CN105866296A - 一种建立白芍的药物制剂的指纹图谱的方法 - Google Patents
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Classifications
-
- G—PHYSICS
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-
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Abstract
本发明涉及一种建立白芍的药物制剂的指纹图谱的方法。该方法，以白芍配方颗粒为检测对象，建立了针对该药物制剂的指纹图谱的方法，获得了较为全面的图谱信息，确认了共有特征峰1号峰羟基芍药苷、2号峰芍药内酯苷、3号峰芍药苷，选择3号峰芍药苷作为指纹图谱中的内参考峰，确定了白芍配方颗粒的共有特征峰1号峰、2号峰、4号峰等的相对保留时间，且能够结合该指纹图谱中多个色谱峰的信息，能够全面地、快速地检测白芍配方颗粒的质量，有利于其全面质量检测和整体质量控制，从而有助于提高该药物使用的安全性和稳定性。同时，本发明所述建立白芍的药物制剂的指纹图谱的方法具有稳定性高、精密度高、重复性好等优点。
Description
技术领域
本发明属于药物分析领域，具体涉及一种建立白芍的药物制剂的指纹图谱的方法。
背景技术
白芍配方颗粒是通过对中药白芍饮片进行提取、浓缩、制粒所得。白芍为毛茛科植物芍药(Paeonia lactiflora Pall.)的干燥根，主要含有芍药苷、芍药内酯苷、羟基芍药苷等单萜苷类和苯甲酸、没食子酸等酸类成分；夏、秋二季采挖，洗净，除去头尾和细跟，置沸水中煮后除去外皮或去皮后再煮，晒干，主产浙江、安徽、四川等地，此外，山东、贵州、湖南、湖北、甘肃、陕西、河南、云南等地亦产。白芍性味苦酸，归肝、脾经，具有养血调经、平肝止痛、敛阴止汗等功效，临床常用于治疗头痛眩晕、胁痛、腹痛、四肢挛痛、血虚萎黄、月经不调、自汗盗汗等症。
《中国药典》2015年版对白芍的质量控制包括原植物品种、药材性状、理化鉴别、含量测定等项目，文献报道的白芍主要化学成分为单萜及其苷类，如芍药苷、芍药内酯苷、羟基芍药苷等。目前普遍认为芍药苷为白芍的有效成分，且以芍药苷含量的高低来衡量白芍药材质量的优劣。长期以来对白芍的质量控制，仅以芍药苷的含量作为白芍及其复方制剂的质量标准，通常是薄层色谱法或高效液相色谱法。然而，一方面，通过上述单一成分的含量测定或鉴别白芍配方颗粒，不能从整体上检测和控制其质量；另一方面，通过单一成分的含量测定联合其他成分的鉴别白芍配方颗粒，费时、费力，难以广泛地应用于生产实践。
因此，建立一种能够全面地、快速地检测白芍配方颗粒的方法，对于其全面质量检测和整体质量控制具有重要意义。
发明内容
为此，本发明所要解决的是现有的白芍配方颗粒的检测方法单一检测指标不能从整体上检测和控制其质量、多个检测指标联合检测费时、费力，难以广泛地应用于生产实践的技术问题，从而提出一种建立白芍的药物制剂的指纹图谱的方法。
为解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案来实现的：
本发明提供一种建立白芍的药物制剂的指纹图谱的方法，该方法包括如下步骤：
(1)取待测白芍的药物制剂0.05-0.15重量份，精密称定，精密加入稀乙醇10-30体积份，称定重量，加热回流提取或超声提取20-40分钟，放冷，再称定重量，取稀乙醇补足减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液，作为供试品溶液；
(2)精密称取芍药苷对照品，加甲醇制成每1体积份含0.00002-0.00010重量份的溶液，摇匀，作为对照品A溶液；
精密称取芍药内酯苷对照品，加甲醇制成每1体积份含0.0005-0.0015重量份的溶液，摇匀，作为对照品B溶液；
精密称取羟基芍药苷对照品，加甲醇制成每1体积份含0.00012-0.00014重量份的溶液，摇匀，作为对照品C溶液；
(3)色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相A、以0.1％的磷酸溶液为流动相B按照如下程序进行梯度洗脱：0min，A：B为5％：95％；0-5min，A：B为5％：95％→10％：90％；5min，A：B为10％：90％；5-25min，A：B为10％：90％→16％：84％；25-40min，A：B为16％：84％；检测波长为230nm，流速为1mL/min；
(4)分别精密吸取供试品溶液、对照品A溶液、对照品B溶液和对照品C溶液0.005-0.015体积份，注入高效液相色谱仪，测定，分别得供试品溶液、对照品A溶液、对照品B溶液和对照品C溶液的液相色谱；
(5)利用国家药典委员会中药色谱指纹图谱相似度评价系统，对供试品溶液、对照品A溶液、对照品B溶液和对照品C溶液的液相色谱分别经过数据导入，多点校正和数据匹配，即得指纹图谱；
所述重量份与所述体积份的关系为g/mL。
优选地，本发明上述建立白芍的药物制剂的指纹图谱的方法，该检测方法包括如下步骤：
(1)取待测白芍的药物制剂0.10重量份，精密称定，精密加入稀乙醇20体积份，称定重量，加热回流提取或超声提取30分钟，放冷，再称定重量，取稀乙醇补足减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液，作为供试品溶液；
(2)精密称取芍药苷对照品，加甲醇制成每1体积份含0.00006重量份的溶液，摇匀，作为对照品A溶液；
精密称取芍药内酯苷对照品，加甲醇制成每1体积份含0.0010重量份的溶液，摇匀，作为对照品B溶液；
精密称取羟基芍药苷对照品，加甲醇制成每1体积份含0.00013重量份的溶液，摇匀，作为对照品C溶液；
(3)色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相A、以0.1％的磷酸溶液为流动相B按照如下程序进行梯度洗脱：0min，A：B为5％：95％；0-5min，A：B为5％：95％→10％：90％；5min，A：B为10％：90％；5-25min，A：B为10％：90％→16％：84％；25-40min，A：B为16％：84％；检测波长为230nm，流速为1mL/min；
(4)分别精密吸取供试品溶液、对照品A溶液、对照品B溶液和对照品C溶液0.010体积份，注入高效液相色谱仪，测定，分别得供试品溶液、对照品A溶液、对照品B溶液和对照品C溶液的液相色谱；
(5)利用国家药典委员会中药色谱指纹图谱相似度评价系统，对供试品溶液、对照品A溶液、对照品B溶液和对照品C溶液的液相色谱分别经过数据导入，多点校正和数据匹配，即得指纹图谱。
进一步优选地，本发明上述建立白芍的药物制剂的指纹图谱的方法，以4.6mm×250mm、5μm的Waters XbridgeC18、4.6mm×250mm、5μm的Thromo Acclaim120C18或4.6mm×250mm、5μm的Ecosil C18为色谱柱。
进一步优选地，本发明上述建立白芍的药物制剂的指纹图谱的方法，所述稀乙醇的质量百分数为48～52％。
进一步优选地，本发明上述建立白芍的药物制剂的指纹图谱的方法，所述稀乙醇的质量百分数为49.5～50.5％。
进一步优选地，本发明上述建立白芍的药物制剂的指纹图谱的方法，所述步骤(1)中，以0.45μm微孔滤膜进行过滤。
进一步优选地，本发明上述建立白芍的药物制剂的指纹图谱的方法，所述药物制剂为片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、蜜炼丸剂、缓释制剂、速释制剂、控释制剂、口服液体制剂或注射制剂。
进一步优选地，本发明上述建立白芍的药物制剂的指纹图谱的方法，所述白芍的药物制剂通过以下方法制备而成：
取白芍，加热回流提取至少1次，每次加入至少2重量倍量的水提取至少0.5h，过滤，合并滤液，滤液浓缩至60℃相对密度为1.00-1.10的流浸膏，加入常规辅料，按照常规工艺，制成临床上可接受的片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、蜜炼丸剂、缓释制剂、速释制剂、控释制剂、口服液体制剂或注射制剂。
进一步优选地，本发明上述建立白芍的药物制剂的指纹图谱的方法，所述白芍的药物制剂通过以下方法制备而成：
取白芍，加热回流提取1～5次，每次加入2～10重量倍量的水提取0.5～2h，过滤，合并滤液，滤液浓缩至60℃相对密度为1.05-1.10的流浸膏，加入常规辅料，按照常规工艺，制成临床上可接受的片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、蜜炼丸剂、缓释制剂、速释制剂、控释制剂、口服液体制剂或注射制剂。
进一步优选地，本发明上述建立白芍的药物制剂的指纹图谱的方法，所述白芍的药物制剂通过以下方法制备而成：
取白芍，加热回流提取2次，第1次加入8重量倍量的水提取1.5h，第2次加入6重量倍量的水提取1h，过滤，合并滤液，滤液浓缩至60℃相对密度为1.05-1.10的流浸膏，加入常规辅料，按照常规工艺，制成临床上可接受的片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、蜜炼丸剂、缓释制剂、速释制剂、控释制剂、口服液体制剂或注射制剂。
所述药学上可接受的辅料为：填充剂、崩解剂、润滑剂、助悬剂、粘合剂、甜味剂、矫味剂、防腐剂、基质等。填充剂包括：淀粉、预胶化淀粉、乳糖、甘露醇、甲壳素、微晶纤维素、蔗糖等；崩解剂包括：淀粉、预胶化淀粉、微晶纤维素、羧甲基淀粉钠、交联聚乙烯吡咯烷酮、低取代羟丙纤维素、交联羧甲基纤维素纳等；润滑剂包括：硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠、滑石粉、二氧化硅等；助悬剂包括：聚乙烯吡咯烷酮、微晶纤维素、蔗糖、琼脂、羟丙基甲基纤维素等；粘合剂包括，淀粉浆、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素等；甜味剂包括：糖精钠、阿斯帕坦、蔗糖、甜蜜素、甘草次酸等；矫味剂包括：甜味剂及各种香精；防腐剂包括：尼泊金类、苯甲酸、苯甲酸钠、山梨酸及其盐类、苯扎溴铵、醋酸氯乙定、桉叶油等；基质包括：PEG6000、PEG4000、虫蜡等。
进一步优选地，本发明上述建立白芍的药物制剂的指纹图谱的方法，所述白芍的药物制剂的指纹图谱的共有特征峰为：1号峰羟基芍药苷、2号峰芍药苷内酯、3号峰芍药苷和4号峰，各峰号的相对保留时间分别为：1号峰0.47、2号峰0.86、3号峰1.00和4号峰1.69。
本发明还提供上述方法在白芍的药物制剂的质量检测和质量控制中的应用。
与现有技术相比，本发明的上述技术方案具有以下优点：
本发明所述建立白芍的药物制剂的指纹图谱的方法，以白芍配方颗粒为检测对象，建立了针对该药物制剂的指纹图谱的方法，获得了较为全面的图谱信息，确认了共有特征峰1号峰羟基芍药苷、2号峰芍药内酯苷、3号峰芍药苷，选择3号峰芍药苷作为指纹图谱中的内参考峰，确定了白芍配方颗粒的共有特征峰1号峰、2号峰、4号峰等的相对保留时间，且能够结合该指纹图谱中多个色谱峰的信息，能够全面地、快速地检测白芍配方颗粒的质量，有利于其全面质量检测和整体质量控制，从而有助于提高该药物使用的安全性和稳定性。同时，本发明所述建立白芍的药物制剂的指纹图谱的方法具有稳定性高、精密度高、重复性好等优点。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中：
图1是本发明实验例1中不同提取溶剂的色谱图；
图2是本发明实验例1中不同提取方法的色谱图；
图3是本发明实验例1中不同提取时间的色谱图；
图4是本发明实验例1中不同溶剂量的色谱图；
图5(A)、5(B)、5(C)分别是本发明实验例1中不同流动相的色谱图；
图6、7、8、9分别是本发明实验例2中梯度1、2、3、4的色谱图；
图10是本发明实验例2中不同色谱柱的色谱图；
图11是本发明实验例2中不同流速的色谱图；
图12是本发明实验例2中不同柱温的色谱图；
图13为本发明实验例3中15批白芍配方颗粒的特征图谱；
图14为本发明实验例3中白芍对照药材特征图谱；
图15为本发明实验例3中15批白芍配方颗粒及白芍对照药材特征图谱的共有模式；
图16为本发明实验例3中专属性考察实验结果。
具体实施方式
实施例1
以下实施例和实验例中，白芍配方颗粒的制备方法为：
取白芍，加热回流提取2次，第1次加入8重量倍量的水提取1.5h，第2次加入6重量倍量的水，提取1h，过滤，合并滤液，滤液浓缩至60℃相对密度为1.05-1.10的流浸膏，加入常规辅料，按照常规工艺，制成颗粒剂。，
实施例2
本实施例建立白芍配方颗粒的指纹图谱的方法，包括如下步骤：
(1)取待测白芍配方颗粒0.10g，精密称定，精密加入稀乙醇20mL，称定重量，加热回流提取或超声提取30分钟，放冷，再称定重量，取稀乙醇补足减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液，作为供试品溶液；
(2)精密称取芍药苷对照品，加甲醇制成每1mL含0.00006g的溶液，摇匀，作为对照品A溶液；
精密称取芍药内酯苷对照品，加甲醇制成每1mL含0.0010g的溶液，摇匀，作为对照品B溶液；
精密称取羟基芍药苷对照品，加甲醇制成每1体积份含0.00013g的溶液，摇匀，作为对照品C溶液；
(3)色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以4.6mm×250mm、5μm的WatersXbridgeC18为色谱柱，以乙腈为流动相A、以0.1％的磷酸溶液为流动相B按照如下程序进行梯度洗脱：0min，A：B为5％：95％；0-5min，A：B为5％：95％→10％：90％；5min，A：B为10％：90％；5-25min，A：B为10％：90％→16％：84％；25-40min，A：B为16％：84％；检测波长为230nm，流速为1mL/min；
(4)分别精密吸取供试品溶液、对照品A溶液、对照品B溶液和对照品C溶液0.010mL，注入高效液相色谱仪，测定，分别得供试品、对照品A溶液、对照品B溶液和对照品C溶液的液相色谱；
(5)利用国家药典委员会中药色谱指纹图谱相似度评价系统，对供试品溶液、对照品A溶液、对照品B溶液和对照品C溶液的液相色谱分别经过数据导入，多点校正和数据匹配，即得指纹图谱。
实施例3
本实施例建立白芍配方颗粒的指纹图谱的方法，包括如下步骤：
(1)取待测白芍配方颗粒0.05g，精密称定，精密加入稀乙醇30mL，称定重量，加热回流提取或超声提取20分钟，放冷，再称定重量，取稀乙醇补足减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液，作为供试品溶液；
(2)精密称取芍药苷对照品，加甲醇制成每1mL含0.00010g的溶液，摇匀，作为对照品A溶液；
精密称取芍药内酯苷对照品，加甲醇制成每1mL含0.0015g的溶液，摇匀，作为对照品B溶液；
精密称取羟基芍药苷对照品，加甲醇制成每1体积份含0.00014g的溶液，摇匀，作为对照品C溶液；
(3)色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以4.6mm×250mm、5μm的WatersXbridgeC18为色谱柱，以乙腈为流动相A、以0.1％的磷酸溶液为流动相B按照如下程序进行梯度洗脱：0min，A：B为5％：95％；0-5min，A：B为5％：95％→10％：90％；5min，A：B为10％：90％；5-25min，A：B为10％：90％→16％：84％；25-40min，A：B为16％：84％；检测波长为230nm，流速为1mL/min；
(4)分别精密吸取供试品溶液、对照品A溶液、对照品B溶液和对照品C溶液0.005mL，注入高效液相色谱仪，测定，分别得供试品溶液、对照品A溶液和对照品B溶液的液相色谱；
(5)利用国家药典委员会中药色谱指纹图谱相似度评价系统，对供试品溶液、对照品A溶液、对照品B溶液和对照品C溶液的液相色谱分别经过数据导入，多点校正和数据匹配，即得指纹图谱。
实施例4
本实施例建立白芍配方颗粒的指纹图谱的方法，包括如下步骤：
(1)取待测白芍配方颗粒0.15g，精密称定，精密加入稀乙醇10mL，称定重量，加热回流提取或超声提取40分钟，放冷，再称定重量，取稀乙醇补足减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液，作为供试品溶液；
(2)精密称取芍药苷对照品，加甲醇制成每1mL含0.00002g的溶液，摇匀，作为对照品A溶液；
精密称取芍药内酯苷对照品，加甲醇制成每1mL含0.0005g的溶液，摇匀，作为对照品B溶液；
精密称取羟基芍药苷对照品，加甲醇制成每1体积份含0.00012g的溶液，摇匀，作为对照品C溶液；
(3)色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以4.6mm×250mm、5μm的WatersXbridgeC18为色谱柱，以乙腈为流动相A、以0.1％的磷酸溶液为流动相B按照如下程序进行梯度洗脱：0min，A：B为5％：95％；0-5min，A：B为5％：95％→10％：90％；5min，A：B为10％：90％；5-25min，A：B为10％：90％→16％：84％；25-40min，A：B为16％：84％；检测波长为230nm，流速为1mL/min；
(4)分别精密吸取供试品溶液、对照品A溶液、对照品B溶液和对照品C溶液0.015mL，注入高效液相色谱仪，测定，分别得供试品溶液、对照品A溶液、对照品B溶液和对照品C溶液的液相色谱；
(5)利用国家药典委员会中药色谱指纹图谱相似度评价系统，对供试品溶液、对照品A溶液、对照品B溶液和对照品C溶液的液相色谱分别经过数据导入，多点校正和数据匹配，即得指纹图谱。
实验例
1、仪器与试药
仪器包括：高效液相色谱仪：Waters e2695高效液相色谱仪(美国waters公司)：四元泵，二极管阵列检测器(PDA)，自动进样器，Empower色谱工作站；色谱柱：Waters XbridgeC18(4.6mm×250mm，5μm)色谱柱；天平：千分之一天平(上海恒平JA2003)，万分之一天平(Sartorius BS224S)，十万分之一天平(Precisa XR205SM DR)；超声波发生器：(昆山超声KQ-700DE 40KHz 280W)；超纯水系统：美国Millipore(密理博)公司；DGX-9073鼓风干燥箱(上海福玛公司)；高温箱式电阻炉(上海凯朗SRJX-4-13D)；
试药包括：乙腈为色谱纯(德国Merk公司)，水为超纯水(电阻率18.2mΩ.cm)，其他试剂均为分析纯；白芍配方颗粒(序号1-15)由华润三九医药股份有限公司提供，按照实施例1的制备方法制备而成。
实验例1供试品溶液的制备
(1)提取溶剂的选择
分别采用甲醇、30％乙醇、稀乙醇作为提取溶剂按照以下方法对白芍配方颗粒进行提取：取白芍配方颗粒粉末0.1g，精密称定，置50mL量瓶中，分别加入上述提取溶剂35mL，超声处理(功率280W，频率40kHz)30分钟，放冷，加相应的提取溶剂至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
不同提取溶剂的色谱图如图1所示，对除溶剂峰外的三个最大峰进行比较，结果如表1和表2所示。
表1不同提取溶剂时除溶剂峰外的三个最大峰的总峰面积
表2除溶剂峰外的三个最大峰的系统适应性参数
由图1、表1和表2可知，提取溶剂为甲醇、30％乙醇、稀乙醇的峰形峰数无明显差异，提取溶剂为稀乙醇的峰面积稍大于提取溶剂为甲醇的峰面积。此外，由于提取溶剂为甲醇和稀乙醇时样品几乎全部溶解，提取溶剂为30％乙醇时样品部分溶解，且稀乙醇对人体的毒性较甲醇对人体的毒性低，故选择提取溶剂为稀乙醇。
(2)提取方法的选择
根据选择的提取溶剂，考察提取方法为未超声提取30min、加热回流提取30min，即：取白芍配方颗粒粉末0.1g，精密称定，置50mL量瓶中，加入稀乙醇35mL，分别加热回流提取或超声处理(功率280W，频率40kHz)30分钟，放冷，加稀乙醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
不同提取方法的色谱图如图2所示，对除溶剂峰外的三个最大峰进行比较，结果如表3所示。
表3不同提取方法的系统适应性参数
由图2和表3可知，加热回流和超声提取的色谱图的峰形、峰高、峰数相似；由于回流提取和超声提取时样品几乎全部溶解，考虑到实验操作的简便性，最终选择提取方法为超声提取。
(3)提取时间的选择
根据选择的提取溶剂和提取方法，考察提取时间为15min、30min和45min的区别，即：取白芍配方颗粒粉末0.1g，精密称定，置50mL量瓶中，加入稀乙醇35mL，分别超声处理(功率280W，频率40kHz)15min、30min和45min，放冷，加稀乙醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
不同提取时间的色谱图如图3所示，对除溶剂峰外的三个最大峰进行比较，结果如表4和5所示。
表4不同提取时间的系统适应性参数
表5不同提取溶剂时除溶剂峰外的三个最大峰的总峰面积
由图3和表4、5可知，提取时间为30min时，除溶剂峰外的三个最大峰总峰面积最大；经计算，比较对，超声处理30min和45min时芍药苷的提取率相近，且高于超声处理15min芍药苷的提取率；为了节约时间，确定提取时间为30min。
(4)溶剂量考察
根据以上确定的实验条件，考察不同的溶剂量，即：分别取白芍配方颗粒粉末0.1g，精密称定，分别置10ml、25mL、50mL量瓶中，分别加入稀乙醇8ml、20mL、35mL，超声处理(功率280W，频率40kHz)30分钟。放冷，加稀乙醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
不同溶剂量的色谱图如图4所示，对除溶剂峰外的三个最大峰进行比较，结果如表6和7所示。
表6不同溶剂量的系统适应性参数
表7不同溶剂量的芍药苷峰面积
由图4和表6、7可知，提取溶剂量为25mL和50mL时提取效果相当，为了节省溶剂、简便操作，选择25mL为提取溶剂量。
(5)最终提取方案
取白芍配方颗粒约0.1g，精密称定，置25mL容量瓶中，加稀乙醇20mL，超声处理(功率280W，频率40kHz)30分钟，溶解，加稀乙醇至刻度，摇匀，0.45μm微孔滤膜过滤，即得。
实验例2色谱分析条件的确定
(1)检测波长的选择
实验以检测到的峰数、峰高为选择原则，采用3D全波长扫描，230nm得到的峰信息量较为全面，且共有峰的响应最高，因此确定最佳波长为230nm。
(2)流动相的选择
配方颗粒是饮片经大规模水提取后经一系列制剂生产的产物，其所含成分复杂，等度洗脱很难分离，故本实施采用例梯度洗脱方式。比较乙腈-水、甲醇-水，先确定所用有机相，结果如图5(A)所示；在此基础上再比较水、0.1％磷酸水，如图5(B)所示，从而确定水相；最后比较不同比例(0.1％、0.2％)的差别，记录色谱图，如图5(C)所示。
由图5(A)、5(B)和5(C)可知，由于乙腈-水为流动相时分离的色谱峰多，分离度较好，且基线平稳，故确定了流动相使用的有机相为乙腈；通过比较水与0.1％磷酸水的洗脱效果，结果显示以0.1％磷酸作为水相时，色谱图峰数较多；再对不同比例酸性溶液进行比较，其中0.1％磷酸与0.2％磷酸分离效果无明显差别，且考虑到色谱柱耐受pH为2-8，故确定水相的磷酸浓度为0.1％。
(3)梯度的选择
在实验过程中采用了多个不同的洗脱梯度对同一份白芍配方颗粒提取样品进行测定，通过比较不同洗脱程序所测定的样品色谱图，从中优选色谱信息较丰富，主要色谱峰分离度高，基线较平稳且分析时间较为合理的梯度4洗脱程序作为最终的色谱分析条件，梯度1为等度洗脱：乙腈-0.1％磷酸溶液(14：86)。
表8为梯度2(A：乙腈和B：0.1％磷酸溶液)的梯度洗脱程序，表9为梯度3(A：乙腈和B：0.1％磷酸溶液)的梯度洗脱程序，表10为梯度4(A：乙腈和B：0.1％磷酸溶液)的梯度洗脱程序，不同梯度洗脱程序的色谱图如图6、7、8、9所示。
表8梯度2(A：乙腈；B：0.1％磷酸溶液)的梯度洗脱程序
表9梯度3(A：乙腈；B：0.1％磷酸溶液)的梯度洗脱程序
表10梯度4(A：乙腈；B：0.1％磷酸溶液)的梯度洗脱程序
由图6、7、8、9可知，梯度3比梯度2的分离效果好，但梯度2、3的50min后的峰分离效果差；梯度4的色谱图的峰形良好，分离度高，分析时间较为合适，故确定梯度4为最终的流动相梯度。
(4)不同色谱柱的考察
取同一份白芍配方颗粒样品的供试品溶液，分别以Waters XbridgeC18(4.6mm×250mm，5μm)作为色谱柱1、以Thromo Acclaim120C18(4.6mm×250mm，5μm)作为色谱柱2、以Ecosil C18(4.6mm×250mm，5μm)作为色谱柱3进行测定，所得结果如图10所示。
不同色谱柱的系统适应性参数如表11所示，不同色谱柱时6个共有峰的相对保留时间的结果如表12所示。
表11不同色谱柱的系统适应性参数
表12不同色谱柱时6个共有峰的相对保留时间的结果
由图10和表11可知，Waters XbridgeC18(4.6mm×250mm，5μm)的分离效果较好，选择Waters XbridgeC18为本实验的色谱柱。由表12可知，1号峰～6号峰与参照物S峰的相对保留时间的RSD分别为11.79％、1.98％、1.42％、0.00％、4.20％，峰1的RSD％值超过要求，说明峰1在不同色谱柱的重现性较差，建议剔除该共有峰。
(5)不同流速的考察
取同一份白芍配方颗粒样品的供试品溶液，分别以0.8mL/min、1.0mL/min，1.2mL/min的流速测定，所得色谱图如图11所示，系统适应性参数如表13所示。
表13不同流速的系统适应性参数
由图11和表13可知，流速为0.8mL/min时，5、6号峰分离效果不佳；又因为内径为4.6mm的柱子流速一般为1.0mL/min，压力可以控制在系统耐受范围内，故本实验采用1.0mL/min进行测定。
(6)不同柱温的选择
取同一份白芍配方颗粒样品的供试品溶液，分别以柱温25℃、30℃、35℃的柱温测定，所得色谱图如图12所示，系统适应性参数如表14所示。
表14不同柱温的系统适应性参数比较
由图12和表14可知，比较不同柱温(15℃、25℃、35℃)的系统适应性参数，综合比较，柱温为25℃时的分离效果最佳；又因为本实验的环境保持在25℃，故采用25℃进行测定。
(7)最终色谱条件
色谱柱：Waters XbridgeC18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；
柱温：25℃；
检测波长：230nm；
流动相：乙腈-0.1％磷酸水，梯度洗脱；
流速：1mL/min；
梯度洗脱程序如表15所示：
表15梯度洗脱程序
实验例3白芍配方颗粒特征图谱的建立
参照《中药注射剂指纹图谱研究的技术指南(试行)》，利用中国药典委员会推荐的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版”软件，通过对所得指纹图谱的进行相似度比较(以中位数建立参照指纹图谱)，并进行方法学考察。
根据实验例1和2，确定白芍配方颗粒HPLC特征图谱按如下方法建立：
(1)取白芍配方颗粒约0.1g，精密称定，置25mL容量瓶中，加稀乙醇20mL，超声处理(功率280W，频率40kHz)30分钟，溶解，加稀乙醇至刻度，摇匀，0.45μm微孔滤膜过滤，即得。
(2)高效液相HPLC色谱分析条件：
色谱柱：Waters XbridgeC18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；
柱温：25℃；
检测波长：230nm；
流动相：乙腈-0.1％磷酸水，梯度洗脱；
流速：1mL/min；
梯度洗脱程序如表15所示：
表15梯度洗脱程序
按上述方法进行白芍配方颗粒特征图谱的建立。
取白芍对照药材和15个批次的白芍配方颗粒样品作为供试品溶液，通过高效液相色谱得到白芍配方颗粒特征图谱，图13为15批白芍配方颗粒的特征图谱(S1～S15依次为批号1209001S、1309003H、1201002S、1112001H、1209003H、1401001S、1312002W、1305001H、1303002H、1306002H、1203002H、1210003H、1204001S、1212002H、1311002W的白芍配方颗粒的图谱S16为白芍对照药材图谱)，图14为白芍对照药材特征图谱，图15为15批配方颗粒及对照药材特征图谱的共有模式。
采用药典委员会编制的指纹图谱相似度评价软件“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版”，生成对照特征图谱，对配方颗粒特征图的检测结果进行分析、比较，选取其中的芍药苷作为参照峰(S峰)，计算各特征峰与S峰的相对保留时间规定值，所得结果如表16、17所示。
表16白芍配方颗粒的共有模式的相对保留时间
表17白芍配方颗粒的相对保留时间
(3)方法学验证
3.1重复性考察
取同一批号的供试品(批号：1204001S)6份，按(1)中供试品制备及(2)中色谱条件分别测定4个共有峰的相对保留时间，重复性考察实验结果如表18所示。
如表18所示，1号峰～4号峰与参照物S峰的相对保留时间的RSD分别为0.52％、0.18％、0.00％、0.72％；这表明，该方法重复性较好。
表18重复性考察结果
3.2精密度考察
取同一瓶重复性项下的供试品溶液(批号：1204001S)，连续进样6次。
分别测定4个共有峰的相对保留时间，精密度考察实验结果如表19所示。
表19精密度考察结果
由表19可知，1号峰～4号峰与参照物S峰的相对保留时间的RSD分别为0.18％、0.13％、0.00％、0.39％；这表明，该方法精密度较好。
3.3专属性考察
取同一瓶重复性项下的供试品溶液与空白溶剂稀乙醇做对比，专属性考察实验结果如图16所示。
由图16可知，空白溶剂在相应保留时间处无色谱峰，无干扰，符合要求。
3.4稳定性考察
取同一瓶重复性项下的供试品溶液，分别在0h、1h、4h、8h、12h、24h测定4个共有峰的相对保留时间。稳定性考察结果如表20所示。
表20稳定性考察结果
由表20可知，1号峰～4号峰与参照物S峰的相对保留时间的RSD分别为0.63％、0.04％、0.00％、0.80％；这表明，该方法稳定性较好。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (10)
1.一种建立白芍的药物制剂的指纹图谱的方法，其特征在于，
该方法包括如下步骤：
(1)取待测白芍的药物制剂0.05-0.15重量份，精密称定，精密加入稀乙醇10-30体积份，称定重量，加热回流提取或超声提取20-40分钟，放冷，再称定重量，取稀乙醇补足减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液，作为供试品溶液；
(2)精密称取芍药苷对照品，加甲醇制成每1体积份含0.00002-0.00010重量份的溶液，摇匀，作为对照品A溶液；
精密称取芍药内酯苷对照品，加甲醇制成每1体积份含0.0005-0.0015重量份的溶液，摇匀，作为对照品B溶液；
精密称取羟基芍药苷对照品，加甲醇制成每1体积份含0.00012-0.00014重量份的溶液，摇匀，作为对照品C溶液；
(3)色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相A、以0.1％的磷酸溶液为流动相B按照如下程序进行梯度洗脱：0min，A：B为5％：95％；0-5min，A：B为5％：95％→10％：90％；5min，A：B为10％：90％；5-25min，A：B为10％：90％→16％：84％；25-40min，A：B为16％：84％；检测波长为230nm，流速为1mL/min；
(4)分别精密吸取供试品溶液、对照品A溶液、对照品B溶液和对照品C溶液0.005-0.015体积份，注入高效液相色谱仪，测定，分别得供试品溶液、对照品A溶液、对照品B溶液和对照品C溶液的液相色谱；
(5)利用国家药典委员会中药色谱指纹图谱相似度评价系统，对供试品溶液、对照品A溶液、对照品B溶液和对照品C溶液的液相色谱分别经过数据导入，多点校正和数据匹配，即得指纹图谱；
所述重量份与所述体积份的关系为g/mL。
2.根据权利要求1所述的建立白芍的药物制剂的指纹图谱的方法，其特征在于，
该方法包括如下步骤：
(1)取待测白芍的药物制剂0.10重量份，精密称定，精密加入稀乙醇20体积份，称定重量，加热回流提取或超声提取30分钟，放冷，再称定重量，取稀乙醇补足减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液，作为供试品溶液；
(2)精密称取芍药苷对照品，加甲醇制成每1体积份含0.00006重量份的溶液，摇匀，作为对照品A溶液；
精密称取芍药内酯苷对照品，加甲醇制成每1体积份含0.0010重量份的溶液，摇匀，作为对照品B溶液；
精密称取羟基芍药苷对照品，加甲醇制成每1体积份含0.00013重量份的溶液，摇匀，作为对照品C溶液；
(3)色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相A、以0.1％的磷酸溶液为流动相B按照如下程序进行梯度洗脱：0min，A：B为5％：95％；0-5min，A：B为5％：95％→10％：90％；5min，A：B为10％：90％；5-25min，A：B为10％：90％→16％：84％；25-40min，A：B为16％：84％；检测波长为230nm，流速为1mL/min；
(4)分别精密吸取供试品溶液、对照品A溶液、对照品B溶液和对照品C溶液0.010体积份，注入高效液相色谱仪，测定，分别得供试品溶液、对照品A溶液、对照品B溶液和对照品C溶液的液相色谱；
(5)利用国家药典委员会中药色谱指纹图谱相似度评价系统，对供试品溶液、对照品A溶液、对照品B溶液和对照品C溶液的液相色谱分别经过数据导入，多点校正和数据匹配，即得指纹图谱。
3.根据权利要求1或2所述的建立白芍的药物制剂的指纹图谱的方法，其特征在于，以4.6mm×250mm、5μm的Waters XbridgeC18、4.6mm×250mm、5μm的Thromo Acclaim120C18或4.6mm×250mm、5μm的Ecosil C18为色谱柱。
4.根据权利要求1-3任一项所述的建立白芍的药物制剂的指纹图谱的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，以0.45μm微孔滤膜进行过滤。
5.根据权利要求1-4任一项所述的建立白芍的药物制剂的指纹图谱的方法，其特征在于，所述药物制剂为片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、蜜炼丸剂、缓释制剂、速释制剂、控释制剂、口服液体制剂或注射制剂。
6.根据权利要求1-5任一项所述的建立白芍的药物制剂的指纹图谱的方法，其特征在于，所述白芍的药物制剂通过以下方法制备而成：
取白芍，加热回流提取至少1次，每次加入至少2重量倍量的水提取至少0.5h，过滤，合并滤液，滤液浓缩至60℃相对密度为1.00-1.10的流浸膏，加入常规辅料，按照常规工艺，制成临床上可接受的片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、蜜炼丸剂、缓释制剂、速释制剂、控释制剂、口服液体制剂或注射制剂。
7.根据权利要求6所述的建立白芍的药物制剂的指纹图谱的方法，其特征在于，所述白芍的药物制剂通过以下方法制备而成：
取白芍，加热回流提取1～5次，每次加入2～10重量倍量的水提取0.5～2h，过滤，合并滤液，滤液浓缩至60℃相对密度为1.05-1.10的流浸膏，加入常规辅料，按照常规工艺，制成临床上可接受的片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、蜜炼丸剂、缓释制剂、速释制剂、控释制剂、口服液体制剂或注射制剂。
8.根据权利要求7所述的建立白芍的药物制剂的指纹图谱的方法，其特征在于，所述白芍的药物制剂通过以下方法制备而成：
取白芍，加热回流提取2次，第1次加入8重量倍量的水提取1.5h，第2次加入6重量倍量的水提取1h，过滤，合并滤液，滤液浓缩至60℃相对密度为1.05-1.10的流浸膏，加入常规辅料，按照常规工艺，制成临床上可接受的片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、蜜炼丸剂、缓释制剂、速释制剂、控释制剂、口服液体制剂或注射制剂。
9.根据权利要求1-8任一项所述的建立白芍的药物制剂的指纹图谱的方法，其特征在于，所述白芍的药物制剂的指纹图谱的共有特征峰为：1号峰羟基芍药苷、2号峰芍药苷内酯、3号峰芍药苷和4号峰，各峰号的相对保留时间分别为：1号峰0.47、2号峰0.86、3号峰1.00和4号峰1.69。
10.权利要求1-9任一项所述的方法在白芍的药物制剂的质量检测和质量控制中的应用。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20160817 |