于，特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。 例如，可以使用酶测定来确定该多肽的活性。
可以使用本领域已知的方法来回收多肽。例如，该多肽可以通过常规程序，包括但不限于，收集、离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀，从该营养培养基回收。在一个方面，回收包含该多肽的发酵液。
可以通过本领域中已知的多种程序来纯化该多肽以获得基本上纯的多肽，这些程序包括但不限于：色谱法(例如，离子交换色谱、亲和色谱、疏水作用色谱、色谱聚焦、以及尺寸排阻色谱)、电泳程序(例如，制备型等电点聚焦)、差别溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE、或提取(参见例如，蛋白纯化(Protein Purification)，詹森(Janson)和赖登(Ryden)编辑，VCH出版社(VCH Publishers)，纽约，1989)。
在一个替代性方面中，没有回收该多肽，而是将表达该多肽的本发明的宿主细胞用作该多肽的来源。
植物
本发明还涉及分离的植物，例如转基因植物、植物部分或植物细胞，这些植物包括本发明的多肽，从而表达并且产生可回收的量的多肽或结构域。多肽或结构域可从植物或植物部分回收。作为替代方案，包括该多肽或结构域的植物或植物部分可以按原样用于改善食品或饲料的质量，例如改善营养价值、可口性及流变学特性，或破坏抗营养因素。
转基因植物可以是双子叶的(双子叶植物)或单子叶的(单子叶植物)。单子叶植物的实例是草，如草甸草(蓝草，早熟禾属)；饲草，如羊茅属(Festuca)、黑麦草属(Lolium)；温带草，如翦股颖属(Agrostis)；以及谷类，例如小麦、燕麦、黑麦、大麦、稻、高粱、以及玉蜀黍(玉米)。
双子叶植物的实例是烟草、豆类(如羽扇豆(lupins)、马铃薯、糖甜菜(sugarbeet)、豌豆、豆(bean)和大豆(soybean))、以及十字花科植物(十字花科(familyBrassicaceae))(如花椰菜、油菜籽、以及紧密相关的模式生物拟南芥)。
植物部分的实例是茎、愈伤组织、叶、根、果实、种子、以及块茎、以及包括这些部分的独立组织，例如，表皮、叶肉、薄壁组织(parenchyme)、维管组织、分生组织。特定植物细胞区室，如叶绿体、质外体(apoplast)、线粒体、液泡、过氧化物酶体以及细胞质也被认为是植物部分。此外，任何植物细胞，无论是何种组织来源，都被认为是植物部分。同样地，植物部分，如分离以有助于本发明的利用的特定组织和细胞也被认为是植物部分，例如胚、胚乳、糊粉和种皮。
同样包括于本发明范围内的是此类植物、植物部分以及植物细胞的子代。
可以根据本领域已知方法构建表达该多肽或结构域的转基因植物或植物细胞。简而言之，通过将编码该多肽或结构域的一个或多个表达构建体结合到植物宿主基因组或叶绿体基因组中并且将所得修饰的植物或植物细胞繁殖成转基因的植物或植物细胞来构建植物或植物细胞。
表达构建体方便地是核酸构建体，它包括编码多肽或结构域的多核苷酸，该多核苷酸可操作地与选择的植物或植物部分中表达该多核苷酸所需的适当调节序列连接。而且，表达构建体可包括用于鉴别整合了此表达构建体的植物细胞的选择性标记，和将此构建体引入所讨论的植物所必需的DNA序列(后者取决于所用的引入DNA的方法)。
例如基于希望在何时、何处、和怎样表达该多肽或结构域来确定调节序列，例如启动子和终止子序列以及任选的信号序列或转运序列的选择。例如编码多肽或结构域的基因的表达可以是组成型的或诱导型的，或者可以是发育、阶段或组织特异性的，并且基因产物可以被靶向至特定组织或植物部分，例如种子或叶。调节序列由例如塔格(Tague)等人，1988，植物生理学(Plant Physiology)86:506描述。
对于组成型表达，可以使用35SCaMV、玉米泛素1、或稻肌动蛋白1启动子(弗兰克(Franck)等人，1980，细胞(Cell)21:285-294；克里斯滕森(Christensen)等人，1992，植物分子生物学(Plant Mol.Biol.)18:675-689；张(Zhang)等人，1991，植物细胞(Plant Cell)3:1155-1165)。器官特异性启动子可以是以下各项的启动子，例如来自贮藏库组织(例如种子、马铃薯块茎、和果实)(爱德华兹(Edwards)和科鲁兹(Coruzzi)，1990，遗传学年鉴(Ann.Rev.Genet.)24:275-303)，或来自代谢库组织(例如分生组织)(伊藤(Ito)等人，1994，植物分子生物学(Plant Mol.Biol.)24:863-878)的启动子，种子特异性启动子，例如来自稻的谷蛋白、醇溶谷蛋白、球蛋白或白蛋白启动子(吴(Wu)等人，1998，植物与细胞生理学(Plant Cell Physiol.)39:885-889)，来自豆球蛋白B4的蚕豆启动子和来自蚕豆的未知种子蛋白基因(康拉德(Conrad)等人，1998，植物生理学杂志(J.Plant Physiol.)152:708-711)，来自种子油体蛋白的启动子(陈(Chen)等人，1998，植物与细胞生理学(Plant CellPhysiol.)39:935-941)，来自欧洲油菜的贮藏蛋白napA启动子，或本领域已知的任何其他种子特异性启动子，例如，如在WO 91/14772中所描述的。此外，启动子可以是叶特异性启动子，如来自稻或番茄的rbcs启动子(京冢(Kyozuka)等人，1993，植物生理学(PlantPhysiol.)102:991-1000)、小球藻病毒腺嘌呤甲基转移酶基因启动子(麦卓(Mitra)和希金斯(Higgins)，1994，植物分子生物学26:85-93)、来自稻的aldP基因启动子(加贺屋(Kagaya)等人，1995，分子遗传学与基因组学(Mol.Gen.Genet.)248:668-674)、或伤口诱导型启动子(如马铃薯 pin2启动子)(许(Xu)等人，1993，植物分子生物学22:573-588)。同样地，启动子可以通过非生物处理来诱导，如温度、干旱、或盐度变化，或通过外源施加的激活该启动子的物质来诱导，例如乙醇、雌激素、植物激素(如乙烯、脱落酸和赤霉酸)、以及重金属。
还可使用启动子增强子元件，从而在植物中达到多肽或结构域的更高表达。例如，启动子增强子元件可以是位于启动子和编码多肽或结构域的多核苷酸序列之间的内含子。例如，许等人，1993，同上，披露了使用稻肌动蛋白1基因的第一内含子以增强表达。
该选择性标记基因及该表达构建体的任何其他部分可以选自本领域中可用的那些。
可以根据本领域中已知的常规技术将核酸构建体结合到植物基因组中，这些常规技术包括土壤杆菌介导的转化、病毒介导的转化、微注射、粒子轰击、生物射弹转化、以及电穿孔(加塞尔(Gasser)等人，1990，科学(Science)244:1293；波特里库斯(Potrykus)，1990，生物/技术(Bio/Technology)8:535；岛本(Shimamoto)等人，1989，自然(Nature)338:274)。
目前根癌土壤杆菌介导的基因转移是用于产生转基因双子叶植物(关于综述，请参见霍伊卡(Hooykas)和施尔伯鲁特(Schilperoort)，1992，植物分子生物学(PlantMol.Biol.)19:15-38)并且用于转化单子叶植物的方法，但对于这些植物还常常使用其他的转化方法。用于产生转基因单子叶植物的方法是粒子(涂覆有转化DNA的微观金或钨粒子)轰击胚愈伤组织或发育中的胚(克里斯托(Christou)，1992，植物杂志(Plant J.)2:275-281；岛本，1994，生物技术当前述评(Curr.Opin.Biotechnol.)5:158-162；瓦西尔(Vasil)等人，1992，生物/技术(Bio/Technology)10:667-674)。用于转化单子叶植物的替代方法是基于原生质体转化，如由奥米儒勒(Omirulleh)等人，1993，植物分子生物学(Plant Mol.Biol.)21:415-428所描述。另外的转化方法包括美国专利号6,395,966和7,151,204(两者都通过引用以其全文结合于此)中所描述的那些。
在转化后，根据本领域熟知的方法选出已并入了表达构建体的转化体，并使其再生成为完整植物。通常设计转化程序用于通过如下方法在再生期间或在后续世代中选择性消除选择基因：例如，使用带有两个独立的T-DNA构建体的共转化或利用特异性重组酶位点特异性地切除选择基因。
除用本发明的构建体直接转化特定植物基因型外，还可以通过使具有该构建体的植物与缺乏该构建体的第二植物进行杂交来产生转基因植物。例如，可以通过杂交将编码多肽或结构域的构建体引入特定植物品种中，无需总是直接地转化该给定品种的植物。因此，本发明不仅涵盖了从根据本发明 已经转化的细胞直接再生的植物，而且还涵盖了这类植物的后代。如在此使用的，后代可以是指根据本发明制备的亲本植物的任何代的后代。此类后代可以包括根据本发明制备的DNA构建体。杂交导致通过供体植物系与起始系交叉授粉，将转基因引入植物系。此类步骤的非限制性实例描述于美国专利号7,151,204中。
植物可以通过回交转化方法生成。例如，植物包括被称为回交转化的基因型、种系、近交体、或杂交体的植物。
可以使用遗传标记以协助本发明的一种或多种转基因从一个遗传背景渗入到另一个。标记协助的选择提供了相对于常规育种的优势，在于其可以用于避免由表型变异导致的错误。另外，遗传标记可以在具体杂交的个别后代中提供有关良种种质相对程度的数据。例如，当具有所希望性状并且另外具有非农艺学所希望的遗传背景的植物与良种亲本杂交时，可以使用遗传标记来选择不仅具有感兴趣的性状，还具有相对较大比例所希望种质的后代。以此方式，使一种或多种性状渗入特定遗传背景所需的世代数得以最小化。
本发明还涉及产生本发明的多肽或结构域的方法，这些方法包括(a)在有益于产生该多肽或结构域的条件下培养转基因植物或植物细胞，该转基因植物或植物细胞包括编码该多肽或结构域的多核苷酸；并且(b)回收该多肽或结构域。
发酵液配制品或细胞组合物
本发明还涉及包含本发明的多肽的发酵液配制品或细胞组合物。发酵液产物进一步包含在发酵过程中使用的另外的成分，例如像，细胞(包括含有编码本发明的多肽的基因的宿主细胞，这些宿主细胞被用于产生多肽)、细胞碎片、生物质、发酵介质和/或发酵产物。在一些实施例中，该组合物是含有一种或多种有机酸、杀灭的细胞和/或细胞碎片以及培养基的细胞杀灭的全培养液。
如在此使用的术语“发酵液”是指由细胞发酵产生、不经历或经历最低限的回收和/或纯化的制剂。例如，当微生物培养物生长至饱和，在碳限制条件下孵育以允许蛋白质合成(例如，由宿主细胞进行酶的表达)并且分泌到细胞培养基中时，产生发酵液。发酵液可以包含在发酵结束时得到的发酵材料的未分级的或分级的内容物。典型地，发酵液是未分级的并且包括用过的培养基以及例如通过离心去除微生物细胞(例如，丝状真菌细胞)之后存在的细胞碎片。在一些实施例中，发酵液包含用过的细胞培养基、胞外酶以及有活力的和/或无活力的微生物细胞。
在一个实施例中，该发酵液配制品和细胞组合物包括第一有机酸组分(包括至少一种1-5碳的有机酸和/或其盐)以及第二有机酸组分(包括至少一种6碳或更多碳的有机酸和/或其盐)。在具体实施例中，该第一有机酸组分是 乙酸、甲酸、丙酸、其盐，或前述两种或更多种的混合物；并且该第二有机酸组分是苯甲酸、环己烷羧酸、4-甲基戊酸、苯乙酸、其盐，或前述两种或更多种的混合物。
在一方面，该组合物包含一种或多种有机酸，并且任选地进一步含有杀灭的细胞和/或细胞碎片。在一个实施例中，从细胞杀灭的全培养液中去除这些杀灭的细胞和/或细胞碎片，以提供不含这些组分的组合物。
这些发酵液配制品或细胞组合物可以进一步含有一种防腐剂和/或抗微生物(例如抑菌)剂，包括但不限于山梨醇、氯化钠、山梨酸钾、以及本领域中已知的其他试剂。
这些发酵液配制品或细胞组合物可以进一步包括多种酶活性，如选自由以下各项组成的组的一种或多种(例如，若干种)酶：纤维素酶、半纤维素酶、酯酶、棒曲霉素、漆酶、木质素分解酶、果胶酶、过氧化物酶、蛋白酶、以及膨胀蛋白。这些发酵液配制品或细胞组合物还可以包括选自下组的一种或多种(例如，若干种)酶，该组由以下各项组成：水解酶、异构酶、连接酶、裂解酶、氧化还原酶或转移酶，例如，α-半乳糖苷酶、α-葡糖苷酶、氨肽酶、淀粉酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、β-木糖苷酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、葡糖淀粉酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变位酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白分解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶或木聚糖酶。
该细胞杀灭的全培养液或组合物可以包含在发酵终止时得到的发酵物质的未分级的内容物。典型地，该细胞杀灭的全培养液或组合物包含用过的培养基以及在微生物细胞(例如，丝状真菌细胞)生长至饱和、在碳限制条件下孵育以允许蛋白质合成(例如，纤维素酶和/或一种或多种葡糖苷酶的表达)之后存在的细胞碎片。在一些实施例中，细胞杀灭的全培养液或组合物含有用过的细胞培养基、胞外酶、和杀死的丝状真菌细胞。在一些实施例中，可以使用本领域已知方法来使细胞杀灭的全培养液或组合物中存在的微生物细胞透性化和/或裂解。
在此描述的全培养液或细胞组合物典型地是液体，但是可以含有不溶组分，例如杀灭的细胞、细胞碎片、培养基组分、和/或一种或多种不溶性酶。在一些实施例中，可以除去不溶性组分以提供澄清的液体组合物。
可以通过WO 90/15861或WO 2010/096673所述的方法产生本发明的全培养液配制品和细胞组合物。
下面给出了本发明的组合物的用途的实例。该组合物的剂量以及使用该组合物的其他条件可以基于本领域中已知的方法进行确定。
用途
本发明的甘露聚糖酶可以用于其中需要降解甘露聚糖的应用。其中可以使用甘露聚糖酶的实例是在从软木和棕榈仁滤饼生产生物乙醇中，用于改进动物饲料以及在咖啡的水解中。此外，瓜尔胶被用于很多食物产品中，并且被用于石油和天然气工业中，所以本发明的甘露聚糖酶可以用于洗涤剂中以除去含甘露聚糖污渍，用于水力压裂以产生从钻孔延伸进入岩层的地下压裂，从而增加岩层可以产生的流体的速率或用于清洁钻孔滤饼。因此甘露聚糖可以用于由钻井孔造成的地下地层的压裂中，或甘露聚糖可以被用作钻孔滤饼中的组分。
甘露聚糖可以用于降解纤维素材料，用于例如在一种生产发酵产物的方法中生产发酵产物和用于发酵纤维素材料，该方法包括：(a)在本发明的具有甘露聚糖酶活性的多肽的存在下，用酶组合物糖化纤维素材料；(b)用一种或多种发酵微生物对糖化的纤维素材料进行发酵，以产生该发酵产物；并且(c)从发酵中回收该发酵产物。可以在糖化之前预处理纤维素材料。
本发明的某些甘露聚糖酶可以用于防止或除去物品(例如纺织品和/或织物)上的生物膜。此类甘露聚糖酶优选与SEQ ID NO:3的或SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性；
当物品上存在微生物并且在物品上粘在一起时，生物膜会在纺织品上发展。一些微生物倾向于粘附至物品(例如纺织品)的表面上。一些微生物粘附在此类表面上并且在表面上形成生物膜。生物膜可以是粘性的并且粘附的微生物和/或生物膜会是难以除去的。此外，由于生物膜的粘性性质，生物膜粘附污垢。市场上可获得的商业衣物洗涤剂组合物并不除去此类粘附的微生物或生物膜。
本发明涉及具有甘露聚糖酶活性的多肽用于从物品上防止、减少或除去生物膜的用途，其中该多肽获得自真菌来源并且其中该物品是纺织品。在本发明的一个实施例中，具有甘露聚糖酶活性的多肽用于防止、减少或除去物品的粘性。
酶组合物
本发明还涉及包含本发明的多肽的组合物。优选地，这些组合物富含这种多肽。术语“富含”指示该组合物的纤维二糖水解酶活性已经增加，例如，富集因子为至少1.1。
这些组合物可以包括本发明的多肽作为主要酶组分，例如单组分组合物。可替代地，这些组合物可以包括多种酶活性，如选自下组的一种或多种(例如，数种)酶，该组由以下各项组成：纤维素酶、半纤维素酶、具有纤 维素分解增强活性的AA9多肽、酯酶、棒曲霉素、漆酶、木质素分解酶、果胶酶、过氧化物酶、蛋白酶、以及膨胀蛋白。这些组合物还可以包含一种或多种(例如若干种)选自下组的酶，该组由以下各项组成：水解酶、异构酶、连接酶、裂解酶、氧化还原酶、或转移酶、例如α-半乳糖苷酶、α-葡糖苷酶、氨肽酶、淀粉酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、β-木糖苷酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、葡糖淀粉酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变位酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、或木聚糖酶。
这些组合物可根据本领域已知的方法制备并且可以是液体或干燥组合物的形式。可以根据本领域中已知的方法稳定这些组合物。
下面给出了本发明的组合物的用途的实例。该组合物的剂量以及使用该组合物的其他条件可以基于本领域中已知的方法进行确定。
在下面各段中对本发明进行了进一步的概述：
1.一种具有甘露聚糖酶活性的多肽，该多肽选自下组，该组由以下各项组成：
(a)与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性的多肽；
(b)与SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:5的成熟多肽具有至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性的多肽；
(c)由如下多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸在非常低严格条件、低严格条件、中严格条件、中-高严格条件、高严格条件或非常高严格条件下与以下项杂交：
(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列，
(ii)其cDNA序列，或
(iii)(i)或(ii)的全长互补体；
(d)由如下多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸在中严格条件、中-高严格条件、高严格条件或非常高严格条件下与以下项杂交：
(i)SEQ ID NO:4的成熟多肽编码序列，
(ii)其cDNA序列，或
(iii)(i)或(ii)的全长互补体；
(e)由与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列或其cDNA序列具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性的多核苷酸编码的多肽；
(f)由与SEQ ID NO:4的成熟多肽编码序列或其cDNA序列具有至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性的多核苷酸编码的多肽；
(g)SEQ ID NO:3的变体或SEQ ID NO:2的成熟多肽，该变体或该成熟多肽在一个或多个(例如若干个)位置处包括取代、缺失、和/或插入；
(h)SEQ ID NO:6的变体或SEQ ID NO:5的成熟多肽，该变体或该成熟多肽在一个或多个(例如若干个)位置处包括取代、缺失、和/或插入；以及
(i)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)或(h)的多肽的片段，该片段具有甘露聚糖酶活性。
2.如段落1所述的多肽，该多肽选自下组，该组由以下各项组成：
(a)与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性的多肽；以及
(b)与SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:5的成熟多肽具有至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性的多肽。
3.如段落1-2中任一项所述的多肽，该多肽包括SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQID NO:5、SEQ ID NO:6或者SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:5的成熟多肽或由其组成。
4.如段落1-3中任一项所述的多肽，其中该成熟多肽对应于SEQ ID NO:2的氨基酸1至541、SEQ ID NO:2的氨基酸121至541或SEQ ID NO:5的氨基酸1至526。
5.一种包括催化结构域的多肽，该催化结构域选自下组，该组由以下各项组成：
(a)与SEQ ID NO:2的氨基酸128至446具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性的催化结构域；
(b)与SEQ ID NO:5的氨基酸135至448具有至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性的催化结构域；
(c)由如下多核苷酸编码的催化结构域，该多核苷酸在非常低严格条件、低严格条件、中严格条件、中-高严格条件、高严格条件或非常高严格条件下与以下项杂交：
(i)SEQ ID NO:1的核苷酸490至1446，
(ii)其cDNA序列，或
(iii)(i)或(ii)的全长互补体；
(d)由如下多核苷酸编码的催化结构域，该多核苷酸在中-高严格条件、高严格条件或非常高严格条件下与以下项杂交：
(i)SEQ ID NO:4的核苷酸599至1651，
(ii)其cDNA序列，或
(iii)(i)或(ii)的全长互补体；
(e)由与SEQ ID NO:1的核苷酸490至1446或其cDNA序列具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性的多核苷酸编码的催化结构域；
(f)由与SEQ ID NO:4的核苷酸599至1651或其cDNA序列具有至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性的多核苷酸编码的催化结构域；
(g)在一个或多个(例如若干个)位置处包括取代、缺失、和/或插入的SEQ ID NO:2的氨基酸128至446的变体；以及
(h)在一个或多个(例如若干个)位置处包括取代、缺失、和/或插入的SEQ ID NO:5的氨基酸135至448的变体；以及
(i)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)或(h)的催化结构域的片段，该片段具有甘露聚糖酶活性。
6.如段落5所述的多肽，该多肽进一步包括一个或多个碳水化合物结合 模块。
7.一种包括可操作地连接至催化结构域的碳水化合物结合模块的多肽，其中该结合模块选自下组，该组由以下各项组成：
(a)与SEQ ID NO:2的氨基酸1至124具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性的碳水化合物结合模块；
(b)与SEQ ID NO:2的氨基酸508至541具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性的碳水化合物结合模块；
(c)与SEQ ID NO:5的氨基酸1至130具有至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性的碳水化合物结合模块；
(d)与SEQ ID NO:5的氨基酸492至526具有至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性的碳水化合物结合模块；
(e)由如下多核苷酸编码的碳水化合物结合模块，该多核苷酸在非常低严格条件、低严格条件、中严格条件、中-高严格条件、高严格条件或非常高严格条件下与以下项杂交：
(i)SEQ ID NO:1的核苷酸61至480，
(ii)其cDNA序列，或
(iii)(i)或(ii)的全长互补体；
(f)由如下多核苷酸编码的碳水化合物结合模块，该多核苷酸在中严格条件、中-高严格条件、高严格条件或非常高严格条件下与以下项杂交：
(i)SEQ ID NO:1的核苷酸1630至1731，
(ii)其cDNA序列，或
(iii)(i)或(ii)的全长互补体；
(g)由如下多核苷酸编码的碳水化合物结合模块，该多核苷酸在中严格条件、中-高严格条件、高严格条件或非常高严格条件下与以下项杂交：
(i)SEQ ID NO:4的核苷酸82至586，
(ii)其cDNA序列，或
(iii)(i)或(ii)的全长互补体；
(h)由如下多核苷酸编码的碳水化合物结合模块，该多核苷酸在中严格条件、中-高严格条件、高严格条件或非常高严格条件下与以下项杂交：
(i)SEQ ID NO:4的核苷酸1781至1885，
(ii)其cDNA序列，或
(iii)(i)或(ii)的全长互补体；
(i)由与SEQ ID NO:1的核苷酸61至480或其cDNA序列具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性的多核苷酸编码的碳水化合物结合模块；
(j)由与SEQ ID NO:1的核苷酸1630至1731或其cDNA序列具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性的多核苷酸编码的碳水化合物结合模块；
(k)由与SEQ ID NO:4的核苷酸82至586或其cDNA序列具有至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性的多核苷酸编码的碳水化合物结合模块；
(l)由与SEQ ID NO:4的核苷酸1781至1885或其cDNA序列具有至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性的多核苷酸编码的碳水化合物结合模块；
(m)在一个或多个(例如若干个)位置处包括取代、缺失、和/或插入的SEQ ID NO:2的氨基酸1至124的变体；以及
(n)在一个或多个(例如若干个)位置处包括取代、缺失、和/或插入的SEQ ID NO:2的氨基酸508至541的变体；以及
(o)在一个或多个(例如若干个)位置处包括取代、缺失、和/或插入的SEQ ID NO:5的氨基酸1至130的变体；以及
(p)在一个或多个(例如若干个)位置处包括取代、缺失、和/或插入的SEQ ID NO:5的氨基酸492至526的变体；以及
(q)具有碳水化合物结合活性的(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、 (i)、(j)、(k)、(l)、(m)、(n)、(o)或(p)的碳水化合物结合模块的片段。
8.包括如段落1-7中任一项所述的多肽的组合物。
9.如段落8所述的组合物，该组合物进一步包括一种或多种另外的酶。
10.如段落8-9中任一项所述的组合物，该组合物进一步包括一种或多种洗涤剂组分。
11.如段落8-9中任一项所述的组合物，该组合物进一步包括至少一种脂溶性维生素、和/或至少一种水溶性维生素、和/或至少一种痕量矿物质。
12.根据段落8-10中任一项所述的组合物的用途，用于降解甘露聚糖，例如直链甘露聚糖、半乳甘露聚糖、葡甘露聚糖和半乳葡甘露聚糖。
13.如权段落12所述的用途，用于控制钻井液的粘度。
14.如段落12所述的用途，用于洗涤或清洁纺织品和/或硬表面，例如餐具洗涤。
15.如段落10所述的组合物的用途，用于洗衣和/或硬表面清洁，其中该组合物具有酶洗净益处。
16.用于降解甘露聚糖，例如直链甘露聚糖、半乳甘露聚糖、葡甘露聚糖和半乳葡甘露聚糖的方法，该方法包括将包括如段落1-7中任一项的组合物施加至该甘露聚糖。
17.如段落16所述的方法，其中该甘露聚糖在纺织品的表面上或硬表面上，例如餐具洗涤。
18.如段落16所述的方法，其中该甘露聚糖在由钻井孔造成的地下地层的压裂中使用。
19.如段落18所述的方法，其中该甘露聚糖是钻孔滤饼中的组分。
20.一种用于产生咖啡提取物的方法，该方法包括以下步骤：
(a)提供经烘烤且研磨的咖啡豆；
(b)向所述咖啡豆添加水和如段落1-7中任一项所述的多肽；
(c)孵育以制造水性咖啡提取物；并且
(d)从提取的咖啡豆分离该咖啡提取物。
21.如段落20所述的方法，其中步骤(b)进一步包括添加具有β-1,3-半乳聚糖酶活性的酶。
22.一种用于降解纤维素材料的方法，包括：在如段落1-7中任一项所述的具有甘露聚糖酶活性的多肽的存在下，用酶组合物处理该纤维素材料。
23.一种用于生产发酵产物的方法，该方法包括：
(a)在如段落1-7中任一项所述的具有甘露聚糖酶活性的多肽的存在下，用酶组合物糖化纤维素材料；
(b)用一种或多种发酵微生物对该糖化的纤维素材料进行发酵，以产生该发酵产物；并且
(c)从该发酵中回收该发酵产物。
24.如段落22-23中任一项所述的方法，其中对该纤维素材料进行预处理。
25.如段落22-24中任一项所述的方法，其中该酶组合物包括选自下组的一种或多种酶，该组由以下各项组成：纤维素酶、AA9多肽、半纤维素酶、酯酶、棒曲霉素、木质素分解酶、氧化还原酶、果胶酶、蛋白酶、以及膨胀蛋白。
26.一种发酵纤维素材料的方法，包括：用一种或多种发酵微生物发酵该纤维素材料，其中在如段落1-7中任一项所述的具有甘露聚糖酶活性的多肽的存在下，用酶组合物糖化该纤维素材料。
27.如段落26所述的方法，其中在糖化之前对该纤维素材料进行预处理。
28.如段落26-27中任一项所述的方法，其中该酶组合物包括选自下组的一种或多种酶，该组由以下各项组成：纤维素酶、AA9多肽、半纤维素酶、酯酶、棒曲霉素、木质素分解酶、氧化还原酶、果胶酶、蛋白酶、以及膨胀蛋白。
29.一种编码如段落1-7中任一项所述的多肽的多核苷酸。
30.一种核酸构建体或表达载体，该核酸构建体或表达载体包括如段落29所述的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至指导多肽在表达宿主内产生的一个或多个控制序列。
31.一种重组宿主细胞，该重组宿主细胞包括如段落29所述的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至指导多肽的产生的一个或多个控制序列。
32.一种产生如段落1-7中任一项所述的多肽的方法，该方法包括：
(a)在有益于产生该多肽的条件下培养细胞，该细胞以其野生型形式产生该多肽；并且
(b)回收该多肽。
33.一种产生如段落1-7中任一项所述的多肽的方法，该方法包括：
(a)在有益于产生该多肽的条件下培养如段落31所述的宿主细胞；并且
(b)回收该多肽。
34.一种用编码如段落1-7中任一项所述的多肽的多核苷酸转化的转基因植物、植物部分或植物细胞。
35.一种产生如段落1-7中任一项所述的多肽的方法，该方法包括：
(a)在有益于生产该多肽的条件下，培养如段落34所述的转基因植物或植物细胞；并且
(b)回收该多肽。
36.一种包括如段落1-7中任一项所述的多肽的全培养液配制品或细胞培 养组合物。
37.根据段落1所述的多肽的用途，用于从物品上防止、减少或除去生物膜。
38.根据段落37所述的用途，其中从该物品上减少或除去恶臭。
通过以下实例进一步描述本发明，但不应将其理解为对本发明范围的限制。
实例
菌株
绿毛壳CBS547.75用作具有甘露聚糖酶活性的多肽的来源。该菌株分离自麦秸堆肥，该麦秸堆肥是于1974年在旁遮普省的卢迪亚纳被制备用于蘑菇生长。
Ascobolus stictoideus QA026用作具有甘露聚糖酶活性的多肽的来源。在1991年或之前，与丹麦哥本哈根大学的孢子种植(Sporeplanter)研究所合作，在丹麦分离了该菌株。
米曲霉MT3568菌株用于对具有甘露聚糖酶活性的多肽进行编码的绿毛壳和Ascobolus stictoideus基因的表达。米曲霉MT3568是米曲霉JaL355的amdS(乙酰胺酶)破坏的基因衍生物(WO 2002/40694)，其中通过破坏米曲霉乙酰胺酶(amdS)基因修复pyrG营养缺陷型。
材料
用作缓冲液和底物的化学品是至少试剂级的商业产品。
培养基和溶液
YP+2％葡萄糖培养基由1％酵母提取物、2％蛋白胨以及2％葡萄糖构成。
PDA琼脂板由马铃薯浸出液(马铃薯浸出液是通过将300g切片的(经过洗涤但未削皮)的马铃薯在水中煮沸30分钟，并且然后将该培养液倾析或滤过粗滤布而制成)组成。然后添加蒸馏水，直到悬浮液的总体积为一升，随后添加20g的右旋糖和20g的琼脂粉。该培养基通过在15psi下高压杀菌15分钟来进行灭菌(细菌学分析手册(BacteriologicalAnalytical Manual)，第8版，修订A，1998)。
LB板由10g的细菌用胰蛋白胨(Bacto-Tryptone)、5g的酵母提取物、10g的氯化钠、15g的细菌用琼脂(Bacto-agar)及补足至1升的去离子水构成。该培养基通过在15psi下高压杀菌15分钟来进行灭菌(细菌学分析手册(Bacteriological Analytical Manual)，第8版，修订A，1998)。
COVE蔗糖板由以下构成：342g蔗糖(西格玛(Sigma)S-9378)、20g琼脂粉、20mlCove盐溶液(26g MgSO4.7H2O、26g KCL、26g KH2PO4、50ml Cove痕量金属溶液)以及补足到1升的去离子水。该培养基通过在15psi下 高压杀菌15分钟来进行灭菌(细菌学分析手册(Bacteriological Analytical Manual)，第8版，修订A，1998)。将该培养基冷却至60℃并且添加10mM的乙酰胺、15mM的CsCl、曲通(Triton)X-100(50μl/500ml)。
Cove痕量金属溶液由以下构成：0.04g Na2B4O7.10H2O、0.4g CuSO4.5H2O、1.2gFeSO4.7H2O、0.7g MnSO4.H2O、0.8g Na2MoO4.2H2O、10g ZnSO4.7H2O、以及补足到1升的去离子水。
还原端测定
为了估计在底物水解后的甘露糖产率，使用了由莱韦尔(Lever)(1972)，分析化学(Anal.Biochem.)47:273-279开发的还原端测定。该测定是基于4-羟基苯甲酸酰肼，它在碱性条件下与糖的还原端反应。产物是强黄色阴离子，在410nm吸收。
方法
在PAHBAH缓冲液中将4-羟基苯酰肼(PAHBAH)(西格玛(Sigma)，H9882)稀释至15mg/ml的浓度。PAHBAH缓冲液浓度：50g/L K-Na-酒石酸盐(默克(Merck)公司，1.08087)和20g/L氢氧化钠(西格玛(Sigma)，S8045)。就在使用前制成这一PAHBAH混合物。
在96孔PCR板(赛默飞世尔科技公司(Thermo Scientific))中混合70μl PAHBAH和MiliQ水。添加来自水解实验的样品。样品和MiliQ总是达到150μl的总体积，但是样品的稀释是不同的。用粘性PCR密封箔片(赛默飞世尔科技公司(Thermo Scientific))密封该板。在PTC-200循环加热器(MJ研究公司(MJ Research))中将该板在95℃孵育10min，冷却并且保持在10℃持续1min。将100μl样品转移至平底96孔微量滴定板中(NuncTM公司)，并且在SpectraMax 190吸光度酶标仪(分子装置公司(Molecular Devices))上，在405nm测量显色。将结果与甘露糖标准品进行比较，该甘露糖标准品已经经历了与其进行比较的样品相同的处理和稀释。
恶臭测定
使用电子鼻分析纺织品上的E-2-壬烯醛。
测试纺织品上的恶臭的存在的一种方式是通过使用作为恶臭的标志物的E-2-壬烯醛，因为此化合物引起衣物上的恶臭。
将E-2-壬烯醛的溶液添加至5cm x 5cm纺织品小块布样上并且将该小块布样放入20mL玻璃小瓶中用于GC分析并且盖住该小瓶。在40℃下孵育20分钟后，在来自法国阿尔法M.O.S.(Alpha M.O.S.)的Heracles II电子鼻中分析来自加帽小瓶的5mL顶部空间(具有2个FID的双柱气相色谱仪，柱1：MXT5并且柱2：MXT1701)。
N-端测序
使用应用生物系统公司(Applied Biosystems)蛋白质测序系统进 行N-端测序分析。在预制4％-20％SDS聚丙烯酰胺凝胶(生命技术公司(LifeTechnologies))上纯化这些样品。根据制造商的说明书跑胶并且印迹至 PVDF膜(应用生物系统公司)上。对于N-端氨基酸测序，切下主蛋白带并且放置在蛋白质测序系统的印迹盒中。根据制造商的说明书，使用运行用于PVDF膜样品(脉冲液体PVDF)的文件的方法，来进行N-端测序。通过比较色谱图中的峰值的保留时间与标准品色谱图中PTH-氨基酸的保留时间，可以从对应于氨基酸残基1至7的7个色谱图推导N-端氨基酸序列。
质谱法(MS/MS)测序
通过对来自凝胶内消化的胰蛋白酶消化肽段的串联质谱法(MS/MS)分析，来进行蛋白鉴定。首先将样品用DTT还原并且用碘乙酰胺进行烷基化。然后将还原的并且烷基化的样品施加至SDS凝胶电泳。
根据制造商的说明书跑胶并且染色(预制4％-20％SDS聚丙烯酰胺凝胶(生命技术公司)。切下主蛋白带并且将胶块用测序级胰蛋白酶(罗氏公司(Roche))消化过夜。在消化后，提取产生的胰蛋白酶消化肽段并且在Orbitrap LTQ XL质谱仪(赛默飞世尔科技公司(Thermo Scientific))上进行分析，其中测量肽质量和肽片段质量。为了鉴定蛋白，通过质量搜索程序Mascot(Matrix science公司)将实验获得的质量与储存在数据库中的蛋白的理论肽质量和理论肽片段质量进行比较。
实例1：针对Ascobolus stictoideus菌株QA026的DNA序列信息的来源
从分离自Ascobolus stictoideus菌株QA026(植物和环境科学系，哥本哈根大学，丹麦)的基因组DNA，在普朗莱乌特，瑞士，在Fasteris基因组测序中心，通过IlluminaDNA测序，产生基因组序列信息。使用IDBA迭代de Bruijn Graph De Novo序列汇编程序v0.2(Y彭(Peng)，HCM梁(Leung)，SM姚(Yiu)，FYL程(Chin)2010，计算分子生物学研究(Research inComputational Molecular Biology)6044，426-440页)，分析基因组的初级装配。将由软件构建的基因模型用作检测基因组中的GH26同系物的起始点。使用多个作为向导的已知的GH26蛋白质序列构建更精确的基因模型。
实例2：Ascobolus stictoideus菌株QA026基因组DNA提取
为了生成用于PCR扩增的基因组DNA，将Ascobolus stictoideus菌株QA026通过在26℃生长7日在PDA琼脂平板上繁殖。使用从PDA板收获的孢子接种在带挡板的摇瓶中的100ml的MEX-1培养基(WO 98/38288中的培养基B)里并且在26℃下孵育48小时，同时以85rpm搅拌。
根据改进的DNeasy Plant Maxi试剂盒方案(凯杰丹麦公司(Qiagen Danmark)，哥本哈根，丹麦)分离基因组DNA。通过在14,000xg下离心2分钟收获来自以上培养物的真菌材料。除去上清液并且将0.5g球粒用石英砂在液氮中冷冻并且将其在预冷的研钵中研磨为细粉。将该粉末转移至15ml离心 管中，并添加5ml缓冲液AP1(预热至65℃)和10μl的RNA酶A母液(100mg/ml)，随后进行剧烈涡旋。在用常规反相(regular inverting)的试管在65℃下孵育10分钟后，通过温和混合向裂解液中添加1.8ml缓冲液AP2，随后在冰上孵育10min。然后将裂解液在室温在3000xg下离心5分钟，并且将上清液倾析进放置于50ml收集管中的QIAshredder大核酸纯化柱(maxi spin column)中。随后将其在室温在3000xg下离心5分钟。将贯流(flow-through)转移至一个新的50ml试管中并且添加1.5体积的缓冲液AP3/E，随后进行涡旋。将15ml的样品转移至放置于50ml收集管中的DNeasy大核酸纯化柱中并且在室温在3000xg下离心5分钟。将贯流丢弃并且向放置于50ml收集管中的DNeasy大核酸纯化柱中添加12ml的缓冲液AW，并且在室温在3000xg下离心10分钟。在丢弃贯流后，重复离心以处置剩余的醇。将DNeasy大核酸纯化柱转移至新的50ml试管中并且添加0.5ml缓冲液AE(预热至70℃)。在室温下孵育5分钟后，通过在室温在3000x g下离心5分钟对样品进行洗脱。用另外0.5ml的缓冲液AE重复洗脱并且将洗脱物合并。通过UV分光光度计在260nm测量收获的DNA的浓度。
实例3：包含对具有甘露聚糖酶活性的家族GH26多肽进行编码的Ascobolusstictoideus菌株QA026基因组序列的米曲霉表达载体的构建
设计了如下所示的两个合成寡核苷酸引物以从实例2中制备的基因组DNA PCR扩增Ascobolus stictoideus菌株QA026P335AW基因(SEQ ID NO:1)。使用IN-FUSIONTM克隆试剂盒(BD生物科学公司(BD Biosciences)，帕洛阿尔托(Palo Alto)，加利福尼亚州，美国)将片段直接克隆进表达载体pDau109中(WO 2005/042735)。
F-P335AW
5’-acacaactggggatccaccATGCGTTTCTCTCTCTGCGTCGG-3’(SEQ ID NO:7)
R-P335AW
5’-ccctctagatctcgagCCTTCCTCCTTTCCTAGCAGCT-3’(SEQ ID NO:8)
大写字母代表基因序列。加下划线的序列与pDau109的插入位点是同源的。
使用MJ Research PTC-200DNA引擎进行PCR反应。使用高保真PCR试剂盒(High-Fidelity PCR Kit)(FINNZYMES Oy公司，艾斯堡，芬兰)用于PCR扩增。PCR反应由5μl的5X HF缓冲液(飞酶公司，艾斯堡，芬兰)、0.5μl的dNTPs(10mM)、0.5μl的DNA聚合酶(0.2单位/μl)(飞酶公司，艾斯堡，芬兰)、2μl的引物F-P335AW(2.5μM)、2μl的引物R-P335AW(2.5μM)、0.5μl的Ascobolus stictoideus基因组DNA(100ng/μl)、以及14.5μl的去离子水组成，总体积为25μl。PCR条件 为：1个循环，在95℃持续2分钟。35个循环，各自为在98℃下持续10秒钟，在60℃下持续30秒钟，并且在72℃下持续2.5分钟；以及1个循环，在72℃下持续10分钟。然后将样品保持在12℃，直至从PCR仪中移出。
使用40mM Tris碱、20mM乙酸钠、1mM EDTA二钠(TAE)缓冲液，通过1.0％琼脂糖凝胶电泳分离反应产物，其中从凝胶切下1803bp产物带，并且根据厂商说明书，使用illustraPCR DNA和凝胶带纯化试剂盒(通用电气医疗集团生命科学部(GE Healthcare LifeSciences)，布隆德比，丹麦)进行纯化。然后使用IN-FUSIONTM克隆试剂盒，将片段克隆到BamHI和Xho I消化的pDau109中，生成质粒pP335AW。将P335AW基因克隆到Bam HI-Xho I消化的pDau109中，导致Ascobolus stictoideus P335AW基因在NA2-tpi双启动子的控制下进行转录。NA2-tpi是来自编码黑曲霉中性α-淀粉酶的基因的修饰的启动子，其中已经用来自编码构巢曲霉磷酸丙糖异构酶的基因的未翻译的前导子替换了未翻译的前导子。
根据产生P335AW GH26构建体的IN-FUSIONTM克隆试剂盒的说明进行克隆方案。根据厂商的方案将处理的质粒和插入片段转化进OneTOP 10F′化学感受态大肠杆菌细胞(英杰公司(Invitrogen)，卡尔斯巴德，加利福尼亚州，美国)中，并且将其铺板在补充有0.1mg的氨苄青霉素/ml的LB板上。在37℃下孵育过夜后，看到菌落在LB氨苄青霉素板上在选择下生长。将用P335AW GH26构建体转化的四个菌落在补充有0.1mg的氨苄青霉素/ml的LB培养基中进行培养并且根据厂商的方案，用凯杰(QIAprep)旋转迷你制备型(SpinMiniprep)试剂盒(凯杰公司，巴伦西亚，加利福尼亚州，美国)分离质粒。
用载体引物和P335AW基因特异性引物对分离的质粒进行测序以便确定不含PCR错误的代表性质粒表达克隆。
实例4：对具有甘露聚糖酶活性的P335AW GH26多肽进行编码的Ascobolusstictoideus QA026基因组序列的表征
用应用生物系统公司3700型全自动DNA测序仪(Applied Biosystems Model3700Automated DNA Sequencer)，使用版本3.1BIG-DYETM终止子化学(应用生物系统公司(Applied Biosystems,Inc.)，福斯特城，加州，美国)和引物步移策略进行Ascobolusstictoideus QA026P335AW GH26基因组克隆的DNA测序。仔细检查核苷酸序列数据的质量，并且借助PHRED/PHRAP软件(华盛顿大学，西雅图，华盛顿州，美国)将所有序列互相比较。
实例5：Ascobolus stictoideus GH26甘露聚糖酶P335AW的表达
将表达质粒pP335AW转化进米曲霉MT3568中。米曲霉MT3568是JaL355的AMDS(乙酰胺酶)破坏的衍生物(WO 02/40694)，其中在敲除米曲霉乙酰胺酶(AMDS)基因的过程中修复pyrG营养缺陷型。根据欧洲专利号 0238023，第14-15页中的方法制备MT3568原生质体，将其通过引用结合在此。
在使转化体在PDA板上形成孢子之前，在COVE蔗糖选择板上通过单个的分生孢子纯化转化体。从在30℃下在YP+2％葡萄糖培养基中的1ml 96深孔固定培养的培养上清液分析由转化体对Ascobolus stictoideus GH26多肽的产生。在E-Page 8％SDS-PAGE 48孔凝胶((英杰公司，卡尔斯巴德，加州，美国)上通过考马斯亮蓝染色验证表达。选择一个转化体用于进一步的工作并且将其指定为米曲霉17.4。
对于较大规模的生产，将米曲霉17.4孢子分散到PDA板上并且在37℃下孵育五天。用5ml的0.01％20将融合的孢子板洗涤两次，以使收集的孢子的数目最大化。然后使用孢子悬浮液接种包含150ml的Dap-4C培养基的十五个500ml烧瓶(WO 2012/103350)。将培养物在30℃下进行孵育，同时以100rpm进行恒定振荡。在接种后第四天，通过经由瓶盖MF75 Supor MachV 0.2μm PES过滤器(赛默飞世尔科技公司(Thermo Scientific)，罗斯基勒，丹麦)的过滤来收集培养液。来自这一转化体的新鲜的培养液产生大约67kDa的GH26蛋白的单个带。通过肽测序证实该带与Ascobolus stictoideus GH26多肽的一致性。在重组蛋白的表观的和观察到的大小之间的差异可能会归因于糖基化和/或其他翻译后修饰。
实例6：用于产生Ascobolus stictoideus GH26甘露聚糖酶P335AW的替代方法
基于被鉴定为SEQ ID NO:1的核苷酸序列，可以从多个销售商，例如基因艺术公司(Gene Art)(基因艺术公司生物园(GENEART公司BioPark)，约瑟夫-恩格特街11号(Josef-Engert-Str.11)，93053，雷根斯堡，德国)或DNA 2.0公司(DNA2.0，1430奥布赖恩大道(1430O'Brien Drive)，套房E，门洛帕克，加州94025，美国)获得合成基因。合成基因可以被设计成结合另外的DNA序列，例如限制酶切位点或同源重组区，以协助克隆到表达载体中。
使用上面描述的两种合成寡核苷酸引物F-P335AW和F-P335AW，可以使用一个简单的PCR反应来扩增来自SEQ ID NO:1的合成基因的全长开放读码框。然后可以将该基因克隆到例如如以上所述的表达载体中，并且在宿主细胞，例如在如以上所述的米曲霉中表达。
实例7：针对绿毛壳菌株CBS547.75的DNA序列信息的来源
从分离自绿毛壳菌株CBS547.75的基因组DNA，在新墨西哥州圣达非的基因组资源国家中心，通过IlluminaDNA测序，产生基因组序列信息。使用Abyss 1.2.0序列汇编程序(GSC软件中心，温哥华，加拿大)，分析基因组的初级装配。将由软件构建的基因模型用作检测基因组中的GH26同系物的起始点。使用多个作为向导的已知的GH26蛋白质序列构建更精确的基因模型。
实例8：绿毛壳菌株CBS547.75基因组DNA提取
为了生成用于PCR扩增的基因组DNA，将绿毛壳菌株CBS547.75通过在26℃生长7日在PDA琼脂平板上繁殖。使用从PDA板收获的孢子接种在带挡板的摇瓶中的25ml的YP+2％葡萄糖培养基里并且在26℃下孵育72小时，同时以85rpm搅拌。
根据改进的DNeasy Plant Maxi试剂盒方案(凯杰丹麦公司(Qiagen Danmark)，哥本哈根，丹麦)分离基因组DNA。通过在14,000x g下离心2分钟收获来自以上培养物的真菌材料。除去上清液并且将0.5g球粒用石英砂在液氮中冷冻并且将其在预冷的研钵中研磨为细粉。将该粉末转移至15ml离心管中，并添加5ml缓冲液AP1(预热至65℃)和10μl的RNA酶A母液(100mg/ml)，随后进行剧烈涡旋。在用常规反相(regular inverting)的试管在65℃下孵育10分钟后，通过温和混合向裂解液中添加1.8ml缓冲液AP2，随后在冰上孵育10min。然后将裂解液在室温在3000xg下离心5分钟，并且将上清液倾析进放置于50ml收集管中的QIAshredder大核酸纯化柱(maxi spin column)中。随后将其在室温在3000x g下离心5分钟。将贯流(flow-through)转移至一个新的50ml试管中并且添加1.5体积的缓冲液AP3/E，随后进行涡旋。将15ml的样品转移至放置于50ml收集管中的DNeasy大核酸纯化柱中并且在室温在3000xg下离心5分钟。将贯流丢弃并且向放置于50ml收集管中的DNeasy大核酸纯化柱中添加12ml的缓冲液AW，并且在室温在3000xg下离心10分钟。在丢弃贯流后，重复离心以处置剩余的醇。将DNeasy大核酸纯化柱转移至新的50ml试管中并且添加0.5ml缓冲液AE(预热至70℃)。在室温下孵育5分钟后，通过在室温在3000x g下离心5分钟对样品进行洗脱。用另外0.5ml的缓冲液AE重复洗脱并且将洗脱物合并。通过UV分光光度计在260nm测量收获的DNA的浓度。
实例9：包含对具有甘露聚糖酶活性的家族GH26多肽进行编码的绿毛壳菌株CBS547.75基因组序列的米曲霉表达载体的构建
设计了如下所示的两个合成寡核苷酸引物以从实例2中制备的基因组DNA PCR扩增绿毛壳菌株CBS547.75P335AV基因(SEQ ID NO:4)。使用IN-FUSIONTM克隆试剂盒(BD生物科学公司(BD Biosciences)，帕洛阿尔托(Palo Alto)，加利福尼亚州，美国)将片段直接克隆进表达载体pDau109中(WO 2005/042735)。
F-P335AV
5’-acacaactggggatccaccATGGACAAAATCCTCAGATACTTTCTCT-3’(SEQ ID NO:9)
R-P335AV
5’-ccctctagatctcgagCATGCTTTAACCGCCTGCAA-3’(SEQ ID NO:10)
大写字母代表基因序列。加下划线的序列与pDau109的插入位点是同源 的。
使用MJ Research PTC-200DNA引擎进行PCR反应。使用高保真PCR试剂盒(High-Fidelity PCR Kit)(FINNZYMES Oy公司，艾斯堡，芬兰)用于PCR扩增。PCR反应由5μl的5X HF缓冲液(飞酶公司，艾斯堡，芬兰)、0.5μl的dNTPs(10mM)、0.5μl的DNA聚合酶(0.2单位/μl)(飞酶公司，艾斯堡，芬兰)、2μl的引物F-P335AV(2.5μM)、2μl的引物R-P335AV(2.5μM)、0.5μl的绿毛壳基因组DNA(100ng/μl)、以及14.5μl的去离子水组成，总体积为25μl。PCR条件为：1个循环，在95℃持续2分钟。35个循环，各自为在98℃下持续10秒钟，在60℃下持续30秒钟，并且在72℃下持续2.5分钟；以及1个循环，在72℃下持续10分钟。然后将样品保持在12℃，直至从PCR仪中移出。
使用40mM Tris碱、20mM乙酸钠、1mM EDTA二钠(TAE)缓冲液，通过1.0％琼脂糖凝胶电泳分离反应产物，其中从凝胶切下1946bp产物带，并且根据厂商说明书，使用illustraPCR DNA和凝胶带纯化试剂盒(通用电气医疗集团生命科学部(GE Healthcare LifeSciences)，布隆德比，丹麦)进行纯化。然后使用IN-FUSIONTM克隆试剂盒，将片段克隆到BamHI和Xho I消化的pDau109中，生成质粒pP335AV。将P335AV基因克隆到Bam HI-Xho I消化的pDau109中，导致绿毛壳P335AV基因在NA2-tpi双启动子的控制下进行转录。NA2-tpi是来自编码黑曲霉中性α-淀粉酶的基因的修饰的启动子，其中已经用来自编码构巢曲霉磷酸丙糖异构酶的基因的未翻译的前导子替换了未翻译的前导子。
根据产生P335AV GH26构建体的IN-FUSIONTM克隆试剂盒的说明进行克隆方案。根据厂商的方案将处理的质粒和插入片段转化进OneTOP10F′化学感受态大肠杆菌细胞(英杰公司(Invitrogen)，卡尔斯巴德，加利福尼亚州，美国)中，并且将其铺板在补充有0.1mg的氨苄青霉素/ml的LB板上。在37℃下孵育过夜后，看到菌落在LB氨苄青霉素板上在选择下生长。将用P335AV GH26构建体转化的四个菌落在补充有0.1mg的氨苄青霉素/ml的LB培养基中进行培养并且根据厂商的方案，用凯杰(QIAprep)旋转迷你制备型(SpinMiniprep)试剂盒(凯杰公司，巴伦西亚，加利福尼亚州，美国)分离质粒。
用载体引物和P335AV基因特异性引物对分离的质粒进行测序以便确定不含PCR错误的代表性质粒表达克隆。
实例10：对具有甘露聚糖酶活性的P335AV GH26多肽进行编码的绿毛壳CBS547.75基因组序列的表征
用应用生物系统公司3700型全自动DNA测序仪，使用版本3.1BIG-DYETM终止子化学(应用生物系统公司，福斯特城，加州，美国)和引物步 移策略进行绿毛壳CBS547.75P335AVGH26基因组克隆的DNA测序。仔细检查核苷酸序列数据的质量，并且借助PHRED/PHRAP软件(华盛顿大学，西雅图，华盛顿州，美国)将所有序列互相比较。
实例11：绿毛壳GH26甘露聚糖酶P335AV的表达
将表达质粒pP335AV转化进米曲霉MT3568中。米曲霉MT3568是JaL355的AMDS(乙酰胺酶)破坏的衍生物(WO 02/40694)，其中在敲除米曲霉乙酰胺酶(AMDS)基因的过程中修复pyrG营养缺陷型。根据欧洲专利号0238023，第14-15页中的方法制备MT3568原生质体，将其通过引用结合在此。
在使转化体在PDA板上形成孢子之前，在COVE蔗糖选择板上通过单个的分生孢子纯化转化体。从在30℃下在YP+2％葡萄糖培养基中的1ml 96深孔固定培养的培养上清液分析由转化体对绿毛壳GH26多肽的产生。在E-Page8％SDS-PAGE 48孔凝胶(英杰公司，卡尔斯巴德，加州，美国)上通过考马斯亮蓝染色验证表达。选择一个转化体用于进一步的工作并且将其指定为米曲霉16.1。
对于较大规模的生产，将米曲霉16.1孢子分散到PDA板上并且在37℃下孵育五天。用5ml的0.01％20将融合的孢子板洗涤两次，以使收集的孢子的数目最大化。然后使用孢子悬浮液接种包含150ml的Dap-4C培养基的十五个500ml烧瓶(WO 2012/103350)。将培养物在30℃下进行孵育，同时以100rpm进行恒定振荡。在接种后第四天，通过经由瓶盖MF75Supor MachV 0.2μm PES过滤器(赛默飞世尔科技公司(Thermo Scientific)，罗斯基勒，丹麦)的过滤来收集培养液。来自这一转化体的新鲜的培养液产生大约67kDa的GH26蛋白的单个带。通过肽测序证实该带与绿毛壳GH26多肽的一致性。在重组蛋白的表观的和观察到的大小之间的差异可能会归因于糖基化和/或其他翻译后修饰。
实例12：用于产生绿毛壳GH26甘露聚糖酶P335AV的替代方法
基于被鉴定为SEQ ID NO:4的核苷酸序列，可以从多个销售商，例如基因艺术公司(Gene Art)(基因艺术公司生物园(GENEART公司BioPark)，约瑟夫-恩格特街11号(Josef-Engert-Str.11)，93053，雷根斯堡，德国)或DNA 2.0公司(DNA2.0，1430奥布赖恩大道(1430O'Brien Drive)，套房E，门洛帕克，加州94025，美国)获得合成基因。合成基因可以被设计成结合另外的DNA序列，例如限制酶切位点或同源重组区，以协助克隆到表达载体中。
使用上面描述的两种合成寡核苷酸引物F-P335AV和F-P335AV，可以使用一个简单的PCR反应来扩增来自SEQ ID NO:4的合成基因的全长开放读码框。然后可以将该基因克隆到例如如以上所述的表达载体中，并且在宿主细 胞，例如在如以上所述的米曲霉中表达。
实例13：来自Ascobolus stictoideus(SEQ ID NO:2的成熟多肽)和绿毛壳(SEQID NO:5的成熟多肽)的GH26甘露聚糖酶的纯化
将过滤液调节至pH 7.5并且在0.22μm PES过滤器(Nalge Nunc International公司，Nalgene labware cat#595-4520)上过滤。将滤液加载至在25mM HEPES(pH 7.5)中平衡的SephadexTM G-25(中等)(通用电气医疗集团，皮斯卡塔韦，新泽西州，美国)柱上。收集多个部分并且通过SDS-PAGE以及用分光光度分析来进行分析。用0.7CV的洗脱缓冲液进行洗脱，该洗脱缓冲液是与平衡缓冲液(25mM Hepes pH 7.5)相同的。将洗脱液收集在10ml的部分中。将包含相关蛋白的部分合并起来。
对于来自Ascobolus stictoideus的GH26甘露聚糖酶(SEQ ID NO:2的成熟多肽)，最终酶浓度是0.58mg/mL，并且对于来自绿毛壳的GH26甘露聚糖酶，最终酶浓度是0.75mg/mL。
SDS-PAGE方法的概述
4％-12％Bis-Tris凝胶(生命技术公司在MES SDS运行缓冲液(20X)(生命技术公司)中跑胶。将上样缓冲液制备为Tris-甘氨酸SDS样品缓冲液(2X)(生命技术公司)和样品还原剂(10X)(生命技术公司)的9:1混合物。在舒适型恒温混匀仪(Eppendorf公司)中，在750RPM，将样品与上样缓冲液1:1混合，并且在95℃加热5min。此后将样品迅速旋转减慢。样品混合物的上样量取决于孔的大小和样品中的蛋白浓度。将10μl LMW蛋白梯(通用电气医疗集团(GE Healthcare))用作标记物。将凝胶在250V跑胶28min，具有125mA和40W的最大值。通过用Instant BlueTM(Expedeon)染色，使蛋白条带可视化。
分光光度分析的概述
使用具有1cm光程的1ml比色杯，和给定蛋白的摩尔消光系数，在8453-UV-Vis分光光度计(安捷伦科技有限公司(Aglient Technologies))上，在280nm，用分光光度法估计纯化的样品的蛋白浓度。通过GPMAW 9.20(兆光数据公司(Lighthouse Data))，并且基于不具有修饰(例如糖基化)的成熟蛋白，评估所有蛋白的摩尔消光系数。为了避免背景干扰，将参比溶液测量为分光光度计上的空白样品。所有测量都是进行至少一式三份。
实例14：如通过还原端确定的甘露聚糖酶活性
在以下三种不同底物(都来自Megazyme公司)上测试纯化的甘露聚糖酶：角豆半乳甘露聚糖(半乳糖:甘露聚糖，1:3.5)(5mg/ml)，魔芋葡甘露聚糖(葡萄糖:甘露聚糖，1:1.5)(2.5mg/ml)，和瓜尔胶半乳甘露聚糖(半乳糖:甘露聚糖，1:1.6)(2.5mg/ml)。在使用的魔芋葡甘露聚糖中，每100个糖单元(葡萄糖和甘露糖二者)存在2.7个乙酸基团。
标准品和缓冲液
将甘露糖(西格玛(Sigma)，M2069)溶解在MiliQ水中，以用于制备甘露糖标准品。酶和底物稀释缓冲液：50mM乙酸(西格玛(Sigma)，33209)+0.01％trition x-100(西格玛(Sigma)，X100)，pH 5。用氢氧化钠设置该pH(西格玛(Sigma)，S8045)。
底物溶液的制备
在适当的烧杯中准确称出底物并且用96％乙醇(Kemetyl公司)湿润。添加磁力搅拌器棒并且随后添加稀释缓冲液至终体积的大约4/5。立即将烧杯放置在磁力搅拌器热板上并且搅拌和加热溶液直至沸腾。用铝箔松散地覆盖烧杯。当沸腾时，立即将烧杯转移至冰浴以冷却。将溶液转移至容量瓶中，并且将体积用稀释缓冲液调节至终体积。用磁力搅拌器混合溶液持续大约5min。
酶
与来自里氏木霉的已知GH5β-甘露聚糖酶(SEQ ID NO:11的成熟多肽，浓度0.66mg/mL)一起测试本发明的GH26甘露聚糖酶。
将这些甘露聚糖酶在稀释缓冲液中连续稀释，其中因子为3，分7个步骤，给出按以下倍数稀释的样品：3、9、27、81、243、729和2187。测试所有7个稀释品的每种甘露聚糖酶。为了确定初始速率，选择在曲线路径的一开始的线性范围中的、但是高于量化的极限值的浓度。
酶解
水解体积为200μl，180μl底物溶液和20μl稀释的酶(如实例13中所述进行纯化)，并且是在96孔平底微量滴定板(NuncTM公司)中进行。对于阴性对照，没有酶的孔(空白)加载有20μl稀释缓冲液。没有底物的孔被用来测量酶的自吸收并且包含180μl稀释缓冲液来代替底物。每个板包含加载为20μl甘露糖标准品和180μl稀释缓冲液的至少一个范围的甘露糖标准品。用粘性PCR密封箔片(赛默飞世尔科技公司)密封该板，并且在舒适型恒温混匀仪(Eppendorf公司)中，在37℃和950RPM孵育。水解进行15min并且当样品被转移至还原端测定(在此描述的)中的碱性条件时立即停止水解。通过还原端测定来评估甘露糖产率。
表1：GH5和GH26甘露聚糖酶对3个类型的甘露糖的初始水解速率
给定初始速率是两个重复的平均值。指明了±一个标准差。
表1中的结果示出本发明的GH26甘露聚糖酶降解3种不同类型的甘露聚糖：角豆半乳甘露聚糖、魔芋葡甘露聚糖和瓜尔胶半乳甘露聚糖，并且与来自里氏木霉的已知GH5甘露聚糖酶相比，具有显著更高的初始水解速率。
实例15：瓜尔胶半乳甘露聚糖的转化
使用不同酶加载测量使用本发明的GH26甘露聚糖酶造成的瓜尔胶半乳甘露聚糖至甘露聚糖酶的转化，并且将其与来自里氏木霉的GH5β-甘露聚糖酶(SEQ ID NO:11的成熟多肽)进行比较。如实例14中所述进行实验，并且结果呈现于表2和图1中。
表2：GH5和GH26甘露聚糖酶对瓜尔胶半乳甘露聚糖的转化百分数
表2和图1中的结果示出，与来自里氏木霉的已知GH5甘露聚糖酶相比，本发明的GH26甘露聚糖酶将显著更高量的瓜尔胶半乳甘露聚糖转化为甘露聚糖。
实例16.GH26的深度清洁作用
将分离自衣物的短波单胞菌属的菌株用于本实例，以便证明深度清洁作用，即对生物膜的破坏或除去的作用。使该菌株在30℃下于胰胨大豆琼脂(TSA)(pH 7.3)(CM0131；Oxoid有限责任公司，贝辛斯托克，英国)上预生长2-5天。将来自单菌落的满环物(loop-full)转移至10mL的TSB中并且伴随振荡(240rpm)于30℃下孵育16小时。繁殖后，通过离心(西格玛实验室离心机(Sigma Laboratory Centrifuge)6K15)(3000g，在21℃下，7min)沉淀细胞并且将其重悬于10mL用milliQ水稀释两次的TSB中。使用分光计(POLARstar Omega(BMG莱伯泰科(BMG Labtech)，奥滕贝格(Ortenberg)，德国))测量600nm处的光密度(OD)。将短波单胞菌属细 胞接种进用milliQ水稀释两次的新鲜TSB中至0.03的OD600nm，并且将1.6mL添加至12孔聚苯乙烯平底微板(3512；康宁公司(Corning Incorporated)，康宁，纽约，美国)的每个孔中，向该微板中放入无菌聚酯WFK30A的圆的小块布样(直径2cm)。伴随振荡(100rpm)在15℃下24h后，除去生长培养基，并且将小块布样用0.9％(w/v)NaCl冲洗两次。
在50mL试管中将五个冲洗的小块布样与五个无菌聚酯WFK30A小块布样混合，并且添加10mL的通过添加3.33g/l水中的包含以下项的模式洗涤剂A制备的洗涤液：12％LAS、11％AEO Biosoft N25-7(NI)、7％AEOS(SLES)、6％MPG、3％乙醇、3％TEA(三乙醇胺)、2.75％可可皂、2.75％大豆皂、2％甘油、2％氢氧化钠、2％柠檬酸钠、1％甲酸钠、0.2％DTMPA和0.2％PCA(所有百分数都是w/w)以及0.5ppm的GH26变体。平行地制成使用模式洗涤剂A而不添加酶的洗涤。在30℃下，将试管放入斯图尔特(Stuart)旋转器中，持续1小时。除去洗涤液，并且将小块布样用自来水冲洗两次并且在滤纸上干燥过夜。
使用Color Eye(Macbeth Color Eye 7000反射分光光度计)测量色差(L值)。在入射光中没有UV的情况下进行测量并且从CIE Lab色空间中提取L值。数据表示为ΔL值，意指用GH26变体洗涤的小块布样的L值减去不用酶洗涤的小块布样的L值。深度清洁作用被确定为高于三的ΔL。将来自Ascobolus stictoideus(SEQ ID NO:5)和来自绿毛壳(SEQ ID NO:2)的GH26甘露聚糖酶与商业GH5甘露聚糖酶产品Mannaway(可获得自诺维信公司(Novozymes A/S))进行比较。
实例17
质谱法(MS/MS)测序证实，测试的样品包含预期的蛋白：U19XX包含P335AV(SEQ IDNO:5)并且U19XY包含P335AW(SEQ ID NO:2)。
从SDS-PAGE分析观察到P335AW蛋白以具有不同分子量的两种形式存在。对于具有最低分子量的分子，N-端被鉴定为TPSVPRP(P335AW的序列(SEQ ID NO:2)中的氨基酸121-127)。这些分子的N-端CBM35已经被切掉 但是核心结构域是完整的。具有略微更高分子量的分子包含完整N-端CBM35。
在此描述的和要求的本发明并非是要用在此公开的特定方面来限定范围，因为这些方面的用意是要作为本发明若干方面的说明。预期任何等效方面都处于本发明的范围内。实际上，除在此所示和描述的那些之外，本发明的不同修改对于本领域普通技术人员而言从前述描述将变得清楚。此类修改也旨在落入所附权利要求书的范围内。在有冲突的情况下，以包括定义的本披露为准。

Claims (38)

1.一种具有甘露聚糖酶活性的多肽，该多肽选自下组，该组由以下各项组成：
(a)与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性的多肽；
(b)与SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:5的成熟多肽具有至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性的多肽；
(c)由如下多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸在非常低严格条件、低严格条件、中严格条件、中-高严格条件、高严格条件或非常高严格条件下与以下项杂交：
(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列，
(ii)其cDNA序列，或
(iii)(i)或(ii)的全长互补体；
(d)由如下多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸在中严格条件、中-高严格条件、高严格条件或非常高严格条件下与以下项杂交：
(i)SEQ ID NO:4的成熟多肽编码序列，
(ii)其cDNA序列，或
(iii)(i)或(ii)的全长互补体；
(e)由与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列或其cDNA序列具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性的多核苷酸编码的多肽；
(f)由与SEQ ID NO:4的成熟多肽编码序列或其cDNA序列具有至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性的多核苷酸编码的多肽；
(g)SEQ ID NO:3的变体或SEQ ID NO:2的成熟多肽，该变体或该成熟多肽在一个或多个(例如若干个)位置处包括取代、缺失、和/或插入；
(h)SEQ ID NO:6的变体或SEQ ID NO:5的成熟多肽，该变体或该成熟多肽在一个或多个(例如若干个)位置处包括取代、缺失、和/或插入；以及
(i)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)或(h)的多肽的片段，该片段具有甘露聚糖酶活性。
2.如权利要求1所述的多肽，该多肽选自下组，该组由以下各项组成：
(a)与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性的多肽；以及
(b)与SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:5的成熟多肽具有至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性的多肽。
3.如权利要求1-2中任一项所述的多肽，该多肽包括SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQID NO:5、SEQ ID NO:6或者SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:5的成熟多肽或由其组成。
4.如权利要求1-3中任一项所述的多肽，其中该成熟多肽对应于SEQ ID NO:2的氨基酸1至541、SEQ ID NO:2的氨基酸121至541或SEQ ID NO:5的氨基酸1至526。
5.一种包括催化结构域的多肽，该催化结构域选自下组，该组由以下各项组成：
(a)与SEQ ID NO:2的氨基酸128至446具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性的催化结构域；
(b)与SEQ ID NO:5的氨基酸135至448具有至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性的催化结构域；
(c)由如下多核苷酸编码的催化结构域，该多核苷酸在非常低严格条件、低严格条件、中严格条件、中-高严格条件、高严格条件或非常高严格条件下与以下项杂交：
(i)SEQ ID NO:1的核苷酸490至1446，
(ii)其cDNA序列，或
(iii)(i)或(ii)的全长互补体；
(d)由如下多核苷酸编码的催化结构域，该多核苷酸在中-高严格条件、高严格条件或非常高严格条件下与以下项杂交：
(i)SEQ ID NO:4的核苷酸599至1651，
(ii)其cDNA序列，或
(iii)(i)或(ii)的全长互补体；
(e)由与SEQ ID NO:1的核苷酸490至1446或其cDNA序列具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性的多核苷酸编码的催化结构域；
(f)由与SEQ ID NO:4的核苷酸599至1651或其cDNA序列具有至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性的多核苷酸编码的催化结构域；
(g)在一个或多个(例如若干个)位置处包括取代、缺失、和/或插入的SEQ ID NO:2的氨基酸128至446的变体；以及
(h)在一个或多个(例如若干个)位置处包括取代、缺失、和/或插入的SEQ ID NO:5的氨基酸135至448的变体；以及
(i)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)或(h)的催化结构域的片段，该片段具有甘露聚糖酶活性。
6.如权利要求5所述的多肽，该多肽进一步包括一个或多个碳水化合物结合模块。
7.一种包括可操作地连接至催化结构域的碳水化合物结合模块的多肽，其中该结合模块选自下组，该组由以下各项组成：
(a)与SEQ ID NO:2的氨基酸1至124具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性的碳水化合物结合模块；
(b)与SEQ ID NO:2的氨基酸508至541具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性的碳水化合物结合模块；
(c)与SEQ ID NO:5的氨基酸1至130具有至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性的碳水化合物结合模块；
(d)与SEQ ID NO:5的氨基酸492至526具有至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性的碳水化合物结合模块；
(e)由如下多核苷酸编码的碳水化合物结合模块，该多核苷酸在非常低严格条件、低严格条件、中严格条件、中-高严格条件、高严格条件或非常高严格条件下与以下项杂交：
(i)SEQ ID NO:1的核苷酸61至480，
(ii)其cDNA序列，或
(iii)(i)或(ii)的全长互补体；
(f)由如下多核苷酸编码的碳水化合物结合模块，该多核苷酸在中严格条件、中-高严格条件、高严格条件或非常高严格条件下与以下项杂交：
(i)SEQ ID NO:1的核苷酸1630至1731，
(ii)其cDNA序列，或
(iii)(i)或(ii)的全长互补体；
(g)由如下多核苷酸编码的碳水化合物结合模块，该多核苷酸在中严格条件、中-高严格条件、高严格条件或非常高严格条件下与以下项杂交：
(i)SEQ ID NO:4的核苷酸82至586，
(ii)其cDNA序列，或
(iii)(i)或(ii)的全长互补体；
(h)由如下多核苷酸编码的碳水化合物结合模块，该多核苷酸在中严格条件、中-高严格条件、高严格条件或非常高严格条件下与以下项杂交：
(i)SEQ ID NO:4的核苷酸1781至1885，
(ii)其cDNA序列，或
(iii)(i)或(ii)的全长互补体；
(i)由与SEQ ID NO:1的核苷酸61至480或其cDNA序列具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性的多核苷酸编码的碳水化合物结合模块；
(j)由与SEQ ID NO:1的核苷酸1630至1731或其cDNA序列具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性的多核苷酸编码的碳水化合物结合模块；
(k)由与SEQ ID NO:4的核苷酸82至586或其cDNA序列具有至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性的多核苷酸编码的碳水化合物结合模块；
(l)由与SEQ ID NO:4的核苷酸1781至1885或其cDNA序列具有至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性的多核苷酸编码的碳水化合物结合模块；
(m)在一个或多个(例如若干个)位置处包括取代、缺失、和/或插入的SEQ ID NO:2的氨基酸1至124的变体；以及
(n)在一个或多个(例如若干个)位置处包括取代、缺失、和/或插入的SEQ ID NO:2的氨基酸508至541的变体；以及
(o)在一个或多个(例如若干个)位置处包括取代、缺失、和/或插入的SEQ ID NO:5的氨基酸1至130的变体；以及
(p)在一个或多个(例如若干个)位置处包括取代、缺失、和/或插入的SEQ ID NO:5的氨基酸492至526的变体；以及
(q)具有碳水化合物结合活性的(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)、(j)、(k)、(l)、(m)、(n)、(o)或(p)的碳水化合物结合模块的片段。
8.一种包括如权利要求1-7中任一项所述的多肽的组合物。
9.如权利要求8所述的组合物，该组合物进一步包括一种或多种另外的酶。
10.如权利要求8-9中任一项所述的组合物，该组合物进一步包括一种或多种洗涤剂组分。
11.如权利要求8-9中任一项所述的组合物，该组合物进一步包括至少一种脂溶性维生素、和/或至少一种水溶性维生素、和/或至少一种痕量矿物质。
12.根据权利要求8-10中任一项所述的组合物的用途，用于降解甘露聚糖，例如直链甘露聚糖、半乳甘露聚糖、葡甘露聚糖和半乳葡甘露聚糖。
13.如权利要求12所述的用途，用于控制钻井液的粘度。
14.如权利要求12所述的用途，用于洗涤或清洁纺织品和/或硬表面，例如餐具洗涤。
15.如权利要求10所述的组合物的用途，用于洗衣和/或硬表面清洁，其中该组合物具有酶洗净益处。
16.一种用于降解甘露聚糖，例如直链甘露聚糖、半乳甘露聚糖、葡甘露聚糖和半乳葡甘露聚糖的方法，该方法包括将包含如权利要求1-7中任一项的组合物施加至该甘露聚糖。
17.如权利要求16所述的方法，其中该甘露聚糖在纺织品的表面上或硬表面上，例如餐具洗涤。
18.如权利要求16所述的方法，其中该甘露聚糖在由钻井孔造成的地下地层的压裂中使用。
19.如权利要求18所述的方法，其中该甘露聚糖是钻孔滤饼中的组分。
20.一种用于产生咖啡提取物的方法，该方法包括以下步骤：
(a)提供经烘烤且研磨的咖啡豆；
(b)向所述咖啡豆添加水和如权利要求1-7中任一项所述的多肽；
(c)孵育以制造水性咖啡提取物；并且
(d)从提取的咖啡豆分离该咖啡提取物。
21.如权利要求20所述的方法，其中步骤(b)进一步包括添加具有β-1,3-半乳聚糖酶活性的酶。
22.一种用于降解纤维素材料的方法，该方法包括：在如权利要求1-7中任一项所述的具有甘露聚糖酶活性的多肽的存在下，用酶组合物处理该纤维素材料。
23.一种用于生产发酵产物的方法，该方法包括：
(a)在如权利要求1-7中任一项所述的具有甘露聚糖酶活性的多肽的存在下，用酶组合物糖化纤维素材料；
(b)用一种或多种发酵微生物对该糖化的纤维素材料进行发酵，以产生该发酵产物；并且
(c)从该发酵中回收该发酵产物。
24.如权利要求22-23中任一项所述的方法，其中对该纤维素材料进行预处理。
25.如权利要求22-24中任一项所述的方法，其中该酶组合物包括选自下组的一种或多种酶，该组由以下各项组成：纤维素酶、AA9多肽、半纤维素酶、酯酶、棒曲霉素、木质素分解酶、氧化还原酶、果胶酶、蛋白酶、以及膨胀蛋白。
26.一种发酵纤维素材料的方法，该方法包括：用一种或多种发酵微生物发酵该纤维素材料，其中在如权利要求1-7中任一项所述的具有甘露聚糖酶活性的多肽的存在下，用酶组合物糖化该纤维素材料。
27.如权利要求26所述的方法，其中在糖化之前对该纤维素材料进行预处理。
28.如权利要求26-27中任一项所述的方法，其中该酶组合物包括选自下组的一种或多种酶，该组由以下各项组成：纤维素酶、AA9多肽、半纤维素酶、酯酶、棒曲霉素、木质素分解酶、氧化还原酶、果胶酶、蛋白酶、以及膨胀蛋白。
29.编码如权利要求1-7中任一项所述的多肽的多核苷酸。
30.一种核酸构建体或表达载体，该核酸构建体或表达载体包含如权利要求29所述的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至指导该多肽在表达宿主内的产生的一个或多个控制序列。
31.一种重组宿主细胞，该重组宿主细胞包括如权利要求29所述的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至指导该多肽的产生的一个或多个控制序列上。
32.一种产生如权利要求1-7中任一项所述的多肽的方法，该方法包括：
(a)在有益于产生该多肽的条件下培养细胞，该细胞以其野生型形式产生该多肽；并且
(b)回收该多肽。
33.一种产生如权利要求1-7中任一项所述的多肽的方法，该方法包括：
(a)在有益于产生该多肽的条件下培养如权利要求31所述的宿主细胞；并且
(b)回收该多肽。
34.一种用多核苷酸转化的转基因植物、植物部分或植物细胞，该多核苷酸编码如权利要求1-7中任一项所述的多肽。
35.一种产生如权利要求1-7中任一项所述的多肽的方法，该方法包括：
(a)在有益于生产该多肽的条件下，培养如权利要求34所述的转基因植物或植物细胞；并且
(b)回收该多肽。
36.一种包括如权利要求1-7中任一项所述的多肽的全培养液配制品或细胞培养组合物。
37.根据权利要求1所述的多肽的用途，用于从物品上防止、减少或除去生物膜。
38.根据权利要求37所述的用途，其中从该物品上减少或除去恶臭。
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