CN105859846B - 对hpv16 e7具有结合亲和力的多肽及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种对HPV16 E7具有结合亲和力的多肽及其用途。首次揭示了一种对HPV16的E7蛋白具有结合亲和力的多肽；本发明还提供了该多肽作为药物或分子靶向试剂的诊断或治疗用途。

Description

对HPV16 E7具有结合亲和力的多肽及其用途

技术领域

本发明涉及生物医药领域，更具体地，本发明涉及一种对HPV16 E7具有结合亲和力的多肽及其用途。

背景技术

宫颈癌是一种全球公认的主要与人乳头瘤病毒(HPV)感染相关的癌症，死亡率在全球妇女癌症中高居第二。现有技术中，尽管基于HPV L1蛋白的宫颈癌预防性疫苗已经商业化，但基于HPV及其E7的治疗性疫苗，尚处于实验研究探索阶段。而存在的问题是：治疗性疫苗发挥作用是建立在机体免疫功能基础之上，用肿瘤特异性抗原或表位激发更为强烈的抗肿瘤特异性免疫效应，以达到清除肿瘤细胞的目的；但肿瘤病人往往存在自身免疫功能低下，或免疫抑制或免疫逃逸等而使治疗性疫苗发挥作用有限，难以达到预期的治疗目的。

靶向治疗是目前宫颈癌治疗中最具希望的方法和策略，主要包括下列几种类型：(1)表皮生长因子受体(EGFR)为靶点的治疗：EGFR与细胞内信号转导有关，发挥着调节正常细胞的生长和分化，增强肿瘤细胞侵袭力、促进血管生成、抑制肿瘤细胞凋亡等作用，而使其成为包括宫颈癌在内的多种人类肿瘤诊断和治疗的新靶点。目前，靶向EGFR的肿瘤治疗药物主要分为两类：EGFR单克隆抗体和小分子化合物酪氨酸激酶拮抗剂。其中单克隆抗体主要为HER2单克隆抗体，包括曲妥珠单抗(赫赛汀，Herceptin)和西妥昔单抗等；而小分子化合物主要包括吉非替尼、伊马替尼和埃洛替尼等。(2)以肿瘤血管生成为靶点的治疗：肿瘤细胞的生长和转移依赖于血管的形成，因而抗血管生成也是肿瘤靶向治疗研究的热点之一。如①贝伐单抗(rhuMAb-VEGF)，一种人源化单克隆抗体IgG1，通过抑制VEGF生物活性而抑制血管生成，贝伐单抗单药治疗或与其他化疗药物联合应用均可减少肿瘤血管生成。②舒尼替尼，一种多靶点酪氨酸激酶抑制剂，通过抑制VEGF R的酪氨酸激酶活性从而特异性阻断细胞内信号传导发挥抗肿瘤作用。

总之，分子靶向治疗可最大限度地杀伤肿瘤细胞，有效地降低肿瘤的复发和远处转移的风险，提高患者的生存率并提高患者的总生存时间。尽管基于单克隆抗体及其小分子片段的靶向分子治疗具有明显的优势，但是也存在不足，包括：(1)渗透性不够：限制抗体穿透体积大的实体瘤；(2)靶位点外渗：由于血管透性降低而致抗体在靶位点的外渗；(3)毒副作用：抗体对正常组织的非特异性结合而产生交叉反应，降低了靶向效果；(4)体内清除：注入的抗体代谢提高，降低了治疗效果；(5)抗体的免疫原性：抗体诱导机体产生抗人抗体，使治疗性抗体失活。由于交叉反应及免疫复合物的形成，使毒副作用产生的毒性效应已经成为发展针对癌症治疗性抗体的主要障碍，产生肝、肾及神经系统毒性而使其功能降低。如与HER2靶向抗体trastuzumab(Herceptin)相关的心脏毒性效应。用同位素标记抗体进行放射性免疫治疗也会导致骨髓抑制。

因此，本领域仍然亟待研究靶向性治疗HPV相关肿瘤疾病的新药物或新方法，以改善目前临床现状。

发明内容

本发明的目的在于提供一种对HPV16 E7具有结合亲和力的多肽及其用途。

在本发明的第一方面，提供一种对人乳头瘤病毒16型(HPV16)的E7蛋白具有结合亲和力的多肽，该多肽是以葡萄球菌A蛋白(SPA)Z段(Z结构域)的氨基酸序列作为骨架，进行12-20个(较佳地为13-16个，如14个、15个)氨基酸变异后获得的多肽。

在一个优选例中，相对于葡萄球菌A蛋白Z段的氨基酸序列(SEQ ID NO:5)，所述的对人乳头瘤病毒16型的E7蛋白具有结合亲和力的多肽在第9-11，13-14，17-18，24-25，27-28，32，35，43位上发生氨基酸突变。

在另一优选例中，相对于葡萄球菌A蛋白Z段的氨基酸序列，所述的对人乳头瘤病毒16型的E7蛋白具有结合亲和力的多肽的：

第9位氨基酸突变为S或W；

第10位氨基酸突变为F、L或V；

第11位氨基酸突变为E、L或W；

第13位氨基酸突变为R、I或S；

第14位氨基酸突变为S、L、M或A；

第17位氨基酸突变为W或R；

第18位氨基酸突变为A、W、T或Q；

第24位氨基酸突变为G、R、D或P；

第25位氨基酸突变为D、L、H或G；

第27位氨基酸突变为G、V、A或Q；

第28位氨基酸突变为R、E或L；

第32位氨基酸突变为L、V或E；

第35位氨基酸突变为G、H、Q或D；

第43位氨基酸突变为E或K。

在另一优选例中，所述的对人乳头瘤病毒16型的E7蛋白具有结合亲和力的多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1-4任一所示。

在另一优选例中，所述的对人乳头瘤病毒16型的E7蛋白具有结合亲和力的多肽与人乳头瘤病毒16型的E7蛋白相互作用的K_D值为1×10^-6M至1×10^-7M。

在本发明的另一方面，提供一种靶向人乳头瘤病毒16型的靶向性分子，所述的靶向性分子包括前面任一所述的多肽，以及与该多肽相连接(或偶联)的偶联物，所述的偶联物包括(但不限于)：半胱氨酸残基，多肽标签，抑制人乳头瘤病毒16型的药物，或可检测标记物(如荧光标记，酶，生物素或放射性同位素)。

在一个优选例中，所述的偶联物是肽，所述的偶联物与所述的对人乳头瘤病毒16型的E7蛋白具有结合亲和力的多肽构成融合多肽。

在另一优选例中，所述的多肽标签包括但不限于：His标签(如6×His)，Myc标签，GST标签，Flag标签。

在另一优选例中，所述酶包括但不限于：碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶。

在另一优选例中，所述的抑制人乳头瘤病毒16型的药物包括(但不限于)：毒素；较佳地，所述毒素是具有抑制人乳头瘤病毒16型病毒感染或抑制肿瘤作用的毒素，如白喉毒素、蓖麻毒素、绿脓杆菌外毒素或所述毒素的功能性片段；且，所述的肿瘤是人乳头瘤病毒16型阳性的肿瘤。

在另一优选例中，所述的毒素是绿脓杆菌外毒素A，或所述毒素的功能性片段是绿脓杆菌外毒素A的活性片段PE38KDEL。较佳地，该绿脓杆菌外毒素A或其功能性片段连接于所述的对人乳头瘤病毒16型的E7蛋白具有结合亲和力的多肽的羧基末端(C末端)。

在另一优选例中，所述的偶联物与所述的对人乳头瘤病毒16型的E7蛋白具有结合亲和力的多肽以柔性肽连接，所述柔性肽包括(但不限于)：(Gly₄Ser)₃。

在本发明的另一方面，提供一种分离的多核苷酸，其编码前面任一所述的对人乳头瘤病毒16型的E7蛋白具有结合亲和力的多肽。

在本发明的另一方面，提供一种多核苷酸，其编码所述的靶向人乳头瘤病毒16型的靶向性分子，且其中所述的偶联物是肽。

在本发明的另一方面，提供一种重组载体，该载体包含所述的多核苷酸。

在本发明的另一方面，提供一种宿主细胞，该宿主细胞包含所述的重组载体，或其包含有或基因组中整合有所述的多核苷酸。

在本发明的另一方面，提供一种制备前面任一所述的对人乳头瘤病毒16型的E7蛋白具有结合亲和力的多肽的方法，所述方法包括：(1)培养所述的细胞，从而表达所述的对人乳头瘤病毒16型的E7蛋白具有结合亲和力的多肽；(2)分离纯化(1)获得的多肽。

在本发明的另一方面，提供所述的对人乳头瘤病毒16型的E7蛋白具有结合亲和力的多肽或所述的靶向人乳头瘤病毒16型的靶向性分子的用途，用于制备治疗人乳头瘤病毒16型感染疾病或人乳头瘤病毒16型表达阳性肿瘤的药物；或

用于制备检测人乳头瘤病毒16型病毒感染的检测试剂；或

用于制备诊断人乳头瘤病毒16型感染疾病或人乳头瘤病毒16型表达阳性肿瘤的诊断试剂。

在一个优选例中，所述的靶向人乳头瘤病毒16型的靶向性分子中，所述的偶联物是抑制人乳头瘤病毒16型的药物或抗肿瘤药物(如毒素)，所述的对人乳头瘤病毒16型的E7蛋白具有结合亲和力的多肽或所述的靶向人乳头瘤病毒16型的靶向性分子用于治疗人乳头瘤病毒16型感染疾病或人乳头瘤病毒16型表达阳性肿瘤。

在另一优选例中，所述的靶向人乳头瘤病毒16型的靶向性分子中，所述的偶联物是可检测标记物(如荧光标记或酶)，所述的对人乳头瘤病毒16型的E7蛋白具有结合亲和力的多肽或所述的靶向人乳头瘤病毒16型的靶向性分子用于诊断人乳头瘤病毒16型感染疾病或人乳头瘤病毒16型表达阳性肿瘤。

在另一优选例中，所述的人乳头瘤病毒16型表达阳性肿瘤包括：宫颈癌、头颈部肿瘤或外生殖器肿瘤等。

在另一优选例中，所述的人乳头瘤病毒16型感染疾病包括：宫颈上皮内瘤样病变或外生殖器疣等。

在本发明的另一方面，提供一种药物组合物，其包含：前面所述的对人乳头瘤病毒16型的E7蛋白具有结合亲和力的多肽或所述的靶向人乳头瘤病毒16型的靶向性分子；和药学上可接受的载体。

在本发明的另一方面，提供一种用于诊断或治疗人乳头瘤病毒16型感染疾病或人乳头瘤病毒16型表达阳性肿瘤的药盒，所述的药盒中包括：所述的对人乳头瘤病毒16型的E7蛋白具有结合亲和力的多肽，或所述的靶向人乳头瘤病毒16型的靶向性分子，或所述的药物组合物。

在一个优选例中，所述的对人乳头瘤病毒16型的E7蛋白具有结合亲和力的多肽或所述的靶向人乳头瘤病毒16型的靶向性分子是有效量的。

在本发明的另一方面，提供一种治疗人乳头瘤病毒16型感染疾病或人乳头瘤病毒16型表达阳性肿瘤，包括将所述的对人乳头瘤病毒16型的E7蛋白具有结合亲和力的多肽或所述的靶向人乳头瘤病毒16型的靶向性分子给予需要治疗的对象。

在本发明的另一方面，提供一种诊断人乳头瘤病毒16型感染疾病或人乳头瘤病毒16型表达阳性肿瘤，包括将所述的靶向人乳头瘤病毒16型的靶向性分子给予需要治疗的对象；所述的靶向性分子中，所述的偶联物是可检测标记物(如荧光标记或酶)。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、各Z_HPV16E7以及Z_wt序列的对比。本发明的多肽Z_HPV16E7中被修饰的氨基酸位点在图中己用黑体标出(SEQ ID NO：1-4)。

图2、实施例1中产生的一个融合多肽的重组质粒构建图(A)和氨基酸序列示意图(B)。

Z_HPV16E7代表具有选自SEQ ID NO：1-5任一序列的HPV16E7结合结构域，6xHis代表六组氨酞标记，HM代表NdeI(CATATG)翻译的氨基酸，LE代表XhoI(CTCGAG)翻译的氨基酸。

图3、pET21a(+)/affibody的重组质粒电泳图。

M1：DNA marker；1-5分别为pET21a(+)/Z_HPV16E7:127、pET21a(+)/Z_HPV16E7:301、pET21a(+)/Z_HPV16E7:384、pET21a(+)/Z_HPV16E7:745及pET21a(+)/Z_wt的重组质粒。

图4、Affibody重组蛋白原核表达(A)及纯化(B)的SDS-PAGE电泳分析。

A中：M：蛋白marker；1-2分别为BL21(DE3)菌株和pET21(+)空载体转染的BL21(DE3)菌株，3-8分别为pET21a(+)/Z_HPV16E7:127、pET21a(+)/Z_HPV16E7:301、pET21a(+)/Z_HPV16E7:384、pET21a(+)/Z_HPV16E7:745及pET21a(+)/Z_wt的重组质粒转染的BL21(DE3)菌株。

B中：M：蛋白marker；1-5分别为纯化后Z_{HPV16 E7:127}，Z_{HPV16 E7:301}，Z_{HPV16 E7:384}，Z_{HPV16 E7:745}及Z_wt affibody重组融合蛋白。

图5、HPV16E7重组蛋白的SDS-PAGE电泳及Western Blot分析。

M：marker；1.E.coli.BL21(DE3)菌株；2.重组质粒pET21a(+)/HPV16E7蛋白表达；3.纯化后HPV16E7重组融合蛋白。A：SDS-PAGE；B：Western Blot分析，一抗为His单抗(1:10000)；C：Western Blot分析，一抗为宫颈癌患者血清(1:500)。

图6、Z_{HPV16 E7}结合多肽在ProteOn XPR36仪器上的SPR检测。

A、B、C、D、E分别为Z_{HPV16 E7:127}、Z_{HPV16 E7:301}、Z_{HPV16 E7:384}、Z_{HPV16 E7:745}及Z_wt蛋白与靶蛋白HPV16E7的亲和力分析。

图7、Z_{HPV16 E7}结合多肽与HPV16 E7天然蛋白亲和力的细胞免疫荧光方法鉴定。

A：Z_{HPV16 E7:127}结合多肽的间接免疫荧光检测；B：Z_{HPV16 E7:301}蛋白的间接免疫荧光检测；C：Z_{HPV16 E7:384}蛋白的间接免疫荧光；D：Z_{HPV16 E7:745}蛋白的间接免疫荧光检测；E：HPV16E7兔抗体为一抗的间接免疫荧光检测。

图8、Dylight755标记的Z_{HPV16 E7:384}结合多肽SDS-PAGE电泳及荧光分析。

A为Z_{HPV16 E7:384}多肽SDS-PAGE电泳分析；B为标记Dylight755的Z_{HPV16 E7:384}多肽SDS-PAGE电泳的荧光分析。

图9、Dylight755标记的Z_{HPV16 E7:384}多肽在荷瘤裸鼠中的生物分布和肿瘤靶向的成像分析。A为Dylight755标记的Z_{HPV16 E7:384}多肽各时间点分别在负载Siha、Caski、HeLa229和A375细胞荷瘤裸鼠体内的荧光成像；B为各时间点分别在负载Siha、Caski、HeLa229和A375细胞(按照自上而下的次序)荷瘤裸鼠体内的平均荧光信号的强度。

图10、Dylight755标记的Z_{HPV16 E7:384}多肽在荷瘤裸鼠各脏器和肿瘤组织中的成像分析。A1-D1为在注射Dylight755标记的Z_{HPV16 E7:384}多肽24h后，在荷载肿瘤的裸鼠各主要组织脏器中的荧光分布；A2-D2为相应肿瘤组织及各脏器的平均荧光信号的强度。

图11、四种Z_{HPV16 E7}结合多肽对Siha细胞的IC50分析。A、B、C、D分别为Z_{HPV16 E7:127}、Z_{HPV16 E7:301}、Z_{HPV16 E7:384}及Z_{HPV16 E7:745}蛋白对Siha细胞的IC50分析。

图12、不同浓度Z_{HPV16 E7}结合多肽对Siha细胞的生长抑制作用。A、B、C、D分别为不同浓度的Z_{HPV16 E7:127}、Z_{HPV16 E7:301}、Z_{HPV16 E7:384}及Z_{HPV16 E7；745}蛋白对Siha细胞的生长抑制作用。

图13、pET21a(+)/Z_{HPV16 E7}affitoxin重组质粒构建图。

图14、Z_{HPV16 E7}affitoxin蛋白SDS-PAGE电泳和WB鉴定。

A：1，BL21(DE3)菌株；2，pET21a(+)载体转化的BL21(DE3)；3-7分别为pET21a(+)/HPV16 E7affitoxin127,301,384,745和Z_wt affitoxin重组质粒转染的BL21(DE3)菌株；

B：Z_{HPV16 E7}affitoxin127,301,384,745和Z_wt affitoxin纯化蛋白SDS-PAGE电泳图；1-5分别为Z_{HPV16 E7}affitoxin127,301,384,745和Z_wt affitoxin；

C：为Z_{HPV16 E7}affitoxin127,301,384,745Western blot分析(一抗为His单抗)，1为BL21(DE3)菌株，2为pET21a(+)载体转化的BL21(DE3)，3-6分别为Z_{HPV16 E7}affitoxin127,301,384,745；

D：为Z_wt affitoxin蛋白Western blot分析(一抗为His单抗)，1为BL21(DE3)菌株，2为pET21a(+)载体转化的BL21(DE3)，3为Z_wt affitoxin蛋白。

E：HPV16 E7-affitoxin蛋白Western blot分析(一抗为兔抗SPA-Z多抗)，1为BL21(DE3)菌株2为pET21a(+)载体转染的BL21(DE3)，3-6分别为HPV16 E7affitoxinE127，301，384，745。

F：为Z_wt affitoxin蛋白Western blot分析(一抗为兔抗SPA-Z多抗)，1为BL21(DE3)菌株，2为pET21a(+)载体转化的BL21(DE3)，3为Z_wt affitoxin蛋白。

图15、Z_{HPV16 E7}affitoxin与HPV16 E7天然蛋白亲和力的细胞免疫荧光鉴定。A：Z_{HPV16 E7}affitoxin127蛋白；B：Z_{HPV16 E7}affitoxin301蛋白；C：Z_{HPV16 E7}affitoxin384蛋白；D：Z_{HPV16 E7}affitoxin 745蛋白。

图16、Z_{HPV16 E7}affitoxin蛋白在ProteOn XPR36仪器上的SPR检测。A、B、C、D、E分别为Z_{HPV16 E7}affitoxin127、301、384、745及Z_wt affitoxin蛋白蛋白与靶蛋白HPV16E7的亲和力分析。

图17、Z_{HPV16 E7}affitoxin384对Caski细胞(A)和Siha细胞(B)的IC50分析。

图18、Z_{HPV16 E7}affitoxin384对四种肿瘤细胞生长的影响。

图19、不同浓度Z_HPV16E7affitoxin384对Siha(A)和Caski(B)细胞的生长抑制作用。

图20、血浆中Z_HPV16E7:384(B)与Z_HPV16E7affitoxin384(A)半衰期检测。

图21、Z_{HPV16 E7}affitoxin384对Balb/c荷瘤裸鼠的抑瘤作用效应。

A：五组小鼠在接种Siha的同时，尾静脉注射4mg/kg浓度的Z_HPV16E7affitoxin384或Z_HPV16E7:384、PE38KDEL蛋白、Z_wt affitoxin蛋白及PBS，每隔3天注射一次，共6次，图中箭头所示。

B：五组小鼠在接种Siha后，待肿瘤长至100～200mm³大小时，尾静脉注射4mg/kg浓度的Z_HPV16E7Affitoxin384或Z_HPV16E7:384、PE38KDEL蛋白、Z_wt affitoxin蛋白及PBS，每隔3天注射一次，共6次，图中箭头所示。

具体实施方式

本发明人经过深入的研究，首次揭示了一种对人乳头瘤病毒16型(HPV16)的E7蛋白具有结合亲和力的多肽；本发明还提供了该多肽作为药物或分子靶向试剂的诊断或治疗用途。

如本文所用，所述的“对HPV16 E7具有结合亲和力的多肽”是指以葡萄球菌A蛋白Z段的氨基酸序列作为骨架，进行10-20个氨基酸变异后获得的多肽，且该多肽能够特异性结合HPV16 E7、具有极少或没有非特异性结合。

如本文所用，所述的“本发明的多肽”、“对HPV16 E7具有结合亲和力的多肽”、“HPV16 E7结合多肽”、“Z_HPV16E7affibody多肽”、“Z_HPV16E7affibody”、“Z_HPV16E7”、“affibody蛋白”、“affibody重组蛋白”、“Z_{HPV16 E7}重组蛋白”可以互换使用。

如本文所用，所述的“靶向性分子”是指将本发明的对HPV16 E7具有结合亲和力的多肽与其它功能性偶联物连接后获得的、可以靶向HPV16 E7的分子。所述的偶联物可以是半胱氨酸残基，多肽标签，抑制人乳头瘤病毒16型的药物，酶或可检测标记物等。

如本文所用，所述的“融合多肽”是所述的“靶向性分子”的下位概念，是指本发明的对HPV16 E7具有结合亲和力的多肽与其它功能性肽(例如毒素蛋白或功能性蛋白片段)连接后获得的、可以靶向HPV16 E7的分子。

HPV16型感染是致宫颈癌的主要型别。HPV感染宿主细胞后，其病毒基因整合到宿主染色体，进而使宿主细胞发生突变并发展为肿瘤，其致癌的主要关键分子之一是HPV基因早期区(E)编码的E7蛋白，E7蛋白主要通过其氨基端的保守序列LXCXE与抑癌蛋白pRb结合，使正常状态下与Rb结合的转录因子E2F解离出来，并灭活pRb蛋白，解离的E2F即可激活基因转录，促进了众多细胞增殖相关基因的转录，引起细胞过度增殖恶性转化。高危型HPV E7蛋白是HPV所致宫颈癌的肿瘤原性蛋白，持续并稳定地在宫颈癌及其癌前病变组织中呈高表达，而在正常组织中不存在。综合考虑上述因素，本发明人选择HPV16 E7作为靶抗原。本发明人以葡萄球菌A蛋白的Z结构域(Z_wt，SEQ ID NO:1)作为支架，将其表面氨基酸残基模拟抗体结合位点进行随机突变，通过噬菌体展示技术构建突变文库，以HPV16 E7作为靶抗原对该文库进行亲和筛选，经过大量的筛选工作，最终获得了对于HPV16 E7具有高度亲和力的多肽。

本发明的多肽是以葡萄球菌A蛋白Z结构域的氨基酸序列作为骨架，进行14-20个(较佳地为14个)氨基酸变异后获得的多肽。作为本发明的优选方式，本发明的多肽相对于葡萄球菌A蛋白Z段的氨基酸序列(SEQ ID NO:5)，在第9-11，13-14，17-18，24-25，27-28，32，35，43位上发生氨基酸突变。更优选地，本发明的多肽具有SEQ ID NO:1-4任一所示的氨基酸序列。

本发明还涵盖了在所述HPV16 E7结合多肽的氨基酸序列任一末端或两端加入额外的氨基酸残基而形成的多肽。这些额外的氨基酸残基可以在多肽结合HPV16 E7时起作用，但是也可同样用于其它目的，如涉及该多肽的生产、纯化、稳定、偶联或检测的一种或几种。这些额外的氨基酸残基可以包括一或多种为了化学偶联目的而添加的氨基酸残基。如在多肽链的第一位或最后一位添加，即在N或C末端添加一个半胱氨酸残基等。这种额外的氨基酸残基也可以包括用于多肽纯化或检测的一个“标记”，如与标记抗体相互作用的六组氨酸肽(His₆)标记，或“myc”标记或“flag”标记。此外，其它本领域技术人员熟知的替代方式也包含在本发明中。

所述“额外的氨基酸残基”也可构成具有预期功能的一个或多个多肽结构域，如与第一个、HPV16E7结合结构域相同的结合功能，或者其它结合功能，或是一种酶促功能，或是一种荧光功能，或是其组合。

本发明也包含在所述的HPV16 E7结合多肽基础上，经修饰进而增加其在碱性条件下的稳定性的多肽。这种稳定性包括用对于碱性条件较不敏感的氨基酸残基定点取代在没有修饰的序列中出现的任何天冬酞胺残基。由于在不同的反应之间亲和层析柱要经受频繁的强碱处理以进行洗脱，这种对碱降低敏感性的特性，有利于使用本发明的多肽作为亲和层析中的亲和配体，能够延长亲和层析基质的使用寿命。

本发明也包含在本发明的HPV16 E7结合多肽基础上，进行其它修饰后获得的多肽。这些修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

本发明的HPV16 E7结合多肽可以与偶联物连接，从而构成功能性的靶向性分子，这种连接可通过化学键(包括肽键)相连或吸附；所述的化学键是共价键或非共价键。作为一种优选方式，通过肽键连接，从而形成融合多肽。

所述的HPV16 E7结合多肽与偶联物之间可以直接相连接，或者通过多肽连接子(连接肽)连接。所述的连接子例如包括1-30个氨基酸；较佳地为1-20个氨基酸。连接肽的设置基本上不影响融合蛋白中各多肽的活性。较佳地，可以利用柔性肽(Gly₄Ser)₃进行连接。其它本领域技术人员熟知的连接肽也可应用于本发明。

在“异源”融合多肽中，所述HPV16 E7结合多肽构成了第一个结构域或第一个部分，第二和其它部分具有除了结合HPV16 E7外的其它功能，这些可预期的结果也在本发明的范围内。该融合多肽的第二和其它部分可能包含对除了HPV16 E7外的其它靶分子具有亲和力的结合结构域。这种结合结构域也可能与SPA结构域相关，但在1到大约20个位置具有取代突变。结果是融合多肽有至少一个HPV16 E7结合结构域和至少一个与所述其它靶分子具有亲和力的结构域。这扩展了本发明的多肽的应用，如作为治疗制剂或作为捕获、检测或分离试剂。

本发明融合多肽第二和其它部分的其它选择包括用于治疗性应用的一或多种部分。在治疗性应用中，其它分子也可以通过其它方法共价或非共价偶联到本发明的多肽上。作为本发明的优选实施方式，将改造的铜绿假单胞菌外毒素PE38KDEL通过柔性肽连接于HPV16 E7结合多肽的C-末端，构成融合蛋白。非限制性例子包括用本发明多肽引导效应酶(例如羧肽酶)而进行“ADEPT"(抗体介导的酶前药治疗，antibody-directed enzymeprodrug therapy)的酶；包括用以募集免疫系统的效应细胞和其它组分的蛋白质；包括细胞因子，如IL-2、IFNγ、IL-12、TNFα、IP10；包括促凝血因子，如组织因子、von Willebrand因子；包括毒素，如蓖麻毒蛋白A、calcheamicin、美登木素生物碱；包括毒性小分子，如auristatin类似物、阿霉素等。同时，为了更方便掺入放射性核素(如⁶⁸Ga、⁷⁶Br、¹¹¹In、⁹⁹Tc、¹²⁴I、¹²⁵I)用于诊断或放射性核素(如⁹⁰Y、¹³¹I、²¹¹At)用于治疗，可以考虑上述列举的额外的氨基酸(特别是六组胺酸标记和半胱氨酸)，其目的是将放射性同位素的鳌合剂偶联到多肽序列。

本发明还涵盖了在所述的HPV16 E7结合多肽上连接一个可检测标记物(如荧光标记，生物素或放射性同位素)，从而可基于本发明的多肽的特异性，实现检测HPV16感染或HPV16感染相关疾病的目的。

“HPV16 E7结合亲和力”是指可以例如通过利用表面等离子共振(surfaceplasmon resonance)技术如装置进行检测的一种多肽特性。HPV16 E7结合亲和力可以通过一个实验进行检测，其中将HPV16 E7固定在该装置的感应芯片上，然后将含有待测多肽的样品通过该芯片。或者，也可以将待检测的多肽固定在该装置的感应芯片上，然后将含有HPV16 E7的样品通过该芯片。本领域技术人员可以利用所获得的感应图像建立多肽的HPV16 E7结合亲和力的至少一种定性测量方法。如果需要定量测量方法，例如为了建立相互作用间的某个K_D值，也可以使用表面等离子共振方法。例如，结合值可以利用2000装置(Biocore AB)进行测定。HPV16 E7固定于该装置的感应芯片上，而亲和力待检测的多肽样品通过连续稀释制备并以随机顺序进行注射。然后可从结果中计算K_D值。在本发明的实施例中，所述的多肽的K_D值达到1×10^-6M至1×10^-7M。

本发明还提供了编码本发明的HPV16 E7结合多肽或靶向性分子或融合多肽的分离的核酸，也可以是其互补链。所述核酸可以全序列人工合成，也可用PCR扩增的方法分别获得。

本发明还提供了包含编码所述核酸分子的载体。所述的载体还可包含与所述核酸分子的序列操作性相连的表达调控序列，以便于所述融合蛋白的表达。如本文所用，“操作性相连”或“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其它部分的活性。例如，如果启动子控制以编码序列的转录，那么它就是可操作地连于编码序列。

在本发明中，任何合适的载体都可以使用，比如一些用于细菌、真菌、酵母和哺乳动物细胞的克隆和表达的载体，如Pouwels等，克隆载体：实验室手册中所描述的。

此外，含有所述核酸序列的重组细胞也包括在本发明中。术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞包括大肠杆菌、枯草杆菌等；例如可为大肠杆菌细胞(E.coli)，如大肠杆菌HMS174(DE3)、或BL21(DE3)。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。

生产本发明的HPV16 E7结合多肽或靶向性分子或融合多肽的方法也已包括在本发明中。所述方法包括培养含有相应多肽的编码核酸的重组细胞，获得产物多肽。可将上述制备获得的多肽纯化为基本均一的性质，例如在SDS-PAGE电泳上呈单一条带。

基于要表达多肽的信息和目前重组表达蛋白质的技术水平，结合本发明揭示的内容，本领域技术人员易于制备本发明的多肽。例如，表达未被修饰的Z结构域的质粒可以用作起始材料。使用已知技术，所需的取代突变可以被引入这个质粒中以获得本发明的表达载体。

当使用化学多肽合成方法制备本发明的多肽或靶向性分子或融合蛋白时，上述多肽中的任何天然产生的氨基酸残基都可以被任何相应的、非天然产生的氨基酸残基或其衍生物所取代，只要产物多肽的功能基本不被损害。

本发明还涉及所述的HPV16 E7结合多肽或靶向性分子或融合多肽在不同方面的应用，包括应用于治疗、诊断和/或检测。

本发明的HPV16 E7结合多肽可作为HPV16 E7抗体在不同应用中的一种替代物。作为非限制性的实例，其可用于治疗特征以HPV16 E7表达或HPV16感染为特征的疾病，例如肿瘤(如宫颈癌，头颈部肿瘤)等。通过结合胞内HPV16 E7以抑制细胞信号传导，用于相关疾病的体内和体外诊断。本发明的多肽可作为一种检测试剂、一种捕获试剂或者分离试剂，而且还可直接用作为一种治疗制剂或者将其它治疗制剂靶向HPV16 E7蛋白的手段。体外使用本发明的多肽的方法可以不同方式进行，如微量滴定板、蛋白阵列、生物传感器表面和组织切片等等。为了使本发明多肽适用于特异的用途，在不偏离本发明的范围的情况下，可以对本发明的多肽进行修饰和/或添加。在下面详细描述了这些修饰和添加，其可能包括在同一多肽链中包含的额外的氨基酸，或者标记和/或治疗制剂，其化学修饰或以其它方式结合本发明的多肽。另外，本发明还涵盖了保留了结合HPV16 E7能力的该多肽的片段。

本发明的HPV16 E7结合多肽可以作为治疗制剂，其治疗作用基于至少一种以下机制：(i)加强化疗作用，施用本发明的多肽与目前和将来的化疗治疗协同作用。阻断胞内的HPV16 E7蛋白对抑癌基因pRb的破坏作用；(ii)抑制肿瘤细胞的增殖。可能在细胞内存在以下机制：当结合多肽进入细胞内部与HPV16 E7蛋白结合时，阻断了HPV16 E7与pRb的结合，从而阻断了细胞生长增殖信号。

本发明多肽的HPV16 E7结合特性以及用该多肽生产靶向性分子(包括融合蛋白)和/或标记的结合分子的稳定性意味着该多肽也可以用于将其它活性物质靶向肿瘤部位，这些肿瘤包括表达HPV16 E7的细胞。因此，本发明的另一方面是提供了本文所述的HPV16E7结合多肽与一种具有抗癌活性的物质偶联的应用，以将所述物质运送到表达HPV16 E7的细胞，产生靶细胞的损伤或凋亡。

这种抗癌活性的物质可能是通过融合或通过化学键偶联到HPV16 E7结合多肽上的蛋白质，如选自用于“ADEPT”(antibody-directed enzyme prodrug therapy)应用的效应酶；用于募集免疫系统的效应细胞和其它组分的蛋白；细胞因子，如IL-2、IFNγ、IL-12、TNFαa、IP 10等；促凝血因子，如组织因子、von Willebrand因子等；毒素，如蓖麻毒蛋白A、假单胞菌外毒素、calcheamicin、美登木素生物碱等。或者，所述活性物质也可能是细胞毒性药物，如auristatin类似物或阿霉素或放射性同位素(如⁹⁰Y、¹³¹I、²¹¹At等)，这种同位素可与HPV16 E7结合多肽直接结合，或通过一种鳌合剂，如熟知的鳌合剂DOTA或DTPA而与HPV16E7结合多肽结合。

在相关方面，本发明还提供了一种在体内将具有抗癌活性的物质导向表达HPV16E7细胞的方法，包括施用给患者本文所述的所述活性物质与与HPV16 E7结合多肽的偶联物。这种偶联物在前文已被适当描述。

本发明还包括使用所述的与HPV16 E7结合的多肽检测样品中的HPV16 E7蛋白。例如，这种检测可以用来诊断特征为表达HPV16 E7的疾病情况。检测HPV16 E7的存在可以在体内也可以在体外进行。体内诊断的优选选择是使用正电子放射X线断层摄影术，PET。被检测的样品可以例如是生物学液体样品或组织样品。现在的普遍方法是用针对与HPV16 E7的抗体，这种方法可以适用于本发明的与HPV16 E7结合多肽，这种方法是组织化学方法检测与HPV16 E7的存在，用来鉴定新鲜、冷冻或福尔马林固定、石蜡包埋的组织样品中与HPV16E7蛋白的表达。为了检测HPV16 E7，本发明的多肽也能用作融合蛋白的一部分，其中其它结构域是报告酶或荧光酶。或者，其也可以是被一个或多个荧光制剂和/或放射性同位素标记的，任选通过鳌合剂标记。合适的放射性同位素包括⁶⁸Ga、⁷⁶Br、¹¹¹In、⁹⁹Tc、¹²⁴I和¹²⁵I等。

本发明还包括将所述的HPV16 E7结合多肽应用于检测生物学液体样品中HPV16E7。这个方法包括以下步骤：(1)提供被检测患者的生物学液体样品，(2)将本文所述的HPV16 E7结合多肽在能使所述多肽与样品中存在的任何HPV16 E7结合的条件下加入样品中，(3)除去非结合的多肽，及(4)检测结合的多肽。被检测到的结合的多肽的量与样品中存在的HPV16 E7量相关。在步骤(2)中，HPV16 E7结合多肽可以以任何适宜的形式加入到样品中，包括例如这样的情况，当HPV16 E7结合多肽被固定在一种固体支持物上，通过其使样品接触，或HPV16 E7结合多肽存在于溶液中。

所述的HPV16 E7结合多肽的其它应用还包括：检测样品中HPV16 E7的方法，包括如下步骤：(1)提供一种怀疑含有HPV16 E7的组织样品，例如冷冻切片或用福尔马林包埋的组织切片，(2)在适宜条件下加入本发明的HPV16 E7结合多肽到所述样品中，所述条件为益于所述多肽与样品中存在的任何HPV16 E7结合，(3)除去未结合的多肽，及(4)检测结合的多肽。检测到的结合的多肽的量与样品中存在的HPV16 E7的量相关。

本发明还提供了一个诊断组织样品中HPV16 E7表达的试剂盒，包括与报告酶(如碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶)融合的、本发明的HPV16 E7结合多肽、检测酶活性的试剂、和阳性和阴性对照组织切片。

本发明还提供了一个诊断组织样品中HPV16 E7表达的试剂盒，包括通过抗体检测的与标记(如flag标记或myc标记)融合的本发明的HPV16 E7结合多肽、一个特异于标记的一抗、特异于一抗并与报告酶偶联的二抗、检测酶活性的试剂，和阳性和阴性对照组织切片。

诊断应用的一个领域就是在体内检测癌细胞或其聚集物。本发明提供了一个进行这种诊断的试剂盒，该试剂盒包括标记有一个鳌合物的、本发明的HPV16 E7结合多肽、一种诊断用放射性同位素(非限制性的例子是⁶⁸Ga、⁷⁶Br、¹¹¹In、⁹⁹Tc、¹²⁴I和¹²⁵I等)，以及用于分析掺入效率的试剂。

如上所述，本发明涵盖了本发明的HPV16 E7结合多肽将活性物质靶向表达HPV16E7的细胞如某些类型的癌症细胞的应用。本发明还提供了一个用于此目的的试剂盒，该试剂盒包括用一个鳌合物标记的本发明的HPV16 E7结合多肽、一个治疗性放射性同位素(非限制性的例子是⁹⁰Y、¹³¹I、²¹¹At)，以及用于分析掺入效率的试剂。

本发明还提供一种药物组合物，其包含：有效量的本发明所述的对人乳头瘤病毒16型的E7蛋白具有结合亲和力的多肽或靶向人乳头瘤病毒16型的靶向性分子，和药学上可接受的载体。

如本文所用，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在Remington’s Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.，N.J.1991)中可找到关于药学上可接受的载体的充分说明。在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、甘油和山梨醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质和稳定剂，如白蛋白等。

可将所述的组合物制成各种适合于哺乳动物给药的剂型，所述剂型包括但不限于：注射剂、胶囊剂、片剂、乳剂、栓剂。

在使用时，是将安全有效量的本发明所述的对人乳头瘤病毒16型的E7蛋白具有结合亲和力的多肽或靶向性分子施用于哺乳动物(如人)，其中该安全有效量通常至少约1微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约10毫克/千克体重，较佳地该剂量是约1微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1、HPV16E7结合多肽的文库构建及筛选研究

构建噬菌体展示HPV16 E7结合多肽的随机组合文库，即许多不同的SPA结构域相关多肽的文库，从该文库中筛选HPV16 E7结合多肽，并对其亲和性进行了鉴定。

1、HPV16 E7结合多肽的随机组合噬菌体展示文库的构建和鉴定

根据野生型SPA-Z的氨基酸序列及结构(Nilsson B等，Protein Eng.1987；1(2):107-113)，针对其三个螺旋结构区对应的编码序列设计随机引物，利用PCR方法扩增获得可导致随机氨基酸突变的SPA编码序列，命名为SPA-N。

2、pCANTAB5E/SPA-N重组质粒的构建

选择以M13噬菌体系统(购自北京宝科维食安生物公司)进行亲和体的表达，因此以pCANTAB5E(购自北京宝科维食安生物公司)为载体，通过Sfi I和Not I将获得的SPA-N编码序列克隆至pCANTAB5E载体的Sfi I/Not I位点内，构建pCANTAB5E/SPA-N重组质粒，转化至感受态E.coli TG1细胞中，涂布2YT-A平板，37℃培养过夜。即为初级库，标记为affibody初级库备用。结果随机挑取平板上长出的28个单克隆菌落，将提取质粒用Sfi I和Not I双酶切鉴定为阳性克隆，经测序和分析其随机性。

结果：根据测序结果，送测序的28个克隆中有测序结果的为26个克隆，其中连接成功21个克隆，随机性完全不同，故重组率为21/26＝88％；多样性为21/21＝100％。同时，取上述转化后培养的菌液，用2×YT培养液倍比稀释(1:10，1:10²……)，涂布SOB-AG平板，计算平板上的单菌落数，推算库容。通过增加连接转化次数累计库容，多次连接转化后使克隆数达到2.4×10⁵个Z蛋白变体(affibody分子)，其在第9、10、11、13、14、17、18、24、25、27、28、32、35和43位具有随机的氨基酸残基。

3、HPV16 E7结合多肽的筛选和滴度测定

将纯化的HPV16 E7蛋白包被96孔酶标板，经封闭、加噬菌体文库(初级库)孵育、再加入E.coli TG1 37℃，轻摇温育；取100μl，用2*YT培养基做梯度倍比稀释，取稀释液100μl涂布SOB-AG平板，30℃过夜，计数结合噬菌体感染菌落数，计算HPV16E7结合噬菌体滴度；结果平板可见菌落，滴度是10²；此时完成第一轮淘洗，另部分菌液加10¹⁰辅助噬菌体M13KO7(购自北京宝科维食安生物公司)和卡那霉素培养过夜，离心后取上清经0.22μm滤膜过滤，获得HPV16 E7分子亲和筛选后的噬菌体文库，为一级affibody库。重复上述4轮富集筛选，分别获得HPV16 E7分子亲和筛选后的噬菌体文库，为二级，滴度分别为1×10⁶；在二级库的基础上再重复上述4轮富集筛选，为三级文库，滴度为1×10⁸。同时设置不加噬菌体的空白对照作同步筛选。

4、HPV16 E7结合多肽单克隆噬菌体的制备及ELISA鉴定

ELISA用于筛选表达HPV16 E7结合affibody分子的噬菌体。将10μg/ml的HPV 16E7蛋白以200μl/孔包被96孔酶标板，4℃过夜；PBS洗涤，用2％脱脂奶粉封闭2h；洗涤，取四轮筛选后获得的噬菌体与等体积的3％脱脂奶粉混匀，200μl/孔，37℃，2h。洗涤，加入1:10000稀释的HRP/anti-M13酶标二抗(兔抗M13，Abcam#ab6188)，200μl/孔，37℃，1h；洗涤，加入OPD显色液200μl/孔，37℃，15min；2M H₂SO₄ 50μl/孔，终止反应；置酶标仪(ELx800TM，BIO-TEK，Winooski，USA)读取OD490值。

在四轮淘选循环中选择结合抗原的affibody分子，经过这四轮选择循环，进一步用噬菌体ELISA检测以分析其HPV16 E7结合活性，用高于0.5的OD490的ELISA值为选择标准，鉴定编码HPV16 E7结合多肽的噬菌体，选择高于这个ELISA信号值的150个克隆，并与另外随机挑选12个无ELISA值的克隆进行DNA序列分析。

5、HPV16 E7亲和体分子的序列检测及筛选

共150个单克隆送中国上海生工公司测序，测序引物为CATATGGTTGACAACAAATTCAACAAAGAA(SEQ ID NO:12)。测序结果用DNA STAR软件分析对标准序列SPA-Z与SPA-N进一步分析其三个螺旋区的随机性和多样性。结果获78个完全正确克隆序列，有部分序列完全重复，兼并重复序列后获得65个序列完全正确的克隆。

根据DNA测序结果进行分析，在上述测序正确的65个克隆中，选择与HPV16 E7蛋白结合活性最强的4个单克隆噬菌体(即呈现HPV16 E7亲和体分子的单克隆噬菌体)的DNA序列(分别为Z_{HPV16E7：127}、Z_{HPV16E7：301}、Z_{HPV16E7：384}、Z_{HPV16E7：745})作为靶目标进行研究，氨基酸序列为SEQ ID NO:1、2、3、4，如图1，它们的编码序列如SEQ ID NO:6-9)。下一步用于HPV16 E7结合亲和体的分子克隆和表达及功能检测。

本发明利用噬菌体展示技术，将构建的affibody随机肽库，展示在噬菌体表面，以HPV16 E7蛋白为靶标蛋白，进行HPV16 E7亲和体的筛选。经过四轮淘洗，每轮均经过：亲和-洗涤-扩增，且靶蛋白HPV16 E7蛋白的浓度随着淘洗次数的增加而降低，50μg/ml、30μg/ml、15μg/ml、10μg/ml从而能更好的筛选出亲和力高的亲和体，而随着每轮的大量扩增，亲和体每轮均会有10²的选择性富集。经ELISA进一步筛选出OD值读数较高(A₄₉₀>0.5)的单克隆测序，将测序完整正确的HPV16 E7 affibody序列通过NTI软件比对分析，而后随机挑取亲和力较高的4个单克隆进行下一步的研究，此4个克隆的氨基酸序列分析与标准的野生型比对，三个螺旋结构可变区域出现了约13-14个氨基酸的改变。。

实施例2、HPV16E7结合多肽重组质粒构建和原核蛋白表达及纯化

如前选择了具有较高ELISA读数的4个克隆(图1中的affibody Z_{HPV16 E7:127}、Z_HPV16E7:301、Z_{HPV16 E7:384}、Z_{HPV16 E7:745})，为了对筛选的affibody分子进行功能检测，对其进行重组质粒构建、原核蛋白的表达及其鉴定，并制备纯化蛋白。

1.pET21a(+)/affibody的重组质粒构建和鉴定

参照affibody基因序列(GenBank：GY324633.1)设计PCR引物，上游引物5’GGGAATTCCATATGGTTGACAACAAATTCAACAAAGAA 3’(SEQ ID NO:13，下划线表示Ned I酶切位点)，下游引物5’CCGGAATTCCGTTTCGGAGCCTGAGCGT3’(SEQ ID NO:14，下划线表示XhoⅠ酶切位点)；以筛选的测序正确四级库单克隆affibody Z_{HPV16 E7：127}、Z_{HPV16 E7：301}、Z_{HPV16 E7：384}、Z_{HPV16 E7：745}为模板，通过PCR扩增affibody目的基因(SEQ ID NO:6-9)，同时将affibody Z_wt(SEQ IDNO:1)经原核密码子优化后全序列(SEQ ID NO:10)合成作为阴性对照。将PCR扩增的目的基因经NdeⅠ和XhoⅠ克隆至pET21a(+)载体，构建pET21a(+)/Z_{HPV16 E7}的重组质粒，并经测序鉴定(图2，图3)。

2.原核蛋白生产

将重组质粒转化至大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)中，37℃，培养16h；加0.8mM异丙基硫代-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)(默克公司，德国)IPTG诱导培养6h表达带有His标签的Z_HPV16E7affibody及Z_wt affibody蛋白。经诱导后表达的重组蛋白，用镍螯合亲和层析胶体(Ni-NTA Agarose)(QIAGEN公司，美国)亲和层析法纯化并经SDS-PAGE分析鉴定。

结果，利用分子生物学技术成功构建了pET21a(+)/Z_{HPV16 E7}重组质粒，并采用原核表达系统制备了纯化的Z_{HPV16 E7:127}、Z_{HPV16 E7:301}、Z_{HPV16 E7:384}、Z_{HPV16 E7:745}及Z_WT affibody重组融合蛋白，经SDS-PAGE电泳分析(图4)证实，出现考马斯亮蓝浓染的条带分子质量约7.8kDa，与预期Z_{HPV16 E7}affibody多肽的分子质量大小一致。本发明选择pET21a(+)载体，在设计上利用其多克隆位点的起始酶位点为NdeI(CATATG)，其密码子ATG即为目的蛋白翻译的氨基酸(M)起始密码子，这样利用原核表达系统表达的蛋白即为全长的目的蛋白Z_{HPV16 E7}而不带载体蛋白片段，避免了载体蛋白对实验结果的干扰。

实施例3、Z_{HPV16 E7}affibody多肽与HPV16 E7蛋白的结合

为鉴定Z_{HPV16 E7}affibody多肽与HPV16 E7蛋白结合的特异性，利用表面等离子共振技术(SPR)分析筛选的四个Z_{HPV16 E7:127}、Z_{HPV16 E7:301}、Z_{HPV16 E7:384}、Z_{HPV16 E7:745}分子及其对照Z_wtaffibody与靶蛋白HPV16 E7的特异性结合。

HPV16 E7蛋白的制备：用PCR方法从宫颈癌组织中扩增HPV16 E7基因，克隆至pET21a(+)载体，构建pET21a(+)/HPV16 E7重组质粒，并且测序鉴定；将重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)，经IPTG诱导后表达重组蛋白，用Ni-NTA亲和层析法纯化并经SDS-PAGE及Western blot分析鉴定(参见王冰冰等，HPVl6型E7重组蛋白的表达及其多克隆抗体的制备；细胞与分子免疫学杂志，2014(2)：167-170)。结果，成功制备了HPV16 E7纯化蛋白及其多克隆抗体，并进行了特异性验证(图5A-C)。

Z_{HPV16 E7}affibody多肽的传感器分析：在ProteOn XPR36系统仪器(Bio-Rad公司)进行HPV16 E7蛋白和Z_{HPV16 E7}affibody多肽之间相互作用的亲和力分析，即利用表面等离子共振技术(SPR)分析上述带有His标签的Z_{HPV 16 E7:127}、Z_{HPV16 E7:301}、Z_{HPV16 E7:384}、Z_{HPV16 E7:745}及Z_wtaffibody分子(作为对照)与HPV16 E7之间的相互作用。根据操作手册，在不同的流动池上通过偶联于GLH芯片将HPV16 E7重组蛋白固定，进行与筛选多肽之间的亲和力测定。第6个流动池表面被激活和失活以作为注射时的空白对照。affibody分子分别进行六个不同梯度浓度稀释与HPV16 E7重组蛋白结合，即Z_{HPV16 E7:127}浓度为1.0nM、2.0nM、4.0nM、8.0nM、16.0nM、32.0nM、64.0nM，Z_{HPV16 E7:301}浓度为0.7nM、1.4nM、2.8nM、5.6nM、11.2nM、22.4nM、44.8nM，Z_{HPV16 E7:384}浓度为0.6nM、1.2nM、2.4nM、4.8nM、9.6nM、19.2nM、38.4nM，Z_{HPV16 E7:745}浓度为1.1nM、2.2nM、4.45nM、9.1nM、18.3nM、36.5nM、73.2nM及Z_wt affibody分子浓度为1.0nM、2.0nM、4.0nM、8.0nM、16.0nM、32.0nM、64.0nM，所有的分析在25℃进行，流速为30μl/min，注射标本的容量为200μl，并以流速30μl/min随机顺序注射，随后用HCl(BIO-RAD货号：#176-2250 100mM HCl)洗涤6min(解离)，利用ProteOn Manager^TM软件(BIO-RAD)的1：1朗缪尔结合模型分析结合曲线(感应图)。

采用表面等离子共振技术(SPR)检测，分析重复两次检测的结果，亲和力平衡解离常数KD均值，Z_{HPV16 E7:127}、Z_{HPV16 E7:301}、Z_{HPV16 E7:384}、Z_{HPV16 E7:745}及Z_wt affibody分子分别的为1.91×10^-6mol/L、1.18×10^-7mol/L、1.73×10^-6mol/L、5.02×10^-5mol/L及4.63×10^-2mol/L。结果，纯化的Z_{HPV16 E7:127}、Z_{HPV16 E7:301}、Z_{HPV16 E7:384}、Z_{HPV16 E7:745}蛋白分子与HPV16 E7重组蛋白具有相互作用的能力，如图6A-E显示，较Z_wt affibody分子解离常数KD值相差1000至10000倍。经筛选获得的Z_{HPV16 E7:127}、Z_{HPV16 E7:301}、Z_{HPV16 E7:384}、Z_{HPV16 E7:745}均能与HPV16E7重组蛋白结合，结合的亲和力均已经达到nmol/L级水平，与此同时野生型的Z_wt affibody分子和HPV16 E7重组蛋白几乎没有结合力，表明筛选出的4个affibody分子与HPV16 E7重组蛋白具有较高的特异亲和力，同时表明原核诱导表达的Z_{HPV16 E7}affibody分子与HPV16 E7重组蛋白均具有生物活性。

因此，本发明的Z_{HPV16 E7:127}、Z_{HPV16 E7:301}、Z_{HPV16 E7:384}、Z_{HPV16 E7:745}蛋白分子与HPV16E7靶蛋白分子具有相互结合和识别能力。从蛋白水平验证了Z_{HPV16 E7:127}、Z_{HPV16 E7:301}、Z_{HPV16 E7:384}、Z_{HPV16 E7:745}分子与HPV16E7靶蛋白之间的亲和力。

实施例4、Z_{HPV16 E7}affibody多肽与表达HPV16 E7蛋白细胞的结合

为进一步验证筛选的Z_{HPV16 E7}affibody多肽与HPV16E7靶蛋白的亲和力，利用表达HPV16 E7的宫颈癌细胞作为研究对象，即人宫颈癌细胞系Siha(ATCC:HTB-35，表达HPV16E7的宫颈癌细胞)、Caski(ATCC：CRL-1550，表达HPV16和18 E7的宫颈癌细胞)和HeLa229(ATCC：CCL-2HPV 18阳性的宫颈癌细胞)，并利用黑色素瘤细胞系A375(ATCC:CRL-1619，HPV阴性的黑色素瘤细胞)作为对照，进一步验证Z_{HPV16 E7:127}、Z_{HPV16 E7:301}、Z_{HPV16 E7:384}、Z_{HPV16 E7:745}蛋白分子与HPV16 E7蛋白分子之间的结合。

细胞培养：人宫颈癌细胞系Caski、Siha、HeLa229及黑色素瘤细胞系A375细胞培养于RPMI 1640培养基(10％胎牛血清，2.05mM L-谷氨酞胺和100IU/ml青霉素及100μg/ml链霉素)。细胞在37℃含有5％C0₂的培养箱中培养至24h，细胞状态良好时进行免疫荧光检测。

细胞免疫荧光检测：将灭菌的盖玻片放入六孔板中，将培养至24h的Caski、Siha、HeLa229、A375细胞调整数目为1×10⁶/孔，5％CO₂、37℃培养24h至单层细胞。加入终浓度为50μg/ml Z_{HPV16 E7}affibody多肽于上述含10％FBS培养基中，5％CO₂、37℃培养6h，吸出培养液，用预冷PBS洗涤；采用2％多聚甲醛固定单层细胞10min，PBST洗涤3次，加入0.3％TritonX-100打孔10min，洗涤后加入10％FBS+1640培养基37℃封闭1h，洗涤；分别加入鼠抗His单克隆抗体(ABR公司，美国，1：2000)、兔抗SPA血清(1:500)及HPV16E7兔血清抗体(1：500)，置37℃1h，洗涤后加FITC-羊抗兔IgG二抗(上海联科生物技术公司，中国)和PI(索莱宝公司，北京)2μl/孔1h，避光，洗涤后加盖玻片并用缓冲甘油封片，共聚焦荧光显微镜(Leica TCSSP2 microscope德国)观察并拍片(400×)。

用纯化的Z_{HPV16 E7:127}、Z_{HPV16 E7:301}、Z_{HPV16 E7:384}、Z_{HPV16 E7:745}孵育HPV16 E7蛋白表达阳性宫颈癌Caski、Siha细胞6h后，分别用His单克隆抗体、SPA兔血清分析重组affibody蛋白与细胞株表达的HPV16 E7重组蛋白的识别和结合能力，同时设置HPV16 E7蛋白表达阴性的人黑色素瘤A-375细胞株和HPV18 E7阳性的宫颈癌HeLa229细胞株作为对照，与此同时设置HPV16 E7兔血清抗体作为阳性对照。

结果显示，Z_{HPV16 E7:127}、Z_{HPV16 E7:301}、Z_{HPV16 E7:384}、Z_{HPV16 E7:745}蛋白孵育的Siha、Caski细胞株的细胞核膜和细胞浆内核周可见多个强绿色的点状或团块状荧光蛋白(图7A-D)，与HPV16 E7兔血清抗体孵育的结果一致(图7E)，而HeLa229细胞和A375细胞株均未见明显的荧光团块(图7A-E)。表明，Z_{HPV16 E7:127}、Z_{HPV16 E7:301}、Z_{HPV16 E7:384}、Z_{HPV16 E7:745}重组蛋白能特异性识别细胞中天然表达HPV16 E7蛋白，本发明制备的Z_{HPV16 E7:127}、Z_{HPV16 E7:301}、Z_{HPV16 E7:384}、Z_{HPV16 E7:745}重组蛋白和活细胞表达的HPV 16 E7蛋白有很强的特异结合能力。

上述结果进一步从细胞水平验证了Z_{HPV16 E7:127}、Z_{HPV16 E7:301}、Z_{HPV16 E7:384}、Z_{HPV16 E7:745}重组蛋白与HPV16 E7蛋白具有很强的靶向结合特异性和亲和力。

实施例5、Z_{HPV16 E7}affibody多肽在宫颈癌细胞荷瘤裸鼠中的生物分布和肿瘤靶向在本实施例的实验中，选择上述affibody分子中的Z_{HPV16 E7:384}affibody多肽作为检测对象，用近红外荧光染料DyLight755 NHS Ester(Thermo Fisher公司，美国，货号62278)标记Z_HPV16E7:384affibody多肽，并将其注射到携带Siha、Caski、HeLa229及A375移植肿瘤的小鼠体内，进行Z_{HPV16 E7:384}affibody多肽生物分布研究，并对裸小鼠成像定位以研究标记多肽的靶向特性。

动物肿瘤模型的制备：选择6-7周龄BALB/c-nu小鼠(购于上海斯莱克实验动物有限责任公司，合格证SCXK(沪)2012-0002)，体重为15-18g)。将培养至对数生长期，生长状态良好的Siha、Caski、HeLa229及A375用EDTA(胰酶)消化后，用含10％血清细胞培养液进行吹打、收集，常温1000转/min离心3min，将离心细胞用不含血清的培养液重悬并计数，配制成1×10⁷/ml，取0.2ml于背部近右前臂或下肢近腹股沟皮下注射接种裸鼠。每隔3天观察小鼠的精神状态、活动力、反应、饮食、体重及皮下接种区域外观及触感，并以电子游标卡尺测量瘤体大小直径。待肿瘤长至300-500mm³用于Z_{HPV16 E7}affibody多肽的生物分布和成像研究。

结果显示，裸鼠皮下接种上述细胞均可见明显的肿瘤生长，22只裸鼠全部成瘤。3周后，肿瘤最大直径达到300-500mm³时开始实验。

Z_{HPV16 E7:384}多肽近红外荧光染料Dylight755标记及鉴定：按照说明书步骤进行将Dylight755的标记并鉴定。即取91μg DyLight755 NHS-Ester染料溶解入273μl DMF有机溶剂后，加入透析后的Z_{HPV16 E7:384}affibody蛋白(300μg/ml，共1ml)溶液中，避光，4℃条件下反应1h，将反应后的溶液避光透析，每隔半小时更换透析液(磷酸盐缓冲液，pH7.2-7.4)，2h后收集Dy755-Z_HPV16E7:384荧光蛋白，取样测蛋白浓度为100μg/ml，采用SDS-PAGE电泳进行鉴定。分别取Dy755标记的Z_HPV16E7:384(Dy755-Z_HPV16E7:384)1μg、0.5μg和0.1μg，用磷酸盐缓冲液稀释至10μl，同时取10μl Dy755-DMF染料做阴性对照，分别加入10μl蛋白loading buffer中，于冰上避光条件下电泳，并将凝胶放于活体成像仪(CRi Maesro 2.10，in-vivofluorescence imaging system)中，激发光滤片为671-705nm，发射光滤片为750longpass，采用8bit和2×2模式，用730-950nm波长间隔10nm每次曝光5000ms收集图像信息，用Maesro软件进行图像处理及分析。经鉴定的Dy755-Z_HPV16E7:384分装于棕色离心管，-20℃保存备用。

结果显示，标记蛋白Dy755-Z_HPV16E7:384经SDS-PAGE电泳分析，1.0μg、0.5μg和0.1μg的泳道在相对分子质量为7.8kDa处出现单一的染色条带，但Dylight755染料无条带(图8A)，经小动物活体成像仪扫描，在相应1.0μg和0.5μg位置处均出现单一的荧光条带(图8B)。表明，近红外荧光染料Dylight755标记Z_{HPV16 E7:384}affibody多肽成功。

Z_{HPV16 E7:384}affibody多肽在肿瘤细胞异种移植物的裸鼠中的生物分布和肿瘤靶向作用：待裸鼠的肿瘤长至300-500mm³时将裸鼠带出SPF屏障系统，用10％水合氯醛腹腔注射诱导麻醉，待其进入深度麻醉状态后经尾静脉注射10μg Dy755-Z_HPV16E7:384荧光蛋白，置于小动物活体成像仪(CRi Maesro 2.10，in-vivo fluorescence imaging system)中成像，并用0.8-1.0μl/g水合氯醛维持麻醉状态，以保证小鼠在成像过程中处于深度麻醉，在5min、10min、15min、30min、45min、1h、1.5h、2h、4h、6h、8h和24h连续成像观察(图9A-B)。并于24h后处死并解剖小鼠，取肿瘤组织、肝脏、脾脏、肾脏、和大脑等组织脏器置于成像系统。成像的激发光滤片为671-705nm，发射光滤片为750longpass，采用8bit和2×2模式，730-950nm波长间隔10nm每次曝光5000ms收集图像信息，并用Maesro软件进行图像处理及分析，分别显示背景自发荧光和目标荧光信号，然后测量其荧光值，将背景自发荧光设置为黑色，目标荧光信号设置为红色，最后将两种色彩相叠加。所得数据用GraphPAD软件进行处理。

结果，Siha和Caski荷瘤裸鼠在尾静脉注射50μg Dy755-Z_HPV16E7:384荧光蛋白10min后，肿瘤部位即出现明显的荧光信号，1h-1.5h荧光信号最完整，与肿瘤大小对应，8h时肿瘤的荧光成像明显变小，24h时仍有荧光成像。除肾脏外，肿瘤组织中的荧光强度于30min时开始升高，约至6h均显著高于其他各脏器的荧光强度，尽管至24h荧光强度已经减弱，但仍然高于其他各脏器。HeLa229和A-375对照组观察期间均未检测到有明显区别于背景荧光的荧光信号。实验组和对照组裸鼠肝脾相对应的部位在静脉注射后Dy755-Z_HPV16E7:384荧光蛋白后可见明显的荧光信号，随着染料在小鼠体内不断代谢，信号逐渐降低，至24h已经减弱消失；而肾脏在静脉注射后Dy755-Z_HPV16E7:384荧光蛋白后10min直至24h，可见最强的荧光信号(图9)。分析肿瘤组织荧光信号强度发现，Siha和Caski细胞荷瘤小鼠在30min左右信号强度最高，之后逐渐降低，分别至6h和8h左右信号强度最为明显(图9)。

在尾静脉注射50μg Dy755-Z_HPV16E7:384荧光蛋白24h时解剖小鼠，取实验组和对照组的肿瘤、心脏、肺、脾脏、肝脏及肾脏等重要组织器官进行成像，发现肿瘤、肾脏、心、脑、肠、肺、肌肉和骨骼等组织中荧光信号分布与强度与活体成像结果基本相一致(图10A-D)，且在Siha和Caski荷瘤小鼠中，肿瘤组织的荧光强度与其他各脏器的荧光强度有显著性差异(p<0.05)，而在HeLa229和A375荷瘤小鼠中肿瘤组织的荧光强度与其他各脏器的荧光强度无显著性差异(p>0.05)。荷瘤小鼠在观察期间状态良好，未见明显毒性反应。

结果表明，标记Dylight755-Z_HPV16E7:384多肽具有靶向结合HPV16E7表达阳性肿瘤的特性，且没有严重的毒副作用。

实施例6、Z_{HPV16 E7}affibody多肽的生物学功能研究

为研究Z_{HPV16 E7}affibody多肽体外细胞生长是否具有抑制作用，本发明选择Siha肿瘤细胞株作为实验对象。利用CCK-8试剂检测细胞生长过程中各时间点的细胞生存率进行检测，并利用Grahpad primer5.0软件计算Z_HPV16E7affibody多肽的IC50。

制备Siha肿瘤细胞悬液并接种于96孔细胞培养板，0.5×10⁴/孔。培养24h后，加入1μg/ml放线菌酮、5％胎牛血清，然后分别加入4个affibody蛋白即Z_{HPV16 E7:127}、Z_{HPV16 E7:301}、Z_{HPV16 E7:384}、Z_{HPV16 E7:745}，分别设置100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml、10μg/ml、1μg/ml五个浓度组，并以Z_wt affibody为对照组，同时设培养基对照，采用CCK-8试剂盒(Cell CountingKit-8，GC-0030，CN)检测细胞的生存率，即在加入结合多肽后0、1、3、6、12、24、36、48和72h，加入CCK-8试剂，10μl/孔，在CO₂培养箱内继续孵育30min后置于酶标仪A450处读数。每组均设3个复孔，并进行3次重复实验。细胞存活(Cell viability)计算方法为：Cell viability(％)＝(affitoxin384组的OD值-培养基组OD值)/(SPA-Z_wt对照组OD值-培养基组OD值)×100％；同时用GraphPad primer 5.0软件来计算细胞生长存活的IC50值。

结果，Z_{HPV16 E7:127}、Z_{HPV16 E7:301}、Z_{HPV16 E7:384}、Z_{HPV16 E7:745}多肽对Siha肿瘤细胞的生长均有抑制作用(图12A-D)，其IC50分别是2.882±0.661μM、3.876±0.125μM、2.725±0.358μM和1.835±0.233μM(图11A-D)。显示，Z_{HPV16 E7:127}、Z_{HPV16 E7:301}、Z_{HPV16 E7:384}、Z_{HPV16 E7:745}对表达HPV16 E7阳性的宫颈癌细胞Siha均具有抑制作用，并于6h其抑制细胞生长作用表现为最强，至72h，与Z_wt和培养基对照仍然有显著性差异(p<0.001)；同时显示，Z_{HPV16 E7:127}、Z_{HPV16 E7:301}、Z_{HPV16 E7:384}、Z_{HPV16 E7:745}多肽对Siha细胞的抑制作用具有浓度依赖性，100μg/ml、50μg/ml和10μg/ml组之间的细胞生存率具有显著性差异(p<0.001)，同时三组剂量组与Z_wt和培养基对照组的细胞生存率比较也具有显著性差异(p<0.001)。

以上结果表明，Z_{HPV16 E7:127}、Z_{HPV16 E7:301}、Z_{HPV16 E7:384}、Z_{HPV16 E7:745}多肽具有抑制Siha细胞生长的特性，进一步验证了Z_{HPV16 E7:127}、Z_{HPV16 E7:301}、Z_{HPV16 E7:384}、Z_{HPV16 E7:745}具有体外HPV16 E7靶向结合特异性。

实施例7、Z_{HPV16 E7}affitoxin蛋白对宫颈癌细胞荷瘤裸鼠的保护作用

在本实施例中，利用Z_{HPV16 E7}的靶向作用，携带经改构具有细胞毒作用的绿脓杆菌外毒素A(pseudomonas exotoxinA，PEA)的活性片段PE38KDEL作为细胞毒分子(Gao J,etal.Mol Cancer Ther，2008,7(10):3399-3407)。构建Z_{HPV16 E7}/PE38KDEL原核表达载体，并利用原核表达系统制备并纯化了Z_HPV16E7/PE38KDEL蛋白，即affitoxin，对affitoxin与靶蛋白HPV16 E7的特异性结合，及靶向作用进行和验证，并将其进一步注射到携带Siha(ATCC：HTB-35，表达HPV16的宫颈癌细胞)、Caski(ATCC：CRL-1550，表达HPV16和18的宫颈癌细胞)、HeLa229(ATCC：CCL-2 HPV 18阳性的宫颈癌细胞)和A-375(ATCC:CRL-1619，HPV16阴性的黑色素瘤)移植肿瘤的小鼠体内，进行肿瘤保护和治疗实验。同时用Z_wt affitoxin作对照。

Z_{HPV16 E7}affitoxin蛋白的制备和鉴定：选择Z_{HPV16 E7}affibody作为HPV16 E7的靶向分子，利用柔性肽(Gly₄Ser)₃在其C末端连接PE38(KDEL)，将柔性肽C端连接经原核密码子优化的PE38(KDEL)的全序列(SEQ ID NO:11)，PE38(KDEL)的全序列DNA合成并经EcoRI和XhoI位点克隆至pET21a(+)载体，构建pET21a(+)/PE38(KDEL)载体，进一步通过分子克隆方法将Z_{HPV16 E7:127}、Z_{HPV16 E7:301}、Z_{HPV16 E7:384}、Z_{HPV16 E7:745}及Z_wt编码序列经NedI和EcoRI克隆至pET21a(+)/PE38(KDEL)载体构建重组质粒并测序鉴定，进一步将其转化至大肠杆菌BL21(DE3)，经IPTG诱导后表达重组蛋白，用Ni-NTA亲和层析法纯化并经SDS-PAGE及Western Blot分析鉴定。

结果，成功构建了pET21a(+)/Z_{HPV16 E7}affitoxin127、301、384、745及pET21a(+)/Z_wt affitoxin重组质粒(图13)；该重组质粒在原核表达系统表达并获得纯化的Z_HPV16E7affitoxin127、Z_HPV16E7affitoxin301、Z_HPV16E7affitoxin384、Z_HPV16E7affitoxin745及Z_wt affitoxin重组蛋白，SDS-PAGE电泳提示该蛋白的分子质量约为45kDa(图14A、B)；Western blot结果(图14C、D)显示，His单抗和兔SPA-Z多抗作为一抗，在分子质量约为45kDa均处出现单一条带，提示Z_HPV16E7affitoxin127、Z_HPV16E7affitoxin301、Z_HPV16E7affitoxin384、Z_HPV16E7affitoxin745及Z_wt affitoxin重组蛋白能特异性识别兔SPA-Z多克隆血清抗体。结果表明，Z_HPV16E7affitoxin127、Z_HPV16E7affitoxin301、Z_HPV16E7affitoxin384、Z_HPV16E7affitoxin745及Z_wt affitoxin重组纯化蛋白制备成功。

Z_HPV16E7affitoxin蛋白与靶蛋白结合特性研究：为验证Z_HPV16E7affitoxin蛋白与HPV16 E7结合的特性，采用SPR和细胞免疫荧光方法进一步验证。选择Siha(HPV16+)、Caski(HPV16+、HPV18+)、HeLa229(HPV16-、HPV18+)及黑色素瘤细胞A375作为阴性对照，方法同实施例4。即将培养至24h的Caski、Siha、HeLa229、A375细胞，调整细胞数目为1×10⁶/孔，培养24h至单层细胞，加入终浓度为50μg/ml的Z_{HPV16 E7}affitoxin127、Z_{HPV16 E7}affitoxin301、Z_{HPV16 E7}affitoxin384、Z_{HPV16 E7}affitoxin745及Z_wt affitoxin蛋白，5％CO₂，37℃培养6h，经固定、洗涤后，0.3％Triton x-100打孔，加入10％FBS+1640培养基37℃封闭1h，用PBS洗涤3次；分别加入鼠抗His单克隆抗体(ABR公司，美国，1：2000)、兔抗SPA血清(1:500)及兔抗PE38KDEL血清(1：5000)，置37℃1h，洗涤后加FITC-羊抗兔IgG二抗(上海联科生物技术公司，中国)和PI(索莱宝公司，北京)2μl/孔1h，避光，洗涤后加盖玻片并用缓冲甘油封片，共聚焦荧光显微镜(Leica TCS SP2microscope德国)观察并拍片(40×)。同时，采用不加Z_{HPV16 E7}affitoxin127、Z_{HPV16 E7}affitoxin301、Z_{HPV16 E7}affitoxin384、Z_{HPV16 E7}affitoxin745蛋白，以兔HPV16 E7血清抗体为一抗(1：5000)作为阳性对照。

结果，经细胞免疫荧光检测，在共聚焦荧光显微镜下观察显示，Z_{HPV16 E7}affitoxin127、Z_{HPV16 E7}affitoxin301、Z_{HPV16 E7}affitoxin384、Z_{HPV16 E7}affitoxin745蛋白孵育的Siha、Caski细胞株的细胞核膜和细胞浆内核周可见多个绿色的点状或团块状荧光蛋白，与HPV16 E7兔血清抗体孵育的结果相一致，而HeLa229细胞和A375细胞株均未见明显的荧光团块(图15A-D)，同时Z_wt affitoxin蛋白孵育的Siha、Caski、HeLa229及A375细胞株均未出现荧光团块。表明，Z_{HPV16 E7}affitoxin127、Z_{HPV16 E7}affitoxin301、Z_{HPV16 E7}affitoxin384、Z_{HPV16 E7}affitoxin745重组蛋白识别HPV16 E7，而不识别HPV18E7，即特异性识别活细胞中天然表达HPV16 E7蛋白的能力保持不变，且与活细胞表达的天然HPV16 E7蛋白有很强的结合能力。本实施例进一步从细胞水平验证了Z_{HPV16 E7}affitoxin127、Z_{HPV16 E7}affitoxin301、Z_{HPV16 E7}affitoxin384、Z_HPV16E7affitoxin745重组蛋白具有与活细胞表达的HPV16 E7蛋白具有很强的亲和力。

进一步在ProteOn XPR36系统仪器(Bio-Rad公司)进行Z_{HPV16 E7}affitoxin蛋白和HPV16E7之间相互作用的亲和力分析，即利用表面等离子共振技术(SPR)分析上述His标签的Z_HPV16E7affitoxin127、Z_{HPV16 E7}affitoxin301、Z_{HPV16 E7}affitoxin384、Z_{HPV16 E7}affitoxin745及Z_wt affitoxin分子(作为阴性对照)与HPV16 E7之间的相互作用。实验步骤同实施例3。

结果，采用表面等离子共振技术(SPR)分析测得亲和力解离常数KD值分别的为1.36×10^-6mol/L、1.76×10^-6mol/L、1.45×10^-6mol/L、3.90×10^-6mol/L。重复两次检测。结果表明，纯化的Z_HPV16E7affitoxin 127、affitoxin 301、affitoxin 384、affitoxin 745蛋白(带有His₆标签)与HPV16E7重组蛋白具有相互作用的能力，如图16A-D和表2所示，4个affitoxin蛋白均能与HPV16 E7重组蛋白结合，结合的亲和力均已达到nmol/L级水平，而野生型的Z_wt affitoxin和HPV16 E7重组蛋白几乎没有结合力，表明筛选出的四个affibody蛋白与HPV16E7重组蛋白具有较高的特异亲和力。

结果表明，本发明的Z_HPV16E7affitoxin 127、affitoxin 301、affitoxin 384、affitoxin 745蛋白分子(带有His₆标签)与HPV16E7靶蛋白分子具有相互结合和识别能力。进一步从蛋白水平验证了Z_HPV16E7affitoxin 127、Z_HPV16E7affitoxin 301、Z_HPV16E7affitoxin384、Z_HPV16E7affitoxin 745与HPV16E7靶蛋白之间的亲和力。

Z_HPV16E7affitoxin体外细胞生长抑制作用：为研究Z_HPV16E7affitoxin体外细胞生长抑制作用，选择Z_HPV16E7affitoxin384蛋白作为研究对象。同样选择Caski、Siha、HeLa229和A375四种肿瘤细胞株作为靶细胞。制备上述四种细胞悬液并计数接种于96孔细胞培养板，0.5×10⁴/孔。培养24h后，加入1μg/ml放线菌酮及5％胎牛血清，然后加入Z_HPV16E7affitoxin384蛋白，设置100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml、10μg/ml、1μg/ml五个浓度组，以SPA-Z_wt为对照组(PE38KDEL)，设置五个同样浓度组，同时设培养基对照，采用CCK-8试剂盒检测细胞的生存率，在加样后1h、3h、6h、12h、24h、48h和72h，加入CCK-8试剂10μl/孔，在CO₂培养箱内继续孵育30min后置于酶标仪A450处读数。每组均设置3个复孔，并进行3次重复实验。细胞存活(Cell viability)计算方法为：Cell viability(％)＝(Z_HPV16E7affitoxin384组的OD值-培养基组OD值)/(SPA-Z_wt对照组OD值-培养基组OD值)×100％；同时用GraphPad primer 5.0软件来计算细胞生长存活的IC50值。

结果如图17，经GraphPad primer 5.0软件来计算Siha和Caski细胞生长存活的IC50值，分别为0.28μM和0.24μM。图18显示，Z_HPV16E7affitoxin 384对表达HPV16 E7阳性的宫颈癌细胞Siha和Caski具有较强的杀伤作用，而对表达HPV18E7阳性的宫颈癌HeLa229细胞及表达HPV阴性的黑色素瘤细胞A375均无明显的杀伤作用。图19显示，Z_HPV16E7affitoxin384作用于Siha和Caski 72h后，其细胞生存率与对照细胞之间比较，Siha与Caski细胞生存率之间比较无差异(p>0.05)，Siha和Caski细胞与HeLa229细胞生存率之间比较均有显著性差异(p<0.05)，而Siha和Caski细胞与A375细胞生存率之间比较也具有显著性差异(p<0.05)，而HeLa229与A375细胞生存率之间比较无显著性差异(p>0.05)。Z_HPV16E7affitoxin384的三个剂量组(100μg/ml，10μg/ml及1μg/ml)之间对Siha和Caski细胞生长率均有显著性差异(p<0.05)，而1μg/ml与PE38KDEL与培养基对照组之间均无显著性差异(p<0.05)。Z_HPV16E7affitoxin 384与对照蛋白PE38KDEL作用于Siha，其细胞生存率的比较有显著性差异(p<0.05)；而Z_HPV16E7affitoxin384及PE38KDEL与培养基对照之间均无差异(p>0.05)。Z_HPV16E7affitoxin 384与对照蛋白PE38KDEL作用于Caski，其细胞生存率的比较有显著性差异(p<0.05)；而Z_HPV16E7affitoxin384及PE38KDEL与培养基对照之间均无差异(p>0.05)。以上结果进一步表明，Z_HPV16E7affitoxin 384具有体外HPV16E7靶向结合和杀伤细胞的特异性。

Z_HPV16E7affitoxin384蛋白的药代动力学：选择7周龄BALB/C-nu雌性裸鼠，5只裸鼠尾静脉注射5mg/kg Z_HPV16E7affitoxin384，分别在1min、5min、15min、30min、60min、120min时尾静脉取血100μl，5h后，麻醉小鼠终末取血。另取5只裸鼠尾静脉注射4mg/kgZ_{HPV16 E7:384}，3只裸鼠尾静脉注射PBS100μl作为对照，方法及取血标本的时间点同上。将血液放37℃水浴箱20min后，1500r，4℃离心10min，收集血清-80度分装保存。采用ELISA方法检测血清中的affitoxin和affibody浓度。将10μg/ml的HPV16E7蛋白包被96孔酶标板4℃过夜，加入1:50稀释血清，37℃孵育2h，洗涤后加3％脱脂奶粉，37℃封闭2h后，加入本室制备的SPA-Z兔血清作为二抗，100μl/孔，37℃1h，洗涤后加入羊抗兔IgG-HRP(1:5000)100μl/孔，37℃1h；洗涤，加入TMB显色液，100μl/孔，37℃避光显色30min；置酶标仪450nm波长读取吸光度值。重复3个复孔。同时设置以包被HPV16E7蛋白后不加affibody，并分别以抗16E7的兔血清(1:1000)和SPA-Z兔血清(1:2000)为一抗作为阳性和阴性对照。取0、0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml、100μg/ml的affibody及affitoxin蛋白，经ELISA检测作标准曲线。

结果，以纯化的HPV16E7蛋白为包被抗原，采用ELISA法检测血清中Z_{HPV16 E7}affibody和Z_{HPV16 E7}affitoxin浓度，绘制标准曲线。Z_HPV16E7affibody和Z_HPV16E7affitoxin的计算公式分别为y＝0.1295x-0.11065，R²＝0.9942；y＝0.2378x-0.141，R²＝0.9782。在裸鼠尾静脉注射后的1min、5min、15min、30min、60min、120min及300min血液中的含量分别为122.59μg/ml、82.82μg/ml、54.25μg/ml、48.07μg/ml、45.37μg/ml、34.17μg/ml、28.49μg/ml、20.66μg/ml及112.28μg/ml、91.36μg/ml、67.28μg/ml、51.09μg/ml、42.05μg/ml、32.49μg/ml、29.54μg/ml、24.14μg/ml，根据Graphpad prisimer5.0绘制曲线(图20A，B)计算，Z_{HPV16 E7}affibody和Z_{HPV16 E7}affitoxin的半衰期分别为6.231±0.717min和8.95±0.389min，Z_{HPV16 E7}affitoxin比Z_{HPV16 E7}affibody的半衰期约多2分钟。

Z_HPV16E7affitoxin蛋白的半数致死量分析LD50：为研究Z_{HPV16 E7}affitoxin384蛋白急性毒性作用，选择BALB/c雌鼠作为实验对象，并计算其半数致死量。选择4w龄BALB/c雌鼠，18-20g，分为9个剂量组，每组5-7只，见表3。每只小鼠尾静脉仅一次给药，注射200μl相应剂量的Z_{HPV16 E7}affitoxin384蛋白。给药后观察指标：外观，体征、体重及各剂量组小鼠死亡时间，持续观察至14天，并用Graphpad Primer5.0法计算LD50，重复三次检测。结果Z_{HPV16 E7}affitoxin384蛋白致小鼠半数死亡的LD50为：15.577±3.738mg/kg。

表3、Z_HPV16E7affitoxin384蛋白的急性毒性作用

剂量，mg/kg

25

20

15

10

5

2.5

1

0.5

0.25

死亡率(1)

5/5

4/5

3/5

1/5

0/6

0/7

0/7

0/7

0/7

死亡率(2)

5/5

2/5

0/5

0/5

0/6

0/7

0/7

0/7

0/7

死亡率(3)

5/5

3/5

2/5

0/5

0/6

0/7

0/7

0/7

0/7

Z_{HPV16 E7}affitoxin蛋白的保护作用：为检测Z_{HPV16 E7}affitoxin384蛋白对肿瘤细胞致瘤作用的保护作用，本实施例采用HPV16 E7阳性的Siha细胞制备BALB/c裸鼠的肿瘤模型，具体方法同实施例5，即选择4-5周龄BALB/c-nu小鼠，体重为12-15g，饲养于温州医科大学实验动物中心屏障系统(SPF级)内，共分成5组，即Z_HPV16E7affitoxin384蛋白组，同时设置Z_HPV16E7:384、PE38KDEL、Z_wt affitoxin及PBS作为对照组。每组10～12只。affitoxin384.0mg/kg，同时设置PE38KDEL(mg/kg)作为对照组。将培养48h至对数生长期Siha细胞，配制成所需的细胞数即1x10⁷/ml，取0.2ml于裸鼠的背部近左前臂皮下注射，同时将各组蛋白(均为4mg/kg)稀释于0.2ml的PBS中，在进行肿瘤细胞接种的同时按组别经尾静脉注射0.2ml对应蛋白，PBS组仅注射0.2ml的PBS。每3天注射1次，共6次。每3天观察小鼠生活和精神状态等，测量肿瘤大小并拍照记录，观察至60天。处死小鼠，同时检测小鼠血清测肝功能。

同时，为检测Z_{HPV16 E7}affitoxin384蛋白对Siha荷瘤小鼠的治疗作用，另选择4-5周龄BALB/c-nu小鼠，接种1x10⁷/ml Siha细胞，待肿瘤生长100～200mm³大小时，分成上述同样5个组别，每只裸鼠经尾静脉注射4mg/kg蛋白共0.2ml对应样品。每3天注射1次，共6次。同时每3天观察小鼠生活和精神状态等，测量肿瘤大小并拍照记录，观察至60天。处死小鼠，同时检测小鼠血清测肝功能。

结果见图21A所示，Z_{HPV16 E7}affitoxin384蛋白对肿瘤细胞致瘤作用具有一定的保护作用，Z_{HPV16 E7}affitoxin384蛋白剂量组肿瘤的体积大小与对照组Z_HPV16E7:384、PE38KDEL、Z_wt affitoxin蛋白及PBS组分别在第36天始出现有显著性差异(p<0.01)，而Z_HPV16E7:384与PE38KDEL、Z_wt affitoxin蛋白及PBS组分别在第42天始也开始出现显著性差异(p<0.01)，但PE38KDEL、Z_wt affitoxin蛋白及PBS组之间无差异(p>0.05)。随着时间的延长，肿瘤体积大小在各组别之间，差异明显变大，直至60天。肝脏功能检测转氨酶指标均正常。

Z_{HPV16 E7}affitoxin384蛋白对Siha荷瘤小鼠的治疗作用结果见图21B。Z_{HPV16 E7}affitoxin384蛋白组与Z_HPV16E7:384、PE38KDEL、Z_wt affitoxin蛋白及PBS对照组比较，对肿瘤生长的抑制作用分别在第30或36天始出现有显著性差异(p<0.01)，而Z_HPV16E7:384与Z_wtaffitoxin蛋白、PE38KDEL蛋白及PBS组比较也于36天始出现显著性差异(p<0.01)，Z_wtaffitoxin蛋白、PE38KDEL蛋白及PBS组之间比较无显著性差异(p>0.05)。随着时间的延长，肿瘤体积大小在各组别之间，差异明显变大，直至60天。肝脏功能检测转氨酶指标均正常。

上述结果表明，Z_{HPV16 E7}affitoxin384及Z_HPV16E7:384蛋白均具有保护或抑制肿瘤细胞的生长作用，但以Z_{HPV16 E7}affitoxin384作用为强。即Z_{HPV16 E7}affitoxin384蛋白及Z_HPV16E7:384具有HPV16 E7靶向抑瘤作用。且毒副作用不明显。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (14)

1.一种对人乳头瘤病毒16型的E7蛋白具有结合亲和力的多肽，其特征在于，该多肽是以葡萄球菌A蛋白Z段的氨基酸序列作为骨架，进行12-20个氨基酸变异后获得的多肽；该多肽的氨基酸序列选自：SEQ ID NO:1-4任一所示的序列。

2.如权利要求1所述的对人乳头瘤病毒16型的E7蛋白具有结合亲和力的多肽，其特征在于，该多肽与人乳头瘤病毒16型的E7蛋白相互作用的K_D值为1×10^-6M至1×10^-7M。

3.一种靶向人乳头瘤病毒16型的靶向性分子，其特征在于，所述的靶向性分子包括权利要求1-2任一所述的多肽，以及与该多肽相连接的偶联物，所述的偶联物包括：半胱氨酸残基，多肽标签，抑制人乳头瘤病毒16型的药物，或可检测标记物。

4.如权利要求3所述的靶向性分子，其特征在于，所述的连接为偶联。

5.如权利要求3所述的靶向人乳头瘤病毒16型的靶向性分子，其特征在于，所述的抑制人乳头瘤病毒16型的药物包括：毒素，其具有抑制人乳头瘤病毒16型病毒感染或抑制肿瘤的作用，所述肿瘤是人乳头瘤病毒16型阳性的肿瘤。

6.如权利要求5所述的靶向性分子，其特征在于，所述的毒素选自：白喉毒素、蓖麻毒素、绿脓杆菌外毒素。

7.一种分离的多核苷酸，其编码权利要求1-2任一所述的对人乳头瘤病毒16型的E7蛋白具有结合亲和力的多肽。

8.一种多核苷酸，其编码权利要求3-6任一所述的靶向人乳头瘤病毒16型的靶向性分子，且其中所述的偶联物是肽。

9.一种重组载体，其特征在于，该载体包含权利要求7或8所述的多核苷酸。

10.一种宿主细胞，其特征在于，该宿主细胞包含权利要求9所述的重组载体，或其包含有或基因组中整合有权利要求7或8所述的多核苷酸。

11.一种制备权利要求1-2任一所述的对人乳头瘤病毒16型的E7蛋白具有结合亲和力的多肽的方法，其特征在于，所述方法包括：

(1)培养权利要求10所述的细胞，从而表达权利要求1-2任一所述的对人乳头瘤病毒16型的E7蛋白具有结合亲和力的多肽；

(2)分离纯化(1)获得的多肽。

12.权利要求1-2任一所述的对人乳头瘤病毒16型的E7蛋白具有结合亲和力的多肽或权利要求3-6任一所述的靶向人乳头瘤病毒16型的靶向性分子的用途，用于制备治疗人乳头瘤病毒16型感染疾病或人乳头瘤病毒16型表达阳性肿瘤的药物；或

用于制备检测人乳头瘤病毒16型病毒感染的检测试剂；或

用于制备诊断人乳头瘤病毒16型感染疾病或人乳头瘤病毒16型表达阳性肿瘤的诊断试剂。

13.一种药物组合物，其特征在于，其包含：

权利要求1-2所述的对人乳头瘤病毒16型的E7蛋白具有结合亲和力的多肽或权利要求3-6任一所述的靶向人乳头瘤病毒16型的靶向性分子；和

药学上可接受的载体。

14.一种用于诊断或治疗人乳头瘤病毒16型感染疾病或人乳头瘤病毒16型表达阳性肿瘤的药盒，其特征在于，所述的药盒中包括：权利要求1-2任一所述的对人乳头瘤病毒16型的E7蛋白具有结合亲和力的多肽，或权利要求3-6任一所述的靶向人乳头瘤病毒16型的靶向性分子，或权利要求13所述的药物组合物。