CN105907703B - 一种诱导骨髓间充质干细胞向肝样细胞分化的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种诱导骨髓间充质干细胞向肝样细胞分化的方法，括：分离培养骨髓充质干细胞，收集肝再生12h的血清，用再生12h的肝脏制成肝组织匀浆，所述骨髓充质干细胞在所述血清和所述肝组织匀浆中诱导培养。本发明提供的诱导骨髓间充质干细胞向肝样细胞分化的方法，诱导后的肝样细胞完全具有肝细胞特征。
Description
技术领域
本发明涉及细胞分子生物学领域，尤其涉及一种诱导骨髓间充质干细胞向肝样细胞分化的方法。
背景技术
肝脏移植是目前治疗各种终末期肝病的有效方法，但由于供体来源受限、费用昂贵、免疫排斥等因素而难以大量推广，因而限制了临床肝移植的应用。随着组织工程的兴起和发展，细胞替代治疗将成为攻克一些疑难病症的新途径。骨髓间充质干细胞(bonemesenchymal stem cells, BMSCs)具有强大的增殖能力，较强的多向分化潜能，免疫排斥反应低，来源广泛，取材容易，损伤小，不存在伦理问题，并且具有良好的组织相容性，有望成为治疗终末期肝病的一种新型种子细胞。因此，探索各种诱导骨髓间充质干细胞向肝脏细胞分化的方法，对于临床治疗的推广有着重要的意义。
现有技术中，诱导骨髓间充质干细胞向肝脏细胞分化的方法，由于诱导的不是最佳的生理环境，因此诱导后的肝样细胞多不完全具有肝细胞的特征。
发明内容
本发明的目的是提供一种诱导骨髓间充质干细胞向肝样细胞分化的方法，诱导后的肝样细胞完全具有肝细胞特征。
为了解决上述技术问题，本发明提供的诱导骨髓间充质干细胞向肝样细胞分化的方法是这样实现的：
一种诱导骨髓间充质干细胞向肝样细胞分化的方法，包括：分离培养骨髓充质干细胞，收集肝再生12h的血清，用再生12h的肝脏制成肝组织匀浆，所述骨髓充质干细胞在所述血清和所述肝组织匀浆中诱导培养。
可选的，所述骨髓充质干细胞在所述血清和所述肝组织匀浆中诱导培养中所述骨髓充质干细胞为3代细胞。
可选的，所述血清的浓度为10%。
可选的，所述肝组织匀浆的浓度为10%。
可选的，所述骨髓充质干细胞使用贴壁法培养。
可选的，所述用再生12h的肝脏制成肝组织匀浆包括：肝再生12h小时后，切除肝脏，按200mg肝组织/ml L-DMEM的比例加入培养基，冰上匀浆，4℃、12 000 r/min离心25min，取上清液制成损伤肝组织匀浆。
本发明提供的诱导骨髓间充质干细胞向肝样细胞分化的方法，血清是由血浆去除纤维蛋白原而形成的一种很复杂的混合物，含有各种血浆蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生长因子、激素、无机物等；在大鼠肝中，DNA在部分肝切除后约12h开始复制，24h达到高峰；在部分肝切除后12h诱导细胞分化、增殖的因子要多于24h；使用肝再生12h的血清和再生12h的肝脏制成肝组织匀浆作为诱导环境，诱导环境更接近大鼠的生理状态，试验结果表明，AFP和ALB在未加入肝组织匀浆和血清的BMSCs细胞中不表达。AFP在加入血清和肝组织匀浆诱导培养14 d表达量最多，随着时间的延长表达量降低；ALB在加入血清和肝组织匀浆诱导培养21 d表达量最多；诱导7天可检测到尿素，随诱导时间的延长，尿素表达量上升；因此本发明诱导骨髓间充质干细胞向肝样细胞分化的方法，诱导环境更接近生理状态，诱导培养的肝样细胞更接近生理状态、肝样细胞更成熟。
本发明贴壁培养骨髓间充质干细胞具有操作简便、快速、对细胞活性影响小。
附图说明
图1是本发明提供的骨髓间充质干细胞经诱导后Western blot 免疫印迹甲胎蛋白和白蛋白的表达比较图；
图2是本发明提供的骨髓间充质干细胞经诱导后肝功能代谢检测尿素含量曲线对比图。
具体实施方式
本发明目的在于寻找肝细胞移植需要的合适的肝细胞来源，研究不同诱导方法对骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)在体外分化为肝细胞样细胞的影响。
本发明所使用材料，L-DMEM培养基购自美国Gibco公司，胎牛血清购自美国Hyclone公司，胰蛋白酶购自美国Sigma公司，白蛋白(Albumin,ALB)和甲胎蛋白(α-fetoprotein, FP或AFP)单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司，SD大鼠购自新乡医学院实验动物中心，清洁级，实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。
本发明分别设置四组试验，A组为仅用胎牛血清（ FBS ，fetal bovine serum) 作为培养介质，B第二组以FBS和再生12h的肝组织匀浆为诱导BMSCs的介质，C第三组以肝再生12h的血清为诱导BMSCs的介质，D组以肝再生12h的血清和再生12h的肝脏制成肝组织匀浆为诱导BMSCs的介质，参照对比最佳的诱导骨髓充质干细胞向肝养细胞分化的方法。具体如下：
一、大鼠BMSCs的分离、培养
颈椎脱臼法处死4-6周龄雄性健康SD大鼠（体重100-150 g），于无菌条件下分离双侧下肢股骨、胫骨，用培养基冲出骨髓于离心管中，吹打制成单细胞悬液。1 000 r/min，离心5 min，弃上清液，用培养基重悬。将细胞接种于培养瓶中，置于37 ℃、体积分数为0.05的CO2培养箱中培养。48 h半量换液，之后每3天全量换液。待细胞铺满培养瓶约80%时可进行传代。一般1:3接种传代。
二、血清和肝组织匀浆制备
乙醚麻醉大鼠，无菌条件下从剑突下方约1-2cm处沿腹中线打开腹腔，切除肝左叶和中叶（约占全肝重的68%），缝合伤口并撒上磺胺防止感染，术后常规喂养。12h后心脏抽取全血，制备血清，-20℃保存备用；取出大鼠再生肝组织，按200mg肝组织/ml L-DMEM的比例加入培养基，冰上匀浆，4℃、12 000 r/min离心25min，取上清液作为损伤肝组织匀浆，0.22μm滤膜过滤后-20℃保存。
三、诱导BMSCs分化
取第3代细胞，将2×104个细胞接种在35mm的培养皿中，37℃、5% CO2培养，A组试验的培养基为含有青霉素100 U/mL、链霉素100 U/mL+10%FBS的L-DMEM；B组试验的培养基为含有青霉素100 U/mL、链霉素100 U/mL+10%大鼠肝再生12h肝组织匀浆的L-DMEM；C组试验的培养基为含有青霉素100 U/mL、链霉素100 U/mL+10%大鼠肝再生12h血清的L-DMEM；D组试验的培养基为含有青霉素100 U/mL、链霉素100 U/mL+10%大鼠肝再生12h的血清+10%大鼠肝再生12h肝组织匀浆的L-DMEM。诱导0、7、14、21d在倒置显微镜下观察细胞形态，每3d换液1次。
具体的检测如下：
检测统计学分析：以α=0.05为检验水准，用SPSS13.0统计软件分析，采用重复测量数据的两因素方差分析。
一、免疫荧光检测
分别于诱导的7、14、21 d收集细胞，制作细胞涂片。以4%多聚甲醛溶液固定10min，PBS冲洗3次，0.1% Triton X-100孵育10min，10%羊血清室温封闭30 min，0.3% H202处理15min，分别加入ALB或AFP一抗4℃孵育过夜，PBS冲洗后加入经Biotin标记的二抗和Streptavidin-FITC孵育60min，在荧光显微镜(日本Nicon公司)下观察拍照。统计结果显示，AFP和ALB阳性细胞率在四组中，D组最多，B组优于C组，A组不表达AFP和ALB,如表1所示。
表1 AFP和ALB在不同诱导方法中的阳性细胞率
-:阴性; ± : 少量阳性; +: 20%-30% 阳性; ++:30%-40%阳性; +++: 40%-50%阳性；++++: 50%-60%阳性
二、Western blot 免疫印迹分析
取于诱导的0、7、14、21 d的细胞检测ALB、AFP的表达。12%SDS-PAGE凝胶电泳，80mV2h，将蛋白质电转到PVDF膜上，ALB、AFP分别孵育1h后，加入辣根过氧化物酶标记的二抗，ECL法显色。
收集第二组试验和第三组试验不同时间点的细胞，Western blot检测ALB、AFP的表达。结果显示，AFP和ALB阳性细胞率在四组中，D组最多，B组优于C组，A组不表达AFP和ALB,如表1所示。
ALB、AFP在四组中，D组表达量多，B组多于C组，A组不表达。如图1所示。
三、肝细胞功能检测
在诱导的0、7、14、21 d收集培养细胞上清液，采用谷氨酸脱氢酶法检测上清液中尿素含量，观察其动态变化趋势，绘制尿素含量变化曲线。如图2所示。
将各组各时间点上清液中尿素浓度绘制成折线图。A组在各个时间点均检测不到尿素。其余三组随诱导时间的延长，尿素表达量上升，但D组诱导的尿素含量大于B组和C组（P <0.05）。
大鼠肝脏在正常的生理状态下仅有约0.0012％～0.01％的细胞进行有丝分裂。在毒物造成的损伤或手术切除后，肝脏细胞可以迅速开始增生并很快恢复肝。而肝大部分切除术后的再生肝组织匀浆则可能包含全部刺激因子和营养成分。且在大鼠肝中，DNA在部分肝切除后约12h开始复制，24h达到高峰；在部分肝切除后12h诱导细胞分化、增殖的因子要多于24h。血清是由血浆去除纤维蛋白原而形成的一种很复杂的混合物，血清组成及含量常随供血动物的性别、年龄、生理条件和营养条件不同而异。血清中含有各种血浆蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生长因子、激素、无机物等，成份可能有几百种之多。
因此，本发明使用部分肝切除12h后大鼠肝组织匀浆和部分肝切除12h大鼠肝脏血清进行诱导分化，让促使肝细胞生长的因子、激素和其他调节因子共同发挥作用，诱导的肝样细胞更接近生理状态。具体分析如下：
AFP是一种胞浆蛋白，由肝前体细胞分泌，随着细胞逐渐成熟而消失，成熟的肝细胞不表达AFP。ALB是健康人血浆中含量最多的蛋白质，ALB在肝细胞内合成后，分泌进入血液循环而分布到身体各处。ALB是最常用和最可靠的肝细胞功能检测指标，因为ALB主要由肝细胞合成分泌，其他组织细胞分泌极少。肝脏可以将氨基酸代谢产生的氨合成尿素，经肾脏排出体外。尿素主要在肝脏合成，其他器官如肾和脑作用甚微。我们的实验结果表明未经部分肝切除大鼠肝组织匀浆诱导的BMSCs不表达AFP、ALB和尿素。经胎牛血清和再生24h的肝组织匀浆诱导的AFP、ALB和尿素的表达均少于经肝再生12h的血清和再生12h的肝脏制成肝组织匀浆诱导的AFP、ALB和尿素的表达。经肝再生12h的血清和再生12h的肝脏制成肝组织匀浆诱导的BMSCs 14 d时AFP表达达到高峰，随着时间的延长表达量降低；ALB和尿素在加入肝再生12h的血清和再生12h的肝脏制成肝组织匀浆培养7 d有少量表达，随着时间的延长表达量升高，21 d表达量最多。多个指标的联合检测结果，支持BMSCs向成熟肝细胞方向分化，且随着诱导时间的延长，具有肝细胞分泌白蛋白、合成尿素功能的细胞逐渐增多，提示此类细胞具有成熟肝细胞的功能，成功的完成了体外诱导大鼠BMSCs向肝细胞的分化。
本实验所检测的肝细胞表型和肝细胞功能两个方面的多个指标，随着诱导培养时间的延长，标志逐渐出现和趋向成熟。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种诱导骨髓间充质干细胞向肝样细胞分化的方法，其特征在于，包括：分离培养骨髓充质干细胞，收集肝再生12h的血清，用再生12h的肝脏制成肝组织匀浆，所述骨髓充质干细胞在所述血清和所述肝组织匀浆中诱导培养；所述血清的浓度为10%，所述肝组织匀浆的浓度为10%。
2.根据权利要求1中所述的诱导骨髓间充质干细胞向肝样细胞分化的方法，其特征在于，所述骨髓充质干细胞在所述血清和所述肝组织匀浆中诱导培养中所述骨髓充质干细胞为3代细胞。
3.根据权利要求1或2所述的诱导骨髓间充质干细胞向肝样细胞分化的方法，其特征在于，所述用再生12h的肝脏制成肝组织匀浆包括：肝再生12h小时后，切除肝脏，按200mg肝组织/ml L-DMEM的比例加入培养基，冰上匀浆，4℃、12 000 r/min离心25min，取上清液制成损伤肝组织匀浆。
4.根据权利要求3所述的诱导骨髓间充质干细胞向肝样细胞分化的方法，其特征在于，所述骨髓充质干细胞使用贴壁法培养。
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