CN105879124B

CN105879124B - 一种注射用左旋聚乳酸填充剂及其制备方法

Info

Publication number: CN105879124B
Application number: CN201610263435.4A
Authority: CN
Inventors: 刘建建; 耿凤; 杨莹莹; 苏江伟; 张燕; 郭学平
Original assignee: BLOOMAGE FREDA BIOPHARM Co Ltd
Current assignee: Huaxi Biotechnology Co., Ltd.
Priority date: 2016-04-26
Filing date: 2016-04-26
Publication date: 2019-03-19
Anticipated expiration: 2036-04-26
Also published as: CN105879124A

Abstract

本发明公开了一种注射用左旋聚乳酸填充剂及其制备方法，该填充剂有效成分为左旋聚乳酸微粒、蜂巢HA和增效剂，所述蜂巢HA是将高分子量的透明质酸钠和低分子量的透明质酸钠复配而成的水溶液在碱性条件下醇沉、干燥而得；所述增效剂为甘露醇，或者为质量比1:0.05‑0.12的甘露醇和芦荟多糖的混合物。本发明填充剂制备简单，复悬时间更短、有效期长，使用更加方便。

Description

一种注射用左旋聚乳酸填充剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种注射用左旋聚乳酸填充剂及其制备方法，属于高分子医疗用品技术领域。

背景技术

聚乳酸（Polylactic acid，PLA）是20世纪90年代迅速发展起来的新一代可完全降解高分子材料，它是以微生物发酵产物乳酸为单体，用化学合成方法聚合而成的，是热塑性脂肪族树脂的一种。合成聚乳酸的原料其分子中含有一个手性碳原子，具有旋光性。因此，聚乳酸具有左旋聚乳酸（PLLA）、右旋聚乳酸（PDLA）、外消旋聚乳酸（D，L-PLA）和内消旋聚乳酸（meso-PLA）等几种不同的旋光异构聚合体。

PLLA在美容注射领域应该较为广泛，其作为美容注射用材料有其独特之处。与单纯填充剂不同，PLLA是一种可以刺激皮下胶原蛋白生长的人工合成真皮填充剂。PLLA可以引起一种异物巨细胞反应，从而导致胶原蛋白逐渐生成。这个过程中，PLLA聚合状态和分子结构被分解破坏，通过非酶水解缓慢降解为乳酸，最终降解为CO₂和H₂O。在降解过程中，这些乳酸可刺激胶原形成，导致真皮内纤维素增生产生想要的美容效果，随着时间的增加使真皮层增厚，填充部位完全被新生的自体组织代替，得到一个“永久性美容”的效果。

目前国内市场尚没有左旋聚乳酸填充剂产品上市，国外市场只有美国赛诺菲-安万特公司（Sanofi-aventis U.S.）的Sculptra和Sculptra Aesthetic产品在FDA批准上市。Sculptra和Sculptra Aesthetic采用了CMC-Na作为左旋聚乳酸微粒的助悬剂，CMC-Na存在两方面问题：一是CMC-Na不是人体内源性物质，生物相容性没有透明质酸好；二是CMC-Na作为助悬剂时，Sculptra和Sculptra Aesthetic需要很长时间（一般为2 h左右）的水化作用才能用于皮内注射，作为美容注射填充剂，给患者的应用带来不便。此外，Sculptra和Sculptra Aesthetic水化结束后注射前需要将填充剂混匀后才能注射，这就使得聚乳酸微粒不能够充分混匀，容易聚集，从而造成皮下结节的出现。

目前，国内对左旋聚乳酸填充剂研究较少，相关专利也较少，公布号为CN104258470 A的专利介绍了一种注射用聚乳酸微球和交联透明质酸混合凝胶及其制备方法，该混合凝胶由聚乳酸微球和交联透明质酸凝胶的盐溶液组成，聚乳酸微球的分子量为15-120kDa，平均粒径为10-150微米。该专利产品聚乳酸微球是在含水凝胶环境中保存，研究发现，PLLA微粒在含水环境下不能长时间稳定存在，储存超过1个月时就可能发生微球结构坍塌或微粒黏连等，可见，该混合凝胶存在稳定性差、有效期短等缺点。公布号为CN104147640 A的专利介绍了一种由右旋聚乳酸高分子树脂制备成的微米与纳米级的整形美容填充颗粒及其制备方法，这种颗粒的粒径为50至0.45微米，由右旋聚乳酸和氨基酸组成，还可以含有甘露醇或其他小分子物质作为赋形剂。但是，该专利产品中的右旋聚乳酸纳米微粒在人体中降解生成的D-乳酸无法被人体直接吸收，容易造成局部的D-乳酸积累。

发明内容

针对目前左旋聚乳酸填充剂较少、填充剂水化时间长、注射后容易造成皮下结节等不足，提供了一种注射用左旋聚乳酸填充剂及其制备方法，该填充剂为固态，保质期长、稳定性好，且通过有效成分的选择，填充剂水化混匀时间大大缩短，聚乳酸微粒也更容易分散均匀，减少了皮下结节的出现，为美容注射领域提供了新的选择。

本发明还提供了上述填充剂的制备方法，该方法操作简单、易于实施，制得的填充剂性能更优。

本发明具体技术方案如下：

一种注射用左旋聚乳酸填充剂，该填充剂有效成分为左旋聚乳酸微粒、蜂巢HA和增效剂，所述蜂巢HA是将高分子量的透明质酸钠和低分子量的透明质酸钠复配而成的水溶液在碱性条件下醇沉、干燥而得；所述增效剂为甘露醇，或者为质量比1:0.05-0.12的甘露醇和芦荟多糖的混合物。

上述填充剂中，由左旋聚乳酸微粒、蜂巢HA和增效剂复配而成。所述蜂巢HA是由高分子HA和低分子HA复配而得，在水溶液中，HA分子由于氢键的作用呈螺旋状态，当高分子量HA和低分子量HA在碱性环境下达到一定浓度和比例时，HA分子间逐渐由螺旋结构变成网状结构，最后变成类似蜂巢结构。蜂巢HA在水溶液中具有亲体仿生性的类蜂巢结构，可以更好的分散聚乳酸微粒，防止其聚集，从而减少由于聚乳酸分布不均造成的皮下结节的出现；而且经过碱性醇沉后，蜂巢HA其溶解速度较普通HA更快，减少了产品水化混匀时间。增效剂为甘露醇或甘露醇与芦荟多糖的混合物，所述甘露醇是一种抗氧化物，能够清除氧自由基，提高肤感，并且较高浓度的甘露醇能够明显抑制HA的降解，延长填充时间。所述芦荟多糖具有美白保湿、抗氧化、消炎、修复肌肤、延缓衰老的作用，能够减缓皮肤注射时的炎症反应，也能抑制HA的降解。同时，甘露醇和芦荟多糖还能够促进产品冻干成型，与单一甘露醇相比更有利于产品复悬，进一步减少了产品混匀时间。

进一步的，甘露醇和芦荟多糖的质量比1:0.083。

本发明所用的蜂巢HA是以高分子量和低分子量的透明质酸钠为原料经过处理得到的。高分子量的透明质酸钠的分子量优选为1000～3000 kDa，低分子量的透明质酸钠的分子量优选为1～500 kDa。

进一步的，所述蜂巢HA中，高分子量的透明质酸钠与低分子量的透明质酸钠的复配质量比为：1:9~9:1。

进一步的，蜂巢HA是按以下方法制得的：将高分子量的透明质酸钠和低分子量的透明质酸钠溶于水中，充分搅拌均匀后调节溶液pH至8-13，然后在搅拌下加入体积分数为95%的乙醇或95%的甲醇溶液进行醇沉，过滤除去上层液体，剩余沉淀用体积分数为75~80%的乙醇或75~80%的甲醇溶液洗涤脱盐，脱盐三次后，将沉淀用无水乙醇、无水甲醇或无水丙酮脱水、干燥，得到蜂巢HA。图8是原子力显微镜下蜂巢HA的微观结构图，原子力显微镜的参数为：Multimode Nanoscope VIII，探针是XSC11，扫描模式是scanasyst，扫描速度是1Hz，分辨率是512×512。从图中可以看出，蜂巢HA具有亲体仿生性的类蜂巢结构。

进一步的，所述左旋聚乳酸的分子量为30000~100000 Da，优选分子量为30000~60000 Da。

进一步的，所述左旋聚乳酸为形状不规则的微米级颗粒（简称微粒），或者为形状规则的微球。左旋聚乳酸的粒径为微米级，粒径一般为15~75 μm，优选为20~50 μm。

本发明注射用左旋聚乳酸填充剂为固体制剂，优选为冻干粉。这样可以保证左旋聚乳酸一直处于无水状态下储存，不会存在左旋聚乳酸微球结构坍塌或左旋聚乳酸微粒黏连，延长了填充剂的稳定性和有效期。

进一步的，在填充剂中，左旋聚乳酸在填充剂中的质量百分比含量为10-60%，所述蜂巢HA在填充剂中的质量百分比含量为10%~20%，所述增效剂在填充剂中的质量百分比含量为20%~80%。上述含量中，各有效成分的含量均指的是有效成分在填充剂固体制剂中的含量。

优选的，左旋聚乳酸在填充剂中的质量百分比含量为40%-50%，所述蜂巢HA在填充剂中的质量百分比含量为10%~20%，所述增效剂在填充剂中的质量百分比含量为30%-60%。

最优选的，左旋聚乳酸在填充剂中的质量百分比含量为41%，所述蜂巢HA在填充剂中的质量百分比含量为11%，所述增效剂在填充剂中的质量百分比含量为48%。

本发明还提供了上述注射用左旋聚乳酸填充剂的制备方法，该方法包括以下步骤：

（1）将高分子量的透明质酸钠和低分子量的透明质酸钠溶于水中，充分搅拌均匀后调节溶液pH至8-13，然后在搅拌下加入体积分数为95%的乙醇或95%的甲醇溶液进行醇沉，过滤除去上层液体，剩余沉淀用体积分数为75~80%的乙醇或75~80%的甲醇溶液洗涤脱盐，脱盐三次后，将沉淀用无水乙醇、无水甲醇或无水丙酮脱水、真空干燥，得到蜂巢HA；

（2）将蜂巢HA与增效剂溶于水中，得蜂巢HA与增效剂的混合液；

（3）取左旋聚乳酸微粒或微球，加入蜂巢HA与增效剂的混合液中，搅拌均匀后将pH调节至中性，冷冻干燥，得注射用左旋聚乳酸填充剂。

上述方法制得的填充剂为冻干粉。

上述步骤（1）中，水的用量满足将透明质酸钠完全溶解即可，可以根据实际情况进行调整。

上述步骤（1）中，高低分子量的透明质酸钠搅拌均匀后再调节pH至8-13，然后在同样的转速下加入乙醇或甲醇溶液进行醇沉。搅拌速度可以选择200-250r/min。

上述步骤（1）中，用氢氧化钠调节pH。

上述步骤（2）中，水的用量满足将蜂巢HA与增效剂完全溶解即可，可以根据实际情况进行调整。

上述步骤（3）中，搅拌转速可以为500-600 r/min。

优选的，上述步骤（3）采用特殊的搅拌方式使有效成分充分混合，具体为：搅拌按照正向、反向交替搅拌30s的方式进行，共搅拌20-40min。由于正反向交替搅拌，混合物中有微小气泡产生，这些微小气泡使冻干后的样品质地更加疏松，减少了产品应用时的水化混匀时间。

进一步的，搅拌时，转子离液面的深度为液面高度的30-40%时效果较佳。

上述制备方法中，所用的左旋聚乳酸微粒或微球可以市购，也可以按照现有技术中公开的方法自行制备。本发明的具体技术方案中，采用机械法制备左旋聚乳酸微粒，采用乳化-溶剂挥发法制备左旋聚乳酸微球。

机械法制备左旋聚乳酸微粒的具体方法为：在工作压力为0.2~0.8 MPa、左旋聚乳酸的进料速度为30~100 g/min的条件下，用气流粉碎机粉碎左旋聚乳酸，得到的微粒用pH6.0的盐酸溶液浸润洗涤两次，真空干燥，得左旋聚乳酸微粒。

为了使左旋聚乳酸微粒的粒度更为集中，还可以对所得微粒进行进一步的悬浮筛分处理，具体为：将得到的微粒用pH 6.0的盐酸溶液浸润洗涤两次后，将微粒转移至孔径10μm的微孔滤器中并浸于pH 6.0的体积浓度15%~20%的乙醇溶液中，在搅拌下通过死端过滤筛分出微小颗粒，然后真空干燥，得到粒度集中的左旋聚乳酸微粒。

乳化-溶剂挥发法制备左旋聚乳酸微球的具体方法为：将左旋聚乳酸溶于二氯甲烷中，配成质量浓度为2.5%~4%的溶液，按照左旋聚乳酸和聚乙烯醇1:0.8的质量比，将左旋聚乳酸二氯甲烷溶液在200~800 r/min搅拌下缓慢注入浓度为0.1%~0.2%（w/v）的聚乙烯醇（PVA）水溶液中，室温下搅拌乳化;乳化完成后，常压或减压下搅拌挥发除去二氯甲烷，剩余反应液过滤收集滤饼，洗涤即得左旋聚乳酸微球。

为了使左旋聚乳酸微球的粒度更为集中，也可以按照上述方法对微球进行悬浮筛分处理，具体为：将洗涤得到的左旋聚乳酸微球转移至孔径10 μm的微孔滤器中并浸于pH6.0的体积浓度15%~20%的乙醇的混合溶液中，在搅拌下通过死端过滤筛分出微小微球，然后真空干燥，得到粒度集中的左旋聚乳酸微球。

本发明具有以下有益效果：

1、本发明在左旋聚乳酸填充剂的配方中加蜂巢HA。蜂巢HA由高分子量HA与低分子量HA复配后在碱性条件下醇沉所得，经过此方法制得的蜂巢HA在水中溶解速度快，能够形成仿生性的蜂巢结构，可以更好的分散左旋聚乳酸微粒，减少其聚集，从而减少皮下结节的发生。而且，碱性醇沉后的蜂巢HA的溶解速度比普通HA更快，减少了产品使用过程中的水化混匀时间。

2、本发明在左旋聚乳酸填充剂的配方中加入高含量的甘露醇或甘露醇与芦荟多糖的混合物。甘露醇和芦荟多糖均具有抗氧化物、提高肤质的作用，能够明显抑制HA的降解，延长填充时间，维持更好的填充效果。同时，它们的存在还会加快填充剂在水中的混匀速度，减少混匀时间。

3、本发明在制备左旋聚乳酸填充剂时优选采用正反向交替混匀的方式，与单向混匀相比，正反向交替混匀可以使混合液产生更多的微小气泡，冻干后的产品质地更疏松，产品的混匀时间更短。

4、本发明优选采用悬浮筛分的方式将气流粉碎或乳化-溶剂挥发制得左旋聚乳酸微粒或微球进行筛分处理，所得左旋聚乳酸填充剂中聚乳酸颗粒更集中、复悬时间更短、产品更加稳定。

5、本发明将填充剂优选制成固体制剂，例如冻干粉，避免了左旋聚乳酸与水接触，PLLA微粒或微球均为干燥状态储存，更有利于提高产品的稳定性，延长了填充剂的有效期。

附图说明

图1气流磨粉碎所得PLLA微粒粒度分布图。

图2悬浮筛分后所得PLLA微粒粒度分布图。

图3悬浮筛分筛出的PLLA微粒粒度分布图。

图4 PLLA不规则微粒显微镜图（放大倍数10×15）。

图5 PLLA微粒在含水溶液中室温放置1个月显微镜图（放大倍数10×15）。

图6 PLLA微球显微镜图（放大倍数10×15）。

图7 PLLA微球在含水溶液中室温放置1个月显微镜图（放大倍数10×15）。

图8原子力显微镜下蜂巢HA的微观结构图。

具体实施方式

为了更好的理解本发明，下面结合具体实施例来进一步说明。但是本发明不仅限于以下具体实施例。如无特别说明，所用各成分的含量均为质量百分比含量。

实施例1

填充剂配方为（wt%，下述实施例亦同）：左旋聚乳酸41%，蜂巢HA 11%，甘露醇48%。左旋聚乳酸的分子量为50000 Da。

填充剂的制备方法如下：

1、左旋聚乳酸微粒的制备：在工作压力为0.6 MPa、左旋聚乳酸的进料速度为60g/min的条件下，用气流粉碎机粉碎，制备平均粒径为30μm、分子量为50000Da的左旋聚乳酸微粒，得到的微粒用pH 6.0的盐酸溶液浸润洗涤两次，真空干燥，得左旋聚乳酸微粒。

2、蜂巢HA的制备：将3g分子量为2000kDa的高分子量透明质酸钠和7g分子量为300kDa的低分子量透明质酸钠溶于400 g水中，200 r/min的转速下搅拌1 h，用NaOH调节溶液pH至10，然后在搅拌下迅速加入水的2体积倍的体积分数为95%的乙醇或甲醇溶液进行醇沉，搅拌至沉淀完全，过滤除去上层液体，剩余沉淀加入体积分数为75~80%的乙醇或甲醇溶液洗涤，溶解其中的盐，然后过滤，连续用体积分数为75~80%的乙醇或甲醇溶液洗涤脱盐三次，然后将沉淀用无水乙醇、无水甲醇或无水丙酮脱水、真空干燥，得到蜂巢HA；

3、填充剂的制备：在50ml注射用水中加入1.1g的蜂巢HA和4.8 g甘露醇，混匀即得蜂巢HA与甘露醇混合液，向该混合液中加入4.1g上述的左旋聚乳酸微粒，调整转子离液面深度为溶液高度的30-40%，在500 r/min的转速下搅拌，搅拌时正向反向交替转动30 s，共搅拌20-30min，然后调节溶液pH至中性后立即分装并冷冻干燥，环氧乙烷灭菌，即得填充剂。

实施例2

填充剂配方：同实施例1。

填充剂的制备方法如下：

1、左旋聚乳酸微粒的制备：在工作压力为0.6 MPa、左旋聚乳酸的进料速度为60g/min的条件下，用气流粉碎机粉碎，制备平均粒径为30μm、分子量为50000Da的左旋聚乳酸微粒，得到的微粒用pH 6.0的盐酸溶液浸润洗涤两次，然后将左旋聚乳酸微粒转移至10 μm的微孔滤器中并浸于用盐酸调节至pH为 6.0的体积分数15%~20%（v/v）的乙醇溶液中，在搅拌下通过死端过滤筛分出部分微小颗粒，真空干燥，得到左旋聚乳酸微粒。

图1-3是采用Winner2308A激光粒度分析仪测试的微粒的粒度分布，从图中可以看出，气流粉碎后80%以上的左旋聚乳酸微粒粒径在20~75 μm，约60%的微粒粒径在20~50 μm；经悬浮筛分后的左旋聚乳酸微粒约80%以上粒径在20~60 μm，平均粒径为30 μm；筛出的左旋聚乳酸微粒粒径90%以上在13 μm以下。这表明悬浮筛分增加了微粒的集中度。

图4是所得左旋聚乳酸微粒的显微镜图，图5是将微粒在含水溶液中室温放置1个月的显微镜图。从图的对比可以看出，PLLA微粒在含水环境下不能长时间稳定存在，储存超过1个月时就可能发生微粒黏连。

2、蜂巢HA的制备：同实施例1；

3、填充剂的制备：同实施例1。本发明填充剂为冻干粉，PLLA微球在干燥状态储存，稳定性高，有效期长。

实施例3

填充剂配方（wt%）：左旋聚乳酸41%，蜂巢HA 11%，甘露醇48%。左旋聚乳酸的分子量为50000 Da。

填充剂的制备方法如下：

1、左旋聚乳酸微球的制备：将左旋聚乳酸溶于二氯甲烷中，配成质量浓度为3.0%的溶液，取40ml该溶液，在600 r/min搅拌下缓慢注入640mL 0.15%（w/v）的聚乙烯醇（PVA）水溶液中，室温下搅拌乳化5 min；乳化完成后，常压或减压下搅拌挥发除去二氯甲烷，剩余反应液过滤，滤饼洗涤3次，即得左旋聚乳酸微球，粒径30μm，左旋聚乳酸分子量50000Da。

2、蜂巢HA的制备：将3g分子量为2000kDa的高分子量透明质酸钠和7g分子量为300kDa的低分子量透明质酸钠溶于400g水中，200 r/min的转速下搅拌1 h，用NaOH调节溶液pH至10，然后在搅拌下迅速加入水的2体积倍的体积分数为95%的乙醇或甲醇溶液进行醇沉，搅拌至沉淀完全，过滤除去上层液体，剩余沉淀用体积分数为75~80%的乙醇或甲醇溶液洗涤脱盐三次，然后将沉淀用无水乙醇、无水甲醇或无水丙酮脱水、真空干燥，得到蜂巢HA；

3、填充剂的制备：在50ml注射用水中加入1.1g的蜂巢HA和4.8 g甘露醇，混匀即得蜂巢HA与甘露醇混合液，向该混合液中加入4.1g上述的左旋聚乳酸微球，调整转子离液面深度为溶液高度的30-40%，在500 r/min的转速下搅拌，搅拌时正向反向交替转动30 s，共搅拌20-30min，然后调节溶液pH至中性后立即分装并冷冻干燥，环氧乙烷灭菌，即得填充剂。

实施例4

填充剂的制备方法如下：

1、左旋聚乳酸微球的制备：将左旋聚乳酸溶于二氯甲烷中，配成质量浓度为3.0%的溶液，取40ml该溶液，在600 r/min搅拌下缓慢注入640mL 0.15%（w/v）的聚乙烯醇（PVA）水溶液中，室温下搅拌乳化5 min；乳化完成后，常压或减压下搅拌挥发除去二氯甲烷，剩余反应液过滤，滤饼洗涤3次，即得左旋聚乳酸微球。将左旋聚乳酸微球转移至10 μm的微孔滤器中并浸于用盐酸调节至pH为 6.0的体积分数15%~20%（v/v）的乙醇溶液中，在搅拌下，通过死端过滤筛分出部分微小颗粒，真空干燥，得左旋聚乳酸微球，粒径30μm，左旋聚乳酸分子量50000 Da。

图6是所得左旋聚乳酸微球的显微镜图，图7是将微球在含水溶液中室温放置1个月的显微镜图。从图的对比可以看出，PLLA微球在含水环境下不能长时间稳定存在，储存超过1个月时就可能发生微球结构坍塌。

2、蜂巢HA的制备：同实施例3；

3、填充剂的制备：同实施例3。本发明填充剂为冻干粉，PLLA微球在干燥状态储存，稳定性高，有效期长。

实施例5

填充剂配方（wt%）：同实施例2。

填充剂的制备方法如下：

1、左旋聚乳酸微粒的制备：同实施例2。

2、蜂巢HA的制备：将一定量的高分子量透明质酸钠和低分子透明质酸钠溶于400g水中，200 r/min的转速下搅拌1 h，用NaOH调节溶液pH至13，然后在搅拌下迅速加入水的2体积倍的体积分数为95%的乙醇或甲醇溶液进行醇沉，搅拌至沉淀完全，过滤除去上层液体，剩余沉淀用体积分数为75~80%的乙醇或甲醇溶液洗涤脱盐三次，然后将沉淀用无水乙醇、无水甲醇或无水丙酮脱水、真空干燥，得到蜂巢HA；

3、填充剂的制备：同实施例2。

制备蜂巢HA时，所用的高分子量、低分子量的透明质酸钠按照下表所示进行选择：

实施例6

填充剂配方（wt%）：左旋聚乳酸41%，蜂巢HA 11%，甘露醇48%。

填充剂的制备方法如下：

1、左旋聚乳酸微球的制备：将左旋聚乳酸溶于二氯甲烷中，配成质量浓度为2.5%的溶液，取400ml该溶液，在600 r/min搅拌下缓慢注入800mL 0.1%（w/v）的聚乙烯醇（PVA）水溶液中，室温下搅拌乳化5 min；乳化完成后，常压或减压下搅拌挥发除去二氯甲烷，剩余反应液过滤，滤饼洗涤3次，即得左旋聚乳酸微球。将左旋聚乳酸微球转移至10 μm的微孔滤器中并浸于用盐酸调节至pH 为6.0的体积分数15%~20%（v/v）的乙醇溶液中，在搅拌下，通过死端过滤筛分出部分微小颗粒，真空干燥，得左旋聚乳酸微球，所得微球的平均粒径和分子量如下表所示。

2、蜂巢HA的制备：同实施例4；

3、填充剂的制备：同实施例4。

制备的左旋聚乳酸微球的分子量和平均粒径如下表所示：

实施例7

填充剂配方为（wt%，下述实施例亦同）：左旋聚乳酸50%，蜂巢HA 20%，甘露醇30%。左旋聚乳酸的分子量为50000 Da。

填充剂的制备方法同实施例2。

实施例8

填充剂配方为（wt%，下述实施例亦同）：左旋聚乳酸10%，蜂巢HA 10%，甘露醇80%。左旋聚乳酸的分子量为50000 Da。

填充剂的制备方法同实施例2。

实施例9

填充剂配方为（wt%，下述实施例亦同）：左旋聚乳酸60%，蜂巢HA 20%，甘露醇20%。左旋聚乳酸的分子量为50000 Da。

填充剂的制备方法同实施例2。

实施例10

填充剂配方（wt%）：左旋聚乳酸41%，蜂巢HA 11%，增效剂48%。左旋聚乳酸的分子量为50000 Da，增效剂为质量比1:0.083的甘露醇和芦荟多糖的混合物。

填充剂的制备方法如下：

1、左旋聚乳酸微球的制备：同实施例4。

2、蜂巢HA的制备：同实施例4；

3、填充剂的制备：同实施例4。

实施例11

填充剂配方（wt%）：左旋聚乳酸41%，蜂巢HA 11%，增效剂48%。左旋聚乳酸的分子量为50000 Da，增效剂为质量比1:0.05的甘露醇和芦荟多糖的混合物。

填充剂的制备方法如下：

1、左旋聚乳酸微球的制备：同实施例4。

2、蜂巢HA的制备：同实施例4；

3、填充剂的制备：同实施例4。

实施例12

填充剂配方（wt%）：左旋聚乳酸41%，蜂巢HA 11%，增效剂48%。左旋聚乳酸的分子量为50000 Da，增效剂为质量比1:0.12的甘露醇和芦荟多糖的混合物。

填充剂的制备方法如下：

1、左旋聚乳酸微球的制备：同实施例4；

2、蜂巢HA的制备：同实施例4；

3、填充剂的制备：同实施例4。

实施例13

填充剂的制备方法如下：

1、左旋聚乳酸微粒的制备：同实施例2；

2、蜂巢HA的制备：同实施例2；

3、填充剂的制备：在50ml注射用水中加入1.1g的蜂巢HA和4.8g甘露醇，混匀即得蜂巢HA与甘露醇混合液，向该混合液中加入4.1g上述的左旋聚乳酸微粒，调整转子离液面深度为溶液高度的30-40%，在500 r/min的转速下沿同一方向搅拌20-30min，然后调节溶液pH至中性后立即分装并冷冻干燥，环氧乙烷灭菌，即得填充剂。

实施例14

填充剂配方为（wt%，下述实施例亦同）：左旋聚乳酸25%，蜂巢HA 15%，甘露醇60%。左旋聚乳酸的分子量为40000 Da。

填充剂的制备方法如下：

1、左旋聚乳酸微粒的制备：在工作压力为0.8MPa、左旋聚乳酸的进料速度为100g/min的条件下，用气流粉碎机粉碎，制备平均粒径为15μm、分子量为40000Da的左旋聚乳酸微粒，得到的微粒用pH 6.0的盐酸溶液浸润洗涤两次，真空干燥，得左旋聚乳酸微粒。

2、蜂巢HA的制备：同实施例1；

3、填充剂的制备：在50ml注射用水中加入1.5g的蜂巢HA和6g甘露醇，混匀即得蜂巢HA与甘露醇混合液，向该混合液中加入2.5g上述的左旋聚乳酸微粒，调整转子离液面深度为溶液高度的30-40%，在500 r/min的转速下搅拌，搅拌时正向反向交替转动30 s，共搅拌20-30min，然后调节溶液pH至中性后立即分装并冷冻干燥，环氧乙烷灭菌，即得填充剂。

实施例15

填充剂配方为（wt%，下述实施例亦同）：左旋聚乳酸40%，蜂巢HA 15%，甘露醇45%。左旋聚乳酸的分子量为40000 Da。

填充剂的制备方法如下：

1、将左旋聚乳酸溶于二氯甲烷中，配成质量浓度为4.0%的溶液，取40ml该溶液，在200 r/min搅拌下缓慢注入640mL 0.2%（w/v）的聚乙烯醇（PVA）水溶液中，室温下搅拌乳化5min；乳化完成后，常压或减压下搅拌挥发除去二氯甲烷，剩余反应液过滤，滤饼洗涤3次，即得左旋聚乳酸微球，粒径50μm，左旋聚乳酸分子量40000 Da。

2、蜂巢HA的制备：将5g分子量为2000kDa的高分子量透明质酸钠和3g分子量为300kDa的低分子量透明质酸钠溶于400g水中，200 r/min的转速下搅拌1 h，用NaOH调节溶液pH至8，然后在搅拌下迅速加入水的2体积倍的体积分数为95%的乙醇或甲醇溶液进行醇沉，搅拌至沉淀完全，过滤除去上层液体，剩余沉淀用体积分数为75~80%的乙醇或甲醇溶液洗涤脱盐三次，然后将沉淀用无水乙醇、无水甲醇或无水丙酮脱水、真空干燥，得到蜂巢HA；

3、填充剂的制备：在50ml注射用水中加入1.5g的蜂巢HA和4.5g甘露醇，混匀即得蜂巢HA与甘露醇混合液，向该混合液中加入4g上述的左旋聚乳酸微球，调整转子离液面深度为溶液高度的30-40%，在500 r/min的转速下搅拌，搅拌时正向反向交替转动30 s，共搅拌20-30min，然后调节溶液pH至中性后立即分装并冷冻干燥，环氧乙烷灭菌，即得填充剂。

对比例1

填充剂的制备方法为：

1、左旋聚乳酸微粒的制备：同实施例2。

2、填充剂的制备：在50ml注射用水中加入1.1g的分子量1000kDa的HA和4.8 g甘露醇，混匀即得HA混合物与甘露醇混合液，向该混合液中加入4.1g上述的左旋聚乳酸微粒，调整转子离液面深度为溶液高度的30-40%，在500 r/min的转速下搅拌，搅拌时正向反向交替转动30 s，共搅拌20-30min，然后调节溶液pH至中性后立即分装并冷冻干燥，环氧乙烷灭菌，即得填充剂。

对比例2

填充剂配方为（wt%，下述实施例亦同）：左旋聚乳酸41%，羧甲基纤维素钠11%，甘露醇48%。左旋聚乳酸的分子量为50000 Da。

填充剂的制备方法为：

1、左旋聚乳酸微粒的制备：同实施例2。

2、填充剂的制备：在50ml注射用水中加入1.1g的羧甲基纤维素钠和4.8 g甘露醇，混匀即得羧甲基纤维素钠与甘露醇混合液，向该混合液中加入4.1g上述的左旋聚乳酸微粒，调整转子离液面深度为溶液高度的30-40%，在500 r/min的转速下搅拌，搅拌时正向反向交替转动30 s，共搅拌20-30min，然后调节溶液pH至中性后立即分装并冷冻干燥，环氧乙烷灭菌，即得填充剂。

对比例3

填充剂配方为（wt%，下述实施例亦同）：左旋聚乳酸41%，氨基酸 11%，甘露醇48%。左旋聚乳酸的分子量为50000 Da。

填充剂的制备方法为：

1、左旋聚乳酸微粒的制备：同实施例2。

2、填充剂的制备：在50ml注射用水中加入1.1g的氨基酸和4.8 g甘露醇，混匀即得氨基酸与甘露醇混合液，向该混合液中加入4.1g上述的左旋聚乳酸微粒，调整转子离液面深度为溶液高度的30-40%，在500 r/min的转速下搅拌，搅拌时正向反向交替转动30 s，共搅拌20-30min，然后调节溶液pH至中性后立即分装并冷冻干燥，环氧乙烷灭菌，即得填充剂。

对比例4

填充剂配方为（wt%，下述实施例亦同）：左旋聚乳酸41%，交联HA 11%，甘露醇48%。左旋聚乳酸的分子量为50000 Da。

填充剂的制备方法为：

1、左旋聚乳酸微粒的制备：同实施例2。

2、交联透明质酸钠颗粒的制备：将分子量为2000kDa的透明质酸钠加入0.1mol/L的NaOH溶液中，加入交联剂1,4-丁二醇缩水甘油醚（BDDE），搅拌均匀后，30℃交联24h得到交联透明质酸钠，然后转移到PBS缓冲液中纯化12h（每2h换一次缓冲液），纯化完成后交联透明质酸钠凝胶冷冻干燥得到交联透明质酸钠干粉。

3、填充剂的制备：在50ml注射用水中加入1.1g的交联HA和4.8 g甘露醇，混匀即得交联HA与甘露醇混合液，向该混合液中加入4.1g上述的左旋聚乳酸微粒，调整转子离液面深度为溶液高度的30-40%，在500 r/min的转速下搅拌，搅拌时正向反向交替转动30 s，共搅拌20-30min，然后调节溶液pH至中性后立即分装并冷冻干燥，环氧乙烷灭菌，即得填充剂。

将上述实施例和对比例制备的左旋聚乳酸填充剂进行下列功效学试验，以对其性能进行评价。

试验1：填充剂的混匀时间评价

取5mL注射水，分别加入5mL实施例和对比例的填充剂中，用旋转混匀器混匀，测定不同样品的混匀时间。混匀标准为：混匀后的悬浊液均一，无大块聚乳酸颗粒和团状凝胶。

各实施例和对比例的填充剂的混匀时间如下表所示：

通过实施例1和2、实施例3和4的对比可以看出，PLLA微粒或微球的粒度筛分对PLLA的混匀有一定的提升作用；通过实施例2和实施例5的对比可以看出，高低分子量透明质酸钠分子量的选择以及配比的选择对于蜂巢HA的形成有重要影响，从而使所得填充剂的混匀时间产生较大不同；通过实施例4和实施例6的对比可以看出，在本发明范围内，PLLA分子量和粒径的大小对于填充剂的混匀时间影响较小；通过实施例2、7-9的对比可以看出，填充剂有效成分的含量对于填充剂混匀时间有较大影响；通过实施例4和实施例10-12的对比可以看出，当选择甘露醇和芦荟多糖的混合物作为增效剂时，比单一甘露醇更有利于PLLA的分散，能够减少混匀时间；通过实施例2和13的对比可以看出，正反向交替搅拌比单一方向搅拌能够使蜂巢HA与左旋聚乳酸微粒充分混合，更有利于填充剂的混匀。通过实施例2和对比例1-4的对比可以看出，蜂巢HA和甘露醇的选择使填充剂的混匀时间大大降低，这使填充剂植入皮下后减少了红肿、皮下结节等不良反应的发生，并且产品混匀时间的减少给施针医师的操作带来更多便利。

试验2：局部注射反应评价

选择SPF级Wistar大鼠进行试验，雌雄各半，重量约为180-230g。

取45只大鼠，平均分为9组，每组5只，每组分别注射实施例2、实施例5-1、实施例5-3、实施例7、实施例10、对比例1、对比例2、对比例3、对比例4的填充剂。注射方法如下：取0.3ml试验1中混匀后的填充剂溶液，分别植入大鼠背部皮下，感受注射过程中注射器推挤的难易程度，一周后观察是否有红肿、皮下结节等不良反应出现。

各实施例和对比例的填充剂的注射反应见下表：

实验结果表明，填充剂中蜂巢HA的加入，使得注射过程中注射器更容易推挤，并且蜂巢HA包裹聚乳酸微粒使填充剂更容易分散，注射完成一周后也无红肿、皮下结节等不良反应出现，表明对皮肤的刺激小，适用于软组织填充。采用同样的方法对其他实施例的填充剂产品进行局部注射反应评价，结果均显示填充剂在注射过程中注射器容易推挤、填充剂容易分散且注射后无红肿、皮下结节等不良反应。

Claims

1.一种注射用左旋聚乳酸填充剂，其特征是：有效成分为左旋聚乳酸、蜂巢HA和增效剂，所述蜂巢HA是将高分子量的透明质酸钠和低分子量的透明质酸钠复配而成的水溶液在碱性条件下醇沉、干燥而得，所述增效剂为甘露醇，或者为质量比1:0.05-0.12的甘露醇和芦荟多糖的混合物；所述蜂巢HA中，高分子量的透明质酸钠的分子量为1000~3000 kDa，低分子量的透明质酸钠的分子量为1~500 kDa；所述注射用左旋聚乳酸填充剂为冻干粉。

2.根据权利要求1所述的注射用左旋聚乳酸填充剂，其特征是：所述左旋聚乳酸的分子量为30000~100000 Da。

3.根据权利要求2所述的注射用左旋聚乳酸填充剂，其特征是：所述左旋聚乳酸的分子量为30000~60000 Da。

4.根据权利要求1所述的注射用左旋聚乳酸填充剂，其特征是：所述蜂巢HA中，高分子量的透明质酸钠与低分子量的透明质酸钠的复配质量比为：1:9~9:1。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的注射用左旋聚乳酸填充剂，其特征是：左旋聚乳酸在填充剂中的质量百分比含量为10-60%，所述蜂巢HA在填充剂中的质量百分比含量为10~20%，所述增效剂在填充剂中的质量百分比含量为20~80%。

6.根据权利要求5所述的注射用左旋聚乳酸填充剂，其特征是：左旋聚乳酸在填充剂中的质量百分比含量为40-50%，所述蜂巢HA在填充剂中的质量百分比含量为10~20%，所述增效剂在填充剂中的质量百分比含量为30-48%。

7.根据权利要求6所述的注射用左旋聚乳酸填充剂，其特征是：左旋聚乳酸在填充剂中的质量百分比含量为41%，所述蜂巢HA在填充剂中的质量百分比含量为11%，所述增效剂在填充剂中的质量百分比含量为48%。

8.根据权利要求1所述的注射用左旋聚乳酸填充剂，其特征是：所述左旋聚乳酸为形状不规则的微粒，或者为形状规则的微球；所述左旋聚乳酸粒径为15~75 μm。

9.根据权利要求8所述的注射用左旋聚乳酸填充剂，其特征是：所述左旋聚乳酸粒径为20~50 μm。

10.一种权利要求1所述的注射用左旋聚乳酸填充剂的制备方法，其特征是包括以下步骤：

（1）将高分子量的透明质酸钠和低分子量的透明质酸钠溶于水中，充分搅拌均匀后调节溶液pH至8-13，然后在搅拌下加入体积分数为95%的乙醇或95%的甲醇溶液进行醇沉，过滤除去上层液体，剩余沉淀用体积分数为75~80%的乙醇或75~80%的甲醇溶液洗涤脱盐，脱盐三次后，将沉淀用无水乙醇、无水甲醇或无水丙酮脱水、干燥，得到蜂巢HA；

11.根据权利要求10所述的制备方法，其特征是：步骤（3）中，搅拌按照正向、反向交替搅拌30s的方式进行，共搅拌20-40min。

12.根据权利要求10所述的制备方法，其特征是：左旋聚乳酸微粒按照以下方法制得：在工作压力为0.2~0.8 MPa、左旋聚乳酸的进料速度为30~100 g/min的条件下，用气流粉碎机粉碎左旋聚乳酸，得到的微粒用pH 6.0的盐酸溶液浸润洗涤两次后，将微粒转移至孔径10 μm的微孔滤器中并浸于pH 6.0的体积浓度15%~20%的乙醇溶液中，在搅拌下通过死端过滤筛分出微小颗粒，然后真空干燥，得到左旋聚乳酸微粒。

13.根据权利要求10所述的制备方法，其特征是：左旋聚乳酸微球按照以下方法制得：将左旋聚乳酸溶于二氯甲烷中，配成质量浓度为2.5%~4%的溶液，按照左旋聚乳酸和聚乙烯醇1:0.8的质量比，将左旋聚乳酸二氯甲烷溶液在200~800 r/min搅拌下缓慢注入质量体积浓度为0.1%~0.2%的聚乙烯醇水溶液中，室温下搅拌乳化;乳化完成后，常压或减压下搅拌挥发除去二氯甲烷，剩余反应液过滤收集滤饼，洗涤得左旋聚乳酸微球，将左旋聚乳酸微球转移至孔径10 μm的微孔滤器中并浸于pH 6.0的体积浓度15%~20%的乙醇溶液中，在搅拌下通过死端过滤筛分出微小微球，然后真空干燥，得到左旋聚乳酸微球。