CN105874058A

CN105874058A - 多肽组合物及使用其的多能干细胞的培养方法

Info

Publication number: CN105874058A
Application number: CN201480058971.XA
Authority: CN
Inventors: 萩屋启太; 森冈早苗; 村上裕太; 半户里江; 铃木晃生; 岩木义英; 佐佐木翼
Original assignee: Fujifilm Corp
Current assignee: Fujifilm Corp
Priority date: 2013-10-31
Filing date: 2014-10-29
Publication date: 2016-08-17
Also published as: WO2015064661A1; CA2928623A1; EP3064576A4; JPWO2015064661A1; EP3064576A1; EP3064576B1; US20160272945A1; CA2928623C; JP6388872B2; US9938505B2

Abstract

本发明提供一种可诱导多能干细胞的细胞培养性能尤其是优异的细胞增殖能力的多肽组合物及使用其的多能干细胞的培养方法。本发明提供：多肽组合物，其包含规定的多肽，所述规定的多肽包含来源于人玻连蛋白或玻连蛋白的规定的第1区域的氨基酸序列，且通过第1区域所包含的半胱氨酸残基而进行分子之间交联的二聚体以上的多聚体多肽为组合物所包含的多肽的总质量的20质量％以下；多能干细胞的培养方法，其包含在该多肽组合物的存在下培养多能干细胞的阶段；培养器，其具备具有细胞培养表面的支撑体及配置在支撑体的细胞培养表面上的多肽组合物所包含的多肽。

Description

多肽组合物及使用其的多能干细胞的培养方法

技术领域

本发明涉及一种多肽组合物及使用其的多能干细胞的培养方法。

背景技术

以损伤组织的功能恢复等为目的开发了各种再生医疗。其中，报告了大量关于以组织本身的再生等为最终目的的灵长类尤其人类的全能或多能干细胞的技术。尤其，诱导型多能干细胞(iPS细胞)与胚胎干细胞不同是从体细胞诱导，因此具有伦理方面的问题少的优点。

在培养这些灵长类的全能或多能干细胞(对这两者进行统称，本发明中简称为“多能干细胞”。)的情况下，要求在未分化状态下经长期维持多能干细胞。为了长期培养未分化状态的多能干细胞，通常使用小鼠成纤维细胞等饲养细胞。

然而，指出因使用如小鼠成纤维细胞的来源于异种动物的饲养细胞，培养液中可能混入来源于异种动物的抗原性物质等的异物。在将全能或多能干细胞用于医疗用途或与此相当的用途的情况下，要求将这些细胞在不存在饲养细胞的条件下进行培养。

鉴于这种情况，进行了代替饲养细胞功能的细胞粘附性材料的开发。例如Nature Biotechnology,2001,Vol19,pp.971-974中公开了作为饲养细胞的代替物使用小鼠肉瘤提取成分即基质胶，始终良好地对维持了未分化状态的人胚胎干细胞进行培养。

日本专利公开2001-17183号公报中公开有不含饲养细胞且含有增殖的灵长类原始细胞的细胞性组合物，作为优选方式公开有还含有细胞外基质的细胞性组合物。并且，日本专利公开2010-29186号公报中公开有以含有规定浓度的细胞外基质蛋白质及水性溶剂的涂布溶液，涂布已进行等离子体聚合的细胞培养表面的细胞培养基质，并且记载有根据该细胞培养基质具有有助于避免胚胎干细胞的分化的良好的粘附性。

Biomaterials,2010,Nov；Vol.31(32),pp.8281-8288及NatureBiotechnology,2010,Vol.28,No.6,pp.606-610中分别公开有由可有助于胚胎干细胞的长期培养的玻连蛋白部分序列构成的重组肽或合成肽，具体而言，天然玻连蛋白的氨基酸序列中的第1个至第52个的氨基酸序列的多肽(参考Biomaterials,2010,Nov；Vol.31(32),pp.8281-8288)及包含RGD序列的第41个至第52个的氨基酸序列(参考NatureBiotechnology,2010,Vol.28,No.6,pp.606-610)的多肽。已知由于这些多肽为非生物体试料，因此能够避免混入抗原性物质等的混入的可能性，且可进行工业生产这一点上优异。

发明内容

发明要解决的技术课题

然而，若考虑将多能干细胞用于再生医疗等的医疗用途或与此相当的用途，则应尽量排除以来源于小鼠等的成纤维细胞等的异种饲养细胞或来源于小鼠的基质胶为首的来源于异种动物的成分的使用。并且，即使是来源于同种动物的细胞或成分，也不能完全排除混入抗原性物质等的可能性。而且，即使是同种及异种中任一种，来源于生物体的材料其提取量极为微量，或根据给予体其性能有所偏差等，从工业上的观点考虑也不优选。近年，以医疗用途中的应用为目标，盛行没有混入来源于异种动物的成分或抗原性物质的化学上认可的条件下对干细胞进行培养的研究。然而，未发现能够代替显示足以实用的细胞培养性能的饲养细胞的材料。

例如，作为避免使用来源于生物体的材料本身的方法，Biomaterials,2010,Nov；Vol.31(32),pp.8281-8288及Nature Biotechnology,2010,Vol.28,No.6,pp.606-610中公开有使用由人玻连蛋白的部分序列构成的重组肽或合成肽来实施胚胎干细胞的长期培养的例。

然而，即使是这些重组肽，作为多能干细胞的细胞培养性能还不够充分。

本发明能够提供一种可诱导多能干细胞的细胞培养性能尤其是优异的细胞增殖能力的多肽组合物及使用其的多能干细胞的培养方法。

用于解决技术课题的手段

本发明为如下所述。

[1]一种多肽组合物，其包含选自由以下多肽(a)～(c)构成的组中的至少一种：(a)具有由序列号1表示的氨基酸序列的多肽；(b)具有与由序列号1表示的氨基酸序列的同源性为80％以上的氨基酸序列且具有多能干细胞的培养性能的多肽；及(c)具有序列号1中缺失、取代或附加1或数个氨基酸的氨基酸序列且具有多能干细胞的培养性能的多肽，多肽(a)～(c)为包含由以下(1-i)～(1-iii)中的任一个氨基酸序列表示的第1区域的多肽：(1-i)由序列号1表示的氨基酸序列中由第1个～第44个氨基酸残基构成的氨基酸序列；(1-ii)由与由氨基酸序列(1-i)构成的氨基酸序列的同源性为80％以上的氨基酸序列构成且具有对多能干细胞的细胞粘附能力的氨基酸序列；及(1-iii)由氨基酸序列(1-i)中缺失、取代或附加1或数个氨基酸的氨基酸序列构成且具有对多能干细胞的细胞粘附能力的氨基酸序列，且选自由多肽(a)～(c)构成的组中的至少一种且通过第1区域所包含的半胱氨酸残基而进行分子之间交联的二聚体以上的多聚体多肽为组合物所包含的多肽的总质量的20质量％以下。

[2]一种多肽组合物，其包含由40个～450个氨基酸残基构成的多肽(d)，多肽(d)为包含由以下(1-i)～(1-iii)中的任一个氨基酸序列表示的第1区域及由以下(2-i)～(2-iii)中的任一个氨基酸序列表示的第2区域的多肽：(1-i)由序列号1表示的氨基酸序列中由第1个～第44个氨基酸残基构成的氨基酸序列；(1-ii)由与由氨基酸序列(1-i)构成的氨基酸序列的同源性为80％以上的氨基酸序列构成且具有对多能干细胞的细胞粘附能力的氨基酸序列；及(1-iii)由氨基酸序列(1-i)中缺失、取代或附加1或数个氨基酸的氨基酸序列构成且具有对多能干细胞的细胞粘附能力的氨基酸序列，(2-i)由PRPSLAKKQRFRHRNRKGYRSQRGHSRGRNQN(序列号3)表示的氨基酸序列；(2-ii)与由序列号3表示的氨基酸序列具有80％以上的同源性且具有对支撑体的细胞培养表面的吸附能力的氨基酸序列；及(2-iii)相对由序列号3表示的氨基酸序列缺失、取代或附加1或数个氨基酸且具有对支撑体的细胞培养表面的吸附能力的氨基酸序列，且多肽(d)且通过第1区域所包含的半胱氨酸残基而进行分子之间交联的二聚体以上的多聚体多肽为组合物所包含的多肽的总质量的20质量％以下。

[3]根据[1]或[2]所记载的多肽组合物，其中，通过多肽中的任一位置的半胱氨酸残基而进行分子之间交联的二聚体以上的多聚体多肽为组合物所包含的多肽的总质量的20质量％以下。

[4]根据[1]～[3]中任一项所述的多肽组合物，其中，组合物中的多肽(a)～(c)或(d)包含如下至少一种多肽，即包含于第1区域且在由序列号1表示的氨基酸序列中相当于第25个氨基酸残基的半胱氨酸残基及相当于第31个氨基酸残基的半胱氨酸残基之间进行分子内交联的多肽。

[5]根据[1]～[3]中任一项所述的多肽组合物，其中，组合物中的多肽(a)～(c)或(d)包含如下多肽，所述多肽包含于第1区域且分别在由序列号1表示的氨基酸序列中，相当于第5个氨基酸残基的半胱氨酸残基与相当于第9个氨基酸残基的半胱氨酸残基之间、相当于第19个氨基酸残基的半胱氨酸残基与相当于第21个氨基酸残基的半胱氨酸残基之间、相当于第25个氨基酸残基的半胱氨酸残基与相当于第31个氨基酸残基的半胱氨酸残基之间、及相当于第32个氨基酸残基的半胱氨酸残基与相当于第39个氨基酸残基的半胱氨酸残基之间进行分子内交联。

[6]根据[1]～[3]中任一项所述的多肽组合物，其中，组合物所包含的多肽与纤溶酶原激活物抑制剂-1(Plasminogen activator inhibitor-1)的结合常数大于0.06。

[7]根据[1]～[6]中任一项所述的多肽组合物，其中，作为组合物中的多肽(a)～(c)或(d)包含如下至少一种多肽，所述多肽还包含由下述(3a-i)～(3a-iii)中的任一个氨基酸序列构成的第3区域：(3a-i)由序列号1表示的氨基酸序列中，由第56个～第341个氨基酸残基构成的氨基酸序列或其部分氨基酸序列；(3a-ii)与(3a-i)的氨基酸序列或其部分氨基酸序列具有80％以上的同源性的氨基酸序列；及(3a-iii)相对(3a-i)的氨基酸序列或其部分氨基酸序列缺失、取代或附加1或数个氨基酸的氨基酸序列。

[8]根据[1]～[7]中任一项所述的多肽组合物，其中，作为组合物中的多肽(a)～(c)或(d)包含如下至少一种多肽，所述多肽还包含由下述(4a-i)～(4a-iii)中的任一个氨基酸序列构成的第4区域：(4a-i)由序列号1表示的氨基酸序列中，由第374个～第459个氨基酸残基构成的氨基酸序列或其部分氨基酸序列；(4a-ii)与(4a-i)的氨基酸序列或其部分氨基酸序列具有80％以上的同源性的氨基酸序列；及(4a-iii)相对(4a-i)的氨基酸序列或其部分氨基酸序列缺失、取代或附加1或数个氨基酸的氨基酸序列。

[9]一种多肽组合物，其包含选自由以下多肽(a)～(c)构成的组中的至少一种：(a)具有由序列号1表示的氨基酸序列的多肽；(b)具有与由序列号1表示的氨基酸序列的同源性为80％以上的氨基酸序列且具有多能干细胞的培养性能的多肽；及(c)具有序列号1中缺失、取代或附加1或数个氨基酸的氨基酸序列且具有多能干细胞的培养性能的多肽，通过多肽中所包含的半胱氨酸残基而进行分子之间交联的二聚体以上的多聚体多肽为组合物所包含的多肽的总质量的20质量％以下。

[10]一种多能干细胞的培养方法，其包含在[1]～[9]中任一项所述的多肽组合物的存在下培养多能干细胞的阶段。

[11]一种培养器，其具备具有细胞培养表面的支撑体及配置在支撑体的细胞培养表面上的[1]～[9]中任一项所述的多肽组合物所包含的多肽。

发明效果

根据本发明，能够提供一种可诱导多能干细胞的细胞培养性能尤其是优异的细胞增殖能力的多肽组合物及使用其的多能干细胞的培养方法。

附图说明

图1是表示本发明的参考例中各多肽的培养板表面的吸附试验结果的曲线图。

图2是表示本发明的参考例中使用各多肽的iPS细胞的增殖曲线的曲线图。

图3是在本发明的参考例中各多肽上进行培养时的iPS细胞菌落的形态图像(左栏)及放大图像(右栏)。

图4是本发明的参考例中各多肽上进行培养时的iPS细胞的DAPI染色图像(左栏)及NANOG染色图像(右栏)。

图5是本发明的实施例所涉及的多肽组合物I-1(泳道(B))与I-2(泳道(A))的SDS-PAGE的凝胶图像。

图6是表示本发明的实施例所涉及的多肽组合物中的多肽与PAI-1的结合关系的曲线图。

具体实施方式

本发明的多肽组合物，包含选自由以下多肽(a)～(c)构成的组中的至少一种：

(a)具有由序列号1表示的氨基酸序列的多肽；

(b)具有与由序列号1表示的氨基酸序列的同源性为80％以上的氨基酸序列且具有多能干细胞的培养性能的多肽；及

(c)具有序列号1中缺失、取代或附加1或数个氨基酸的氨基酸序列且具有多能干细胞的培养性能的多肽，

多肽(a)～(c)为包含由以下(1-i)～(1-iii)中的任一个氨基酸序列表示的第1区域的多肽：

(1-i)由序列号1表示的氨基酸序列中由第1个～第44个氨基酸残基构成的氨基酸序列；

(1-ii)由与由氨基酸序列(1-i)构成的氨基酸序列的同源性为80％以上的氨基酸序列构成且具有对多能干细胞的细胞粘附能力的氨基酸序列；及

(1-iii)由氨基酸序列(1-i)中缺失、取代或附加1或数个氨基酸的氨基酸序列构成且具有对多能干细胞的细胞粘附能力的氨基酸序列，且

选自由多肽(a)～(c)构成的组中的至少一种且通过第1区域所包含的半胱氨酸残基而进行分子之间交联的二聚体以上的多聚体多肽为组合物所包含的多肽的总质量的20质量％以下。

并且，本发明的其他多肽组合物包含由40个～450个氨基酸残基构成的多肽(d)，多肽(d)为包含由以下(1-i)～(1-iii)中的任一个氨基酸序列表示的第1区域及由以下(2-i)～(2-iii)中的任一个氨基酸序列表示的第2区域的多肽：

(1-iii)由氨基酸序列(1-i)中缺失、取代或附加1或数个氨基酸的氨基酸序列构成且具有对多能干细胞的细胞粘附能力的氨基酸序列，

(2-i)由PRPSLAKKQRFRHRNRKGYRSQRGHSRGRNQN(序列号3)表示的氨基酸序列；

(2-ii)与由序列号3表示的氨基酸序列具有80％以上的同源性且具有对支撑体的细胞培养表面的吸附能力的氨基酸序列；及

(2-iii)相对由序列号3表示的氨基酸序列缺失、取代或附加1或数个氨基酸且具有对支撑体的细胞培养表面的吸附能力的氨基酸序列，且

多肽(d)且通过第1区域所包含的半胱氨酸残基而进行分子之间交联的二聚体以上的多聚体多肽为组合物所包含的多肽的总质量的20质量％以下。

本发明人等为了开发能够增殖多能干细胞的重组蛋白质不断进行深入研究发现，通过在如下多肽组合物的存在下培养多能干细胞，能够提高多能干细胞的增殖能力，所述多肽组合物不是以通过人玻连蛋白N末端侧的半胱氨酸残基而进行分子之间交联的二聚体以上的多聚体的形态，而是以没有分子之间交联的单体的形态，大量包含含有规定的人玻连蛋白N末端侧的部分序列且具备具有对多能干细胞的细胞粘附能力的氨基酸序列的多肽。本发明是基于这个研究结果而完成的。

以下，对本发明的实施方式进行详细的说明。

本发明的多肽组合物为如下的组合物，包含选自由上述的多肽(a)～(c)构成的组中的至少一种，且选自由多肽(a)～(c)构成的组中的至少一种且通过第1区域所包含的半胱氨酸残基而进行分子之间交联的二聚体以上的多聚体多肽为组合物所包含的多肽的总质量的20质量％以下。本多肽组合物能够提高多能干细胞的增殖能力。

并且，本发明的其他多肽组合物为如下的组合物，包含上述的多肽(d)，且多肽(d)且通过第1区域所包含的半胱氨酸残基而进行分子之间交联的二聚体以上的多聚体多肽为组合物所包含的多肽的总质量的20质量％以下。本多肽组合物能够维持未分化状态并提高多能干细胞的增殖能力。

在本说明书中“工序”这一用语，不只是独立的工序，即使无法与其他工序明显地区别的情况下也能够实现本工序所期望的目的，则也包含在本用语中。

并且，在本说明书中用“～”来表示的数值范围表示分别将“～”的前后所记载的数值作为最小值及最大值来包含的范围。

并且，在本说明书中，对于组合物中的各成分的量，在存在多个相当于组合物中各成分的物质时，若无特别说明，表示组合物中存在的该多个物质的总量。

在本说明书中，“同种”是指人，“异种”是指除人以外的动物。

本说明书中，有时将氨基酸序列中的氨基酸残基以本技术领域中周知的单字母标记(例如，将甘氨酸残基标记为“G”)或三字母标记(例如，将甘氨酸残基标记为“Gly”)来进行标记。

本发明中，对于与多肽的氨基酸序列有关的“％”，若无特别说明，以氨基酸(或亚氨基酸)残基的个数为基准。

在本说明书中，对于氨基酸序列的特定氨基酸残基所使用的“对应的氨基酸残基”等的表述是指将进行对比的两个以上氨基酸序列，以本技术领域中周知的方法，在插入、缺失及取代考虑在内的基础上，以相等的氨基酸残基达到最多的方式进行排列(对齐)时，与成为基准的氨基酸序列中的特定氨基酸残基的位置一致的其他氨基酸序列中的氨基酸残基。

有关本说明书中的氨基酸序列的“同源性”可以是指使用BLAST软件包(参考Ausubel等，1999Short Protocolsin Molecular Biology，4thEd-Chapter 18)计算的值。例如，相对序列号1的同源性为80％以上是指BLAST中的Max.Identities的值为80以上。

在本说明书中，氨基酸序列中对于“缺失、取代或附加氨基酸的氨基酸序列”的表述并不排除缺失、取代及附加的氨基酸序列所包含的氨基酸的两个以上组合。

＜多肽＞

本发明所涉及的多肽(a)～(c)为如下所述：

(a)具有由序列号1表示的氨基酸序列的多肽；

(c)具有序列号1中缺失、取代或附加1或数个氨基酸的氨基酸序列且具有多能干细胞的培养性能的多肽。

序列号1：

DQESCKGRCTEGFNVDKKCQCDELCSYYQSCCTDYTAECKPQVTRGDVFTMPEDEYTVYDDGEEKNNATVHEQVGGPSLTSDLQAQSKGNPEQTPVLKPEEEAPAPEVGASKPEGIDSRPETLHPGRPQPPAEEELCSGKPFDAFTDLKNGSLFAFRGQYCYELDEKAVRPGYPKLIRDVWGIEGPIDAAFTRINCQGKTYLFKGSQYWRFEDGVLDPDYPRNISDGFDGIPDNVDAALALPAHSYSGRERVYFFKGKQYWEYQFQHQPSQEECEGSSLSAVFEHFAMMQRDSWEDIFELLFWGRTSAGTRQPQFISRDWHGVPGQVDAAMAGRIYISGMAPRPSLAKKQRFRHRNRKGYRSQRGHSRGRNQNSRRPSRATWLSLFSSEESNLGANNYDDYRMDWLVPATCEPIQSVFFFSGDKYYRVNLRTRRVDTVDPPYPRSIAQYWLGCPAPGHL

在此，多肽中“具有多能干细胞的培养性能”是指具有多能干细胞的增殖活性。可通过如下进行对于是否具有增殖活性的评价，例如在吸附多肽的细胞培养表面上接种多能干细胞使其细胞密度达到250cells/孔，并培养8天后用PBS清洗方式除去非粘附细胞时，粘附细胞是否存在2500cells/孔(接种细胞数的10倍)以上。

在此粘附细胞数可通过对多能干细胞所表现的碱性磷酸酶的活性进行定量的方法或MTT试验等来进行定量。

由序列号1表示的全长459氨基酸残基构成的多肽为玻连蛋白，在本发明中，玻连蛋白是指人玻连蛋白。另外，确认了天然的玻连蛋白为序列的一部分中具有糖链的糖蛋白质。

多肽(b)优选为具有与由序列号1表示的氨基酸序列的同源性为90％以上的氨基酸序列且具有多能干细胞的培养性能的多肽，更优选为具有与由序列号1表示的氨基酸序列的同源性为95％以上的氨基酸序列且具有多能干细胞的培养性能的多肽。

多肽(c)优选为具有序列号1中缺失、取代或附加1个～5个氨基酸的氨基酸序列且具有多能干细胞的培养性能的多肽。

本发明所涉及的多肽优选为(a1)由序列号1表示的氨基酸序列构成的多肽、(b1)由与由序列号1表示的氨基酸序列的同源性为80％以上的氨基酸序列构成且具有多能干细胞的培养性能的多肽、或(c1)由序列号1中缺失、取代或附加1或数个氨基酸的氨基酸序列构成且具有多能干细胞的培养性能的多肽。

在此，(b1)的多肽优选为由与序列号1所表示的氨基酸序列的同源性为90％以上的氨基酸序列构成且具有多能干细胞的培养性能的多肽，更优选为由与序列号1所表示的氨基酸序列的同源性为95％以上的氨基酸序列构成且具有多能干细胞的培养性能的多肽。

并且，(c1)的多肽优选为由序列号1中缺失、取代或附加1或数个优选1个～5个氨基酸的氨基酸序列构成且具有多能干细胞的培养性能的多肽。

多肽(a)～(c)包含由以下(1-i)～(1-iii)中的任一个氨基酸序列表示的第1区域。

(1-iii)由氨基酸序列(1-i)中缺失、取代或附加1或数个氨基酸的氨基酸序列构成且具有对多能干细胞的细胞粘附能力的氨基酸序列。

由序列号1表示的氨基酸序列中由第1个～第44个氨基酸残基构成的多肽部位是作为人玻连蛋白的生长素介质B(SMB)域而所知的域。已知SMB域与纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)相互作用。并且，SMB域中含有相当于玻连蛋白的氨基酸序列中第25个～第31个这7个氨基酸残基的由CSYYQSC(序列号2)表示的氨基酸序列、及相当于玻连蛋白的氨基酸序列中第45个～第47个这3个氨基酸残基的细胞粘附性基序的RGD序列两者。多肽(a)～(c)中的第1区域可具有选自由序列号2表示的氨基酸序列及RGD序列构成的组中的任一种，从细胞粘附性及细胞增殖性的观点考虑，多肽(a)～(c)中的第1区域优选包含这些序列的两者。

即，(1-i)～(1-iii)的第1区域为位于天然玻连蛋白的较N末端侧的序列，并发挥与未分化多能干细胞的粘附性，其结果，可推测能够增殖多能干细胞。因此，包含第1区域的多肽与不包含第1区域的多肽相比，细胞粘附性优异，细胞增殖能力更优异。

本发明中的多肽(a)～(c)中包含规定氨基酸序列的第1区域具有优异的细胞粘附性。因此本发明中的多肽能够良好地增殖细胞尤其是多能干细胞。具有这种氨基酸序列的本发明所涉及的(a)～(c)的多肽能够经长期增殖多能干细胞。

多肽具有“对多能干细胞的细胞粘附能力”是指多能干细胞对多肽显示附着性。可通过已知的评价方法来评价多能干细胞对多肽是否显示附着性。例如，可在由多肽包覆的培养表面接种多能干细胞并在24小时后，用磷酸缓冲液(PBS)等轻轻擦拭，并根据擦拭后培养表面上残留的多能干细胞的量进行评价。

由(1-ii)表示的氨基酸序列优选为由与由氨基酸序列(1-i)构成的氨基酸序列的同源性为90％以上的氨基酸序列构成且具有对多能干细胞的细胞粘附能力的氨基酸序列，更优选为由与由氨基酸序列(1-i)构成的氨基酸序列的同源性为95％以上的氨基酸序列构成且具有对多能干细胞的细胞粘附能力的氨基酸序列。

由(1-iii)表示的氨基酸序列优选为由氨基酸序列(1-i)中缺失、取代或附加1个～5个氨基酸的氨基酸序列构成且具有对多能干细胞的细胞粘附能力的氨基酸序列。

序列号1表示的氨基酸序列中第1个～第44个氨基酸残基中，作为第5个氨基酸残基、第9个氨基酸残基、第19个氨基酸残基、第21个氨基酸残基、第25个氨基酸残基、第31个氨基酸残基、第32个氨基酸残基及第39个氨基酸残基包含有半胱氨酸残基。多肽(a)～(c)可以不包含相当于这些8个半胱氨酸残基的半胱氨酸残基，或可包含至少一个。半胱氨酸残基由于在生理条件下具有与其他半胱氨酸残基容易交联的倾向，因此当多肽(a)～(c)包含半胱氨酸残基时，多肽中其他部位的半胱氨酸残基彼此之间可产生分子内交联。

从促进并提高多能干细胞的增殖的观点考虑，多肽(a)～(c)优选包含序列号1中示出的氨基酸序列中上述的8个半胱氨酸残基中的两个以上，尤其优选第1区域所包含的两个以上的半胱氨酸残基相互分子内交联。

从促进并提高多能干细胞的增殖的观点考虑，可形成分子内交联的半胱氨酸残基的组合优选为相当于第5个氨基酸残基的半胱氨酸残基与相当于第9个氨基酸残基的半胱氨酸残基、相当于第19个氨基酸残基的半胱氨酸残基与相当于第21个氨基酸残基的半胱氨酸残基、相当于第25个氨基酸残基的半胱氨酸残基与相当于第31个氨基酸残基的半胱氨酸残基、及相当于第32个氨基酸残基的半胱氨酸残基与相当于第39个氨基酸残基的半胱氨酸残基的组合。多肽(a)～(d)优选包含可形成分子内交联的半胱氨酸残基的四个优选组合中的任一个，更优选包含所有这种四个组合。另外，本说明书中，有时将特定的半胱氨酸残基以与表示序列号1中示出的氨基酸序列位置的数字的组合来表示，例如，当为序列号1中示出的氨基酸序列中相当于第25个氨基酸残基的半胱氨酸残基时，表示为“Cys25”。

第1区域的氨基酸残基数从多能干细胞的细胞粘附性及增殖性的观点考虑，可设定为3～60氨基酸残基数，优选为10～55氨基酸残基数。

多肽(a)～(c)所包含的氨基酸残基数(氨基酸长度)只要在400～550的范围内则并无特别限制，从具有对人玻连蛋白的高相同性的方面考虑，优选为450～520，更优选为450～459。

本发明所涉及的多肽(d)为如下所述。

包含由上述(1-i)～(1-iii)中的任一个氨基酸序列表示的第1区域及由以下(2-i)～(2-iii)中的任一个氨基酸序列表示的第2区域，且由40个～450个氨基酸残基构成的多肽：

(2-i)由PRPSLAKKQRFRHRNRKGYRSQRGHSRGRNQN(序列号3)表示的氨基酸序列；

(2-iii)相对由序列号3表示的氨基酸序列缺失、取代或附加1或数个氨基酸残基且具有对支撑体的细胞培养表面的吸附能力的氨基酸序列。

多肽(d)为了具有多能干细胞的培养性能，具备“对多能干细胞的细胞粘附性”及“对支撑体的细胞培养表面的吸附能力”，因此优选。在此，支撑体是指使用本发明的培养方法进行细胞培养时，具有赋予本发明所涉及的多肽的面的培养器的部位。

即，由上述(1-i)～(1-iii)中的任一个氨基酸序列表示的第1区域具有优异的细胞粘附性，由此能够良好地增殖细胞尤其是多能干细胞。包含这种氨基酸序列的多肽(d)能够在维持未分化状态的同时经长期增殖多能干细胞。

并且，由上述(2-i)～(2-iii)中的任一个氨基酸序列表示的第2区域有助于对支撑体的细胞培养表面的吸附性。包含这种氨基酸序列的多肽(d)显示对支撑体的细胞培养表面的良好的粘附性。多肽(d)通过同时包含第1区域及第2区域，培养期间内不会从支撑体的细胞培养表面剥离而能够在维持未分化状态的同时经长期增殖多能干细胞。并且，多肽(d)能够抑制从支撑体的细胞培养表面的剥离并增殖培养中未分化状态的多能干细胞，且能够提高培养操作时的操作性。

其结果，多肽(d)能够促进多能干细胞在未分化状态下的增殖，并且无需基于化学键的对支撑体的细胞培养表面的固定处理而获得可在工业上生产的多肽。

并且，多肽(d)与天然人玻连蛋白相比在排除抗原性物质、感染症源的混入风险的同时能够保持与天然玻连蛋白同等的性能，即对多能干细胞的粘附性、细胞增殖性及未分化维持性。

在此，关于多肽“在未分化状态下能够增殖多能干细胞”是指多能干细胞在培养期间维持分化能力。对于多能干细胞是否处于未分化状态，可通过已知的评价方法来进行评价。例如，通过分子标记物的表达(SSEA-4及/或Oct-4等基于流式细胞仪的表达测定、Oct-4及/或NANOG等免疫染色等)、体外实验时的多能分化的确认及基于对免疫缺陷小鼠等的移植的畸胎瘤形成的确认等本领域技术人员已知的方法来进行。对于是否进行增殖可通过常规方法，利用使用了各种显微镜以肉眼进行观察或ALP活性等的反应试验、流式细胞仪等的方法或通过其他方法来进行评价。并且，作为本发明中的维持多能干细胞分化能力的培养期间，根据培养条件及多能干细胞的细胞状态而有所不同，例如可设定为1个月的培养期间。

多肽(d)中的第1区域与多肽(a)～(c)中的第1区域含义相同。对于与多肽(d)中的第1区域有关的事项，直接适用有关多肽(a)～(c)所记载的事项。

第2区域包含由序列号3表示的32个氨基酸残基构成的氨基酸序列，从多肽(d)的精制容易性的观点考虑，优选多肽(d)中的第2区域为由序列号3表示的氨基酸序列构成的多肽。由序列号3表示的氨基酸序列包含于位于天然玻连蛋白的C末端侧的血红素结合蛋白样结构域II的一部分中，且相当于由序列号1表示的氨基酸序列的第342个～第373个氨基酸残基构成的肝素结合域。以下，有时将由序列号3表示的氨基酸序列称为肝素结合域。

多肽(d)具有肝素结合域，由此可推测具有对支撑体的细胞培养表面的吸附能力。其结果，通过使用多肽(d)，能够维持未分化状态而经长期培养未分化多能干细胞。

并且，多肽(d)包含肝素结合域，由此具有确保多肽(d)的亲水性并抑制多肽的疏水凝集的倾向。其结果，多肽(d)的精制变得容易，并能够提高制造效率。

在此，“具有对支撑体的细胞培养表面的吸附能力”是指氨基酸序列不会对成为对象的培养器的细胞培养表面(以下，有时简称为“培养表面”)产生化学反应而是进行物理性的吸附。可通过如下进行是否对支撑体的细胞培养表面具有吸附能力的评价，例如，已进行等离子体处理的聚苯乙烯制培养器中添加含有该多肽的溶液使其达到200pmol/cm²并在37℃下放置2个小时后，用磷酸缓冲液清洗两次时，残留于培养皿表面的该多肽是否存在10pmol/cm²以上。

在此，残留于培养皿表面的多肽的量可通过对与识别多肽的抗体的结合量进行定量的ELISA(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)法或水解吸附的多肽并将生成的氨基酸通过HPLC等进行定量来测定。

并且肝素结合域可以是与由序列号3表示的氨基酸序列具有80％以上、优选90％以上、更优选95％以上的同源性，并且在未分化状态下能够增殖多能干细胞，且具有对支撑体的细胞培养表面的吸附能力的氨基酸序列。

并且进而肝素结合域可以是由相对由序列号3表示的氨基酸序列缺失、取代或附加1个或数个、优选1个～5个氨基酸残基的氨基酸序列构成且具有对支撑体的细胞培养表面的吸附能力的氨基酸序列。

多肽(d)只要具有第1区域及第2区域即可，其相对位置并无特别限制。多肽(d)中优选第1区域位于第2区域的N末端侧。

具有第1区域及第2区域的多肽(d)由40个～450个氨基酸残基构成。通过设定为40个氨基酸残基以上，细胞粘附性或细胞增殖性或对支撑体的细胞培养表面的吸附能力优异，另一方面，通过设定为450个氨基酸残基以下，更能发挥细胞粘附性或细胞增殖性及对支撑体的细胞培养表面的吸附能力，而且能够抑制蛋白质之间的缔合、交联或凝集的形成。多肽(d)从难以引起凝集的形成等的观点考虑，优选为80个以上，更优选为90个以上，进一步优选为100个以上，另一方面，优选为400个以下，更优选为250个以下，进一步优选为170个以下，更进一步优选为150个以下。对于它们的上限值或下限值可任意组合，例如，优选由40个～400个氨基酸残基构成，更优选由80个～250个氨基酸残基构成，进一步优选由80个～150个氨基酸残基构成，更进一步优选由100个～150个氨基酸残基构成。

从防止疏水凝集的观点考虑，优选多肽(a)～(d)具有-2.0～-0.95的GRAVY值。GRAVY值(Kyte J.,Doolittle R.F.(1982),J.Mol.Biol,157:105-132)表示多肽的疏水度的总平均。表示GRAVY的值越大疏水度越高。若GRAVY值为-0.95以下，则具有能够容易抑制疏水凝集发生的倾向。另一方面，若为-2.0以上，则具有对支撑体的细胞培养表面的吸附及未分化细胞的增殖变得容易，且随着GRAVY值变大吸附性及细胞增殖性提高的倾向。从兼顾抑制凝集形成与吸附性或细胞增殖性的方面考虑，作为多肽的GRAVY值，更优选-1.70～-0.975，进一步优选-1.60～-1.10。由于氨基酸残基数越少越有凝集的倾向，因此当为氨基酸残基数为80～170个的多肽时，从兼顾抑制凝集形成与吸附性或细胞增殖性的方面考虑，GRAVY值优选为-1.70～-0.975，进一步优选为-1.60～-1.10。

GRAVY值可通过增减序列中的例如疏水性氨基酸(例如，Trp、Tyr、Phe、Leu、Ile、Val或Met)比例或增减氨基酸残基数等来进行调整。

多肽(a)～(d)优选还具有上述的氨基酸序列以外的其他氨基酸序列。从适当发挥细胞粘附性及对支撑体的细胞培养表面的吸附能力的观点考虑，多肽(a)～(d)优选包含由序列号1表示的氨基酸序列即人玻连蛋白的氨基酸序列的部分序列。由此，多肽(a)～(d)能够获得接近人玻连蛋白的性质例如对多能干细胞优异的粘附性及增殖性。

作为可包含于多肽(a)～(d)中的人玻连蛋白的部分氨基酸序列，从多肽(a)～(d)的细胞粘附性及细胞增殖性或对支撑体的细胞培养表面的吸附能力或抑制凝集形成的观点考虑，优选包含选自由以下第3区域及第4区域构成的组中的至少一个：

(3)由下述氨基酸序列构成的第3区域，所述氨基酸序列选自由序列号1表示的氨基酸序列中由第56个～第341个氨基酸残基构成的氨基酸序列及其部分氨基酸序列，及

(4)由下述氨基酸序列构成的第4区域，所述氨基酸序列选自由序列号1表示的氨基酸序列中由第374个～第459个氨基酸残基构成的氨基酸序列及其部分氨基酸序列。

作为第3区域，从制作多肽时具有抑制疏水凝集的倾向的观点考虑，可选择(3a)由序列号1表示的氨基酸序列中由第56个～第341个氨基酸残基构成的氨基酸序列或其部分氨基酸序列，可选择(3b)由第269个～第341个氨基酸残基构成的氨基酸序列或其部分氨基酸序列，可选择(3c)由第274个～第341个氨基酸残基构成的氨基酸序列或其部分氨基酸序列，或可选择(3d)由第294个～第341个氨基酸残基构成的氨基酸序列或其部分氨基酸序列。(3a)～(3d)的氨基酸序列中，具有减少氨基酸残基数而能够减轻疏水凝集的倾向。其中，由于具有能够更可靠地抑制疏水凝集的倾向，因此优选选择(3d)的氨基酸序列。

在此，多肽(a)～(d)优选还包含由下述(3a-i)～(3a-iii)中的任一个氨基酸序列构成的第3区域的多肽。

(3a-i)由序列号1表示的氨基酸序列中由第56个～第341个氨基酸残基构成的氨基酸序列或其部分氨基酸序列、

(3a-ii)与(3a-i)的氨基酸序列或其部分氨基酸序列具有80％以上、优选90％以上、更优选95％以上的同源性的氨基酸序列、及

(3a-iii)相对(3a-i)的氨基酸序列或其部分氨基酸序列缺失、取代或附加1或数个、优选1个～5个氨基酸的氨基酸序列。

并且，多肽(a)～(d)优选还包含由下述(3b-i)～(3b-iii)中的任一个氨基酸序列构成的第3区域的多肽。

(3b-i)由序列号1表示的氨基酸序列中由第269个～第341个氨基酸残基构成的氨基酸序列或其部分氨基酸序列、

(3b-ii)与(3b-i)的氨基酸序列或其部分氨基酸序列具有80％以上、优选90％以上、更优选95％以上的同源性的氨基酸序列、及

(3b-iii)相对(3b-i)的氨基酸序列或其部分氨基酸序列缺失、取代或附加1或数个、优选1个～5个氨基酸的氨基酸序列。

第4区域从对培养皿的吸附性的观点考虑，可设定为由第374个～第459个氨基酸残基构成的氨基酸序列或其部分氨基酸序列，可设定为由第374个～第409个氨基酸残基构成的氨基酸序列或其部分氨基酸序列，或可设定为由第374个～第379个氨基酸残基构成的氨基酸序列或其部分氨基酸序列。

其中，除了对培养皿的吸附性以外，从制作多肽时易于抑制疏水凝集的方面考虑，优选第374个～第379个，通过减少所选择的氨基酸数具有减轻疏水凝集的倾向。

在此，多肽(a)～(d)优选还包含由下述(4a-i)～(4a-iii)中的任一个氨基酸序列构成的第4区域的多肽。

(4a-i)由序列号1表示的氨基酸序列中由第374个～第459个氨基酸残基构成的氨基酸序列或其部分氨基酸序列、

(4a-ii)与(4a-i)的氨基酸序列或其部分氨基酸序列具有80％以上、优选90％以上、更优选95％以上的同源性的氨基酸序列、及

(4a-iii)相对(4a-i)的氨基酸序列或其部分氨基酸序列缺失、取代或附加1或数个、优选1个～5个氨基酸的氨基酸序列。

并且，优选还包含由下述(4b-i)～(4b-iii)中的任一个氨基酸序列构成的第4区域的多肽。

(4b-i)由序列号1表示的氨基酸序列中由第374个～第409个氨基酸残基构成的氨基酸序列或其部分氨基酸序列、

(4b-ii)与(4b-i)的氨基酸序列或其部分氨基酸序列具有80％以上优选90％以上、更优选95％以上的同源性的氨基酸序列、及

(4b-iii)相对(4b-i)的氨基酸序列或其部分氨基酸序列缺失、取代或附加1或数个、优选1个～5个氨基酸的氨基酸序列。

多肽(a)～(d)进一步优选还包含由下述(4c-i)～(4c-iii)中的任一个氨基酸序列构成的第4区域的多肽。

(4c-i)由序列号1表示的氨基酸序列中由第374个～第379个氨基酸残基构成的氨基酸序列或其部分氨基酸序列、

(4c-ii)与所述(4c-i)的氨基酸序列或其部分氨基酸序列具有80％以上、优选90％以上、更优选95％以上的同源性的氨基酸序列、及

(4c-iii)相对(4c-i)的氨基酸序列或其部分氨基酸序列缺失、取代或附加1或数个、优选1个～5个氨基酸的氨基酸序列。

构成第3区域及第4区域的氨基酸序列的部分氨基酸序列是指在规定范围的氨基酸残基中由连续的3个以上氨基酸残基构成的氨基酸序列。这些部分氨基酸序列的氨基酸残基数可在不超过上述的多肽(d)的总氨基酸残基数的范围内选择。

多肽(a)～(d)通过包含第3区域，具有有利于提高与培养皿的吸附性的倾向。通过包含第4区域，多肽(a)～(d)具有进一步有利于提高与培养皿的吸附性的倾向。多肽(a)～(d)可只具有第3及第4区域中的任一个，也可具有两者。

并且，多肽(a)～(d)的GRAVY值从调整容易性的观点考虑，优选通过构成第3及第4区域的氨基酸序列中的氨基酸残基数的增减、氨基酸残基的缺失、取代或附加等来调整，尤其，更优选调整构成第3区域的氨基酸序列的长度。

多肽(a)～(d)可以不包含序列号1中示出的氨基酸序列中第56个～第131个中包含的氨基酸残基，也可以不包含第56个～第268个中包含的氨基酸残基，也可以不包含第269个～第273个中包含的氨基酸残基，或也可以不包含第50个～第293个中包含的氨基酸残基。可推测由这些氨基酸残基构成的氨基酸序列对多肽(a)～(d)的多能性细胞培养的性能没有帮助，从与培养皿的吸附的观点考虑可选择适当的序列。

当第3区域包含与由序列号1表示的序列的半胱氨酸残基对应的氨基酸残基时，在该半胱氨酸残基的位置可具有半胱氨酸残基以外的氨基酸残基。由此，能够防止由半胱氨酸残基引起的分子内或分子之间交联的形成，因此优选。作为取代半胱氨酸残基的其他氨基酸残基，并无特别限制，可优选列举丝氨酸残基、丙氨酸残基或甘氨酸残基。其中，从具有与半胱氨酸类似的结构的方面考虑，优选丝氨酸残基或丙氨酸残基。

并且，多肽(a)～(d)，在不损坏细胞粘附性及对支撑体的细胞培养表面的吸附性的范围内，可具有上述以外的其他附加的任意氨基酸残基。作为由这种其他任意氨基酸残基构成的序列，例如可举出为了通过重组技术容易地制作多肽(a)～(d)而附加的附加序列。作为这种附加序列，可列举N末端侧的蛋氨酸残基、N末端侧的GPLG序列、标签序列(例如谷胱甘肽S-转移酶(GST)、FLAG标签、His标签等)、各区域之间可附加的连接序列(例如，GGGS、GGGGS、GGGGGS等)等。

多肽(a)～(d)可通过本领域技术人员已知的氨基酸合成技术或基因重组技术来制造。

当通过基因重组技术获得多肽(a)～(d)时，具体而言，首先取得对成为对象的氨基酸序列进行编码的基因，并将其组装到表达载体中，以制作重组表达载体，并将其导入于适当的宿主中以制作转化体。通过在适当的培养基中培养所得到的转化体，能够生成作为目标的多肽，因此通过常规方法从培养物回收作为目标的多肽，由此能够获得多肽(a)～(d)。

多肽(a)～(c)或(d)从细胞增殖性及未分化多能干细胞的未分化状态下的增殖能力等观点考虑，优选为由80个～450个氨基酸残基构成的多肽(A)，其包含：

(1)由下述氨基酸序列构成的第1区域，所述氨基酸序列由序列号1表示的氨基酸序列的第1个～第47个氨基酸残基构成；

(2)由下述氨基酸序列构成的第2区域，所述氨基酸序列由序列号1表示的氨基酸序列的第342个～第373个氨基酸残基(序列号3，肝素结合域)构成；以及选自由以下第3区域及第4区域构成的组中的至少一个：

(3)由下述氨基酸序列或其部分氨基酸序列构成的第3区域，所述氨基酸序列由序列号1表示的氨基酸序列的第269个～第341个氨基酸残基构成；及

(4)由下述氨基酸序列或其部分氨基酸序列构成的第4区域，所述氨基酸序列由序列号1表示的氨基酸序列的第374个～第459个氨基酸残基构成。

并且，多肽(a)～(c)或(d)从细胞增殖性及未分化多能干细胞的未分化状态下的增殖能力等的观点考虑，优选为由100个～450个氨基酸残基构成的多肽(B)，其包含：

(1)由下述氨基酸序列(包含由序列号2表示的氨基酸序列与RGD序列)构成的第1区域，所述氨基酸序列由序列号1表示的氨基酸序列的第1个～第44个氨基酸残基构成；

(2)由下述氨基酸序列构成的第2区域(肝素结合域)，所述氨基酸序列由序列号3表示的氨基酸序列的第342个～第373个氨基酸残基构成；以及选自由以下第3区域及第4区域构成的组中的至少一个：

多肽(a)～(c)从细胞增殖性及未分化多能干细胞的未分化状态下的增殖能力等的观点考虑，优选为由400个～550个氨基酸残基构成的多肽(A)，其包含：

(2)由下述氨基酸序列构成的第2区域(序列号3，肝素结合域)，所述氨基酸序列由序列号1表示的氨基酸序列的第342个～第373个氨基酸残基构成；以及选自由以下第3区域及第4区域构成的组中的至少一个：

并且，多肽(a)～(c)从细胞增殖性及未分化多能干细胞的未分化状态下的增殖能力等的观点考虑，优选为由400个～550个氨基酸残基构成的多肽(B)，其包含：

(1)由下述氨基酸序列构成的第1区域，所述氨基酸序列由序列号1表示的氨基酸序列的第1个～第55个氨基酸残基构成；

并且，上述多肽(A)或(B)进一步优选GRAVY值为-2.0～-0.95的多肽。

并且，作为多肽(d)的上述多肽(A)优选氨基酸残基数为80个～250个。

而且，作为多肽(d)的上述多肽(A)或(B)，进一步优选GRAVY值为-2.0～-0.95且氨基酸残基数为80个～250个的多肽。

进而，作为多肽(d)的上述多肽(A)，进一步优选GRAVY值为-1.70～-0.975且氨基酸残基数为80个～250个的多肽。

并且，作为多肽(d)的上述多肽(A)或(B)优选氨基酸残基数为100个～250个。

而且，作为多肽(d)的上述多肽(A)或(B)，进一步优选GRAVY值为-2.0～-0.95且氨基酸残基数为100个～250个的多肽。

进而，作为多肽(d)的上述多肽(A)或(B)，进一步优选GRAVY值为-1.70～-0.975且氨基酸残基数为100个～250个的多肽。

进而，作为多肽(d)的上述多肽(A)或(B)，进一步优选GRAVY值为-1.70～-0.975且氨基酸残基数为100个～170个的多肽。

以下列举多肽(a)～(c)或(d)的一例，但本发明并不限定于这些。

[表1]

作为本发明所涉及的多肽(a)～(c)或(d)的优选例可列举：

(d1)具有由序列号4～序列号23、序列号38及序列号39中的任一个表示的氨基酸序列的多肽；

(d2)具有与由序列号4～序列号23、序列号38及序列号39中的任一个表示的氨基酸序列的同源性为80％以上、优选90％以上、更优选95％以上的氨基酸序列且具有多能干细胞的培养性能的多肽；或

(d3)具有序列号4～序列号23，序列号38及序列号39中的任一个表示的氨基酸序列中缺失、取代或附加1或数个、优选1个～5个氨基酸的氨基酸序列且具有多能干细胞的培养性能的多肽，

作为更优选例可列举：

(d4)由序列号4～序列号23、序列号38及序列号39中的任一个表示的氨基酸序列构成的多肽；

(d5)由与序列号4～序列号23、序列号38及序列号39中的任一个表示的氨基酸序列的同源性为80％以上、优选90％以上、更优选95％以上的氨基酸序列构成且具有多能干细胞的培养性能的多肽；或

(d6)由序列号4～序列号23、序列号38及序列号39中的任一个表示的氨基酸序列中缺失、取代或附加1或数个、优选1个～5个氨基酸的氨基酸序列构成且具有多能干细胞的培养性能的多肽。

另外，在本说明书中，有时将多肽(a)、多肽(b)、多肽(c)及多肽(d)统称为“特定多肽”。即，“特定多肽”是指多肽(a)～(d)中的任一个或两个以上。

＜多肽组合物＞

多肽组合物包含选自由上述多肽(a)～(c)构成的组中的至少一种，且选自由多肽(a)～(c)构成的组中的至少一种且通过第1区域所包含的半胱氨酸残基而进行分子之间交联的二聚体以上的多聚体多肽为多肽组合物所包含的多肽的总质量的20质量％以下。并且，在多肽组合物为包含上述多肽(d)的组合物的情况下，多肽(d)且通过第1区域所包含的半胱氨酸残基而进行分子之间交联的二聚体以上的多聚体多肽为多肽组合物所包含的多肽的总质量的20质量％以下。多肽组合物在各自的多肽组合物中可包含选自由多肽(a)～(c)构成的组中的至少一种及多肽(d)两者，在这种情况下，选自由多肽(a)～(d)构成的组中的至少一种且通过第1区域所包含的半胱氨酸残基而进行分子之间交联的二聚体以上的多聚体多肽为多肽组合物所包含的多肽的总质量的20质量％以下。

即，当多肽(a)～(d)所包含的第1区域中存在一个以上半胱氨酸残基时，第1区域的半胱氨酸残基在与存在于其他多肽中的第1区域的半胱氨酸残基之间形成分子之间交联，由此能够形成多肽的二聚体以上的多聚体。若通过第1区域所包含的半胱氨酸残基而进行分子之间交联的多肽(a)～(d)的多聚体以超过组合物所包含的多肽的总质量的20％的含率来存在于多肽组合物中，则多能干细胞的增殖能力被损坏。另外，相对于本说明书中的多肽的总质量的多聚体的含率是指在组合物中存在多种多肽的情况下，设定为相对于组合这些多肽的总体的总质量的多聚体的含量(率)。

多肽组合物中的多肽(a)～(d)的多聚体的含率，从促进多能干细胞的增殖能力的观点考虑，优选为组合物所包含的多肽的总质量的15质量％以下，更优选为10质量％以下，尤其优选为5质量％以下。

多肽组合物进一步从多能干细胞的培养性能的观点考虑，通过第1区域的半胱氨酸残基的分子之间交联的多聚体以外的、通过多肽中任一位置的半胱氨酸残基而进行分子之间交联的二聚体以上的多聚体多肽优选为组合物所包含的多肽的总质量的20质量％以下，更优选为15质量％以下，更优选为10质量％以下，进一步优选为5质量％以下。

多肽组合物中多肽(a)～(d)的多聚体的含率，例如，通过使用“ImageJ”(美国国立卫生研究所(NIH：National Institutes of Health)提供)等图像分析软件分析能够算出通过常规方法实施的SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法)的结果。

多肽组合物中的多肽(a)～(d)从促进并提高多能干细胞的增殖的观点考虑，更优选包含含于第1区域且在由序列号1表示的氨基酸序列中相当于第25个氨基酸残基的半胱氨酸残基与相当于第31个氨基酸残基的半胱氨酸残基之间进行分子内交联的多肽，进一步优选包含包含于第1区域且分别在由序列号1表示的氨基酸序列中相当于第5个氨基酸残基的半胱氨酸残基与相当于第9个氨基酸残基的半胱氨酸残基之间、相当于第19个氨基酸残基的半胱氨酸残基与相当于第21个氨基酸残基的半胱氨酸残基之间、相当于第25个氨基酸残基的半胱氨酸残基与相当于第31个氨基酸残基的半胱氨酸残基之间、及相当于第32个氨基酸残基的半胱氨酸残基与相当于第39个氨基酸残基的半胱氨酸残基之间进行分子内交联的至少一种多肽(a)～(d)。

本发明的多肽组合物可包含多肽(a)～(d)以外的多肽。当多肽组合物为包含选自多肽(a)～(c)中的至少一种多肽的多肽组合物时，从更有效地获得本发明效果的观点考虑，多肽(a)～(d)的总含率优选为组合物的85质量％以上，更优选为90质量％以上，进一步优选为95质量％以上，尤其优选为99质量％以上。并且，当多肽组合物为包含多肽(d)的多肽组合物时，从更有效地获得本发明效果的观点考虑，多肽(a)～(d)的总含率优选为组合物的85质量％以上，更优选为90质量％以上，进一步优选为95质量％以上，尤其优选为99质量％以上。

多肽组合物所包含的多肽与纤溶酶原激活物抑制剂-1(Plasminogenactivator inhibitor-1：PAI-1)的结合常数从多能干细胞的培养性能的观点考虑，优选大于0.06。具有通过第25个的半胱氨酸残基与第31个的半胱氨酸残基形成的分子内交联的多肽已知有相对纤溶酶原激活物抑制剂-1(Plasminogen activator inhibitor-1：PAI-1)显示结合性的情形。因此，表示相对PAI-1的结合常数越低，具有通过第25个半胱氨酸残基与第31个半胱氨酸残基形成的分子内交联的多肽越少。从促进多能干细胞的增殖的观点考虑，组合物中的多肽与PAI-1的结合常数优选为0.1以上，进一步优选为0.22以上。另外，对于组合物中的多肽与PAI-1的结合常数的上限值并无特别限制，但从与在所有多肽中各结合有1分子PAI-1的情况相当的方面考虑，优选1.0以下。

多肽中的半胱氨酸残基具有在与相同多肽中的其他半胱氨酸残基之间或其他多肽中的半胱氨酸残基之间交联的倾向。通过调整氧化还原条件能够控制与其他多肽中的半胱氨酸残基之间形成的分子之间交联的形成是公知的，例如，可举出Sinha N.K.et al.,J Biol Chem.250pp.8624-8629,1975所记载的方法。

具体而言，可通过包含如下工序的制造方法获得作为目的的多肽(a)～(d)，即，制备组合尿素、胍盐酸盐等改性剂以使改性剂浓度成为4M～8M的反应溶液的工序；在得到的反应溶液中，以规定的比例例如还原剂与氧化剂以10:1～2:1的比例(还原剂:氧化剂(摩尔比))来共存还原型谷胱甘肽及半胱氨酸等的还原剂与氧化型谷胱甘肽及胱氨酸等氧化剂的工序；将包含还原剂及氧化剂的反应溶液中的改性剂的浓度逐渐降至0M～0.5M的工序。

本发明的多肽组合物可以是如下多肽组合物，即包含选自由多肽(a)～(c)构成的组中的至少一种，且通过多肽中所包含的半胱氨酸残基而进行分子之间交联的二聚体以上的多聚体多肽为组合物所包含的多肽的总质量的20质量％以下。本方式的多肽组合物中，通过多肽(a)～(c)中的任一位置的半胱氨酸残基而进行分子之间交联的多聚体的含率为组合物所包含的多肽的总质量的20质量％以下。因此，本方式的多肽组合物也与前述的多肽组合物相同能够提高多能干细胞的增殖性能。

关于可包含于本方式的多肽组合物中的多肽(a)，对于所有与其他方式的多肽组合物有关的前述的事项，只要能够适用于本方式的多肽组合物中的多肽(a)，可直接沿用前述的事项，优选范围也可直接沿用。

可包含于本方式的多肽组合物中的多肽(b)只要是具有与由序列号1表示的氨基酸序列的同源性为80％以上的氨基酸序列且具有多能干细胞的培养性能的多肽，可以是具有任意序列的多肽，也可以不具有上述的(1-i)～(1-iii)的氨基酸序列。对于所有与由序列号1表示的氨基酸序列的同源性有关的事项、可含有多肽(b)的氨基酸序列及GRAVY值等其他方式的多肽组合物有关的前述的事项，只要能够适用于本方式的多肽组合物中的多肽(b)，可直接沿用前述的事项，优选范围也可直接沿用。

可包含于本方式的多肽中的多肽(c)，只要是具有序列号1中缺失、取代或附加1或数个氨基酸的氨基酸序列且具有多能干细胞的培养性能的多肽，可以是具有任意序列的多肽，也可以不具有上述的(1-i)～(1-iii)的氨基酸序列。对于所有由序列号1表示的氨基酸序列中缺失、取代或附加的氨基酸的数量及种类、可含有多肽(b)的氨基酸序列、GRAVY值等其他方式的多肽组合物有关的前述的事项，只要能够适用于本方式的多肽组合物中的多肽(c)，可直接沿用前述的事项，优选范围也可直接沿用。

＜多能干细胞的培养方法＞

本发明的多能干细胞的培养方法包含在上述的多肽组合物的存在下培养多能干细胞的阶段。根据本培养方法，能够更有效地增殖多能干细胞。

多能干细胞的培养方法从促进多能干细胞的增殖的观点及操作性的观点考虑，包含在支撑体的细胞培养表面赋予本发明所涉及的多肽组合物，以得到多肽包覆培养表面的阶段(以下，称为培养表面制备工序)及在多肽包覆培养表面上接种多能干细胞而进行培养的阶段(以下，称为培养工序)。

作为本发明所涉及的多能干细胞优选为灵长类动物的多能干细胞，具体而言，包含胚胎干细胞(ES细胞)、诱导型多能干细胞(iPS细胞)、成体干细胞、受精卵内部细胞团细胞及早期胚细胞等，这些细胞可使用一种或根据需要混合使用两种以上。iPS细胞中包含在Nature,2007,July 19；Vol.448,pp.313-317；Cell,2006,August 25；Vol.126(4),pp.663-676中所记载的细胞或与此类似的细胞。

其中，作为本发明中优选适用的多能干细胞的例，可列举iPS细胞。

另外，作为灵长类动物，可列举人、猴子及猩猩等，尤其优选与所使用的多肽(a)～(d)同属的人。适用于本发明中的成分或物质，只要是来源于灵长类动物的成分或物质，则作为来源于同种动物的成分或物质而能够优选适用于本发明中。

作为用于培养的培养液，可根据成为培养对象的细胞的种类适当选择。作为可使用的培养液，可以是公知的任何培养液，例如，可列举Essential8、DMEM、MEM、F12、DME、RPMI1640、MCDB104、199、MCDB153、L15、SkBM及Basal培养基等，优选为Essential8。

并且，这些培养液中可添加通常能够添加的各种成分，例如葡萄糖、FBS(胎牛血清)或人血清、抗生素(青霉素、链霉素等)。另外，添加血清时的浓度，可根据当时的培养状态进行适当变更，但通常可设定为10％(v/v)。

其中，作为其他的成分优选为水、盐(钠、钾、镁、钙等的氯化物、氢氧化物、碳酸化物等的无机盐及丙酮酸钠等的有机盐)、氨基酸(必需氨基酸及非必需氨基酸)、维生素(核黄素、生物素、氰钴胺素、抗坏血酸及抗坏血酸衍生物等)、微量元素(硒、铁、锌、铜等)、碳源(D-葡萄糖等)、FGF(碱性成纤维细胞生长因子FGF-2等)、TGF-β、胰岛素及转铁蛋白的培养基。

本发明的培养方法中，优选在不存在来源于异种动物的成分下培养多能干细胞。由此，能够以较高的精度来排除混入来源于异种动物的异物的可能性。作为不存在来源于异种细胞的成分下的培养，可举出使用不含有来源于异种动物的成分的培养液的培养及不使用来源于异种动物的饲养细胞等的培养等。

而且，本发明的培养方法中，优选在不存在来源于异种动物的成分及血清成分下培养多能干细胞。由此，能够进一步排除来源于异种动物的成分的混入。

作为不含有来源于异种动物的成分的培养基，可使用由含有非必需氨基酸、谷氨酸、β-巯基乙醇、FGF-2、TGF-β、胰岛素及转铁蛋白等培养基成分中的至少一种的低渗透压培养基构成的混合培养基。具体而言，可使用TeSR2(StemCell Technologies Inc.)及Essential8(LifeTechnology,Inc.)等培养基，但并不限定于此。

另外，细胞的培养中，可适用常规培养条件例如在37℃的温度下5％(v/v)CO₂浓度的培养箱(incubator)内的培养。

多能干细胞的培养及继代方法中，可使用用于维持多能干细胞而使用的常规的培养基。具体而言，例如可列举mTeSR、TeSR2(StemCellTechnologies Inc.)等。通过常规方法进行对培养基的多能干细胞的接种。另外，一系列继代中使用的培养基可以不一定相同，只要能够将多能干细胞维持在未分化状态，则也可以是不同的培养基。

培养表面制备工序中包含多肽包覆培养表面对于支撑体的培养表面赋予含有规定量的特定多肽的涂布溶液的阶段。由此，通过特定多肽能够包覆培养表面。

涂布溶液中的特定多肽的总含量，根据成为涂布对象的培养表面的种类或大小有所不同，但从对培养表面的吸附能力的观点考虑，优选设定为1pmol/cm²～1000pmol/cm²，更优选设定为100pmol/cm²～300pmol/cm²。作为为了制备涂布溶液而使用的水性介质并无特别限制，例如可列举磷酸缓冲液、Tris缓冲液及超纯水等。

对于涂布，可赋予涂布溶液后，保持规定时间例如30分～24小时左右，由此无需特别处理，而能够在培养表面包覆特定多肽。

培养工序包含在多肽包覆培养表面上接种多能干细胞而进行培养的阶段。

对于多能干细胞的接种密度及培养，并无特别限制，可直接适用常规进行的条件。例如，作为1×10³个/cm²～1×10⁵个/cm²左右的接种密度，可按照上述的培养及继代条件来进行培养。并且可以以1个/cm²～5个/cm²左右的接种密度并按照上述的培养及继代条件来培养10μm～100μm的细胞团。

由此，以特定多肽包覆的培养表面上使多能干细胞操作性良好，并且在使用多肽(d)的情况下，能够维持未分化状态而进行良好地增殖。

而且，在特定多肽的存在下(优选进一步来源于异种动物的成分等的非存在下)培养的多能干细胞能够几乎完全或大幅度地排除来源于试料等抗原性物质等异物混入的可能性，通过该培养方法培养的多能干细胞对于医疗用途或与此相当的用途的使用能够充分地确保安全性。

另外，根据使用特定多肽的培养方法，能够以更低的成本且简便的操作来培养多能干细胞，不仅对医疗用途而且对研究领域中的需要也能够作出巨大的贡献。

＜培养器＞

本发明中培养器是指具备具有细胞培养中使用的表面的支撑体的培养器。作为这种支撑体，可直接使用本领域中作为细胞培养用支撑体而周知的培养器。作为支撑体原材料的例，可包含塑料(例如，聚苯乙烯、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯树脂、聚碳酸酯树脂、聚酯树脂)、玻璃、微孔过滤器材料(例如，纤维素、尼龙、玻璃纤维、聚酯及聚碳酸酯)、以间歇式或连续式在细胞培养中或基因工程学(例如生物反应器等)中使用的生物反应器用材料(可包含中空纤维管或微载体珠。)及聚对苯二甲酸乙二酯、Teflon(注册商标)、陶瓷及其相关聚合物材料等。

并且，支撑体也可以是由等离子体聚合薄膜包覆培养表面的支撑体。

作为培养器的形态并无特别限制，可以是能够适用于多能干细胞的培养的任何形态。作为这种形态的容器的例，可列举多孔板(例如，6孔、12孔、24孔、96孔)、培养皿(例如，有盖培养皿等)、管、培养瓶、滚瓶、振荡培养瓶等。

本发明所涉及的培养器是具备具有细胞培养表面的支撑体及配置在支撑体的细胞培养表面上的多肽组合物所包含的多肽的培养器。

本培养器具有具备前述的本发明所涉及的多肽组合物中的多肽即选自由多肽(a)～(d)构成的组中的至少一种的培养表面。因此，特定多肽良好地吸附在培养表面，在特定多肽上接种多能干细胞的情况下，操作性良好，并且，在使用多肽(d)的情况下，在维持未分化状态下能够增殖多能干细胞。

在此，培养器中的培养表面是指在接种细胞并进行生长发育时细胞能够附着的表面。

本发明所涉及的培养器可通过包含如下工序的制造方法制造，即准备具备具有细胞培养表面的支撑体的培养器(以下，称为“准备工序”)；在细胞培养表面赋予选自由多肽(a)～(d)构成的组中的至少一种而进行吸附处理(以下，称为“吸附处理工序”)。由此，能够容易地获得本发明所涉及的培养器。

准备工序中准备具备具有培养表面的支撑体的培养器。支撑体在培养表面具有等离子体聚合薄膜的情况下，可包含在支撑体上形成等离子体聚合薄膜的工序。对于形成等离子体聚合薄膜的方法，可直接适用常规方法。

吸附处理工序中包含在培养表面赋予特定多肽并进行保持的工序。吸附处理工序中，可通过制备以规定量含有特定多肽的吸附液而赋予培养表面并保持规定时间，由此特定多肽吸附于培养表面。

对于吸附处理工序，可直接适用在培养方法中以多肽包覆培养表面制备工序来说明的事项。

实施例

以下，通过实施例详细说明本发明。但是，本发明并不受它们的任何限定。另外，若无特别说明，“％”为质量基准。

[参考例1]

＜多肽的制备＞

通过利用PCR的常规方法，对将具有表2及表3所示的氨基酸序列的RCP-1～RCP-17的各多肽进行编码的基因序列进行扩增。另外，RCP-11相当于天然人玻连蛋白的序列。另外，将与各多肽的氨基酸序列对应的天然人玻连蛋白的氨基酸序列(序列号1)中的位置示于表2及表3中的“NOTE”栏。其中，各多肽的氨基酸序列中，有时包含对表中所记载的对应范围的天然人玻连蛋白的氨基酸序列进行附加、删除或取代的氨基酸序列。另外，RCP-1～RCP-10及RCP-17相对于由上述的序列号4～13及序列号38表示的各个氨基酸序列，除了在N末端具有蛋氨酸以外，由相同的氨基酸序列构成。

对于RCP-1～RCP-10及RCP-17，在预先通过NcoI(TAKARA BIOINC.)进行切断处理的pET-28b(+)中，使用InFusion Advantage PCRCloning Kit(商品名，Clontech Laboratories,Inc)插入目标基因，以构筑各表达用载体。对于RCP-11～RCP-16，预先通过BamHI(TAKARA BIOINC.)进行切断处理的pGEX-6P-1(GE Healthcare Japan Corporation)中，以与上述同样的方法插入目标基因，以构筑各表达用载体。表达用载体的序列，通过序列分析进行确认。

[表2]

[表3]

使用已制作的RCP-1～RCP-10及RCP-17的表达载体，通过常规方法转换为BL21(DE3)pLysS(Novagen)，并涂布于含卡那霉素LB板上，在37℃下孵育16个小时。通过菌落直接PCR法确认载体的导入后，在添加1mM的IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，Wako Pure ChemicalIndustries,Ltd.)的含卡那霉素LB中，在37℃下振荡培养5个小时，以诱导多肽的表达。

通过离心处理回收菌体，并用清洗用缓冲液(20mM Tris，150mMNaCl，pH7.6)再悬浮菌体。通过声波降解法破碎菌体后，以15000rpm、30min、4℃的条件进行离心，以回收不溶性级分。用包含0.5质量％TritonX100的清洗用缓冲液进行清洗后，用低浓度尿素缓冲液(Low UreaBuffer：20mM Tris，150mM NaCl，2M尿素，pH7.6)进行再悬浮，并进行声波降解法处理。通过离心处理回收不溶性级分后，添加高浓度尿素缓冲液(High Urea Buffer：20mM Tris，150mM NaCl，8M尿素，pH7.6)，并通过声波降解法处理对不溶性级分进行可溶化。

将包含通过上述方法得到的目标肽的溶液，使用AKTA Explorer100(商品名，GE Healthcare Japan Corporation)及HiTrap Heparin HP 5ml(商品名，GE Healthcare Japan Corporation)进行精制。将前述的高浓度尿素缓冲液作为结合用缓冲液，并将高盐浓度调整缓冲液(20mM Tris，1M NaCl，8M尿素，pH7.6)作为溶出用缓冲液进行阶段性溶出，以精制目标多肽。

使用上述中制备的RCP-11～RCP-16的表达载体，通过常规方法转换为BL21(Novagen)，并涂布于含氨苄青霉素LB板上，在37℃下孵育16个小时。通过菌落直接PCR法确认载体的导入后，在添加100μM的IPTG的含氨苄青霉素LB中，在20℃下振荡培养24个小时，以诱导多肽的表达。

回收菌体，并用B-PER(注册商标)Bacterial Protein ExtractionReagent in Phosphate Buffer(商品名，Thermo FisherScientific Inc.)进行再悬浮后，通过声波降解法破碎菌体。以15000rpm、30min、4℃的条件进行离心，以除去不溶性级分，并使用AKTA Explorer100及GSTrapHP5ml×2(商品名，GE Healthcare Japan Corporation)精制上清液。使用Hiprep 26/10Desalting(商品名，GE Healthcare Japan Corporation)对溶出级分进行脱盐，进一步以溶液量的1/2000添加GST融合蛋白切断用蛋白酶(PreScission Protease)，并在4℃下孵育24个小时，切断GST标签。再通过GSTrapHP 5ml×2进行精制，将已切断的GST标签吸附于色谱柱而除去。使用Slide-A-Lizer(商品名，3.5K MWCO.：Thermo FisherScientific Inc.，下同)对通过色谱柱的级分进行透析，并取代为PBS。

将与上述一样得到的RCP-1的多肽，利用LADY GEL(12.5％，Bio-Rad Laboratories,Inc.)进行电泳，利用GelCode^TM BlueStain Reagent(商品名，Thermo Scientific Inc.)进行染色。其结果，在相当于由氨基酸序列预测的分子量为28.3kDa的位置上可以确认到单一的条带。对于其他多肽也得到了同样的结果。

对于RCP-1～RCP-10及RCP-17，将精制后的各多肽溶液，使用Slide-A-Lizer(商品名，3.5K MWCO.)进行透析。透析外液是以透析用缓冲液(PBS，1.5M NaCl，0.5M L-精氨酸，1mM EDTA，pH7.4)为基础，并通过阶段透析除去尿素。最终透析产物使用NanoDrop(商品名，Thermo Fisher Scientific Inc.)并根据280nm的吸光度计算出浓度。有无透析后的凝集示于表4。

并且，GRAVY值作为将每个氨基酸所确定的疏水性指标进行总和并除以氨基酸数的值进行计算(参考Kyte J.,Doolittle R.F.(1982),J.Mol.Biol,157：105-132)。GRAVY值为从各多肽所包含的氨基酸的疏水度计算的多肽的亲疏水性的指标，值越大则表示越疏水，值越小则表示越亲水。将结果示于表4。

并且对于有无凝集，则以以下的G、A及B来进行评价。结果一并示于表4。

G：未见凝集物形成。

A：可确认到粒径100nm左右的颗粒形成。

B：可确认到粒径1mm以上的可见凝集的形成。

[表4]

	GRAVY	氨基酸数	凝集
				RCP-1	-0.835	247	A
RCP-2	-1.516	88	G
				RCP-3	-1.124	108	G
RCP-4	-1.150	118	G
				RCP-5	-1.124	128	G
RCP-6	-0.875	246	A
				RCP-7	-0.979	160	A
RCP-8	-1.045	166	A
				RCP-9	-0.958	176	B
RCP-10	-0.971	186	B
				RCP-17	-1.072	143	A

如表4所示，RCP-2～RCP-5、RCP-7～RCP-8、及RCP-17是氨基酸残基数为约80个～约170个的多肽，虽然容易发生凝集，但GRAVY值在-1.70～-0.975的范围，由此可知凝集的形成被抑制。

[参考例2]

＜对培养皿的吸附性评价＞

将通过上述方法得到的各多肽在规定的缓冲液中进行稀释，以使其能够以0～200pmol/cm²的规定的最终浓度添加于孔中，并在结束等离子体处理的聚苯乙烯制96孔板(Tissue Culture-Treated,Falcon公司)中每次添加64μL。在37℃下孵育2个小时而将各多肽吸附于板上后，用PBS清洗两次，得到RCP-1～RCP-16的各多肽包覆表面。

通过上述的方法得到的各多肽包覆表面中，对包覆RCP-1及RCP-11～16的表面，分别赋予64μL硼酸缓冲液与1N的NaOH，并在80℃且100％湿度下孵育24个小时。空气冷却后，在各孔中添加75μL硼酸缓冲液，进一步添加以1:100(质量比)混合OPA(邻苯二甲醛：Wako PureChemical Industries,Ltd.)/甲醇溶液(160mg/ml)与NAC(N-乙酰基-L-半胱氨酸：Wako Pure Chemical Industries,Ltd.)/硼酸缓冲液溶液(2mg/ml)的50μL反应液。在40℃下孵育30分钟后，使用Envision多标记分析仪(商品名，PerkinElmer公司)测量荧光强度(激发355nm/荧光486nm)。通过另外各多肽溶液制作校准曲线，算出吸附量。将结果示于图1。图1中黑色菱形表示RCP-1，黑色四边形表示RCP-11，黑色三角形表示RCP-12，黑色圆形表示RCP-13，白色菱形表示RCP-14，白色四边形表示RCP-15，白色三角形表示RCP-16。

如图1所示，试验中使用的多肽中，使用包含PRPSLAKKQRFRHRNRKGYRSQRGHSRGRNQN(序列号3[由序列号1中的第342个～第373个氨基酸残基构成的氨基酸序列])的RCP-1、15、16的多肽时，可知具有与具有人玻连蛋白序列的RCP-11同等的良好的对板的吸附性。另一方面，可知不含PRPSLAKKQRFRHRNRKGYRSQRGHSRGRNQN的RCP-13、14的吸附量相对于包含该序列的多肽约为1/4较低。

[参考例3]

＜细胞粘附性评价1＞

对于上述多肽的人iPS细胞(“Tic”：细胞编号No.JCRB1331：独立行政法人医药基盘研究所[567-0085大阪府茨木市彩都浅木7丁目6番8号]分售)的细胞粘附性评价，按如下进行。

作为用于维持人iPS细胞的饲养细胞，使用EmbryoMax(注册商标)(第一代小鼠胚胎成纤维细胞：潮霉素抗性，经丝裂霉素C处理，来源于C57/BL6，继代第3代)(Millipore Corporation)，并用DMEM(Invitrogen Corporation)、10％(v/v)胎牛血清培养基培养24个小时，以粘附于T25烧瓶(商品名，Corning Incorporated)上。人iPS细胞用培养基使用在表5的组成的物质中添加FGF-2(Sigma-aldrich Co.LLC.)使其最终浓度达到10ng/ml的物质。

[表5]

iPS细胞使用上述培养基，并在37℃下5％(v/v，下同)CO₂培养箱内进行维持培养。培养基除了iPS细胞的接种次日以外，每天更换新的培养基。继代操作通过用DISPASE(注册商标)II(neutral proteaseGradeII，Roche公司)剥离细胞，并通过移液操作将细胞分离成适当尺寸来实施。

将与上述一样培养的人iPS细胞，利用TrypLE Select(商品名，Invitrogen公司)并在37℃下处理5分钟，分离成单个细胞。并以300rpm离心2min回收细胞，并悬浮包含终浓度10μM Y-27362((R)-(+)-反式-N-(4-吡啶基)-4-(1-氨乙基)-环己酰胺·2HCl·H₂O、Rho结合激酶抑制剂，Wako Pure Chemical Industries,Ltd.)的TeSR2(商品名，不含来源于异种动物的成分及血清成分的培养基，Stemcell Technologies Inc.)。

将RCP-1～RCP-10及RCP-17、RCP-11、RCP-15及RCP-16、及作为比较对照将人玻连蛋白(从人血浆提取，BD bioscience Company)、重组层粘连蛋白(rLaminin-5：Oriental Yeast Co.，Ltd.及Human RecombinantLaminin-511：Biolamina公司)分别以达到表6所示的添加浓度的方式，悬浮于规定的缓冲液(RCP-1～RCP-10及RCP-17为上述的GRAVY值及凝集特性的评价中使用的透析用缓冲液，RCP-11、15、16、天然玻连蛋白及重组层粘连蛋白为PBS)中，制备试料1～17，并添加于96孔板的各孔中，并在37℃下保持2个小时后进行吸附。在得到的肽处理96孔板的各孔中，接种iPS细胞使其达到30000cells/孔的细胞密度。培养24个小时后，通过PBS清洗除去非粘附细胞，并用4％多聚甲醛(Wako PureChemical Industries,Ltd.)只固定粘附细胞。使用Attophos(注册商标)APFluorescent Substrate System(Promega Corporation)计算出ALP活性，从校准曲线计算出具有ALP活性的未分化iPS细胞数。将结果示于表6。表6中，对于细胞粘附率采用将基于使用天然玻连蛋白的试料15的细胞粘附率设定为100时的相对值。n＝3。

[表6]

	肽种类	添加量	细胞粘附率(％)
				试料1	RCP-1	200pmol/cm²	109.3±5.3
试料2	RCP-2	20μg/cm²	98.7±6.2
				试料3	RCP-3	20μg/cm²	106.1±4.5
试料4	RCP-4	20μg/cm²	100.1±4.5
				试料5	RCP-5	10μg/cm²	94.1±6.5
试料6	RCP-6	20μg/cm²	92.8±4.4
				试料7	RCP-7	5μg/cm²	88.6±8.1
试料8	RCP-8	5μg/cm²	89.2±1.4
				试料9	RCP-9	20μg/cm²	95.5±10.2
试料10	RCP-10	20μg/cm²	93.0±7.8
				试料11	RCP-17	5μg/cm²	95.9±4.6
试料12	RCP-11	200pmol/cm²	93.5±7.9
				试料13	RCP-15	200pmol/cm²	13.2±3.4
试料14	RCP-16	200pmol/cm²	9.4±2.9
				试料15	天然玻连蛋白	130pmol/cm²	100±5.5
试料16	rLaminin-5	3.2μg/cm²	155.7
				试料17	Laminin-511	5.0μg/cm²	142.0

如表6所示，具有序列号1所记载的序列的第1个～第44个的RCP-1～RCP-10、RCP-17及RCP-11与天然人玻连蛋白的iPS细胞的细胞粘附率良好。尤其，不含序列号1所记载的序列的第56个至第268个氨基酸的一部分或全部的RCP-1～RCP-10及RCP-17与天然人玻连蛋白以及具有与天然人玻连蛋白相同氨基酸序列的RCP-11相比细胞粘附率更为良好。由此，可知序列号1所记载的第1个～第44个序列中存在对细胞粘附重要的序列。

[参考例4]

＜细胞粘附性评价2＞

通过Fmoc固相合成法合成表7所示的多肽。制作以130pmol/cm²的浓度吸附天然玻连蛋白的表面后，以30,000cells/孔的比例接种添加100μM的上述合成肽的细胞悬浮液。以与＜细胞粘附性评价1＞同样的方法计算出接种24h后的粘附细胞数。将结果示于表7。表7中，对于细胞粘附率采用将不含合成肽的培养液中的细胞粘附率设定为100时的相对值。n＝3。

[表7]

如表7所示，可知相对于通过添加包含CSYYQSC或RGD的Peptide-4、5及6而有意阻碍细胞对天然玻连蛋白的粘附，在添加将不含CSYYQSC及RGD的Peptide-1、2、3及Peptide-5、6的RGD序列取代为RGE的Peptide-7、8时，没有阻碍粘附。因此，可知通过多肽包含CSYYQSC及RGD中的至少一个，能够发挥细胞粘附能力。

[参考例5]

＜增殖评价＞

在吸附RCP-1、11及天然人玻连蛋白的96孔板中，以250cells/孔的比例接种以与上述＜细胞粘附性评价1＞同样回收的iPS细胞，并在37℃下5％CO₂培养箱内培养8天。以与上述＜细胞粘附性评价1＞同样的方法计测各经时后的粘附细胞数，得到增殖曲线。将增殖曲线示于图2。另外图2中，黑色菱形表示使用RCP-1的例，黑色四边形表示使用RCP-11的例。

同样地，将RCP-1～10及RCP-17、及作为比较对照将HumanRecombinant Laminin-511分别以达到表8所示的添加浓度的方式制备试料1～12，在与上述＜细胞粘附性评价1＞同样地吸附各多肽的96孔板中，以5000cells/孔的比例进行接种，并在37℃下CO₂培养箱内培养3天。以与上述＜细胞粘附性评价1＞同样的方法计测3天后的细胞数。将结果示于表8。

[表8]

	肽种类	添加量	3天后的细胞数(％)
				试料1	RCP-1	80μg/cm²	100.0
试料2	RCP-2	20μg/cm²	81.7
				试料3	RCP-3	20μg/cm²	109.7
试料4	RCP-4	20μg/cm²	120.7
				试料5	RCP-5	10μg/cm²	121.2
试料6	RCP-6	20μg/cm²	70.5
				试料7	RCP-7	5μg/cm²	89.9
试料8	RCP-8	5μg/cm²	171.0
				试料9	RCP-9	20μg/cm²	105.8
试料10	RCP-10	20μg/cm²	101.9
				试料11	RCP-17	5μg/cm²	153.5
试料12	Laminin-511	1.28μg/cm²	56.8

根据图2，RCP-1显示比具有天然玻连蛋白的氨基酸序列的RCP-11更高的细胞增殖性。RCP-11的细胞数在培养第8天为RCP-1的细胞数的约2/3左右。从得到的细胞数的增减计算出倍增时间的结果，使用RCP-1的情况下为46.4±2.1小时，使用RCP-11的情况下为67.7±2.1小时。

并且根据表8，可知RCP-1～RCP-10及RCP-17均比与玻连蛋白相同的细胞外基质即层粘连蛋白的细胞增殖率高。可知即使将序列号1中的第274个半胱氨酸残基取代为丝氨酸残基同样也能获得这种高的细胞增殖率。

从图2及表8的结果令人吃惊地发现，由对细胞增殖与培养皿的吸附有效的序列构成，且不含相当于天然人玻连蛋白的第56个至第268个氨基酸的一部分或全部的序列的RCP-1～RCP-10及RCP-17具有比具有与人玻连蛋白同等的序列的RCP-11及作为比较例的Laminin-511更高的增殖能力。

而且，根据表8，可知包含CSYYQSC的序列及RGD序列、PRPSLAKKQRFRHRNRKGYRSQRGHSRGRNQN序列双方的RCP-1～RCP-10及RCP-17均显示高的细胞增殖性。

[参考例6]

＜细胞粘附性评价3＞

除了将RCP-1用PBS来调整为125pmol/cm²～1000pmol/cm²的浓度而使用以外，与上述＜细胞粘附性评价1＞同样地评价细胞粘附性。将结果示于表9。表9中，对于细胞粘附率采用将相对于以130pmol/cm²的浓度吸附天然玻连蛋白的培养器的细胞粘附率设定为100时的相对值。n＝3。

[表9]

肽种类	添加量	细胞粘附率(％)
			RCP-1	1000pmol/cm²	98.5±17.2
RCP-1	500pmol/cm²	108.8±23.0
			RCP-1	250pmol/cm²	89.2±10.6
RCP-1	125pmol/cm²	90.3±25.3
			天然玻连蛋白	130pmol/cm²	100±5.5

如表9所示，对RCP-1的iPS细胞的粘附性通过添加125pmol/cm²以上而显示与天然玻连蛋白同等的细胞粘附率。

[参考例7]

＜未分化维持评价＞

在TeSR2中悬浮与上述＜细胞粘附性评价1＞同样地回收的iPS细胞。在与上述＜细胞粘附性评价1＞同样地分别吸附上述＜细胞粘附性评价1＞中使用的试料1、试料2、试料5、试料6及试料7的6孔板(Tissue culture-treated，Falcon Company)中接种iPS细胞，并在37℃下CO₂培养箱内进行培养。培养基除了接种次日以外，每天更换新的培养基。每隔6天以与前述同样的方法进行继代。将在各自的试料上培养的iPS细胞的形态示于图3。

并且以本条件来培养1个月后，将细胞用4％(v/v)多聚甲醛来进行固定，并通过1％(v/v)Triton-X/PBS亢进膜透性。通过Image IT SignalEnhancer(商品名，Invitrogen公司)进行粘连处理后，添加抗人NANOG抗体(AF1997，R&D Systems，Inc)、Alexa Fluor555结合兔抗山羊IgG抗体(Invitrogen公司)及DAPI(DOJINDO公司)并进行标记，并用荧光显微镜进行拍摄。将这些荧光显微镜图像示于图4。

图3及图4的各图中，(A)表示在RCP-1上培养的iPS细胞，(B)表示在RCP-11上培养的iPS细胞，(C)表示在天然人玻连蛋白上培养的iPS细胞，(D)表示在rLaminin-5上培养的iPS细胞，(E)表示在rLaminin-511上培养的iPS细胞。比例尺：100μm。图3中，左栏表示菌落整体图像，右栏表示放大图像，图4中，左栏表示DAPI染色图像，右栏表示基于抗NANOG抗体的染色图像。图3及图4中的比例尺：200μm。

如图3所示，在包含对细胞增殖与培养皿的吸附有效的序列的RCP-1、11与天然人玻连蛋白上进行培养的iPS细胞显示出具有均质的菌落、且高的核占有率的未分化细胞的特征形态。并且如图4所示，在具有细胞增殖域及吸附域的RCP-1、11与天然人玻连蛋白上进行培养的iPS细胞在菌落整体中强烈表达NANOG，可知良好地维持了未分化状态。

从上述参考例1～7的评价结果可知，由包含CSYYQSC及RGD序列中的任一个与PRPSLAKKQRFRHRNRKGYRSQRGHSRGRNQN序列的40个～450个氨基酸残基构成的多肽对支撑体的细胞培养表面的吸附性优异。并且，这种多肽在与iPS细胞的共培养条件下，就iPS细胞的细胞粘附性及未分化状态的维持而言，与具有与天然玻连蛋白及人玻连蛋白同等序列的RCP-11是同等的，且就iPS细胞的增殖性而言，是比RCP-11更优异的结果。可知RCP-1～RCP-10及RCP-17在iPS细胞的细胞粘附性及未分化状态的维持方面均为良好。这种各能力的全部中，在其他多肽或作为比较例的重组层粘连蛋白中未能获得良好的结果。

因此，根据本发明所涉及的(d)的多肽，能够在未分化状态下增殖多能干细胞，并且能够提供对细胞培养表面的吸附性优异的多肽与使用该多肽的多能干细胞的培养方法及培养器。

[实施例1]

＜多肽组合物的制备＞

上述中得到的RCP-1～RCP-10及RCP-17中，将RCP-17用于以下的实施例。

将参考例1中得到的精制后的多肽RCP-17的溶液使用Slide-A-Lizer(商品名，3.5K MWCO.)进行透析。透析外液是以透析用缓冲液(PBS，1.5M NaCl，0.5M L-精氨酸，1mM EDTA，pH7.4)为基础，进行阶段透析直至尿素浓度达到2M，并除去尿素。

透析后，将多肽溶液以1/10倍(v/v)稀释于稀释用缓冲液(2M尿素，PBS，1.5M NaCl，0.5M L-精氨酸，1mM EDTA，pH7.4)，接着为了进行多肽的氧化，将氧化缓冲液(2M尿素，2mM氧化型谷胱甘肽[WakoPure Chemical Industries,Ltd.]，20mM还原型谷胱甘肽[Wako Pure ChemicalIndustries,Ltd.]，PBS，1.5M NaCl，0.5M L-精氨酸，1mM EDTA，pH7.4)作为透析外液透析5天。接着在透析用缓冲液(PBS，1.5M NaCl，0.5ML-精氨酸，1mM EDTA，pH7.4)进行透析而除去尿素。最终透析产物使用Amicon Ultra 3K(商品名，Millipore Corporation)进行浓缩直至多肽浓度达到0.5mg/ml。

将最终透析产物在4℃下静置24h，并充分进行氧化，作为最终产物得到多肽组合物I-1。使用NanoDrop(商品名，Thermo Fisher ScientificInc.)并根据280nm的吸光度计算出最终产物的浓度。

另一方面，将参考例1中得到的精制后的多肽RCP-17的溶液使用Slide-A-Lizer(商品名，3.5K MWCO.)，并且将透析外液以透析用缓冲液(PBS，1.5M NaCl，0.5M L-精氨酸，1mM EDTA，pH7.4)为基础，进行阶段透析直至尿素浓度达到0M，以除去尿素，作为最终产物得到比较用多肽组合物I-2。

＜多肽组合物的性状＞

分别将含有以上述方法得到的RCP-17的多肽的多肽组合物I-1及I-2与作为比较例包含VTN-N(商品名，重组人玻连蛋白，LifeTechnologies)的多肽组合物I-3，使用非还原SDS-PAGE(15质量％，ATTO CORPORATION)进行分离，并使用GelCode^TM Blue Stain Reagent(Thermo Scientific Inc.)进行染色。将结果示于图5。并且，通过使用ImageJ分析得到的染色图像来定量Band强度，并计算出单体及多聚体的存在比。将结果示于表10。

[表10]

图5中，对于通过阶段透析只除去尿素的多肽组合物I-2及含有VTN-N的多肽组合物I-3中的、能够确认分子之间交联的多聚体的形成，经多肽的氧化处理得到的多肽组合物I-1中，没有确认到RCP-17的多聚体。

并且，如表10所示，实施例所涉及的多肽组合物I-1中多聚体为约5质量％以下。

[实施例2]

＜细胞增殖性评价2＞

使用实施例1中得到的多肽组合物I-1～多肽组合物I-3进行了以下的细胞增殖性评价。

将各多肽组合物I-1～I-3以使其在组合物中的多肽的浓度达到表11所示的最终浓度的方式悬浮于规定的缓冲液(对于包含RCP-17的多肽组合物I-1及I-2采用参考例的GRAVY值及凝集特性的评价中使用的透析用缓冲液，而对于包含VTN-N的多肽组合物I-3采用PBS)中，以制备多肽液，并添加到具有等离子体处理细胞培养表面的等离子体处理剂聚苯乙烯制96孔板(BD Falcon)的各孔中，并在37℃下保持2个小时而进行吸附，得到具有多肽包覆表面的肽处理96孔板。在得到的肽处理96孔板的各孔中，接种以1:1(体积比)混合TeSR2(Stemcell Technologies Inc.)与Nutristem(注册商标，Bio Industries Inc.)的培养基中悬浮的iPS细胞使其细胞密度达到10000cells/孔。培养72个小时后，通过PBS清洗除去非粘附细胞，用4质量％多聚甲醛(Wako Pure Chemical Industries,Ltd.)只固定粘附细胞。用Attophos(注册商标)AP Fluorescent Substrate System(Promega Corporation)计算出ALP活性，并从校准曲线计算出具有ALP活性的未分化iPS细胞数。将结果示于表11。表11中，细胞增殖率以将使用重组层粘连蛋白进行培养时经过72个小时后的细胞数设定为100％时的比例来表示。n＝3。

[表11]

如表11所示，可知本发明的实施例所涉及的多肽组合物I-1比多肽组合物I-2细胞增殖性更优异。这表示通过多肽的多聚体的形成细胞增殖活性遭到破坏。

[实施例3]

＜多肽组合物的制备＞

上述中得到的RCP-1～RCP-10及RCP-17中，对于RCP-5以以下的方法实施了还原处理。

在包含RCP-5的多肽溶液中添加Tris(2-carboxyethyl)phosphineHydrochloride(Wako Pure Chemical Industries,Ltd.)使其终浓度达到100mM，并在4℃下静置24h，以制备试料A。

作为比较，将包含RCP-5的多肽溶液以未处理的状态在-80℃下进行冻结，以制备试料B。

将各自的试料使用Slide-A-Lizer(商品名，3.5K MWCO.)进行了透析。透析外液是以透析用缓冲液(PBS，1.5M NaCl，0.5M L-精氨酸，1mM EDTA，pH7.4)为基础，并通过阶段透析除去尿素，分别得到多肽组合物II-1(试料A)及II-2(试料B)。

＜多肽的结构分析＞

使用Peptide Mass Fingerprint法进行了二硫化物键的分析。详情如下。

1)蛋白质的酶消化

将50mM碳酸氢铵缓冲液(pH7.8)900μL加入微量离心管中，并且分别添加100μL的多肽组合物II-1及II-2。另外，添加10μL的100μg/ml胰蛋白酶(Wako Pure Chemical Industries,Ltd.)或500ng/ml的Glu-C(Promega)，并在37℃下静置一个晚上。将被消化的片段化肽使用离心浓缩装置(Buchi)进行浓缩直至达到100μL。

2)脱盐

将上述消化物10μL使用ziptip C15CHIP(商品名，Millipore)进行脱盐，并作为测量试料。

3)MALDI-MS测量

使用UltraflexTOF/TOF(商品名，Bruker Daltonics)，并以337nm激光波长来测量了试料。采用反射模式进行测量，同样使用Peptidecalibration standard II(商品名，Bruker Daltonics，产品编号222570)，对m/z 700～4000的范围进行了质量校正。非还原测量中，混合肽消化物1μL与CHCA基质(α-氰基-4-羟基肉桂酸)的0.1％TFA/H₂O-MeCN(2:1)饱和溶液4μL，并载持于靶板上。还原测量中，在靶板上混合肽消化物0.5μL与40mM DTT溶液(pH9.0)0.5μL，并静置20分钟后，载持CHCA基质饱和溶液0.5μL，并进行干燥。将试料载持于靶板之后的最终目标(On-target)清洗(脱盐)按照从Bruker Daltonics Corporation获得的操作指南进行实施。

4)测量值的评价

对于得到的质量分析值通过Mascot server(商品名，Matrix ScienceLtd.)进行搜索，确定基于各自酶的片段化肽的序列。同样，通过调查基于还原处理的片段化肽的质量变化，确定片段化肽内所包含的半胱氨酸有关的二硫化物键的交联位置。

分析结果，关于多肽组合物II-1所包含的RCP-5的N末端侧4个残基(Cys5、Cys9、Cys19及Cys21)，检测出作为主成分的以Cys5与Cys9、Cys19与Cys21为一对的进行分子内交联的组合物。并且只在多肽组合物II-2所包含的RCP-5中，观测到Cys39彼此进行分子之间交联的成分。

＜PAI-1结合性评价＞

使用已知的与具有Cys25与Cyc31交联的结构的多肽结合的Plasminogen Acitivator Inhibitor-1(PAI-1)，尝试了Cys25与Cyc31交联结构的检测。

将上述多肽组合物II-1及II-2(100μg/ml)添加到聚苯乙烯制的平面底、黑色96孔板(half-Area)中使其达到64μL/孔。使用密封薄膜(Funakoshi Co.,Ltd.)包覆板整体，并在4℃下静置而对各多肽组合物中的RCP-5进行固相。12个小时后，去掉孔内的液体，并添加包含5％Bovine Serum Albumin(Sigma)的TBS(NIPPON GENE CO.,LTD.)使其达到150μL/孔。在37℃下静置1个小时后，去掉孔内的液体，再添加Blocker Casein(商品名，Thermo scientific)使其达到150μL/孔，同样在37℃下静置而实施粘连。1个小时后，添加包含0.05％Tween20的TBS(TBST)使其达到150μL/孔，并连续从孔内去掉液体。实施4次该操作，清洗孔内。

接着，将使用TBS并从170nM至2.6nM依次进行等倍稀释的重组体PAI-1(目录编号1786-PI，R&D systems)溶液，分别添加到孔内使其达到50μL/孔，并在37℃下进行静置。1个小时后，从孔内去掉PAI-1溶液，以与前述同样的方法并用TBST共清洗4次，除去未结合PAI-1。接着，将未标记anti-goat IgG H+L(目录编号A10537，Life technologies)原液用TBS进行700倍稀释，并添加使其达到150μL/孔，在37℃下静置而再进行粘连。1个小时后，从孔内去掉抗体溶液，以与前述同样的方法并用TBST共清洗4次。然后，将抗PAI-1抗体(目录编号AF1786，R&Dsystems)原液用TBS进行100倍稀释，并添加使其达到100μL/孔。在37℃下静置1个小时后，从孔内去掉抗体溶液，以与前述同样的方法用共TBST清洗4次而除去未结合Anti-PAI-1抗体。

而且，将HRP标记抗goat IgG抗体(目录编号81-1620，Lifetechnologies)原液用TBS进行7500倍稀释，并添加使其达到100μL/孔。在37℃下静置1个小时后，从孔内去掉抗体溶液，以与前述同样的方法并用TBST共清洗4次而除去未结合标记抗体。接着，使用QuantaBluFluorogenic Peroxidase Substrate Kit(商品名，Thermo scientific)，并按照说明书所记载的方法调整HRP基质，并添加使其达到50μL/孔。在37℃下静置20分钟后，添加附属于同kit的停止液使其达到50μL/孔，以停止反应。将激发、荧光波长分别设定为330nm、410nm，并使用Envision(商品名，Perkinelmer)将RCP-5与PAI-1的结合作为相对荧光单位进行了测量。

将得到的测量值设定为X轴，将测量值除以PAI-1添加浓度(nM)的值设定为Y轴来标绘的结果示于图6。得到的直线相当于以下ScatchardPlot的式，因此从倾斜度可以计算出结合常数(KA)。

(式)

PAI-1结合量/PAI-1添加量＝-KA×PAI-1结合量

将算出的结果示于表12。可知多肽组合物II-1中的RCP-5与多肽组合物II-2中的RCP-5相比PAI-1的结合常数大，即存在较多Cys25、Cys31、分子内交联体。

[表12]

多肽组合物	结合常数	备注
			II-1	0.22	实施例
II-2	0.06	比较例

＜细胞增殖性评价＞

以与实施例3的＜细胞增殖性评价2＞所记载的方法同样的方法，评价了多肽组合物II-1及II-2的细胞增殖性。将结果示于表13。可知多肽组合物II-1与多肽组合物II-2相比细胞增殖活性优异，即Cys25、Cys31、分子内交联体结合的多肽的细胞增殖活性优异。

[表13]

如此，本发明的多肽组合物为不是以通过人玻连蛋白N末端侧的半胱氨酸残基而进行分子之间交联的二聚体以上的多聚体的形态，而是以没有进行分子之间交联的单体的形态，包含较多的包含规定的人玻连蛋白N末端侧的部分序列且具备具有对多能干细胞的细胞粘附能力的氨基酸序列的多肽的肽组合物。可知在这种多肽组合物的存在下有效地增殖多能干细胞。

因此，根据本发明，能够提供可诱导多能干细胞的细胞培养性能尤其是优异的细胞增殖能力的多肽组合物及使用其的多能干细胞的培养方法。

2013年10月31日于日本申请的日本专利申请第2013-227583号的公开，通过参考并将其内容全部援用于本说明书中。

本说明书中所记载的所有的文献、专利申请及技术标准，通过参考而援用于此的每个文献、专利申请及技术标准与具体且个别记载时相同程度地通过参考援用于本说明书中。

Claims

1.一种多肽组合物，其包含选自由以下多肽(a)～(c)构成的组中的至少一种：

(a)具有由序列号1表示的氨基酸序列的多肽；

(c)具有序列号1中缺失、取代或附加1或数个氨基酸而成的氨基酸序列且具有多能干细胞的培养性能的多肽，

(1-iii)由氨基酸序列(1-i)中缺失、取代或附加1或数个氨基酸而成的氨基酸序列构成且具有对多能干细胞的细胞粘附能力的氨基酸序列，且

选自由多肽(a)～(c)构成的组中的至少一种中的通过第1区域所包含的半胱氨酸残基而进行分子之间交联的二聚体以上的多聚体多肽为组合物所包含的多肽的总质量的20质量％以下。

2.一种多肽组合物，其包含由40个～450个氨基酸残基构成的多肽(d)，多肽(d)为包含由以下(1-i)～(1-iii)中的任一个氨基酸序列表示的第1区域及由以下(2-i)～(2-iii)中的任一个氨基酸序列表示的第2区域的多肽：

(1-iii)由氨基酸序列(1-i)中缺失、取代或附加1或数个氨基酸而成的氨基酸序列构成且具有对多能干细胞的细胞粘附能力的氨基酸序列，

(2-i)由PRPSLAKKQRFRHRNRKGYRSQRGHSRGRNQN即序列号3表示的氨基酸序列；

(2-iii)相对由序列号3表示的氨基酸序列缺失、取代或附加了1或数个氨基酸且具有对支撑体的细胞培养表面的吸附能力的氨基酸序列，且多肽(d)中的通过第1区域所包含的半胱氨酸残基而进行分子之间交联的二聚体以上的多聚体多肽为组合物所包含的多肽的总质量的20质量％以下。

3.根据权利要求1或2所述的多肽组合物，其中，

通过多肽中的任一位置的半胱氨酸残基而进行分子之间交联的二聚体以上的多聚体多肽为组合物所包含的多肽的总质量的20质量％以下。

4.根据权利要求1～3中任一项所述的多肽组合物，其中，

组合物中的多肽(a)～(c)或(d)包含如下至少一种多肽，所述多肽包含于第1区域且在相当于由序列号1表示的氨基酸序列中的第25个氨基酸残基的半胱氨酸残基与相当于第31个氨基酸残基的半胱氨酸残基之间进行分子内交联。

5.根据权利要求1～3中任一项所述的多肽组合物，其中，

组合物中的多肽(a)～(c)或(d)包含如下多肽，所述多肽包含于第1区域且分别在相当于由序列号1表示的氨基酸序列中的下述半胱氨酸残基之间进行分子内交联：

相当于第5个氨基酸残基的半胱氨酸残基与相当于第9个氨基酸残基的半胱氨酸残基之间、

相当于第19个氨基酸残基的半胱氨酸残基与相当于第21个氨基酸残基的半胱氨酸残基之间、

相当于第25个氨基酸残基的半胱氨酸残基与相当于第31个氨基酸残基的半胱氨酸残基之间、及

相当于第32个氨基酸残基的半胱氨酸残基与相当于第39个氨基酸残基的半胱氨酸残基之间。

6.根据权利要求1～3中任一项所述的多肽组合物，其中，

组合物所包含的多肽与纤溶酶原激活物抑制剂-1的结合常数大于0.06。

7.根据权利要求1～6中任一项所述的多肽组合物，其中，

作为组合物中的多肽(a)～(c)或(d)包含如下至少一种多肽，所述多肽还包含由下述(3a-i)～(3a-iii)中的任一个氨基酸序列构成的第3区域：

(3a-i)由序列号1表示的氨基酸序列中，由第56个～第341个氨基酸残基构成的氨基酸序列或其部分氨基酸序列；

(3a-ii)与(3a-i)的氨基酸序列或其部分氨基酸序列具有80％以上的同源性的氨基酸序列；及

(3a-iii)相对(3a-i)的氨基酸序列或其部分氨基酸序列缺失、取代或附加1或数个氨基酸而成的氨基酸序列。

8.根据权利要求1～7中任一项所述的多肽组合物，其中，

作为组合物中的多肽(a)～(c)或(d)包含如下至少一种多肽，所述多肽还包含由下述(4a-i)～(4a-iii)中的任一个氨基酸序列构成的第4区域：

(4a-i)由序列号1表示的氨基酸序列中，由第374个～第459个氨基酸残基构成的氨基酸序列或其部分氨基酸序列；

(4a-ii)与(4a-i)的氨基酸序列或其部分氨基酸序列具有80％以上的同源性的氨基酸序列；及

(4a-iii)相对(4a-i)的氨基酸序列或其部分氨基酸序列缺失、取代或附加1或数个氨基酸而成的氨基酸序列。

9.一种多肽组合物，其包含选自由以下多肽(a)～(c)构成的组中的至少一种：

(a)具有由序列号1表示的氨基酸序列的多肽；

通过多肽中所包含的半胱氨酸残基而进行分子之间交联的二聚体以上的多聚体多肽为组合物所包含的多肽的总质量的20质量％以下。

10.一种多能干细胞的培养方法，其包含在权利要求1～9中任一项所述的多肽组合物的存在下培养多能干细胞的阶段。

11.一种培养器，其具备具有细胞培养表面的支撑体及配置在支撑体的细胞培养表面上的权利要求1～9中任一项所述的多肽组合物所包含的多肽。