CN105829538A

CN105829538A - 用于控制疼痛的组合物和方法

Info

Publication number: CN105829538A
Application number: CN201480056362.0A
Authority: CN
Inventors: S·M·伊耶; S·L·德尔普; K·L·蒙哥马利; K·A·戴塞鲁斯; C·汤
Original assignee: Circuit Therapy Co ltd; Leland Stanford Junior University
Current assignee: Circuit Therapy Co ltd; Leland Stanford Junior University
Priority date: 2013-08-14
Filing date: 2014-08-13
Publication date: 2016-08-03
Also published as: JP6621747B2; JP2019194228A; AU2014306679A1; EP3033427A1; US20160199663A1; US20200121942A1; WO2015023782A1; JP2016529256A; US10307609B2; CA2921221A1; EP3033427A4

Abstract

本公开提供用于控制疼痛的组合物和方法。本公开提供用于鉴别控制疼痛的试剂的方法。

Description

用于控制疼痛的组合物和方法

交叉参考

本申请要求于2013年8月14日提交的美国临时专利申请号61/865,962的权益，所述申请以引用的方式整体并入本文。

关于联邦资助研究的声明

本发明在美国国立卫生研究院授予的政府资助号NS080954的支持下完成。政府对本发明享有某些权利。

引言

初级伤害感受器是调节正常和病理性疼痛的复杂疼痛处理系统中的第一神经元。出于研究和治疗目的对这些神经元进行刺激和抑制的能力受到药物和电刺激约束的限制；因此，还不可能在自由活动动物中实现伤害感受器的非侵袭性、空间定位控制。

文献

Liske等人(2013)Muscle&Nerve47:916；Llewellyn等人(2010)NatureMed.16:1161；Ji等人(2012)PLoSOne7:e32699；Wang和Zylka(2009)J.Neurosci.29:13020；Daou等人(2012)Soc.Neurosci.Conf.575.06/1I11；Daou等人(2013)J.Neurosci.33:47；Mourot等人(2012)NatMethods9:396；Kokel等人(2013)Nat.Chem.Biol9:257；Mattis等人(2012)Nat.Methods9:159；Williams和Denison(2013)Sci.TranslMed.5:177ps6；Chow和Boyden(2013)Sci.TranslMed.5:177ps5；Towne等人(2010)GeneTher.17:141；Towne等人(2009)MolPain5:52；Iyer等人(2014)Nat.Biotech.32:3。

发明内容

特征

本公开涉及一种用于控制个体的疼痛的方法，所述方法包括将包含编码视蛋白多肽的核苷酸序列的核酸引入个体的伤害感受器，所述视蛋白多肽响应于激活视蛋白的波长的光提供所述伤害感受器的超极化。在一些情况下，所述光是经皮递送的。在一些情况下，所述视蛋白包含与SEQIDNO:1、3、4、6、15及16中的一个具有至少约75％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些情况下，所述疼痛为神经性疼痛。在一些情况下，包含编码视蛋白的核苷酸的核酸经由注射到神经中、经由肌内注射或经由静脉内注射向个体施用。在一些情况下，所述核酸是在治疗部位(例如疼痛部位)处或附近向个体施用。在一些情况下，所述核酸是重组表达载体，举例来说，重组表达载体是病毒载体。在有些情况下，当重组表达载体是病毒载体时，所述病毒载体是慢病毒载体或腺相关病毒(AAV)载体。在有些情况下，AAV载体是AAV6载体或AAV8载体。所述核苷酸序列与提供神经元中的选择性表达的启动子可操作地连接。举例来说，所述启动子可以是突触蛋白-I启动子、人突触核蛋白1启动子、人Thy1启动子或钙/钙调蛋白依赖性激酶1Iα(CAMKIIα)启动子。所述个体可以是哺乳动物；例如人、大鼠或小鼠。在一些情况下，视蛋白的激活提供至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％的疼痛减轻。在一些情况下，视蛋白的激活提供100％疼痛减轻，即，个体基本上不经受疼痛。

本公开涉及一种神经性疼痛的非人的动物模型，其中所述非人的动物在动物的伤害感受器中表达包含编码视蛋白多肽的核苷酸序列的核酸，所述视蛋白多肽响应于激活视蛋白的波长的光提供所述伤害感受器的去极化。在一些情况下，所述视蛋白包含与SEQIDNO:8-14和19-21中的一个具有至少约75％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些情况下，所述核酸是重组表达载体，例如病毒载体。举例来说，在一些情况下，病毒载体是慢病毒载体或腺相关病毒(AAV)载体，例如AAV6载体或AAV8载体。在有些情况下，编码视蛋白的核苷酸序列与提供神经元中的选择性表达的启动子可操作地连接；例如，所述启动子可以是突触蛋白-I启动子、人突触核蛋白1启动子、人Thy1启动子或钙/钙调蛋白依赖性激酶I1α(CAMKI1α)启动子。在有些情况下，所述动物是大鼠。在有些情况下，所述动物是小鼠。

本公开涉及一种鉴别减轻疼痛的试剂的方法，所述方法包括：a)向受试的非人动物施用测试试剂；及b)当去极化光激活的多肽用光来激活时，如果有的话，测定所述测试试剂对疼痛的作用，其中与在测试试剂不存在下通过去极化光激活多肽的光激活所诱发的疼痛水平相比，测试试剂在所述非人动物中减轻疼痛，表明所述测试试剂是用于减轻疼痛的候选试剂。

本公开涉及一种鉴别减轻疼痛的试剂的方法，所述方法包括：a)向受试的非人动物施用测试试剂；及b)如果有的话，在施用测试试剂之后测定所述测试试剂对经由去极化光激活多肽的激活诱发疼痛所需的光量的作用，其中与在测试试剂不存在下产生疼痛体征所需的光量相比，增加产生疼痛体征所需的光量的测试试剂表明所述测试试剂是用于减轻疼痛的候选试剂。

附图简述

图1A-C描绘展示投向脊髓板层的rAAV2/6-hSyn-ChR2(H134R)-eYFP转导的无髓伤害感受器的坐骨内注射的数据。

图2A-F描绘展示产生可调的疼痛样行为的ChR2⁺小鼠的经皮照射的数据。

图3A-G描绘在蓝光敏化的ChR2表达小鼠和黄光脱敏的NpHR表达小鼠中对机械和热刺激的反应。

图4A和4B描绘展示NpHR⁺小鼠逆转的机械异常性疼痛和由慢性缩窄性损伤引起的热痛觉过敏的黄光刺激的数据。

图5A-G描绘各种光激活多肽的氨基酸序列。

图6A和6B描绘视蛋白转导的粒径分布。

图7A-D描绘在AAV2/6-hSyn-eNpHR3.0-eYFP的坐骨内注射之后观察到的NpHR转导的代表性图像。

图8A-F描绘来自ChR2+和NpHR+DRG神经元的电生理记录。

图9提供表1。

图10A和10B描绘腰部和胸部脊髓中的AAV8转导。

图11描绘在直接注射到神经节之后三叉神经节感觉神经元中的eNpHR3.0表达。

图12描绘使用AAV6在伤害感受纤维中表达GFP或eNpHR3.0的小鼠的机械阈值。

定义

如本文所用，“个体”、“受试者”或“患者”是动物，例如哺乳动物，包括人。哺乳动物包括但不限于有蹄类动物、犬科动物、猫科动物、牛科动物、绵羊科动物、非人的灵长类动物、兔形动物、以及啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。一方面，个体是人。另一方面，个体是非人哺乳动物。

在天然蛋白序列中的氨基酸取代可以是“保守的”或“非保守的”并且这类取代的氨基酸残基可以是或不是由遗传密码编码的残基。“保守氨基酸取代”是其中氨基酸残基用具有化学上类似的侧链的氨基酸残基替代(即，具有碱性侧链的一个氨基酸被具有碱性侧链的另一个氨基酸替代)的取代。“非保守氨基酸取代”是其中氨基酸残基用具有化学上不同的侧链的氨基酸残基替代(即，具有碱性侧链的一个氨基酸被具有芳族侧链的一个氨基酸替代)的取代。标准的二十个氨基酸“字母表(alphabet)”基于其侧链的化学性质被分成多种化学类别。这些类别包括具有以下侧链的氨基酸：碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)以及具有芳族基团的侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。

如本文所用，重组表达载体或包含重组表达载体的药物组合物的“有效剂量”或“有效量”是足以实现有利或所需结果的量。对于预防性用途，有利或所需结果包括这样的结果，如消除或降低风险、减轻严重性或延缓疾病的起始，包括疾病的生物化学、组织学和/或行为症状、其并发症和疾病发展过程中出现的过渡病理表型。对于治疗性用途，有利或所需结果包括这样的临床结果，如减轻一种或多种由该疾病引起的症状、提高那些患有该疾病的患者的生存质量、减少治疗该疾病所需的其他药物的剂量、增强另一药物的效果(如经由靶向)、延缓疾病的进程和/或延长生存期。有效剂量可通过一次或多次给药进行施用。出于本公开的目的，重组表达载体或包含重组表达载体的药物组合物的有效剂量是足以直接地或间接地实现预防性或治疗性治疗的量。举例来说，重组表达载体或包含重组表达载体的药物组合物的有效剂量可以是足以减轻疼痛(例如，神经性疼痛)的量。如在临床背景中所理解的，重组表达载体或包含重组表达载体的药物组合物的有效剂量可以或未必与另一药物、化合物或药物组合物联合实现。因此，“有效剂量”可在施用一种或多种治疗剂的情形中考虑，并且如果与一种或多种其他试剂联合可能或能够实现所需结果，可考虑给予有效量的单一试剂。

如本文所用，“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”是获得有利或所需结果(包括临床结果)的方法。出于本公开的目的，有利或所需临床结果包括但不限于以下一个或多个：减轻由该疾病引起的症状、提高那些患有该疾病的患者的生存质量、减少治疗该疾病所需的其他药物的剂量、延缓疾病的进程和/或延长个体的生存期。例如，“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”可指的是减轻疼痛。

在进一步描述本发明前，应理解本发明不限于所描述的具体实施方案，因为这些实施方案当然可以变化。还应该理解，本文所用的术语仅仅是为了描述具体的实施方案，并不意味着限制，因为本发明的范围只受所附权利要求书的限制。

当提供一个数值范围时，应该理解的是介于该范围的上下限间的每一个中间值(除非文中另外清楚地指出，否则所述中间值是下限单位的十分之一)和任何其他所说明的或者在所说明的范围中的中间值都被包括在本发明内。这些较小范围的上下限可独立地被包括在该较小的范围中，且在所说明范围内明确地排除极限值的条件下也被包括在本发明内。当所述范围包括所述上下限中的一个或两个时，排除了那些所包括的上下限中的一个或两个的范围也包括在本发明范围内。

除非另外定义，否则本文所用的全部技术和科学术语都具有本发明相关领域的普通技术人员通常理解的相同含义。虽然类似于或等价于本文所述的那些的任何方法和材料还可用于实践或测试本发明，但现在描述示优选方法和材料。本文所提及的全部出版物以引用的方式并入本文，从而公开和描述了与出版物所引用的内容相关的方法和/或材料。

除非文中另外清楚指出，否则必须指出如本文和所附权利要求书中所用，单数形式“一个(种)”和“所述”包括复数指示物。因此，例如，“视蛋白”包括多种这类视蛋白并且“伤害感受器”包括一种或多种伤害感受器及本领域技术人员已知的其等价物，诸如此类。还应该注意，权利要求书可能撰写成排除了任何可选要素。因此，此声明旨在用作排除性术语如“单独”、“仅仅”等与权利要求要素的陈述相关联的前提基础，或采用“负”限制。

应当理解，为清楚起见在参照不同实施方案的上下文中所描述的本发明的某些特点也可在单个实施方案中以组合方式给出。相反，为简洁起见在参照单一实施方案的上下文中所描述的本发明的某些特点也可单独地或以任何适合的子组合方式给出。关于本发明的实施方案的所有组合具体地由本发明所涵盖并且在本文中公开就好象每个组合个别地和明确地公开一样。另外，各种实施方案及其要素的所有子组合也具体地由本发明所涵盖并且在本文中公开就好象每个这种子组合个别地且明确地在本文中公开一样。

本文所讨论的出版物只提供在本申请的申请日之前的公开内容。本文中的任何内容都不能被解释为承认本发明无权使借助于在先发明的这种出版日期提前。此外，所提供的出版日期可能不同于实际的出版日期，实际的出版日期可能需要独立地确认。

发明详述

本公开提供用于控制个体疼痛的组合物和方法。本公开提供用于鉴别控制疼痛的试剂的方法。

减轻疼痛的方法

本公开提供用于控制个体疼痛的组合物和方法。在一些情况下，根据本公开的用于控制疼痛的方法总体上涉及将包含编码视蛋白的核苷酸序列的核酸引入个体的神经元中，所述视蛋白响应于激活视蛋白的波长的光提供细胞的超极化；这类方法提供疼痛的减轻。所述核酸进入神经元(例如，初级传入神经元，如小直径或大直径的初级传入神经元；例如伤害感受器)，所述视蛋白在神经元中产生，并且所述视蛋白被插入细胞膜中。术语“视蛋白”、“光响应蛋白”、“光响应多肽”、“光激活蛋白”及“光激活多肽”在本文中可互换地使用。

在一些情况下，包含编码视蛋白的核苷酸序列的核酸提供视蛋白在神经元(例如，初级传入神经元；例如伤害感受器)中的表达，所述视蛋白响应于激活视蛋白的波长的光提供细胞的超极化。在一些情况下，包含编码视蛋白的核苷酸序列的核酸提供视蛋白在伤害感受器子群中的表达，所述视蛋白响应于激活视蛋白的波长的光提供细胞的超极化。光激活多肽对伤害感受器子群的靶向表达可通过以下一者或多者实现：选择载体(例如，AAV6；AAV1；AAV8；等)；选择启动子；及递送手段。例如，投向坐骨神经可提供光激活多肽在无髓伤害感受器(推定的C-纤维)中的产生。

本公开提供用于减轻疼痛的方法，例如，疼痛如急性疼痛、慢性疼痛、神经性疼痛、伤害感受性疼痛、异常性疼痛、炎性疼痛、炎性痛觉过敏、神经病、神经痛、糖尿病性神经病变、人类免疫缺陷病毒相关的神经病、神经损伤、类风湿关节炎性疼痛、骨关节炎性疼痛、烧伤、背痛、眼睛疼痛、内脏疼痛、癌症疼痛(例如骨癌疼痛)、牙齿疼痛、头痛、偏头痛、腕管综合征、纤维肌痛、神经炎、坐骨神经痛、骨盆超敏反应、骨盆疼痛、带状疱疹后神经痛、术后疼痛、中风后疼痛、以及月经疼痛。

疼痛可划分为急性或慢性。急性疼痛开始突然且较为短暂(通常在十二周或更短)。其通常与特殊原因如特定损伤有关且常常是急剧的和严重的。它是一种可以在由手术、牙科操作、拉伤或扭伤引起的特定损伤之后出现的疼痛。急性疼痛一般不导致任何持续的心理反应。相比之下，慢性疼痛是长期疼痛，通常持续超过三个月并且导致明显的心理和情绪问题。慢性疼痛的常见实例是神经性疼痛(例如，痛性糖尿病性神经病变、带状疱疹后神经痛)、腕管综合征、背痛、头痛、癌症疼痛、关节炎性疼痛以及慢性术后疼痛。在一些情况下，本公开的方法在减轻急性疼痛中是有效的。在一些情况下，本公开的方法在减轻慢性疼痛中是有效的。

当患者症状中的不适和异常敏感性的特征出现时，存在临床疼痛。个体可表现出各种疼痛症状。这类症状包括：1)自发疼痛，可能是钝痛、烧灼样疼痛或是剧痛；2)对有害刺激的疼痛反应扩大(痛觉过敏)；以及3)由一般的无害刺激产生的疼痛(异常性疼痛--Meyer等人,1994,TextbookofPain,13-44)。虽然患有各种形式的急性和慢性疼痛的患者可具有相似症状，但是潜在机制可以是不同的，并且由此可能需要不同的治疗策略。疼痛还因此可根据不同的病理生理学被分成许多不同亚型，包括伤害感受性疼痛、炎性疼痛及神经性疼痛。在一些情况下，本公开的方法在减轻伤害感受性疼痛中是有效的。在一些情况下，本公开的方法在减轻炎性疼痛中是有效的。在一些情况下，本公开的方法在减轻神经性疼痛中是有效的。

伤害感受性疼痛是由组织损伤或可能引起损伤的强烈刺激产生的。中度到重度的急性伤害感受性疼痛是来自以下的疼痛的突出特征：中枢神经系统外伤、拉伤/扭伤、烧伤、心肌梗塞和急性胰腺炎、术后疼痛(在任何类型的手术操作之后的疼痛)、创伤后疼痛、肾绞痛、癌症疼痛及背痛。癌症疼痛可以是慢性疼痛，如肿瘤相关疼痛(例如骨痛、头痛、面痛或内脏痛)或与癌症治疗有关的疼痛(例如，化疗后综合征、慢性术后疼痛综合征或放射后综合征)。癌症疼痛还可响应于化疗、免疫疗法、激素疗法或放射疗法而出现。背痛可能是由于椎间盘突出或断裂或腰椎椎间小关节、骶骼关节、椎旁肌或后纵韧带的异常所致。背痛可自然消退，但在一些患者中，当它持续超过12周时，其变成可使人特别虚弱的慢性病状。

神经性疼痛可定义为由神经系统中的原发性病变或功能障碍引发或引起的疼痛。神经性疼痛的病因包括例如周围神经病、糖尿病性神经病变、带状疱疹后神经痛、三叉神经痛、背痛、癌症神经病、HIV神经病、幻肢痛、腕管综合征、中风后中枢疼痛以及与以下病状有关的疼痛：慢性酒精中毒、甲状腺机能减退、尿毒症、多发性硬化症、脊髓损伤、帕金森氏病、癫痫及维生素缺乏症。

炎症过程是作为对组织损伤或存在外来物质的反应的一系列复杂的生化和细胞事件，其导致肿胀和疼痛。关节炎性疼痛是一种常见的炎性疼痛。

其他类型的疼痛包括：由肌骨骼病症引起的疼痛，包括肌痛、纤维肌痛、脊椎炎、血清阴性(非类风湿性)关节病、非关节风湿病、营养不良病、糖原分解、多发性肌炎及脓性肌炎；心脏和血管疼痛，包括由心绞痛、心肌梗塞、二尖瓣狭窄、心包炎、雷诺氏现象、硬化病及骨骼肌局部缺血引起的疼痛；头痛，如偏头痛(包括有先兆的偏头痛和无先兆的偏头痛)、丛集性头痛、紧张型头痛、混合型头痛及与血管病症有关的头痛；以及口面痛，包括牙痛、耳痛、口腔灼热综合征及颞下颌肌筋膜痛。

在一些情况下，减轻疼痛的本发明方法涉及将包含编码视蛋白的核苷酸序列的核酸引入伤害感受器(通过将神经信号传送到脊髓和脑潜在地响应于损伤刺激的感觉神经元)中，所述视蛋白响应于激活视蛋白的波长的光提供伤害感受器的超极化，由此减轻疼痛。所述伤害感受器可以是热伤害感受器、机械伤害感受器、化学伤害感受器或其他类型的伤害感受器。伤害感受标记包括但不限于IB4、P物质、TRPV1及生长激素抑制素。

疼痛是否减轻可使用多种疼痛量表在人受试者中测定。患者的自我报告可用于评定疼痛是否减轻；参见，例如Katz和Melzack(1999)Surg.Clin.NorthAm.79:231。或者，可使用观测疼痛量表。LANSS疼痛量表可用于评定疼痛是否减轻；参见，例如Bennett(2001)Pain92:147。可使用视觉模拟疼痛量表；参见，例如Schmader(2002)Clin.J.Pain18:350。可使用李克特疼痛量表(Likertpainscale)；例如，其中0是无疼痛，5是中度疼痛，且10是可能的最严重疼痛。儿童的自我报告疼痛量表包括例如面部疼痛量表；Wong-BakerFACES疼痛等级量表；以及着色模拟量表。成人的自我报告疼痛量表包括例如视觉模拟量表；语言数字等级量表；语言描述量表；以及简单疼痛目录。疼痛测量量表包括例如AlderHeyTriage疼痛评分(Stewart等人(2004)Arch.Dis.Child.89:625)；行为疼痛量表(Payen等人(2001)CriticalCareMedicine29:2258)；简单疼痛目录(Cleeland和Ryan(1994)Ann.Acad.Med.Singapore23:129)；非语言疼痛指示检查清单(Feldt(2000)PainManag.Nurs.1:13)；重症护理疼痛观察工具(Gelinas等人(2006)Am.J.CritCare15:420)；COMFORT量表(Ambuel等人(1992)J.PediatricPsychol17:95)；Dallas疼痛调查表(Ozguler等人(2002)Spine27:1783)；测痛计疼痛指数(Hardy等人(1952)PainSensationsandReactionsBaltimore:TheWilliams&WilkinsCo.)；面部疼痛量表-修订版(Hicks等人(2001)Pain93:173)；面、腿、活动、哭泣、安抚量表(FaceLegsActivityCryConsolabilityScale)；McGill疼痛调查表(Melzack(1975)Pain1:277)；描述区分量表(Gracely和Kwilosz(1988)Pain35:279)；11点数值框(Jensen等人(1989)Clin.J.Pain5:153)；数字等级量表(Hartrick等人(2003)PainPract.3:310)；Wong-BakerFACES疼痛等级量表；以及视觉模拟量表(Huskisson(1982)J.Rheumatol9:768)。

在一些情况下，用于激活在神经元(例如伤害感受器)中表达的视蛋白的光具有以下强度：约0.05mW/mm²至约0.1mW/mm²、约0.1mW/mm²至约0.2mW/mm²、约0.2mW/mm²至约0.3mW/mm²、约0.3mW/mm²至约0.4mW/mm²、约0.4mW/mm²至约0.5mW/mm²、约0.5mW/mm²至约0.6mW/mm²、约0.6mW/mm²至约0.7mW/mm²、约0.7mW/mm²至约0.8mW/mm²、约0.8mW/mm²至约0.9mW/mm²或约0.9mW/mm²至约1.0mW/mm²。在一些情况下，用于激活在神经元(例如伤害感受器)中表达的视蛋白的光具有以下强度：约1.0mW/mm²至约1.1mW/mm²、约1.1mW/mm²至约1.2mW/mm²、约1.2mW/mm²至约1.3mW/mm²、1.3mW/mm²至约1.4mW/mm²、约1.4mW/mm²至约1.5mW/mm²、约1.5mW/mm²至约1.6mW/mm²、约1.6mW/mm²至约1.7mW/mm²、约1.7mW/mm²至约1.8mW/mm²、约1.8mW/mm²至约1.9mW/mm²、约1.9mW/mm²至约2.0mW/mm²、约2.0mW/mm²至约2.5mW/mm²、约2.5mW/mm²至约3mW/mm²、约3mW/mm²至约3.5mW/mm²、约3.5mW/mm²至约4mW/mm²、约4mW/mm²至约4.5mW/mm²、约4.5mW/mm²至约5mW/mm²、约5mW/mm²至约5.5mW/mm²、约5.5mW/mm²至约6mW/mm²、约6mW/mm²至约7mW/mm²或约7mW/mm²至约10mW/mm²。在一些情况下，用于激活在神经元(例如伤害感受器)中表达的视蛋白的光具有约0.05mW/mm²至约0.1mW/mm²的强度。在一些情况下，用于激活在神经元(例如伤害感受器)中表达的视蛋白的光具有约0.25mW/mm²的强度。在一些情况下，用于激活在神经元(例如伤害感受器)中表达的视蛋白的光具有约1mW/mm²的强度。

在一些情况下，光是经皮(transdemally/transcutaneously)递送的。在一些情况下，使用可植入光源；并且光被递送至体内的部位。在一些情况下，光被递送至体内的治疗部位。在一些情况下，光是颅内递送的。

包含编码视蛋白的核苷酸序列的核酸可通过任何便利的手段引入神经元(例如，伤害感受器)中，所述视蛋白响应于激活视蛋白的波长的光提供细胞的超极化。例如，包含编码视蛋白的核苷酸序列的核酸可引入(例如注射)神经束或神经纤维中，以使得所述核酸进入神经元(例如伤害感受器)，其中视蛋白在神经元中产生并且被插入细胞膜中，所述视蛋白响应于激活视蛋白的波长的光提供细胞的超极化。包含编码视蛋白的核苷酸序列的核酸可引入(例如注射)神经附近，所述视蛋白响应于激活视蛋白的波长的光提供细胞的超极化。可使用立体定位注射；参见，例如Stein等人,J.Virol,,73:34243429,1999；Davidson等人,PNAS,97:3428-3432,2000；Davidson等人,Nat.Genet.3:219-223,1993；以及Alisky&Davidson,Hum.GeneTher.11:2315-2329,2000，其各自的内容以引用的方式整体并入本文。

可肌内引入(例如注射)包含编码视蛋白的核苷酸序列的核酸，所述视蛋白响应于激活视蛋白的波长的光提供细胞的超极化。包含编码视蛋白的核苷酸序列的核酸可经由任何手段(包括例如静脉内、肌内、颅内)施用于治疗部位处或附近的神经等等，所述视蛋白响应于激活视蛋白的波长的光提供细胞的超极化。编码视蛋白的核酸的施用可经由注射；经由在包含编码光激活多肽的核酸的组合物的治疗部位处或附近植入；经由导管；或经由任何其他递送手段进行。编码视蛋白的核酸的施用可经由局部、皮内、静脉内、鞘内或胸膜内施用进行。编码视蛋白的核酸的施用可经由皮内施用进行。

光激活蛋白(视蛋白)可使用许多不同的方法植入到神经中或邻近处。示例性方法包括但不限于使用各种递送装置，如明胶胶囊、液体注射等等。这类方法还包括使用立体定位手术技术，如帧或计算机化手术导航系统以植入或以其他方式达到身体区域。

在一些情况下，包含编码光响应视蛋白的核苷酸序列的核酸可直接递送至负责疼痛的神经元，其中所述递送可使用本领域中已知的神经外科技术(如通过立体定位注射或荧光检查)用针、导管或相关装置完成。还可使用递送包含编码光响应视蛋白的核苷酸序列的核酸至所关注的神经的其他方法，如但不限于用离子脂质或聚合物转染、电穿孔、光转染、穿刺转染(impalefection)或经由基因枪。

超极化的光响应多肽

如上所论述，根据本公开的用于控制疼痛的方法总体上涉及将包含编码光激活多肽(视蛋白)的核苷酸序列的核酸引入个体的神经元中，所述光激活多肽响应于激活光激活多肽的波长的光提供细胞的超极化。光激活多肽可以是当所述蛋白用激活波长的光照射时允许一个或多个离子穿过靶细胞的质膜的多肽。光激活蛋白可表征为离子泵蛋白，其促进每个光子少量离子通过质膜，或可表征为离子通道蛋白，当通道打开时其允许离子流自由地流过质膜。用于减轻疼痛的本发明方法中的合适的光激活蛋白包括超极化的光激活多肽。

合适的光响应多肽的实例包括例如光响应氯泵的Halorhodopsin家族(例如NpHR、NpHR2.0、NpHR3.0、NpHR3.1)。作为另一实例，GtR3质子泵可用于响应于光来促进神经细胞膜超极化。作为另一实例，eArch(质子泵)可用于响应于光来促进神经细胞膜超极化。作为另一实例，ArchT视蛋白或Mac视蛋白可用于响应于光来促进神经细胞膜超极化。

增强的胞内转运氨基酸基元

在一些实施方案中，在细胞中表达的光响应视蛋白可融合至一个或多个选自由以下组成的组的氨基酸序列基元中：信号肽、ER输出信号、膜运输信号和/或N末端高尔基(golgi)输出信号。增强光响应蛋白向哺乳动物细胞的质膜转运的所述一个或多个氨基酸序列基元可融合至光响应蛋白的N末端、C末端或N末端和C末端两者。在一些情况下，增强光响应蛋白向哺乳动物细胞的质膜转运的所述一个或多个氨基酸序列基元融合在光激活多肽内部。任选地，所述光响应蛋白与所述一个或多个氨基酸序列基元可由接头分隔。在一些实施方案中，所述光响应蛋白可通过添加增强蛋白向细胞质膜转运的运输信号(ts)来修饰。在一些实施方案中，运输信号可来源于人体内向整流钾通道Kir2.1的氨基酸序列。在其他实施方案中，运输信号可包含氨基酸序列KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQIDNO:22)。

适用的运输序列可包含与如人体内向整流钾通道Kir2.1的运输序列的氨基酸序列(例如，KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQIDNO:22))具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

运输序列可具有约10个氨基酸至约50个氨基酸的长度，例如，约10个氨基酸至约20个氨基酸、约20个氨基酸至约30个氨基酸、约30个氨基酸至约40个氨基酸或约40个氨基酸至约50个氨基酸。

适用的信号序列可包含与如以下中的一个的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：

1)hChR2的信号肽(例如，MDYGGALSAVGRELLFVTNPVVVNGS(SEQIDNO:23))

2)神经元烟碱乙酰胆碱受体的β2亚单位信号肽(例如，MAGHSNSMALFSFSLLWLCSGVLGTEF(SEQIDNO:24))；

3)烟碱乙酰胆碱受体信号序列(例如，MGLRALMLWLLAAAGLVRESLQG(SEQIDNO:25))；以及

4)烟碱乙酰胆碱受体信号序列(例如，MRGTPLLLVVSLFSLLQD(SEQIDNO:26))。

信号序列可具有约10个氨基酸至约50个氨基酸的长度，例如，约10个氨基酸至约20个氨基酸、约20个氨基酸至约30个氨基酸、约30个氨基酸至约40个氨基酸或约40个氨基酸至约50个氨基酸。

适用于修饰的视蛋白中的ER输出序列包括例如VXXSL(其中X是任何氨基酸)(例如VKESL(SEQIDNO:27)；VLGSL(SEQIDNO:28)；等)；NANSFCYENEVALTSK(SEQIDNO:29)；FXYENE(SEQIDNO:30)(其中X是任何氨基酸)，例如FCYENEV(SEQIDNO:31)；等等。ER输出序列可具有约5个氨基酸至约25个氨基酸的长度，例如，约5个氨基酸至约10个氨基酸、约10个氨基酸至约15个氨基酸、约15个氨基酸至约20个氨基酸或约20个氨基酸至约25个氨基酸。

在一些实施方案中，在蛋白中的信号肽序列可以缺失或被来自不同蛋白的信号肽序列取代。

Arch

在一些实施方案中，合适的光激活蛋白是古紫质(Arch)质子泵(例如，来源于苏打盐红菌(Halorubrumsodomense)的质子泵)，当细胞用光照射时其可转运一个或多个质子穿过细胞的质膜。所述光可具有在约530与约595nm之间的波长或可具有约560nm的波长。在一些实施方案中，Arch蛋白可包含与SEQIDNO:1(Arch)中所示的序列至少75％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的氨基酸序列。Arch蛋白可另外包含取代、缺失和/或引入天然氨基酸序列中的插入以增加或减小对光的敏感度、增加或减小对具体波长的光的敏感度和/或增强或减弱Arch蛋白转运离子穿过靶细胞的质膜的能力。另外，Arch蛋白可含有一个或多个保守的氨基酸取代和/或一个或多个非保守的氨基酸取代。包含取代、缺失和/或引入天然氨基酸序列中的插入的Arch蛋白适当地保留响应于光来转运离子穿过靶细胞的质膜的能力。

在一些实施方案中，Arch蛋白包含至少一个(如一个、两个、三个或更多个)增强向靶细胞的质膜转运的选自由以下组成的组的氨基酸序列基元：信号肽、ER输出信号及膜运输信号。在一些实施方案中，Arch蛋白包含N末端信号肽和C末端ER输出信号。在一些实施方案中，Arch蛋白包含N末端信号肽和C末端运输信号。在一些实施方案中，Arch蛋白包含N末端信号肽、C末端ER输出信号及C末端运输信号。在一些实施方案中，Arch蛋白包含C末端ER输出信号和C末端运输信号。在一些实施方案中，C末端ER输出信号与C末端运输信号是通过接头连接。所述接头在长度上可包含约5、10、20、30、40、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、400或500个氨基酸中的任一个。接头可进一步包含荧光蛋白，例如但不限于黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白、绿色荧光蛋白或青色荧光蛋白。在一些实施方案中，ER输出信号比运输信号更靠近C末端地定位。在一些实施方案中，运输信号比ER输出信号更靠近C末端地定位。

在一些实施方案中，运输信号可来源于人体内向整流钾通道Kir2.1的氨基酸序列。在其他实施方案中，运输信号可包含氨基酸序列KSRITSEGEY1PLDQIDINV(SEQIDNO:22)。适用的运输序列可包含与如人体内向整流钾通道Kir2.1的运输序列的氨基酸序列(例如KSRITSEGEY1PLDQIDINV(SEQIDNO:22))具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些情况下，ER输出信号是例如VXXSL(其中X是任何氨基酸)(例如VKESL(SEQIDNO:27)；VLGSL(SEQIDNO:28)；等)；NANSFCYENEVALTSK(SEQIDNO:29)；FXYENE(SEQIDNO:30)(其中X是任何氨基酸)，例如FCYENEV(SEQIDNO:31)；等等。

ArchT

在一些实施方案中，合适的光激活蛋白是古紫质(ArchT)质子泵(例如，来源于盐红菌属(Halombrumsp.)TP009的质子泵)，当细胞用光照射时其可转运一个或多个质子穿过细胞的质膜。所述光可具有在约530与约595nm之间的波长或可具有约560nm的波长。在一些实施方案中，Arch蛋白可包含与SEQIDNO:3(ArchT)中所示的序列至少75％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的氨基酸序列。ArchT蛋白可另外包含取代、缺失和/或引入天然氨基酸序列中的插入以增加或减小对光的敏感度、增加或减小对具体波长的光的敏感度和/或增强或减弱ArchT蛋白转运离子穿过靶细胞的质膜的能力。另外，ArchT蛋白可含有一个或多个保守的氨基酸取代和/或一个或多个非保守的氨基酸取代。包含取代、缺失和/或引入天然氨基酸序列中的插入的ArchT蛋白适当地保留响应于光来转运离子穿过靶细胞的质膜的能力。

在一些情况下，ArchT多肽包含膜运输信号和/或ER输出信号。在一些实施方案中，运输信号可来源于人体内向整流钾通道Kir2.1的氨基酸序列。在其他实施方案中，运输信号可包含氨基酸序列KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQIDNO:22)。适用的运输序列可包含与如人体内向整流钾通道Kir2.1的运输序列的氨基酸序列(例如KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQIDNO:22))具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些情况下，ER输出信号是例如VXXSL(其中X是任何氨基酸)(例如VKESL(SEQIDNO:27)；VLGSL(SEQIDNO:28)；等)；NANSFCYENEVALTSK(SEQIDNO:29)；FXYENE(SEQIDNO:30)(其中X是任何氨基酸)，例如FCYENEV(SEQIDNO:31)；等等。

GtR3

在一些实施方案中，光响应质子泵蛋白可响应于蓝光并且可来源于蓝隐藻(Guillardiatheta)，其中所述质子泵蛋白当细胞用蓝光照射时能够介导细胞中的超极化电流。所述光可具有在约450与约495nm之间的波长或可具有约490nm的波长。在另一实施方案中，光响应质子泵蛋白可包含与SEQIDNO:4(GtR3)中所示的序列至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的氨基酸序列。光响应质子泵蛋白可另外包含取代、缺失和/或引入天然氨基酸序列中的插入以增加或减小对光的敏感度、增加或减小对具体波长的光的敏感度和/或增强或减弱光响应质子泵蛋白调节细胞质膜的偏振态的能力。另外，光响应质子泵蛋白可含有一个或多个保守的氨基酸取代和/或一个或多个非保守的氨基酸取代。包含取代、缺失和/或引入天然氨基酸序列中的插入的光响应质子泵蛋白适当地保留响应于光来超极化神经元细胞的质膜的能力。

在本文所公开的方法的其他方面中，光响应质子泵蛋白可包含与SEQIDNO:4中所示的序列至少75％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的核心氨基酸序列及至少一个(如一个、两个、三个或更多个)增强向哺乳动物细胞的质膜转运的选自由以下组成的组的氨基酸序列基元：信号肽、ER输出信号及膜运输信号。在一些实施方案中，光响应质子泵蛋白包含N末端信号肽和C末端ER输出信号。在一些实施方案中，光响应质子泵蛋白包含N末端信号肽和C末端运输信号。在一些实施方案中，光响应质子泵蛋白包含N末端信号肽、C末端ER输出信号及C末端运输信号。在一些实施方案中，光响应质子泵蛋白包含C末端ER输出信号和C末端运输信号。在一些实施方案中，C末端ER输出信号与C末端运输信号是通过接头连接的。所述接头在长度上可包含约5、10、20、30、40、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、400或500个氨基酸中的任一个。接头可进一步包含荧光蛋白，例如但不限于黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白、绿色荧光蛋白或青色荧光蛋白。在一些实施方案中，ER输出信号比运输信号更靠近C末端地定位。在一些实施方案中，运输信号比ER输出信号更靠近C末端地定位。

在一些实施方案中，运输信号可来源于人体内向整流钾通道Kir2.1的氨基酸序列。在其他实施方案中，运输信号可包含氨基酸序列KSRITSEGEY1PLDQIDINV(SEQIDNO:22)。适用的运输序列可包含与如人体内向整流钾通道Kir2.1的运输序列的氨基酸序列(例如KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQIDNO:22))具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些情况下，ER输出信号是例如VXXSL(其中X是任何氨基酸)(例如VKESL(SEQIDNO:27)；VLGSL(SEQIDNO:28)；等)；NANSFCYENEVALTSK(SEQIDNO:29)；FXYENE(SEQIDNO:30)(其中X是任何氨基酸)，例如FCYENEV(SEQIDNO:31)；等等。

本文还提供编码本文所述的光响应质子泵蛋白中的任一种的分离的多核苷酸，如包含与SEQIDNO:4中所示的序列至少75％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的核心氨基酸序列的光响应质子泵蛋白。本文还提供包含编码本文所述的蛋白的多核苷酸的表达载体(如本文所述的病毒载体)，如包含与SEQIDNO:4中所示的序列至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的核心氨基酸序列的光响应质子泵蛋白。

Oxy

在一些实施方案中，光激活蛋白是尖尾藻(Oxyrrhismarina)(Oxy)质子泵，当细胞用光照射时其可转运一个或多个质子穿过细胞的质膜。所述光可具有在约500与约560nm之间的波长或可具有约530nm的波长。在一些实施方案中，Oxy蛋白可包含与SEQIDNO:5中所示的序列至少75％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的氨基酸序列。Oxy蛋白可另外包含取代、缺失和/或引入天然氨基酸序列中的插入以增加或减小对光的敏感度、增加或减小对具体波长的光的敏感度和/或增强或减弱Oxy蛋白转运离子穿过靶细胞的质膜的能力。另外，Oxy蛋白可含有一个或多个保守的氨基酸取代和/或一个或多个非保守的氨基酸取代。包含取代、缺失和/或引入天然氨基酸序列中的插入的Oxy蛋白适当地保留响应于光来转运离子穿过靶细胞的质膜的能力。

在一些实施方案中，Oxy蛋白包含至少一个(如一个、两个、三个或更多个)增强向靶细胞的质膜转运的选自由以下组成的组的氨基酸序列基元：信号肽、ER输出信号及膜运输信号。在一些实施方案中，Oxy蛋白包含N末端信号肽和C末端ER输出信号。在一些实施方案中，Oxy蛋白包含N末端信号肽和C末端运输信号。在一些实施方案中，Oxy蛋白包含N末端信号肽、C末端ER输出信号及C末端运输信号。在一些实施方案中，Oxy蛋白包含C末端ER输出信号和C末端运输信号。在一些实施方案中，C末端ER输出信号与C末端运输信号是通过接头连接的。所述接头在长度上可包含约5、10、20、30、40、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、400或500个氨基酸中的任一个。接头可进一步包含荧光蛋白，例如但不限于黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白、绿色荧光蛋白或青色荧光蛋白。在一些实施方案中，ER输出信号比运输信号更靠近C末端地定位。在一些实施方案中，运输信号比ER输出信号更靠近C末端地定位。

Mac

在一些实施方案中，光响应质子泵蛋白可响应于光并且可来源于十字花科小球腔菌(Leptosphaeriamaculans)，其中所述质子泵蛋白当细胞用520nm至560nm光照射时能够将质子泵送穿过细胞膜。所述光可具有在约520nm至约560nm之间的波长。在另一实施方案中，光响应质子泵蛋白可包含与SEQIDNO:6或SEQIDNO:7(Mac；Mac3.0)中所示的序列至少75％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的氨基酸序列。光响应质子泵蛋白可另外包含取代、缺失和/或引入天然氨基酸序列中的插入以增加或减小对光的敏感度、增加或减小对具体波长的光的敏感度和/或增强或减弱光响应质子泵蛋白调节细胞质膜的偏振态的能力。另外，光响应质子泵蛋白可含有一个或多个保守的氨基酸取代和/或一个或多个非保守的氨基酸取代。包含取代、缺失和/或引入天然氨基酸序列中的插入的光响应质子泵蛋白适当地保留响应于光来泵送质子穿过神经元细胞的质膜的能力。

在本文所公开的方法的其他方面中，光响应质子泵蛋白可包含与SEQIDNO:6中所示的序列至少75％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的核心氨基酸序列及至少一个(如一个、两个、三个或更多个)增强向哺乳动物细胞的质膜转运的选自由以下组成的组的氨基酸序列基元：信号肽、ER输出信号及膜运输信号。在一些实施方案中，光响应质子泵蛋白包含N末端信号肽和C末端ER输出信号。在一些实施方案中，光响应质子泵蛋白包含N末端信号肽和C末端运输信号。在一些实施方案中，光响应质子泵蛋白包含N末端信号肽、C末端ER输出信号及C末端运输信号。在一些实施方案中，光响应质子泵蛋白包含C末端ER输出信号和C末端运输信号。在一些实施方案中，C末端ER输出信号与C末端运输信号是通过接头连接的。所述接头在长度上可包含约5、10、20、30、40、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、400或500个氨基酸中的任一个。接头可进一步包含荧光蛋白，例如但不限于黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白、绿色荧光蛋白或青色荧光蛋白。在一些实施方案中，ER输出信号比运输信号更靠近C末端地定位。在一些实施方案中，运输信号比ER输出信号更靠近C末端地定位。

在一些实施方案中，运输信号可来源于人体内向整流钾通道Kir2.1的氨基酸序列。在其他实施方案中，运输信号可包含氨基酸序列KSR1TSEGEY1PLDQIDINV(SEQIDNO:22)。适用的运输序列可包含与如人体内向整流钾通道Kir2.1的运输序列的氨基酸序列(例如，KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQIDNO:22))具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些情况下，ER输出信号是例如VXXSL(其中X是任何氨基酸)(例如VKESL(SEQIDNO:27)；VLGSL(SEQIDNO:28)；等)；NANSFCYENEVALTSK(SEQIDNO:29)；FXYENE(SEQIDNO:30)(其中X是任何氨基酸)，例如FCYENEV(SEQIDNO:31)；等等。

本文还提供编码本文所述的光响应质子泵蛋白中的任一种的分离的多核苷酸，如包含与SEQIDNO:6中所示的序列至少75％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的核心氨基酸序列的光响应质子泵蛋白。本文还提供包含编码本文所述的蛋白的多核苷酸的表达载体(如本文所述的病毒载体)，如包含与SEQIDNO:6中所示的序列至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的核心氨基酸序列的光响应质子泵蛋白。

与光激活的质子泵蛋白有关的进一步公开可见于国际专利申请号PCT/US2011/028893中，所述公开据此以引用的方式整体并入。

NpHR

在一些情况下，在如上所述的神经元质膜上表达的合适的光响应氯泵蛋白可来源于盐碱古菌(Natronomonaspharaonis)。在一些实施方案中，光响应氯泵蛋白可响应于琥珀色光和红光并且当光响应氯泵蛋白用琥珀色光或红光照射时，可介导神经元中的超极化电流。可激活光响应氯泵的光的波长可在约580与630nm之间。在一些实施方案中，光可在约589nm的波长下或者光可具有大于约630nm(例如，小于约740nm)的波长。在另一实施方案中，光具有约630nm的波长。在一些实施方案中，所述光响应氯泵蛋白当暴露于连续的光脉冲时可超极化神经膜持续至少约90分钟。在一些实施方案中，光响应氯泵蛋白可包含与SEQIDNO:16中所示的序列至少约75％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的氨基酸序列。另外，光响应氯泵蛋白可包含取代、缺失和/或引入天然氨基酸序列中的插入以增加或减小对光的敏感度、增加或减小对具体波长的光的敏感度和/或增强或减弱光响应蛋白调节细胞质膜的偏振态的能力。在一些实施方案中，光响应氯泵蛋白含有一个或多个保守的氨基酸取代。在一些实施方案中，光响应蛋白含有一个或多个非保守的氨基酸取代。包含取代、缺失和/或引入天然氨基酸序列中的插入的光响应蛋白适当地保留响应于光来超极化神经元细胞的质膜的能力。

另外，在其他方面中，光响应氯泵蛋白可包含与SEQIDNO:16中所示的序列至少约75％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的核心氨基酸序列及内质网(ER)输出信号。此ER输出信号可融合至核心氨基酸序列的C末端或可融合至核心氨基酸序列的N末端。在一些实施方案中，ER输出信号通过接头与核心氨基酸序列连接。所述接头在长度上可包含约5、10、20、30、40、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、400或500个氨基酸中的任一个。接头可进一步包含荧光蛋白，例如但不限于黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白、绿色荧光蛋白或青色荧光蛋白。在一些实施方案中，ER输出信号可包含氨基酸序列FXYENE(SEQIDNO:30)，其中X可以是任何氨基酸。在另一实施方案中，ER输出信号可包含氨基酸序列VXXSL，其中X可以是任何氨基酸。在一些实施方案中，ER输出信号可包含氨基酸序列FCYENEV(SEQIDNO:31)。

适用于本公开的修饰的视蛋白中的内质网(ER)输出序列包括例如VXXSL(其中X是任何氨基酸)(例如VKESL(SEQIDNO:27)；VLGSL(SEQIDNO:28)；等)；NANSFCYENEVALTSK(SEQIDNO:29)；FXYENE(其中X是任何氨基酸)(SEQIDNO:30)，例如FCYENEV(SEQIDNO:31)；等等。ER输出序列可具有约5个氨基酸至约25个氨基酸的长度，例如，约5个氨基酸至约10个氨基酸、约10个氨基酸至约15个氨基酸、约15个氨基酸至约20个氨基酸或约20个氨基酸至约25个氨基酸。

在其他方面中，本文所述的光响应氯泵蛋白可包含在细胞膜上表达的光响应蛋白，其中所述蛋白包含与SEQIDNO:16中所示的序列至少75％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的核心氨基酸序列及运输信号(例如，其可增强光响应氯泵蛋白向质膜的转运)。运输信号可融合至核心氨基酸序列的C末端或可融合至核心氨基酸序列的N末端。在一些实施方案中，运输信号可通过接头与核心氨基酸序列连接，所述接头在长度上可包含约5、10、20、30、40、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、400或500个氨基酸中的任一个。接头可进一步包含荧光蛋白，例如但不限于黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白、绿色荧光蛋白或青色荧光蛋白。在一些实施方案中，运输信号可来源于人体内向整流钾通道Kir2.1的氨基酸序列。在其他实施方案中，运输信号可包含氨基酸序列KSRITSEGEYIPLDQ1DINV(SEQIDNO:22)。

在一些方面中，光响应氯泵蛋白可包含与SEQIDNO:16中所示的序列至少75％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的核心氨基酸序列及至少一个(如一个、两个、三个或更多个)增强向哺乳动物细胞的质膜转运的选自由以下组成的组的氨基酸序列基元：ER输出信号、信号肽及膜运输信号。在一些实施方案中，光响应氯泵蛋白包含N末端信号肽、C末端ER输出信号及C末端运输信号。在一些实施方案中，C末端ER输出信号与C末端运输信号可通过接头连接。所述接头在长度上可包含约5、10、20、30、40、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、400或500个氨基酸中的任一个。接头还可进一步包含荧光蛋白，例如但不限于黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白、绿色荧光蛋白或青色荧光蛋白。在一些实施方案中，ER输出信号可比运输信号更靠近C末端地定位。在其他实施方案中，运输信号比ER输出信号更靠近C末端地定位。在一些实施方案中，信号肽包含氨基酸序列MTETLPPVTESAVALQAE(SEQIDNO:32)。在另一实施方案中，光响应氯泵蛋白包含与SEQIDNO:17至少95％同一的氨基酸序列。

此外，在其他方面中，光响应氯泵蛋白可包含与SEQIDNO:16中所示的序列至少75％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的核心氨基酸序列，其中SEQIDNO:16的N末端信号肽是缺失或取代的。在一些实施方案中，可使用其他信号肽(如来自其他视蛋白的信号肽)。光响应蛋白可进一步包含本文所述的ER转运信号和/或膜运输信号。在一些实施方案中，光响应氯泵蛋白包含与SEQIDNO:18至少95％同一的氨基酸序列。

在一些实施方案中，光响应视蛋白是包含与SEQIDNO:16中所示的序列至少75％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一的氨基酸序列的NpHR视蛋白。在一些实施方案中，NpHR视蛋白进一步包含内质网(ER)输出信号和/或膜运输信号。例如，NpHR视蛋白包含与SEQIDNO:16中所示的序列至少95％同一的氨基酸序列及内质网(ER)输出信号。在一些实施方案中，与SEQIDNO:16中所示的序列至少95％同一的氨基酸序列通过接头与ER输出信号连接。在一些实施方案中，ER输出信号包含氨基酸序列FXYENE(SEQIDNO:30)，其中X可以是任何氨基酸。在另一实施方案中，ER输出信号包含氨基酸序列VXXSL，其中X可以是任何氨基酸。在一些实施方案中，ER输出信号包含氨基酸序列FCYENEV(SEQIDNO:31)。在一些实施方案中，NpHR视蛋白包含与SEQIDNO:16中所示的序列至少95％同一的氨基酸序列、ER输出信号及膜运输信号。在其他实施方案中，NpHR视蛋白从N末端至C末端包含与SEQIDNO:16中所示的序列至少95％同一的氨基酸序列、ER输出信号及膜运输信号。在其他实施方案中，NpHR视蛋白从N末端至C末端包含与SEQIDNO:16中所示的序列至少95％同一的氨基酸序列、膜运输信号及ER输出信号。在一些实施方案中，膜运输信号来源于人体内向整流钾通道Kir2.1的氨基酸序列。在一些实施方案中，膜运输信号包含氨基酸序列KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQIDNO:22)。在一些实施方案中，膜运输信号通过接头与同SEQIDNO:16中所示的序列至少95％同一的氨基酸序列连接。在一些实施方案中，膜运输信号通过接头与ER输出信号连接。所述接头在长度上可包含约5、10、20、30、40、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、400或500个氨基酸中的任一个。接头可进一步包含荧光蛋白，例如但不限于黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白、绿色荧光蛋白或青色荧光蛋白。在一些实施方案中，光响应视蛋白进一步包含N末端信号肽。在一些实施方案中，光响应视蛋白包含SEQIDNO:17的氨基酸序列。在一些实施方案中，光响应视蛋白包含SEQIDNO:18的氨基酸序列。本文还提供编码本文所述的光响应氯离子泵蛋白中的任一种的多核苷酸，如包含与SEQIDNO:16中所示的序列至少75％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的核心氨基酸序列的光响应蛋白、ER输出信号及膜运输信号。在另一实施方案中，所述多核苷酸包含编码与SEQIDNO:17和SEQIDNO:18至少95％同一的氨基酸的序列。所述多核苷酸可在表达载体(如但不限于本文所述的病毒载体)中。所述多核苷酸可用于表达光响应氯离子泵蛋白。

与光响应氯泵蛋白有关的进一步公开可见于美国专利申请公布号2009/0093403和2010/0145418以及国际专利申请号PCT/US2011/028893中，其各自的公开内容据此以引用的方式整体并入。

杜氏盐藻(Dunaliellasalina)光激活的多肽

在一些实施方案中，合适的光响应离子通道蛋白可响应于470nm-510nm光并且可来源于杜氏盐藻，其中所述离子通道蛋白当细胞用光照射时能够介导细胞中的超极化电流。所述光可具有在约470nm与约510nm之间的波长或可具有约490nm的波长。在一些实施方案中，光响应离子通道蛋白可包含与SEQIDNO:15中所示的序列至少75％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的氨基酸序列。另外，光响应离子通道蛋白可包含取代、缺失和/或引入天然氨基酸序列中的插入以增加或减小对光的敏感度、增加或减小对具体波长的光的敏感度和/或增强或减弱光响应离子通道蛋白调节细胞质膜的偏振态的能力。另外，光响应离子通道蛋白可含有一个或多个保守的氨基酸取代和/或一个或多个非保守的氨基酸取代。包含取代、缺失和/或引入天然氨基酸序列中的插入的光响应离子通道蛋白适当地保留响应于光来转运离子穿过神经元细胞的质膜的能力。

在本文所公开的方法的其他方面中，光响应离子通道蛋白可包含与SEQIDNO:15中所示的序列至少75％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的核心氨基酸序列及至少一个(如一个、两个、三个或更多个)增强向哺乳动物细胞的质膜转运的选自由以下组成的组的氨基酸序列基元：信号肽、ER输出信号及膜运输信号。在一些实施方案中，光响应质子离子通道包含N末端信号肽和C末端ER输出信号。在一些实施方案中，光响应离子通道蛋白包含N末端信号肽和C末端运输信号。在一些实施方案中，光响应离子通道蛋白包含N末端信号肽、C末端ER输出信号及C末端运输信号。在一些实施方案中，光响应离子通道蛋白包含C末端ER输出信号和C末端运输信号。在一些实施方案中，C末端ER输出信号与C末端运输信号是通过接头连接的。所述接头在长度上可包含约5、10、20、30、40、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、400或500个氨基酸中的任一个。接头可进一步包含荧光蛋白，例如但不限于黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白、绿色荧光蛋白或青色荧光蛋白。在一些实施方案中，ER输出信号比运输信号更靠近C末端地定位。在一些实施方案中，运输信号比ER输出信号更靠近C末端地定位。

本文还提供编码本文所述的光响应通道蛋白中的任一种的分离的多核苷酸，如包含与SEQIDNO:15中所示的序列至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的核心氨基酸序列的光响应离子通道蛋白。本文还提供包含编码本文所述的蛋白的多核苷酸的表达载体(如本文所述的病毒载体)，如包含与SEQIDNO:15中所示的序列至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的核心氨基酸序列的光响应通道蛋白。

多核苷酸和载体

如上所论述，根据本公开的用于控制疼痛的方法总体上涉及将包含编码视蛋白的核苷酸序列的核酸引入个体的神经元(例如伤害感受器)中，所述视蛋白响应于激活视蛋白的波长的光提供细胞的超极化。合适的核酸包含编码本文所述的光激活多肽(视蛋白)中的一种或多种(例如，一种或多种如本文所述的光激活多肽)的核苷酸序列。在一些实施方案中，多核苷酸包含一种表达盒，其中所述表达盒含有多个组分(例如，编码序列；转录控制序列；等)，它们被用于在靶细胞中表达由多核苷酸编码的一种或多种蛋白。

在一些实施方案中，编码光激活多肽的多核苷酸的一部分与启动子序列可操作地连接。在靶细胞中起作用的任何合适的启动子都可用于表达编码光激活多肽的多核苷酸。在某些实施方案中，启动子序列可以是具体的靶细胞类型或具体的组织类型所特有的启动子，如特定的神经元或泛神经元启动子。适用于驱动多核苷酸在特定的动物细胞中表达的启动子的起始控制区有许多并且为本领域技术人员所熟知。可使用能够驱动本发明多核苷酸的表达的实际上任何启动子。在一些实施方案中，用于驱动本发明蛋白的表达的启动子可以是Thy1启动子(参见，例如Llewellyn等人,2010,Nat.Med.,16(10):1161-1166)。在一些实施方案中，用于驱动本发明蛋白的表达的启动子可以是人突触蛋白(hSyn)启动子、人延长因子1-α(EF1α)启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子、CMV早期增强子/小鸡β肌动蛋白(CAG)启动子、突触蛋白-I启动子(例如，人突触蛋白-I启动子)、人突触核蛋白1启动子、人Thy1启动子、钙/钙调蛋白依赖性激酶IIα(CAMKIIα)启动子或能够驱动本发明核酸序列在靶细胞中表达的任何其他启动子。

神经元特异性启动子及其他控制元件(例如增强子)在本领域中是已知的，并且可与编码视蛋白的核苷酸序列可操作地连接。合适的神经元特异性控制序列包括但不限于神经元特异性烯醇酶(NSE)启动子(参见，例如EMBLHSENO2、X51956；也参见，例如，美国专利号6,649,811、美国专利号5,387,742)；芳香族氨基酸脱羧酶(AADC)启动子；神经丝启动子(参见，例如GenBankHUMNFL，L04147)；突触蛋白启动子(参见，例如GenBankHUMSYN1B，M55301)；thy-1启动子(参见，例如Chen等人(1987)Cell51:7-19)；血清素受体启动子(参见，例如GenBankS62283)；酪氨酸羟化酶启动子(TH)(参见，例如Nucl.Acids.Res.15:2363-2384(1987)和Neuron6:583-594(1991))；GnRH启动子(参见，例如Radovick等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:3402-3406(1991))；L7启动子(参见，例如Oberdick等人,Science248:223-226(1990))；DNMT启动子(参见，例如Bartge等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:3648-3652(1988))；脑啡肽启动子(参见，例如Comb等人,EMBOJ.17:3793-3805(1988))；髓磷脂碱性蛋白(MBP)启动子；CMV增强子/血小板衍生生长因子-β启动子(参见，例如Liu等人(2004)GeneTherapy11:52-60)；运动神经元特异性基因Hb9启动子(参见，例如美国专利号7,632,679；和Lee等人(2004)Development131:3295-3306)；以及Ca(²⁺)-钙调蛋白依赖性蛋白激酶I1启动子的α亚单位(CaMK1Iα)(参见，例如Mayford等人(1996)Proc.NatlAcad.Sci.USA93:13250)。

在一些实施方案中，启动子可以是诱导型启动子。例如，所述启动子可由响应于外源性施用的药物的反式作用因子来诱导。诱导型启动子的实例包括但不限于四环素开或四环素关的启动子或他莫昔芬诱导型CreER。

在一些实施方案中，本发明多核苷酸可包含可用于从同一转录产物生成两个单独蛋白的核糖体跳跃序列。在这类实施方案中，本发明多核苷酸通常将包括编码光激活蛋白以及反应蛋白的编码序列。在这些实施方案中，核糖体跳跃序列可置于两个编码序列之间以从同一转录产物产生两个不同的蛋白(即光激活蛋白和反应蛋白)。

如上所述，在一些情况下，核酸是包含编码如本文所述的光激活多肽或其任何变体的核苷酸序列的重组表达载体。合适的表达载体包括包含编码RNA(例如mRNA)的核苷酸序列的载体，所述RNA当从载体的多核苷酸转录时将导致本发明蛋白在靶细胞的质膜上的积聚。可使用的载体包括但不限于慢病毒、单纯疱疹病毒、腺病毒、以及腺相关病毒(AAV)载体。慢病毒载体包括但不限于基于人类免疫缺陷病毒(HIV)的载体。慢病毒载体可用其他病毒的包膜蛋白假型化，包括但不限于水疱性口炎病毒(VSV)、狂犬病、Mo鼠科白血病病毒(MLV)、杆状病毒以及埃博拉(Ebola)。这类载体可使用本领域中的标准方法制备。

在一些实施方案中，载体可以是重组AAV载体。AAV载体是可以稳定及位点特异性方式整合到它们所感染的细胞的基因组中的相对较小的DNA病毒。它们能够感染广泛范围的细胞，而不会对细胞的生长、形态或分化产生任何影响，并且它们似乎不牵涉到人体病理中。已对AAV基因组进行克隆、测序和表征。其包括大约4700个碱基且在每个末端含有大约145个碱基的反向末端重复(ITR)区，其充当病毒的复制起点。基因组的其余部分被分成具有包衣壳化功能的两个必需区：含有参与病毒复制和病毒基因表达的rep基因的基因组的左侧部分；及含有编码病毒的衣壳蛋白的cap基因的基因组的右侧部分。

AAV载体可使用本领域中的标准方法制备。任何血清型的腺相关病毒都是合适的(参见，例如Blacklow,“'ParvovirusesandHumanDisease”的第165-174页J.R.Pattison编著(1988)；Rose,ComprehensiveVirology3:1,1974；P.Tattersall“TheEvolutionofParvovirusTaxonomy”,在Parvoviruses中(JRKerr,SFCotmore.MEBloom,RMLinden,CRParrish编著)第5-14页,HudderArnold,London,UK(2006)；以及DEBowles,JERabinowitz,RJSamulski“TheGenusDependovirus”(JRKerr,SFCotmore.MEBloom,RMLinden,CRParrish编著)第15-23页,HudderArnold,London,UK(2006)，其各自的公开内容以引用的方式整体并入本文)。用于纯化载体的方法可见于例如美国专利号6,566,118、6,989,264和6,995,006以及名称为“MethodsforGeneratingHighTiterHelper-freePreparationofRecombinantAAVVectors”的WO/1999/011764中，其公开内容以引用的方式整体并入本文。在杆状病毒系统中制备AAV载体的方法描述于例如WO2008/024998中。AAV载体可以是自身互补或单链的。杂合载体的制备描述于例如PCT申请号PCT/US2005/027091中，其公开内容以引用的方式整体并入本文。已经描述用于体外和体内转移基因的来源于AAV的载体的用途(参见，例如国际专利申请公布号91/18088和WO93/09239；美国专利号4,797,368、6,596,535和5,139,941；以及欧洲专利号0488528，所有专利据此以引用的方式整体并入本文)。这些公布描述各种AAV衍生的构建体，其中rep和/或cap基因是缺失的并且由所关注的基因替代；以及用于体外(至培养细胞中)或体内(直接至有机体中)转移所关注的基因的这些构建体的用途。根据本公开的复制缺陷型重组AAV可通过共转染含有侧接有两个AAV反向末端重复(1TR)区的所关注的核酸序列的质粒和载有AAV包衣壳化基因(rep和cap基因)的质粒到感染了人辅助病毒(例如腺病毒)的细胞系中来制备。然后通过标准技术纯化所产生的AAV重组体。

在一些实施方案中，用于本公开方法中的载体被包衣壳化到病毒颗粒(例如，AAV病毒颗粒，包括但不限于AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15及AAV16)中。因此，本公开包括一种重组病毒颗粒(重组是因为其含有重组多核苷酸)，其包含本文所述的载体中的任一种。产生这类颗粒的方法在本领域中是已知的并且描述于美国专利号6,596,535中，其公开内容据此以引用的方式整体并入。在一些情况下，使用AAV6。在一些情况下，使用AAV1。

药物组合物

本公开的方面包括药物组合物，其包含如上所述的多核苷酸、载体或其组分。出于遗传修饰靶细胞以使得所述靶细胞表达一种或多种光激活蛋白的目的，可向受试者施用本发明药物组合物。在一些实施方案中，本发明药物组合物包含药学上可接受的赋形剂。在一些实施方案中，药物组合物可包含促进本发明多核苷酸或载体向靶细胞递送的组分，包括但不限于转染剂或其组分，如脂质、聚合物等等。

在一些实施方案中，本发明药物组合物将适用于注射到受试者中，例如将是无菌的。例如，在一些实施方案中，本发明药物组合物将适用于注射到受试者中，例如，其中所述组合物是无菌的且不含可检测的热原质和/或其他毒素。

药学上可接受的赋形剂，如媒介物、佐剂、载体或稀释剂容易为公众所获得。此外，药学上可接受的助剂物质，如pH调节和缓冲剂、渗透压调节剂、稳定剂、湿润剂等等，同样容易为公众所获得，并且可并入但不限于本公开的药物组合物中。

递送装置

在一些情况下，递送装置用于递送编码光激活多肽的核酸或包含所述核酸的药物组合物至靶细胞。所述递送装置可向一个或多个靶细胞提供定期的、不定期的、程序化的或临床医师或患者激活剂量的核酸或药物组合物以确保靶细胞继续表达编码的光激活多肽。

合适的递送装置一般可包括一个或多个组件，如储集层、泵、致动器、管组件、针、导管、以及用于向个体的靶细胞或组织递送核酸或药物组合物的任何其他合适的组件。递送装置还可包括便于计算机化操作的组件，如电源、包括存储器的处理器、用户输入装置和/或图形用户界面。在一些实施方案中，递送装置可完全地或部分地植入患者内。在一些实施方案中，递送装置可由照料者来操作，其中所述装置被引入患者身体的一部分中，例如，引入患者脑中，并且本发明药物组合物被递送给靶组织，例如，患者脑的一部分。在一些实施方案中，在递送药物组合物之后，装置可被移除。在其他实施方案中，装置可保持在原位以便随后递送另外的药物组合物。

光产生装置

在进行控制疼痛的本发明方法时，光产生装置可用于向表达一种或多种光激活多肽的靶细胞递送光。适用于本公开方法的光产生装置一般可从所述装置上的一个或多个光源产生多种不同波长的光。在一些实施方案中，光产生装置可包括光套或光套筒，其可置于表达一种或多种本发明蛋白的靶细胞周围或附近。在一些实施方案中，可植入光源的一部分或整个光源。本发明的光产生装置可具有用于刺激本文所公开的光激活蛋白的任何适用的构造。在一些实施方案中，举例来说，光产生装置可包括便于靶细胞或组织的专有照射的组件。例如，在一些实施方案中，光产生装置可专门地将光引向靶细胞、靶细胞的一部分，例如神经细胞的具体轴突或特定解剖结构，例如像一束神经纤维、靶组织或脊髓的一部分。“专门地引导光”意味着光产生装置仅将光递送给特定的靶结构，并且不照射其他结构。例如，在一些实施方案中、光产生装置可被配置来照射神经细胞的轴突，而不是照射神经细胞的任何其他部分。以此方式，来自光产生装置的光仅影响被照射的特定靶结构中的光激活蛋白。

在一些实施方案中，光产生装置未必完全包围含有表达光激活蛋白的靶细胞的区域，而是可具有U形。在一些实施方案中，光产生装置可具有附件臂，其可用于将光产生装置导向特定的区域或靶结构，例如，特定的神经元区域。附件臂可在植入光产生装置之后移除或可保留在原处以将光产生装置的位置固定在接近所关注的靶细胞处。

在一些实施方案中，本发明的光产生装置可包括内体，所述内体具有至少一个用于产生光的连接至电源的装置。在一些实施方案中，所述电源可以是用于为光产生装置供电的内部电池。在一些实施方案中，可植入的光产生装置可包括用于从用于供电装置的外部电源接收无线传输的电磁能的外部天线。无线传输的电磁能可以是无线电波、微波或任何其他电磁能量源，所述电磁能量源可从外部电源传输以为光产生装置供电。在一些实施方案中，光产生装置是通过例如使用半导体或本领域中已知的其他方法产生的集成电路来控制。

在一些实施方案中，所述光产生装置可包括发光二极管(LED)。在一些实施方案中，LED可产生蓝光和/或绿光。在其他实施方案中，LED可产生琥珀色光和/或黄光。在一些实施方案中，若干微LED被包埋在光产生装置的内体中。在其他实施方案中，光产生装置是固态激光二极管或能够产生光的任何其他装置。光产生装置可产生具有足以激活本发明光激活蛋白的波长和强度的光。在一些实施方案中，光产生装置产生具有以下任一强度的光：约0.05mW/mm²、0.1mW/mm²、0.2mW/mm²、0.3mW/mm²、0.4mW/mm²、0.5mW/mm²、约0.6mW/mm²、约0.7mW/mm²、约0.8mW/mm²、约0.9mW/mm²、约1.0mW/mm²、约1.1mW/mm²、约1.2mW/mm²、约1.3mW/mm²、约1.4mW/mm²、约1.5mW/mm²、约1.6mW/mm²、约1.7mW/mm²、约1.8mW/mm²、约1.9mW/mm²、约2.0mW/mm²、约2.1mW/mm²、约2.2mW/mm²、约2.3mW/mm²、约2.4mW/mm²、约2.5mW/mm²、约3mW/mm²、约3.5mW/mm²、约4mW/mm²、约4.5mW/mm²、约5mW/mm²、约5.5mW/mm²、约6mW/mm²、约7mW/mm²、约8mW/mm²、约9mW/mm²或约10mW/mm²，包括端点，包括在这些数目之间的值。在一些实施方案中，光产生装置产生具有以下强度的光：至少约10Hz，如直至约25Hz、如直至约50Hz、如直至约75Hz、如直至约100Hz。

合适的光产生装置一般能够产生具有在以下范围内的波长的光：从约350nm、直至约360nm、直至约370nm、直至约380nm、直至约390nm、直至约400nm、直至约410nm、直至约420nm、直至约430nm、直至约440nm、直至约450nm、直至约460nm、直至约470nm、直至约480nm、直至约490nm、直至约500nm、直至约510nm、直至约520nm、直至约530nm、直至约540nm、直至约550nm、直至约560nm、直至约570nm、直至约580nm、直至约590nm、直至约600nm、直至约610nm、直至约620nm、直至约630nm、直至约640nm、直至约650nm、直至约660nm、直至约670nm、直至约680nm、直至约690nm、直至约700nm、直至约710nm、直至约720nm、直至约730nm、直至约740nm和/或直至约750nm。

在一些实施方案中，合适的光产生装置可包括一种或多种光学纤维，其可从光源传输光并将光递送至靶结构。所述光学纤维可包括塑料或玻璃材料，并且在一些实施方案中，可具有适当柔性以便于将光产生装置放置在不能为刚性结构适应的位置处。例如，在一些实施方案中，光产生装置可包括产生光的光源以及一个或多个光学纤维，所述光学纤维可置于患者身体上或中的各种位置处。来自光源的光可穿过光纤，绕过新来者并在光纤中弯曲，并且出现在光纤的末端处以便将光递送给靶结构。

在一些实施方案中，合适的光产生装置可包括多个光源，这些光源可用于以不同波长的光照射靶组织。例如，在一些实施方案中，光产生装置可包括产生第一波长的光的第一光源，例如红光；和产生第二波长的光的第二光源，例如绿光。这类光产生装置可用于同时用两种波长的光照射同一靶组织，或者可用第一波长的光和第二波长的光交替地照射靶组织。在一些实施方案中，这类光产生装置可用于从同一光源递送光到不同的靶组织。例如，在一些实施方案中，光产生装置可递送第一波长的光到第一靶组织，并且可递送第二波长的光到不同的靶组织。

控制装置

在一些情况下，可控制或调节由光产生装置发出的光量的控制装置用于本发明方法中。在一些实施方案中，控制装置可被配置来调节从光产生装置递送给靶组织的光的波长和/或强度。在一些实施方案中，控制装置可被配置来调节从光产生装置递送给靶组织的光的频率和/或持续时间。例如，在一些实施方案中，控制装置可被配置来从光产生装置递送光脉冲到靶组织。控制装置可调节光脉冲的频率和/或持续时间以使得靶组织用来自光产生装置的光照射，例如，在规律的或无规律的速率下、根据用户输入等。在一些实施方案中，控制装置可从光产生装置产生光脉冲，其具有在约1毫秒或以下、直至约1秒、直至约10秒、直至约20秒、直至约30秒、直至约40秒、直至约50秒、直至约60秒或以上范围内的持续期间。在一些实施方案中，控制装置可从光产生装置产生光脉冲，其具有1脉冲/毫秒、直至约1脉冲/秒、直至约1脉冲/分钟、直至约1脉冲/10分钟、直至约1脉冲/20分钟、直至约1脉冲/30分钟的频率。

在一些实施方案中，合适的控制装置可包括电源，其可安装在无线发射机上。在一些实施方案中，合适的控制装置可包括电源，其可安装在发射线圈上。在一些实施方案中，电池可连接到电源上用于向其提供电力。开关可连接到电源上，允许操作者(例如患者或照料者)手动地激活或去激活电源。在一些实施方案中，一旦开关激活，电源便可通过控制装置上的发射线圈与可植入光产生装置(如光套或套筒)的天线(其可以是外部天线或内部天线)之间的电磁耦合向光产生装置提供电力。发射线圈当接近其时可建立与可植入光产生装置的外部天线的电磁耦合，用于为光产生装置供应电力并且用于向光产生装置传输一个或多个控制信号。在一些实施方案中，控制装置的发射线圈与可植入光产生装置的外部天线之间的电磁耦合可以是射频磁性电感耦合。当使用射频磁性电感耦合时，无线电波的工作频率可以在约1与20MHz之间，包括端点，包括在这些数目之间的任何值(例如，约1MHz、约2MHz、约3MHz、约4MHz、约5MHz、约6MHz、约7MHz、约8MHz、约9MHz、约10MHz、约11MHz、约12MHz、约13MHz、约14MHz、约15MHz、约16MHz、约17MHz、约18MHz、约19MHz或约20MHz)。在一些情况下，无线电波的工作频率可以在约20MHz与5GHz之间，例如，约20MHz至约50MHz、约50MHz至约250MHz、约250MHz至约500MHz、约500MHz至约750MHz、约750MHz至约1GHz、约1GHz至约2GHz、约2GHz至约3GHz、约3GHz至约4GHz或约4GHz至约5GHz。例如，当使用中场射频耦合时，工作频率可以从690MHz至2.2GHz。可使用其他耦合技术，如光接收器、红外线或生物医学的遥测系统(参见，例如Kiourti,"BiomedicalTelemetry:CommunicationbetweenImplantedDevicesandtheExternalWorld,Opticon1826,(8):Spring,2010)。

疼痛的非人动物模型

本公开提供一种伤害感受性疼痛的非人动物模型，其中所述非人动物在动物的神经元(例如，初级传入神经元，如小直径或大直径的初级传入神经元)中表达包含编码视蛋白多肽的核苷酸序列的核酸，所述视蛋白多肽响应于激活视蛋白的波长的光提供所述伤害感受器的去极化。在非人动物中的神经元(例如，初级传入神经元，如小直径或大直径的初级传入神经元；例如伤害感受器)的膜中表达的去极化视蛋白的照射在动物中诱发疼痛。

本发明的非人动物模型适用于鉴别控制疼痛的试剂(如下所述)。本发明的非人动物模型适用于研究应用，例如研究伤害感受器活性在疼痛(例如神经性疼痛)的发生中的作用。在一些情况下，本发明的疼痛非人动物模型是大鼠。在一些情况下，本发明的疼痛非人动物模型是小鼠。

在一些实施方案中，所述非人动物模型不是转基因动物，举例来说，所述非人动物模型不包括整合到生殖细胞的基因组中的编码光激活多肽的核酸。在一些实施方案中，所述非人动物模型包括编码在初级传入神经元(如伤害感受器)中的光激活多肽的核酸，其中所述核酸可整合到初级传入神经元(例如伤害感受器)的基因组中。在一些实施方案中，所述非人动物模型包括编码在初级传入神经元(例如伤害感受器)而不是在非神经元细胞中的光激活多肽的核酸，其中所述核酸可整合到伤害感受器的基因组中。在一些实施方案中，所述非人动物模型包括编码在初级传入神经元(例如伤害感受器)而不是在动物的非神经元细胞中的光激活多肽的核酸，其中所述核酸不整合到伤害感受器的基因组中。

在一些情况下，包含编码去极化光激活多肽的核苷酸序列的Cre依赖性DIO-AAV6构建体(参见，例如Sohal等人(2009)Nature459:698)可与伤害感受器特异性Cre小鼠系一起使用以实现限于伤害感受器的亚群的视蛋白表达。例如，编码去极化光响应多肽的核苷酸序列包括在Cre依赖性DIO-AAV6构建体内；并且所述构建体被引入伤害感受器特异性Cre小鼠的伤害感受器中。

去极化光激活蛋白

如上所论述，本发明的疼痛非人动物模型在动物的神经元(例如，初级传入神经元，如小直径或大直径的初级传入神经元；例如伤害感受器)中表达包含编码视蛋白多肽的核苷酸序列的核酸，所述视蛋白多肽响应于激活视蛋白的波长的光提供所述伤害感受器的去极化。

合适的光响应多肽的实例包括例如光响应阳离子通道蛋白的通道视紫红质家族成员，如莱茵衣藻(Chlamydomonasrheinhardtii)通道视紫红质2(ChR2)；阶跃视蛋白(SFO)；稳定的SFO(SSFO)；嵌合视蛋白如C1V1；团藻(Volvoxcarteri)衍生的通道视紫红质(VChR1)等。这类光响应多肽可用于响应于光刺激来促进神经细胞膜的去极化。

增强的胞内转运氨基酸基元

具有来源于进化更简单的有机体的组分的光响应视蛋白可能不被哺乳动物细胞表达或耐受或当在哺乳动物细胞中以高水平表达时可能展现受损的亚细胞定位。因此，在一些实施方案中，在细胞中表达的光响应视蛋白可融合至一个或多个选自由以下组成的组的氨基酸序列基元中：信号肽、内质网(ER)输出信号、膜运输信号和/或N末端高尔基输出信号。增强光响应蛋白向哺乳动物细胞的质膜转运的所述一个或多个氨基酸序列基元可融合：a)至光响应蛋白的N末端；b)至光响应蛋白的C末端；c)至光响应蛋白的N末端和C末端；或d)光响应蛋白内部。任选地，所述光响应蛋白与所述一个或多个氨基酸序列基元可通过接头分隔。

在一些实施方案中，所述光响应蛋白可通过添加增强蛋白向细胞质膜转运的运输信号(ts)来修饰。在一些实施方案中，运输信号可来源于人体内向整流钾通道Kir2.1的氨基酸序列。在其他实施方案中，运输信号可包含氨基酸序列KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQIDNO:22)。适用的运输序列可包含与如人体内向整流钾通道Kir2.1的运输序列的氨基酸序列(例如，KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQIDNO:22))具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

适于包含在光激活多肽中的信号序列可包含与如以下中的一个的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：

1)hChR2的信号肽(例如，MDYGGALSAVGRELLFVTNPVVVNGS(SEQIDNO:23))

适用于光响应多肽中的内质网(ER)输出序列包括例如VXXSL(其中X是任何氨基酸)(例如VKESL(SEQIDNO:27)；VLGSL(SEQIDNO:28)；等)；NANSFCYENEVALTSK(SEQIDNO:29)；FXYENE(SEQIDNO:30)(其中X是任何氨基酸)，例如FCYENEV(SEQIDNO:31)；等等。ER输出序列可具有约5个氨基酸至约25个氨基酸的长度，例如，约5个氨基酸至约10个氨基酸、约10个氨基酸至约15个氨基酸、约15个氨基酸至约20个氨基酸或约20个氨基酸至约25个氨基酸。

在一些实施方案中，在蛋白中的天然信号肽序列可缺失或被来自不同蛋白的异源信号肽序列取代。

ChR

在一些方面中，所述光响应阳离子通道蛋白可来源于莱茵衣藻，其中阳离子通道蛋白当细胞用光照射时能够转运阳离子穿过细胞膜。在另一实施方案中，光响应阳离子通道蛋白可包含与SEQIDNO:8中所示的序列至少75％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的氨基酸序列。用于激活来源于莱茵衣藻的光响应阳离子通道蛋白的光可具有在约460与约495nm之间的波长或可具有约480nm的波长。另外，具有约100Hz的时间频率的光脉冲可用于激活光响应蛋白。在一些实施方案中，用具有约100Hz时间频率的光脉冲激活来源于莱茵衣藻的光响应阳离子通道可造成表达光响应阳离子通道的神经元的去极化。另外，光响应阳离子通道蛋白可包含取代、缺失和/或引入天然氨基酸序列中的插入以增加或减小对光的敏感度、增加或减小对具体波长的光的敏感度和/或增强或减弱光响应阳离子通道蛋白调节细胞质膜的偏振态的能力。另外，所述光响应阳离子通道蛋白可含有一个或多个保守的氨基酸取代和/或一个或多个非保守的氨基酸取代。包含取代、缺失和/或引入天然氨基酸序列中的插入的光响应质子泵蛋白适当地保留转运阳离子穿过细胞膜的能力。

在一些实施方案中，光响应阳离子通道包含SEQIDNO:8中所列的氨基酸序列的T159C取代。在一些实施方案中，光响应阳离子通道包含SEQIDNO:8中所列的氨基酸序列的L132C取代。在一些实施方案中，光响应阳离子通道包含SEQIDNO:8中所列的氨基酸序列的E123T取代。在一些实施方案中，光响应阳离子通道包含SEQIDNO:8中所列的氨基酸序列的E123A取代。在一些实施方案中，光响应阳离子通道包含SEQIDNO:8中所列的氨基酸序列的T159C取代和E123T取代。在一些实施方案中，光响应阳离子通道包含SEQIDNO:8中所列的氨基酸序列的T159C取代和E123A取代。在一些实施方案中，光响应阳离子通道包含SEQIDNO:8中所列的氨基酸序列的T159C取代、L132C取代及E123T取代。在一些实施方案中，光响应阳离子通道包含SEQIDNO:8中所列的氨基酸序列的T159C取代、L132C取代及E123A取代。在一些实施方案中，光响应阳离子通道包含SEQIDNO:8中所列的氨基酸序列的L132C取代和E123T取代。在一些实施方案中，光响应阳离子通道包含SEQIDNO:8中所列的氨基酸序列的L132C取代和E123A取代。

在一些实施方案中，ChR2蛋白包含至少一个(如一个、两个、三个或更多个)增强向靶细胞的质膜转运的选自由以下组成的组的氨基酸序列基元：信号肽、ER输出信号及膜运输信号。在一些实施方案中，ChR2蛋白包含N末端信号肽和C末端ER输出信号。在一些实施方案中，ChR2蛋白包含N末端信号肽和C末端运输信号。在一些实施方案中，ChR2蛋白包含N末端信号肽、C末端ER输出信号及C末端运输信号。在一些实施方案中，ChR2蛋白包含C末端ER输出信号和C末端运输信号。在一些实施方案中，C末端ER输出信号与C末端运输信号是通过接头连接的。所述接头在长度上可包含约5、10、20、30、40、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、400或500个氨基酸中的任一个。接头可进一步包含荧光蛋白，例如但不限于黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白、绿色荧光蛋白或青色荧光蛋白。在一些实施方案中，ER输出信号比运输信号更靠近C末端地定位。在一些实施方案中，运输信号比ER输出信号更靠近C末端地定位。

在一些实施方案中，运输信号可来源于人体内向整流钾通道Kir2.1的氨基酸序列。在其他实施方案中，运输信号可包含氨基酸序列KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQIDNO:22)。适用的运输序列可包含与如人体内向整流钾通道Kir2.1的运输序列的氨基酸序列(例如，KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQIDNO:22))具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

在一些情况下，ER输出信号是例如VXXSL(其中X是任何氨基酸)(例如VKESL(SEQIDNO:27)；VLGSL(SEQIDNO:28)；等)；NANSFCYENEVALTSK(SEQIDNO:29)；FXYENE(SEQIDNO:30)(其中X是任何氨基酸)，例如FCYENEV(SEQIDNO:31)；等等。

基于ChR2的阶跃视蛋白及稳定的阶跃视蛋白

在其他实施方案中，所述光响应多肽是阶跃函数视蛋白(SFO)蛋白质或稳定的阶跃函数视蛋白(SSFO)蛋白质，其可在蛋白的视黄醇结合袋中的关键位置处具有特定的氨基酸取代。在一些实施方案中，SFO蛋白可具有在SEQIDNO:8的氨基酸残基C128处的突变。在其他实施方案中，SFO蛋白具有在SEQIDNO:8中的CI28A突变。在其他实施方案中，SFO蛋白具有在SEQIDNO:8中的C128S突变。在另一实施方案中，SFO蛋白具有在SEQIDNO:8中的C128T突变。在一些实施方案中，SFO蛋白可包含与SEQIDNO:9中所示的序列至少75％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的氨基酸序列，并且在氨基酸128处包含丙氨酸、丝氨酸或苏氨酸。

在一些实施方案中，SSFO蛋白可具有在SEQIDNO:8的氨基酸残基D156处的突变。在其他实施方案中，SSFO蛋白可具有在SEQIDNO:8的氨基酸残基C128和D156两者处的突变。在一个实施方案中，SSFO蛋白具有在SEQIDNO:8中的C128S和D156A突变。在另一实施方案中，SSFO蛋白可包含与SEQIDNO:10中所示的序列至少75％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的氨基酸序列；并且在氨基酸128处包含丙氨酸、丝氨酸或苏氨酸；或在氨基酸156处包含丙氨酸。在另一实施方案中，SSFO蛋白可包含在SEQIDNO:8中的C128T突变。在一些实施方案中，SSFO蛋白包含在SEQIDNO:8中的C128T和D156A突变。

在一些实施方案中，本文所提供的SFO或SSFO蛋白当细胞用蓝光照射时能够介导细胞中的去极化电流。在其他实施方案中，所述光可具有约445nm的波长。另外，在一些实施方案中，所述光可作为单脉冲的光或作为间隔脉冲的光递送，这是由于SFO和SSFO光电流的延长稳定性。在一些实施方案中，用单脉冲或间隔脉冲的光激活SFO或SSFO蛋白可引起表达SFO或SSFO蛋白的神经元的去极化。在一些实施方案中，所公开的阶跃函数视蛋白和稳定的阶跃函数视蛋白各自可具有用于响应于光来去极化神经元细胞膜的特定性质和特征。

与SFO或SSFO蛋白有关的进一步公开可见于国际专利申请公布号WO2010/056970中，其公开内容据此以引用的方式整体并入。

在一些情况下，基于ChR2的SFO或SSFO包含膜运输信号和/或ER输出信号。在一些实施方案中，运输信号可来源于人体内向整流钾通道Kir2.1的氨基酸序列。在其他实施方案中，运输信号可包含氨基酸序列KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQIDNO:22)。适用的运输序列可包含与如人体内向整流钾通道Kir2.1的运输序列的氨基酸序列(例如，KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQIDNO:22))具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些情况下，ER输出信号是例如VXXSL(其中X是任何氨基酸)(例如VKESL(SEQIDNO:27)；VLGSL(SEQIDNO:28)；等)；NANSFCYENEVALTSK(SEQIDNO:29)；FXYENE(SEQIDNO:30)(其中X是任何氨基酸)，例如FCYENEV(SEQIDNO:31)；等等。

C1V1嵌合阳离子通道

在其他实施方案中，所述光响应阳离子通道蛋白可以是衍生自团藻的VChR1蛋白和莱茵衣藻的ChR1蛋白的C1V1嵌合蛋白，其中所述蛋白包含具有至少第一和第二由ChR1的第一和第二跨膜螺旋替代的跨膜螺旋的VChR1的氨基酸序列；响应于光；并且当细胞用光照射时能够介导细胞中的去极化电流。在一些实施方案中，所述C1V1蛋白可进一步包含在嵌合光响应蛋白的第二与第三跨膜螺旋之间定位的细胞内环结构域内的置换，其中细胞内环结构域的至少一部分是由来自ChR1的相应部分替代。在另一实施方案中，C1V1嵌合蛋白的细胞内环结构域的部分可用来自ChR1的延伸至ChR1的氨基酸残基A145的相应部分替代。在其他实施方案中，C1V1嵌合蛋白可进一步包含在嵌合光响应蛋白的第三跨膜螺旋内的置换，其中第三跨膜螺旋的至少一部分是由来自ChR1的相应部分替代。在又一实施方案中，C1V1嵌合蛋白的细胞内环结构域的部分可用来自ChR1的延伸至ChR1的氨基酸残基W163的相应部分替代。在其他实施方案中，C1V1嵌合蛋白可包含与SEQIDNO:11中所示的序列至少75％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的氨基酸序列。

在一些实施方案中，当细胞用绿光照射时，C1V1蛋白可介导细胞中的去极化电流。在其他实施方案中，所述光可具有在约540nm至约560nm之间的波长。在一些实施方案中，所述光可具有约542nm的波长。在一些实施方案中，C1V1嵌合蛋白当细胞用紫光照射时不能够介导细胞中的去极化电流。在一些实施方案中，嵌合蛋白当细胞用具有约405nm的波长的光照射时不能够介导细胞中的去极化电流。另外，在一些实施方案中，具有约100Hz时间频率的光脉冲可用于激活C1V1蛋白。

在一些情况下，C1V1多肽包含膜运输信号和/或ER输出信号。在一些实施方案中，运输信号可来源于人体内向整流钾通道Kir2.1的氨基酸序列。在其他实施方案中，运输信号可包含氨基酸序列KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQIDNO:22)。适用的运输序列可包含与如人体内向整流钾通道Kir2.1的运输序列的氨基酸序列(例如，KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQIDNO:22))具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些情况下，ER输出信号是例如VXXSL(其中X是任何氨基酸)(例如VKESL(SEQIDNO:27)；VLGSL(SEQIDNO:28)；等)；NANSFCYENEVALTSK(SEQIDNO:29)；FXYENE(SEQIDNO:30)(其中X是任何氨基酸)，例如FCYENEV(SEQIDNO:31)；等等。

C1V1变体

在一些方面中，合适的光响应多肽包含取代或突变的氨基酸序列，其中所述突变多肽保留前体C1V1嵌合多肽的特征性光激活性质，但在一些特定方面中还可具有改变的性质。例如，本文所述的突变的光响应C1V1嵌合蛋白可在动物细胞内或动物细胞质膜上展现增加的表达水平；当暴露于不同波长的光(特别是红光)时展现改变的响应性；和/或性状的组合，由此嵌合C1V1多肽具有低去敏、快失活、低紫光激活的性质以实现与其他光响应阳离子通道的最小交联激活，和/或在动物细胞中的强表达。

因此，本文提供C1V1嵌合光响应视蛋白，其可在嵌合多肽的VChR1部分的整个视黄醇结合袋的关键位置处具有特定的氨基酸取代。在一些实施方案中，C1V1蛋白可在SEQIDNO:11的氨基酸残基E122处具有氨基酸取代。在一些实施方案中，C1V1蛋白可在SEQIDNO:11的氨基酸残基E162处具有取代。在其他实施方案中，C1V1蛋白可在SEQIDNO:11的氨基酸残基E162和E122处具有取代。在其他实施方案中，C1V1蛋白可包含与SEQIDNO:12、SEQIDNO:13或SEQIDNO:14中所示的序列至少75％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的氨基酸序列；并且可包括上述氨基酸取代中的一个或多个。

在一些方面中，C1V1-E122突变嵌合蛋白当细胞用光照射时能够介导细胞中的去极化电流。在一些实施方案中，所述光可以是绿光。在其他实施方案中，所述光可具有在约540nm至约560nm之间的波长。在一些实施方案中，光可具有约546nm的波长。在其他实施方案中，C1V1-E122突变嵌合蛋白当细胞用红光照射时可介导细胞中的去极化电流。在一些实施方案中，红光可具有约630nm的波长。在一些实施方案中，C1V1-E122突变嵌合蛋白当细胞用紫光照射时不介导细胞中的去极化电流。在一些实施方案中，嵌合蛋白当细胞用具有约405nm的波长的光照射时不介导细胞中的去极化电流。另外，在一些实施方案中，具有约100Hz时间频率的光脉冲可用于激活C1V1-E122突变嵌合蛋白。在一些实施方案中，用具有约100Hz时间频率的光脉冲激活C1V1-E122突变嵌合蛋白可引起表达C1V1-E122突变嵌合蛋白的神经元的去极化。

在其他方面中，C1V1-E162突变嵌合蛋白当细胞用光照射时能够介导细胞中的去极化电流。在一些实施方案中，所述光可以是绿光。在其他实施方案中，所述光可具有在约535nm至约540nm之间的波长。在一些实施方案中，光可具有约542nm的波长。在其他实施方案中，光可具有约530nm的波长。在一些实施方案中，C1V1-E162突变嵌合蛋白当细胞用紫光照射时不介导细胞中的去极化电流。在一些实施方案中，嵌合蛋白当细胞用具有约405nm的波长的光照射时不介导细胞中的去极化电流。另外，在一些实施方案中，具有约100Hz时间频率的光脉冲可用于激活C1V1-E162突变嵌合蛋白。在一些实施方案中，用具有100Hz频率的光脉冲激活C1V1-E162突变嵌合蛋白可引起表达C1V1-E162突变嵌合蛋白的神经元的去极化诱发的突触耗尽。

在其他方面中，C1V1-E122/E162突变嵌合蛋白当细胞用光照射时能够介导细胞中的去极化电流。在一些实施方案中，所述光可以是绿光。在其他实施方案中，所述光可具有在约540nm至约560nm之间的波长。在一些实施方案中，光可具有约546nm的波长。在一些实施方案中，C1V1-E122/E162突变嵌合蛋白当细胞用紫光照射时不介导细胞中的去极化电流。在一些实施方案中，嵌合蛋白当细胞用具有约405nm的波长的光照射时不介导细胞中的去极化电流。在一些实施方案中，C1V1-E122/E162突变嵌合蛋白当暴露于紫光时相对于缺少在E122/E162处的突变的C1V1嵌合蛋白或相对于其他光响应阳离子通道蛋白可展现较少的激活。另外，在一些实施方案中，具有约100Hz时间频率的光脉冲可用于激活C1V1-E122/E162突变嵌合蛋白。在一些实施方案中，用具有100Hz频率的光脉冲激活C1V1-E122/E162突变嵌合蛋白可引起表达C1V1-E122/E162突变嵌合蛋白的神经元的去极化诱发的突触耗尽。

在一些情况下，C1V1变体多肽包含膜运输信号和/或ER输出信号。在一些实施方案中，运输信号可来源于人体内向整流钾通道Kir2.1的氨基酸序列。在其他实施方案中，运输信号可包含氨基酸序列KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQIDNO:22)。适用的运输序列可包含与如人体内向整流钾通道Kir2.1的运输序列的氨基酸序列(例如，KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQIDNO:22))具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些情况下，ER输出信号是例如VXXSL(其中X是任何氨基酸)(例如VKESL(SEQIDNO:27)；VLGSL(SEQIDNO:28)；等)；NANSFCYENEVALTSK(SEQIDNO:29)；FXYENE(SEQIDNO:30)(其中X是任何氨基酸)，例如FCYENEV(SEQIDNO:31)；等等。

团藻光激活多肽

在一些实施方案中，合适的光响应多肽是来源于团藻的阳离子通道(VChR1)并且通过用约500nm至约600nm，例如约525nm至约550nm，例如545nm波长的光照射来激活。在一些实施方案中，光响应离子通道蛋白可包含与SEQIDNO:19中所示的序列至少75％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的氨基酸序列。另外，光响应离子通道蛋白可包含取代、缺失和/或引入天然氨基酸序列中的插入以增加或减小对光的敏感度、增加或减小对具体波长的光的敏感度和/或增强或减弱光响应离子通道蛋白调节细胞质膜的偏振态的能力。另外，光响应离子通道蛋白可含有一个或多个保守的氨基酸取代和/或一个或多个非保守的氨基酸取代。包含取代、缺失和/或引入天然氨基酸序列中的插入的光响应离子通道蛋白适当地保留响应于光来转运离子穿过神经元细胞的质膜的能力。

在一些情况下，光响应阳离子通道蛋白可包含与SEQIDNO:19中所示的序列至少75％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的核心氨基酸序列及至少一个(如一个、两个、三个或更多个)增强向哺乳动物细胞的质膜转运的选自由以下组成的组的氨基酸序列基元：信号肽、ER输出信号及膜运输信号。在一些实施方案中，光响应质子离子通道包含N末端信号肽和C末端ER输出信号。在一些实施方案中，光响应离子通道蛋白包含N末端信号肽和C末端运输信号。在一些实施方案中，光响应离子通道蛋白包含N末端信号肽、C末端ER输出信号及C末端运输信号。在一些实施方案中，光响应离子通道蛋白包含C末端ER输出信号和C末端运输信号。在一些实施方案中，C末端ER输出信号与C末端运输信号是通过接头连接的。所述接头在长度上可包含约5、10、20、30、40、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、400或500个氨基酸中的任一个。接头可进一步包含荧光蛋白，例如但不限于黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白、绿色荧光蛋白或青色荧光蛋白。在一些实施方案中，ER输出信号比运输信号更靠近C末端地定位。在一些实施方案中，运输信号比ER输出信号更靠近C末端地定位。

在一些实施方案中，运输信号可来源于人体内向整流钾通道Kir2.1的氨基酸序列。在其他实施方案中，运输信号可包含氨基酸序列KSRITSEGEYIPLDQ1DINV(SEQIDNO:22)。适用的运输序列可包含与如人体内向整流钾通道Kir2.1的运输序列的氨基酸序列(例如，KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQIDNO:22))具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些情况下，ER输出信号是例如VXXSL(其中X是任何氨基酸)(例如VKESL(SEQIDNO:27)；VLGSL(SEQIDNO:28)；等)；NANSFCYENEVALTSK(SEQIDNO:29)；FXYENE(SEQIDNO:30)(其中X是任何氨基酸)，例如FCYENEV(SEQIDNO:31)；等等。

本文还提供编码本文所述的光响应通道蛋白中的任一种的分离的多核苷酸，如包含与SEQIDNO:19中所示的序列至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的核心氨基酸序列的光响应离子通道蛋白。本文还提供包含编码本文所述的蛋白的多核苷酸的表达载体(如本文所述的病毒载体)，如包含与SEQIDNO:19中所示的序列至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的核心氨基酸序列的光响应通道蛋白。

基于VChR1的阶跃函数视蛋白和稳定的阶跃函数视蛋白

在其他实施方案中，光响应多肽是基于VChR1的SFO或SSFO。在一些实施方案中，SFO蛋白可具有在SEQIDNO:19的氨基酸残基C123处的突变。在其他实施方案中，SFO蛋白具有在SEQIDNO:19中的C123A突变。在其他实施方案中，SFO蛋白具有在SEQIDNO:19中的C123S突变。在另一实施方案中，SFO蛋白具有在SEQIDNO:19中的C123T突变。在一些实施方案中，SFO蛋白可包含与SEQIDNO:20中所示的序列至少75％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的氨基酸序列，并且在氨基酸123处包含丙氨酸、丝氨酸或苏氨酸。

在一些实施方案中，SFO蛋白可具有在SEQIDNO:19的氨基酸残基D151处的突变。在其他实施方案中，SFO蛋白可具有在SEQIDNO:19的氨基酸残基C123和D151处的突变。在一个实施方案中，SFO蛋白具有在SEQIDNO:19中的C123S和D151A突变。在另一实施方案中，SSFO蛋白可包含与SEQIDNO:21中所示的序列至少75％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的氨基酸序列；并且在氨基酸122处包含丙氨酸、丝氨酸或苏氨酸；或在氨基酸151处包含丙氨酸。

在一些实施方案中，本文所提供的SFO或SSFO蛋白当细胞用蓝光照射时能够介导细胞中的去极化电流。在其他实施方案中，所述光可具有约560nm的波长。另外，在一些实施方案中，所述光可作为单脉冲的光或作为间隔脉冲的光递送，这是由于SFO和SSFO光电流的延长稳定性。在一些实施方案中，用单脉冲或间隔脉冲的光激活SFO或SSFO蛋白可引起表达SFO或SSFO蛋白的神经元的去极化。在一些实施方案中，所公开的阶跃函数视蛋白和稳定的阶跃函数视蛋白各自可具有用于响应于光来去极化神经元细胞膜的特定性质和特征。

在一些情况下，基于VChR1的SFO或SSFO包含膜运输信号和/或ER输出信号。在一些实施方案中，运输信号可来源于人体内向整流钾通道Kir2.1的氨基酸序列。在其他实施方案中，运输信号可包含氨基酸序列KSRITSEGEY1PLDQIDINV(SEQIDNO:22)。适用的运输序列可包含与如人体内向整流钾通道Kir2.1的运输序列的氨基酸序列(例如，KSRITSEGEYIPLDQ1DINV(SEQIDNO:22))具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些情况下，ER输出信号是例如VXXSL(其中X是任何氨基酸)(例如VKESL(SEQIDNO:27)；VLGSL(SEQIDNO:28)；等)；NANSFCYENEVALTSK(SEQIDNO:29)；FXYENE(SEQIDNO:30)(其中X是任何氨基酸)，例如FCYENEV(SEQIDNO:31)；等等。

筛选方法

本公开提供鉴别适用于控制疼痛的试剂的方法。

鉴别减轻疼痛的试剂的方法

在一些情况下，本发明方法涉及：a)将本公开的非人动物(例如，非人哺乳动物，如大鼠或小鼠)与测试试剂接触，其中所述非人动物在初级传入神经元如伤害感受器中表达去极化的光激活多肽；及b)当所述去极化的光激活多肽用光照射(激活)时，如果有的话，测定测试试剂对疼痛的作用。与在测试试剂不存在下通过去极化的光激活多肽的光激活诱发的疼痛水平相比，测试试剂在非人动物中减轻疼痛，表明所述测试试剂是用于控制(减轻)疼痛的候选试剂。在一些情况下，所述非人动物是如上所述本发明的非人动物模型。

例如，减轻疼痛至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％或大于25％(例如，25％至50％；50％至75％；等)的测试试剂被认为是用于减轻疼痛的候选试剂。

如本文所用，术语“测定(determining)”是指定量和定性测定两者，且因而，术语“测定(determining)”在本文中与“测定(assaying)”、“测量(measuring)”等等可互换地使用。

术语“候选试剂”、“测试试剂”、“试剂”、“物质”和“化合物”在本文中可互换地使用。候选试剂包括许多化学品类别，通常是合成、半合成或天然存在的无机或有机分子。候选试剂包括见于合成或天然化合物的大型库中的那些试剂。例如，合成化合物库可从MaybridgeChemicalCo.(Trevillet,Cornwall,UK)、ComGenex(SouthSanFrancisco,CA)及MicroSource(NewMilford,CT)商购获得。稀有化学品库可从Aldrich(Milwaukee,Wis.)获得并且也可使用。或者，以细菌、真菌、植物及动物提取物形式的天然化合物库可从PanLabs(Bothell,WA)获得或可易于生产。

候选试剂可以是具有大于50道尔顿且小于约2,500道尔顿的分子量的小有机或无机化合物。候选试剂可包含与蛋白的结构相互作用所必需的官能团，例如氢键，并且可包括至少一个胺、羰基、羟基或羧基，且可含有至少两个化学官能团。候选试剂可包含被一个或多个以上官能团取代的环状碳或杂环结构和/或芳族或多环芳族结构。候选试剂还见于生物分子中，包括肽、糖类、脂肪酸、类固醇、嘌呤、嘧啶及其衍生物、结构类似物或组合。

本公开的测定包括对照，其中合适的对照包括在伤害感受器中表达去极化的光响应多肽的非人动物模型，所述模型已暴露于激活光，但没有施用测试试剂。

测试试剂是否减轻非人动物中的疼痛可使用本领域中已知的多种测定中的任一种来确定。例如，可使用通过一个或多个行为如缩回、舔、不动及发声来测量疼痛的测试。合适的测试包括例如：a)福尔马林测定；b)vonFrey测试；c)热测定，如尾巴缩回测定、热板测定、甩尾测试(Rao等人(1996)Neuropharmacol.35:393)；d)Hargreaves测定；等等。参见，例如Mogil等人(2001)MethodsinPainResearch,FrontiersinNeuroscience；及Carter和Shieh(2010)Nociception:GuidetoResearchTechniquesinNeuroscience,Burlington,MA,AcademicPress,第51-52页；及Bannon和Malmberg(2007)CurrentProtocolsinNeuroscience,WileyOnlineLibrary。合适的测试包括在实施例中描述的那些。

鉴别增加产生疼痛反应所需的最小光强度的试剂的方法

本公开提供一种鉴别减轻疼痛的试剂的方法，所述方法包括：a)将本公开的非人动物(例如，非人哺乳动物，如大鼠或小鼠)与测试试剂接触，其中所述非人动物在初级传入神经元如伤害感受器中表达去极化的光激活多肽；及b)在施用测试试剂之后，如果有的话，测定测试试剂对诱发疼痛所需的最少光量的作用。

增加诱发疼痛所需的光量的测试试剂是用于减轻疼痛的候选试剂。例如，增加诱发疼痛所需的光量(以mW/mm²表示)至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少50％、至少75％、至少100％(或2倍)、至少2.5倍、至少5倍、至少10倍或大于10倍的测试试剂被认为是用于减轻疼痛的候选试剂。

例如，如果在非人动物中产生疼痛反应所需的最小光强度是0.5mW/mm²，并且所述测试试剂增加诱发疼痛所需的最少光量至0.75mW/mm²，那么所述测试试剂将被认为是用于减轻疼痛的候选试剂。

本公开的测定包括对照，其中合适的对照包括在伤害感受器中表达去极化的光响应多肽的非人动物模型，所述模型已暴露于激活光，但没有施用测试试剂。在一些情况下，对照是已经施用了已知不影响疼痛的试剂的非人动物模型。

测试试剂是否增加诱发非人动物中的疼痛反应所需的最少光量可使用本领域中已知的多种测定中的任一种来确定。例如，可使用通过一个或多个行为如缩回、舔、不动及发声来测量疼痛的测试。合适的测试包括例如：a)福尔马林测定；b)vonFrey测试；c)热测定，如尾巴抽出测定、热板测定、甩尾测试(Rao等人(1996)Neuropharmacol.35:393)；d)Hargreaves测定；等等。参见，例如Mogil等人(2001)MethodsinPainResearch,FrontiersinNeuroscience；及Carter和Shieh(2010)Nociception:GuidetoResearchTechniquesinNeuroscience,Burlington,MA,AcademicPress,第51-52页；及Bannon和Malmberg(2007)CurrentProtocolsinNeuroscience,WileyOnlineLibrary。合适的测试包括在实施例中描述的那些。

实施例

进行以下实施例以便为本领域普通技术人员提供关于如何制备和使用本发明的完整公开和描述，并且不旨在仅仅是示例性的方法和组合物且不意图限制本发明的范围。已经努力确保所用数值(例如，量、温度等)的精确性，但是应说明某些实验误差和偏差。除非另外指出，份是重量份，分子量是重量平均分子量，温度是摄氏温度，且压力为大气压或接近大气压。可使用标准缩写，例如，bp，碱基对；kb，千碱基；pl，皮升；s或sec，秒；min，分钟；h或hr，小时；aa，氨基酸；kb，千碱基；bp，碱基对；nt，核苷酸；i.m.，肌内；i.p.，腹膜内；s.c.，皮下；等等。

实施例1：疼痛的双向控制

在此显示光遗传学(optogenetics)可用于双向控制正常和病理状态中的急性疼痛。使用可修改的且临床上相关的基因转导策略。使用腺相关病毒血清型6(AAV6)。AAV6具有许多有吸引力的特征；其已在非人的灵长类动物中用于基因递送，并且是将来用于人临床试验中的首要候选¹⁵。其还能够逆向转运，并且可经由神经内递送特异性地转导伤害感受器，从而去除对危险的背根神经节注射的需要。

材料和方法

动物测试受试者和实验

所有手术和行为过程都得到了StanfordUniversityAdministrativePanelonLabAnimalCare的批准。将雌性C57BL/6小鼠(1-4个月大)圈养成5组，12:12光照:黑暗循环。不限量供应食物和水。

AAV6-hSyn-ChR2(H134R)-eYFP和AAV6-hSyn-eNpHR3.0-eYFP的神经内注射

将小鼠用2-2.5％异氟烷麻醉，置于维持在37℃下的加热板上，并且允许达到麻醉的稳定平面，经由检查呼吸频率和捏脚趾试验对其定期复查。使用电动剃刀双侧或单侧地(这取决于注射)将股骨的毛剃掉。使用脱毛膏(Nair)从切口部位除去任何剩余的毛发。然后交替敷用乙醇和优碘(Betadine)溶液对切口部位灭菌，并且将小鼠腿捆扎在手术台上。注射100μl1mg/ml的力莫敌(Rimadyl)。然后使用灭菌钳和弹簧剪在紧邻股骨上方制造一个2cm切口。鉴别臀浅肌和股二头肌并且切开它们之间的结缔组织以暴露坐骨神经腔。牵引器被用于保持所述腔开放并且允许到达神经的畅通途径。使用钝性显微操作器和弹簧剪从下面的筋膜小心地剥离神经。将100μl的0.25％丁哌卡因注射到切口部位中以同时防止神经变干并且诱发局部麻醉。将35G倾斜针(Nanofil#NP35BV-2,WorldPrecisionInstruments)小心地插入神经中，并且使用连接到HarvardPHD注射器泵(HarvardApparatus)的25μl注射器(HamiltonCompany)以1μl/min注射2.5-4μl病毒溶液。当可能时，将2次单独的注射给予坐骨神经的腓总神经和胫骨分支，以确保神经被均匀地填充。ChR2注射小鼠接受3×10¹⁰vg(来自UNCVectorCore)，而NpHR注射小鼠接受1×10¹¹vg或3×10¹¹vg(分别来自UNCVectorCore和Yirovek)。取决于小鼠，这些操作是单侧或双侧进行。然后使用5-0缝线将切口缝合。

表达视蛋白的DRG神经元的分离、培养和电生理学

DRG的分离

背根神经节(DRG)切除、培养及电生理学操作主要是基于先前所报道的方案²³。在神经内注射之后三至四周，将小鼠用异氟烷5％深深地麻醉并且将背部的毛剃掉。然后用4℃无菌磷酸盐缓冲盐水灌注小鼠。快速地进行以下分离步骤，并且在灌注之后5分钟完成。在将背部的皮肤去除之后，使用无菌操作，切开沿着脊柱的肌肉并且咬骨钳被用于剥离椎骨表面的任何肌肉或肌腱。咬骨钳被用于断开直接附接到脊髓背侧的脊椎骨，其从脊柱底部开始并且向头部延伸。将脊髓侧面的肌肉剥离直到可以看到坐骨神经分支，并且骨骼在脊髓的侧面断开以暴露神经路径。使用小弹簧剪切割每个神经分支，用钳子向近端拉动直到可以看到背根神经节，并且在DRG的近端切割。然后将DRG置于4℃无菌的MEM-全溶液(最低必需培养基、MEM维生素、抗生素、以及10％胎牛血清)中。从小鼠的每个表达侧切除三个DRG。

DRG培养

将切除的DRG去髓鞘，并且转移到MEM-胶原酶溶液(最低必需培养基、维生素、抗生素、无胎牛血清、0.125％胶原酶)中。将组织在水浴中在37℃下培养45分钟，然后在2.5mlTripleEExpress(Invitrogen)中研磨。将胰蛋白酶用2.5mlMEM-全溶液淬灭，所述溶液含有80ug/mlDNaseI、100μg/ml来自鸡蛋白的胰蛋白酶抑制剂及2.5mg/mlMgSO₄。将细胞离心，并且以500,000个细胞/ml的细胞密度再悬浮于MEM-全溶液中。将100ul细胞悬液小心地作为气泡置于基质胶涂覆的盖玻片上，然后在37℃、3％CO₂、90％湿度下培养。初始培养之后两小时，将培养的神经元用1mlMEM-全溶液浸没。将细胞在视需要更换新鲜培养基的培养物中维持2-7天直到进行电生理学。

电生理学

SpectraX光引擎(Lumencor)或DG4氙灯(SutterInstruments)被用于鉴别荧光蛋白表达并且递送光脉冲用于视蛋白激活。475/28滤光器被用于将蓝光施加于ChR2，且586/20滤光器被用于将黄光施加于NpHR。穿过显微镜物镜的光功率密度是用功率计(ThorLabs)测量。全细胞记录是由用水平拔出器(P-2000，SutterInstruments)从硼硅酸盐玻璃毛细管(SutterInstruments)拖拉的膜片吸量管(4-6MΩ)获得。外部记录溶液含有(以mM为单位)：125NaCl、2KCl、2CaCl₂、2MgCl₂、30葡萄糖、25HEPES、以及必要时1μM河豚毒素以消除逃脱峰值便于峰值光电流测量。内部记录溶液含有(以mM为单位)：130K-葡糖酸盐、10mMKCl、10HEPES、10EGTA、2MgCl₂。使用MultiClamp700B放大器(MolecularDevices)进行记录，并且pClamp10.3软件(MolecularDevices)被用于记录和分析数据。使用贝塞耳滤波器在4kHz下过滤信号并且用Digidata1440A模拟数字接口(MolecularDevices)在10kHz下数字化。以电压钳模式从1s光脉冲起测量峰值和稳态光电流，其中细胞保持在-50mV下。仔细地监测串联电阻并且如果串联电阻显著地变化(>20％)或达到20MΩ，那么不使用记录。

光测量的潜伏期

实验方案：

在神经内注射之后大约1至5周，将小鼠置于具有薄的、透明塑料地板的塑料围笼中并且在测试之前允许其习惯于测试装置30分钟。连接至激光(OEM激光系统，473nm，1mW/mm²)的多模光纤(ThorLabs,#AFS105/125Y)被引向足垫穿过地板。为了开始试验，需要动物：(1)是苏醒的，(2)所有四个爪子都在地板上，以及(3)处于静止状态，不准备行走。从足垫被照射时到爪缩回时来计算潜伏期。为了避免实验偏差，未将主观标准应用于终点用于潜伏期计算，即正常活动也被认为是试验的结束。设定1分钟的最大潜伏期以确保数据收集的实用性。单独的试验相隔至少2分钟，且每只小鼠具有五次试验，将其平均起来。视频记录所有试验，每秒30帧，并且通过收集后的视频分析计算潜伏期。

统计学

单向ANOVA被用于分析在周1-5中响应于蓝光的ChR2+小鼠潜伏期相比对于黄光的ChR2+小鼠反应的变化。Dunnett’s事后多重比较检验被用于判定哪个潜伏期显著地不同于黄光对照。作用大小是使用g_ψ来计算，g_ψ是针对多个组的Hedges’g的扩展²⁴。

位置厌恶

2个室位置厌恶设置的构建

用连接两个10cm×12cm室的入口通道构造2个室位置设置。每个室的地板(一个红色，另一个蓝色)用10×12阵列的发光二极管(蓝色LED：475nm，红色LED：625nm,Cree)照射并且用镜面引导以使得光功率密度在每个室内是相等的(0.15mW/mm²)。

实验方案

在测试之前允许一个小鼠探索2个室设置持续10分钟，其中关闭LED阵列地板。然后，使用摄像机记录小鼠位置并且使用BIOBSERYEViewer来分析²。在光切断时记录小鼠位置持续10分钟，然后接通光，并且进一步记录位置30分钟。

统计学

双侧配对Student’st检验被用于检查在‘光切断’和‘光接通’条件之间小鼠位置偏好的变化是否在统计上是显著的。然后针对每个ChR2+和NpHR+小鼠计算两种条件之间的变化百分比。随后对于异方差群使用双侧未配对Student'st检验比较这些百分比)。使用Hedges’g计算作用大小。

机械缩回阈值的测量

通过vonFrey试验研究机械异常性疼痛。在试验之前，允许小鼠习惯于测试设置1小时。使用上下法^25,26将各种力量的毛发施加于足底持续大约2秒。

以下行为中任一项的出现被认为是缩回反应：(1)爪的快速退缩或缩回，(2)脚趾的伸展，或(3)立即舔爪。如动物在2秒结束之前出于一些其他原因移动爪，那么试验被认为是不明确的并且重复。取决于所用的视蛋白，随后用蓝光(473nm，0.15mW/mm²)或黄光(593nm，0.15mW/mm²)同时照射小鼠的爪。由一个检查者进行vonFrey试验，收集所有数据，其总是不知道测试中的小鼠是具有视蛋白表达抑或不具有。

统计学

使用非参数的双侧Wilcoxon带符号的秩检验测试vonFrey阈值变化的统计显著性。使用Hedges'g计算作用大小。

热缩回潜伏期的测量

修改的Hargreaves足底试验装置被用于测量不同类型照射的热敏度的变化。将标准的Hargreaves试验玻璃板稍微抬起以允许LED环放置在高于红外发射器处。校准LED环以发出0.15mW/mm²的蓝光(475nm，Cree)或黄光(590nm，OSRAMOptoSemiconductors)。为了控制光诱发的混杂，将当小鼠接受打开频谱照射(对于ChR2注射小鼠是蓝光且对于NpHR注射小鼠是黄光)时红外加热的缩回潜伏期与关闭频谱照射相比(反之亦然)。在红外光开始与首次爪缩回之间自动地测量缩回潜伏期。红外辐射强度在所有试验中保持恒定，并且试验者总是不知道测试中的小鼠是具有视蛋白表达抑或不具有。

统计学

使用双侧配对Student'st检验比较频谱关闭与频谱打开照射之间的热缩回潜伏期的变化。使用Hedges’g计算作用大小。

慢性缩窄性损伤

此处所用的慢性缩窄性损伤模型是从现有的方案改编而来²⁷。用异氟烷使动物麻醉并且以类似于用于神经内注射的坐骨神经暴露的方式单侧暴露坐骨神经。一个7-0prolene双结绷带绑绕在神经周围以使得绷带恰巧能沿着神经滑动，并且缝线的自由端是剪短的。非可吸收的5-0缝线被用于闭合伤口。为了促进神经性疼痛的发展，没有施用术后止痛药。

免疫组织化学、成像及转导的量化

免疫组织化学

用100μlBeuthanasia-D对小鼠施以无痛致死，并且用10ml4℃磷酸盐缓冲盐水(1XPBS)和10ml4％多聚甲醛(PFA)经心灌注。咬骨钳、弹簧剪和镊子被用于从小鼠仔细地一起去除坐骨神经、相关背根神经节和脊髓。单独去除足。将所有组织置于4％PFA中过夜，储存在4℃下。此后，将样品转移到30％蔗糖(在1XPBS中)中并且储存不同长度的时间(最短1天)。随后在显微镜引导下对样品进行解剖，并且在Tissue-TekO.C.T中单独冷冻。使用低温恒温器(LeicaCM3050S)以20μm厚度切割样品，并且固定在载玻片上。在1XPBS中冲洗所有样品3×10min，以便除去任何残余的OCT。对于除髓磷脂外的所有靶标，接着将样品在溶于1XPBS中的0.3％Triton-X100、2％正常驴血清(NDS)中阻断1小时。将样品与溶于1XPBS中的含有0.3％Triton-X100、5％NDS的一级抗体溶液培养过夜，。次日，用1XPBS冲洗样品3×10min，然后与溶于1XPBS中的二级抗体溶液培养1小时。接着在1XPBS中冲洗样品3×10min，并且用PVADABCO盖片。所用的一级抗体是大鼠抗P物质(1:500，#556312，BDPharmingen)、生物素-1B4(1:50，#B-1205，VectorLaboratories)、兔抗生长激素抑制素受体2(1:250，#ab134152，Abcam)及兔抗VRl(对于TRPV1，1:500，#ab31895，Abcam)。所用的二级抗体是Cy5驴抗兔(1:500，#711-175-152，JacksonLaboratories)、Cy3驴抗大鼠(1:500，#711-165-152，JacksonLaboratories)及抗生蛋白链菌素-德克萨斯红(3:100，#SA-5006，VectorLaboratories)。对于髓磷脂，使用溶于1XPBS中的0.2％Triton-X100将样品透化1小时。接着将样品与氟髓磷脂红(1:300，#F34652，MolecularProbes)培养20min。此后，在1XPBS中冲洗样品3×10min，并且用PVADABCO盖片。

共焦成像

使用LeicaTCSSP5激光扫描共焦显微镜，使用20X油浸物镜对样品成像，并且使用LeicaLASAF软件进行分析。随后使用Fiji²⁸处理图像，Fiji被用于将z叠置合在一起，平衡图像亮度和对比度，并且考虑到色盲而变更色彩。

量化

就与P物质、TRPV1、生长激素抑制素及1B4的共表达对来自用AAV6-ChR2注射的3只不同小鼠的DRG进行检查，并且就与髓磷脂的共表达对来自3只不同小鼠的神经样品进行检查。对于每个标记，对YFP阳性的标记-表达神经元/轴突的百分比及对给定标记呈阳性的YFP阳性神经元/轴突的百分比进行量化。

结果

将AAV6-hSyn-ChR2(H134R)-eYFP注射到小鼠的坐骨神经中(图1a)。注射之后二至四周，来自背根神经节中分离的ChR2阳性神经元的电生理学记录显示ChR2是功能性的，并且当用1mW/mm²475nm光在5-10Hz下刺激时表达细胞可引发动作电位(图1b；图6)。另外，在整个神经元中表达ChR2，终止于脊髓背角的中央突，其中在更深的髓板中或在上行脊柱中几乎见不到表达，表明转导神经元是投射到雷克斯髓板(Rexed'slamina)I/I1的伤害感受器(图1c)。免疫组织化学展示在ChR2表达与伤害感受性标记(如IB4、P物质、TRPV1及生长激素抑制素)之间的相当多的重叠。在ChR2与髓磷脂之间没有观察到重叠，表明在坐骨神经中没有转导本体感受器；反而，表达被限制在无髓伤害感受器(推定的C-纤维)(表I，提供于图9中)。此外，转导的背根神经节神经元在直径上比未转导的神经元要小(图6)，与关于C-纤维尺寸的早先组织证据一致¹⁷。

检查这些转导的伤害感受器的光遗传激活的行为作用。允许小鼠自由地探索具有透明地板的室。习惯之后，在注射ChR2的小鼠的足底后爪上展示蓝光(1mW/mm²)，目的是为了光遗传地激活皮肤中的伤害感受器神经末梢，并且观察到特征性疼痛样行为(图2a)。响应于蓝光，小鼠退缩，开始长时间的舔足或发声：与疼痛有关的可控行为¹⁸。为了量化此作用，测量光开启与任何爪缩回之间的时间，不管这类缩回是归因于疼痛抑或正常的探索行为。在注射之后2周，此潜伏期显著地缩短(P＝0.034，作用大小：2.10)，并且在此后3周保持较短(周3：P＝0.027，作用大小＝2.17；周4：P＝0.026，作用大小＝2.19)，与从注射YFP的小鼠和接受频谱关闭的黄光照射的注射ChR2的小鼠记录的潜伏期相比(图2b)。在注射之后5周，潜伏期延长，可能是由于在一些测试小鼠中转基因表达的关闭，如先前在小鼠中用AAV6所报道的¹⁹。尽管刺激是完全经皮的，但注射ChR2的小鼠是光敏的，响应于低强度的蓝光(1mW/mm²)在几百毫秒内缩回。较低水平的照射展示作用的进行性减小，而照射强度增加超过1mW/mm²不会导致潜伏期任何另外的缩短(图2c)。

为了测试疼痛的光遗传诱发是否是可调的，想要知道并没有证明立即厌恶的较低强度的照射(0.25mW/mm²)是否将引起更敏锐的作用。构建位置厌恶装置，其中每个室的地板用发出频谱关闭(红，625nm)或频谱打开(蓝，475nm)的光的LED阵列照射(图2d)。注射ChR2的小鼠当探索蓝光室时不展示疼痛的任何外在体征，并且不舔足或对光畏缩，但对红光室展示80-20％超过蓝光室的偏好(P＝0.0013，作用大小＝3.11)。注射YFP的小鼠没有展示显著的偏好(图2e，f)。这种厌恶可能是由低水平的疼痛引起，所述疼痛水平没有达到诱发反射性缩回的水平，但仍引起可控行为的变化。

据推论，这种低水平的光遗传刺激还可起作用以使注射ChR2的小鼠对其他无害刺激敏化。为了证明这点，进行了机械缩回阈值的vonFrey试验和热缩回潜伏期的Hargreaves试验，但用低强度的蓝光同时照射相关爪(0.15mW/mm²，图3a，b)。虽然这种照射不足以诱发直接的厌恶(图2c)，但其显著地降低了vonFrey阈值(图3b)50％(P＝0.027，作用大小＝0.904)并且降低了Hargreaves潜伏期(图3f，g)55％(P＝0.00038，作用大小＝2.77)。这种敏化可通过在伤害感受器游离神经末梢中诱导的亚阈值去极化出现，其可致使它们对另外的无害刺激更敏感。野生型小鼠在照射与非照射试验之间没有展示在行为上的显著差异。

为了补充光遗传诱发疼痛的能力，开发了在伤害感受器中光遗传地抑制动作电位产生的方法。这种抑制可具有很大的治疗价值，并且对动作电位产生提供一种类型的用药理学或电刺激不可能实现的空间和时间限制控制。

在坐骨神经中用AAV6-hSyn-eNpHR3.0-eYFP注射小鼠；并且观察到与ChR2结果类似的转导概况(图7)。分离培养的NpHR阳性DRG神经元的电生理学记录显示响应于足以阻断动作电位起始的恒定的黄光照射的强烈超极化(图3c；图8)。

使用发出黄(593nm)光的类似修改的vonFrey和Hargreaves装置对注射NpHR的小鼠进行测试。注射NpHR的小鼠当用1.1-1.7mW/mm²光照射时，在其vonFrey缩回阈值中具有69％增加(P＝0.0043，作用大小＝0.802)(图3d,e)。低强度的黄光(0.15mW/mm²)足以使Hargreaves缩回潜伏期延长97％(P＝0.00019，作用大小＝2.05)。野生型小鼠展示一旦用黄光照射在行为上没有显著变化。

最终，光遗传抑制伤害感受的能力是否在治疗上是相关的是通过在神经性疼痛的动物模型中的测试来确定。对注射NpHR的小鼠进行基线vonFrey和Hargreaves试验，重复初始的发现：黄光使小鼠对机械和热刺激脱敏(图4a，4b)。制造慢性缩窄性损伤²⁰以在这些小鼠中诱发神经性疼痛的症状。如所预期，小鼠在损伤之后展示热和机械的异常性疼痛。接着用黄光照射小鼠，同时进行vonFrey和Hargreaves试验。观察到，光遗传抑制可逆转机械异常性疼痛，将vonFrey阈值从预先损伤的36增加到94％，非照射水平(P＝0.0020，作用大小＝0.920，图4a)。类似地，光遗传抑制还逆转注射NpHR的小鼠中的热痛觉过敏，将Hargreaves缩回潜伏期从正常的55％延长到128％，非照射水平(P＝0.012，作用大小＝1.91，图4b)。在两种情况中，注射YFP的对照在照射下没有显示显著变化，在慢性缩窄性损伤之前和之后都是如此。

因此，数据显示视蛋白可通过相对简单的注射操作在伤害感受器中以高特异性表达，而不需要转基因。此外，观察到足够强烈的视蛋白表达和运输以通过非侵袭性经皮照射实现稳固的行为作用。据信这是归因于视蛋白在真皮和皮下游离神经末梢中的表达，其可用最小的光衰减照射。有趣的是，光遗传照射对机械和热阈值的作用即使当此照射具有低强度时也能观察到。这可能是由于游离神经末梢的静息电位和基线兴奋性，从而可允许相对较小的光诱发的膜电流以便仍影响下游神经递质释放。在3周时间内观察到光遗传作用，从AAV6注射之后第2周至第5周。

此处报道的光遗传能力可被寻求干扰伤害感受功能的非侵袭方式的科学家们广泛使用。具体说来，因为视蛋白表达对无髓伤害感受器有特异性，所以光遗传可用于认识伤害感受器活性在神经性疼痛的发生中的作用，通过长期的双向光遗传对照。寻求更大特异性且不希望针对每个单独的视蛋白发展定制的转基因小鼠的研究人员改为使用和许多不同伤害感受器特异性Cre系中的任一种一致的Cre依赖性DIO-AAV6²²，以便实现限于伤害感受器子群的视蛋白表达。非侵袭性、经皮光遗传抑制可用作疼痛，例如顽固性长期疼痛的治疗。

图1：投向脊髓板层I的rAAY2/6-hSyn-ChR2(H134R)-eYFP转导的无髓伤害感受器的坐骨内注射。a)注射示意图，b)离解的ChR2+DRG神经元的电生理学。代表性全细胞电流钳记录展示响应于475nm光(5Hz，1mW/mm²)的光遗传诱发的动作电位且代表性全细胞电压钳记录响应于光脉冲(1s，475nm，1mW/mm²)。细胞保持在-50mV下。c)在脊髓、DRG、神经及足处的表达概况；ChR2以绿色示出，细胞标记以深红色示出，上覆物以白色示出。ChR2不共位于有髓神经元，而是共位于伤害感受性标记，包括1B4、生长激素抑制素、TRPV1及P物质。

图2：ChR2+小鼠的经皮照射造成可调的疼痛样行为。a)实验示意图，b)在ChR2+小鼠中的感光度的时间相关性(光：1mw/mm²)(n＝4只小鼠)。响应于蓝光的潜伏期显著地低于黄光潜伏期，从注射之后第2周到第4周(单向ANOVA：F(6,21)＝3.98；P＝0.0082；Dunnett’s检验：P(第2周)＝0.034，P(第3周)＝0.027，P(第4周)＝0.026；作用大小(第2周)＝2.10，作用大小(第3周)＝2.17，作用大小(第4周)＝2.19)。在第1周和第5周从YFP+对照和ChR2+小鼠上记录的潜伏期是不显著的(P(第1周)＝0.55，P(第5周)＝0.49，P(YFP+)＝0.99)。c)感光度随蓝光强度的增加而急剧降低直到强度是1mW/mm²，稳定在超过此阈值。d)位置厌恶示意图，e)YFP+小鼠显示对于蓝光区的非显著偏好(在蓝光区花费的时间有19.9％增加，P＝0.06，n＝5)，而ChR2小鼠对蓝光区显著地反感(在蓝光区花费的时间有55.6％减少，作用大小＝3.11，P＝0.0013，n＝5)。插图：这两个百分比变化在统计上彼此不同。(P＝0.00061)f)对于位置厌恶数据的个别迹线。所有分组数据显示为平均值±s.e.m。

图3：对机械和热刺激的蓝光敏化的ChR2表达小鼠和黄光脱敏的NpHR表达小鼠。a)ChR2介导的敏化的示意图(0.15mW/mm²蓝光强度)，b)vonFrey阈值在ChR2+小鼠中减小50％(作用大小＝0.904，P＝0.027，n＝10个爪)，而野生型没有表现出显著变化(P＝0.50，n＝10个爪)。c)i)代表性全细胞电压钳记录显示响应于1s586nm光脉冲在表达NpHR的DRG神经元中的向外光电流(由黄色条形指示)ii)代表性全细胞电流钳记录显示在表达NpHR的DRG神经元中电诱发峰值(400pA电流注入，5ms脉冲宽度)的黄(586nm)光介导的抑制。d)NpHR介导的抑制的示意图(1.1-1.7mW/mm²光强度)e)NpHR+小鼠的vonFrey阈值增加了69％(作用大小＝0.802，P＝0.0043，n＝24个爪)，而野生型小鼠没有表现出显著变化(P＝0.71，n＝20个爪)。f)热阈值的光遗传调节的示意图。蓝光/黄光强度(0.15mW/mm²)。g)在蓝光照射期间在ChR2+小鼠中对红外刺激的缩回潜伏期缩短了55％(作用大小＝2.77，P＝0.00038，n＝7个爪)且在黄光照射期间在NpHR+小鼠中延长了97％(作用大小＝2.05，P＝0.00019，n＝10个爪)(与频谱关闭照射相比)，而野生型潜伏期没有显著变化(P＝0.91，n＝9个爪，对于ChR2+小鼠的对照，P＝0.26，n＝10个爪，对于NpHR+小鼠的对照)。所有分组数据显示为平均值±s.e.m。

图4：NpHR+小鼠逆转的机械异常性疼痛和由慢性缩窄性损伤(CCI)引起的热痛觉过敏的黄光刺激。a)在CCI之前，黄光显著地增加NpHR+小鼠的vonFrey阈值(78％增加，作用大小＝1.43，P＝0.0020，n＝10个爪)，而不是YFP+小鼠(P＝0.41，n＝12个爪)。在CCI之后，所有小鼠的vonFrey阈值显著地减小(NpHR+小鼠，64％减小，作用大小＝1.61，P＝0.0020，n＝10个爪；YFP+小鼠，59％减小，作用大小＝1.03，P＝0.00049，n＝12个爪)。黄光显著地增加NpHR+小鼠的vonFrey阈值至接近CCI前水平(258％增加，作用大小＝0.92，P＝0.0020，n＝10个爪)，但YFP+小鼠的阈值没有显著变化(P＝0.57，n＝12个爪)。b)在CCI之前，黄光显著地增加NpHR+小鼠中对红外刺激的缩回潜伏期(112％增加，作用大小＝3.95，P＝0.00025，n＝7个爪，与频谱关闭照射相比)，而YFP+小鼠没有显示显著变化(P＝0.97，n＝9个爪)。在CCI之后，所有小鼠显示在频谱关闭照射期间对红外刺激的缩回潜伏期的缩短(NpHR+小鼠，45％减小，作用大小＝3.75，P＝0.00077，n＝7个爪；YFP+小鼠，40％减小，作用大小＝2.06，P＝0.0038，n＝9个爪)。黄光显著地延长NpHR+小鼠中的此潜伏期(132％增加，作用大小＝1.91，P＝0.012，n＝7个爪)超过初始CCI前潜伏期，但在YFP+小鼠中没有显著的潜伏期变化(P＝0.53，n＝9个爪)。所有分组数据显示为平均值±s.e.m。

图6：视蛋白转导的大小分布。以下的神经内注射：a)AAV6:ChR2及b)AAV6:NpHR导致对较小直径伤害感受器有特异性的视蛋白转导(n＝205个ChR2+神经元，666个ChR2-神经元，n＝217个NpHR+神经元，355个NpHR-神经元)。AAV6:ChR2转导80％<16μm的神经元，AAV6:NpHR转导75％<16μm的神经元。

图7：在AAV2/6-hSyn-eNpHR3.0-eYFP的坐骨内注射之后观察到的NpHR转导的代表性图像。

图8：来自ChR2+和NpHR+DRG神经元的电生理学记录。a)ChR2+DRG神经元的图像，比例尺25μm。b)样品全细胞电流钳记录显示在ChR2+DRG神经元中由10Hz蓝(475nm)光脉冲串(5ms脉冲宽度)激起的峰值。细胞保持在-50mV下，光功率密度是1mW/mm²。c)响应于1s、475nm蓝光的峰值和稳态光电流的概要图。对平均值±SEM进行绘图，n＝7。d)NpHR+DRG神经元的图像，比例尺25μm。e)样品全细胞电流钳记录显示在NpHR+DRG神经元中黄(586nm)光介导的超极化。细胞保持在-48mV下，光功率密度是1mW/mm²。f)响应于1s、586nm黄光的峰值和稳态光电流的概要图。对平均值±SEM进行绘图，n＝10。

图9呈现表1。视蛋白转导概况的分析。共定位百分比是由来自3个不同的ChR2+和NphR+小鼠各自的DRG分析来计算。生长激素抑制素+、VR1+及IB4+神经元是视蛋白+池的主要组分。

参考文献

1.Dubin，A.E.&Patapoutian，A.ReviewseriesNociceptors：thesensorsofthepainpathway.TheJournalofClinicalInvestigation120，3760-3772(2010).

2.Costigan，M.，Scholz，J.&Woolf，C.J.Neuropathicpain：amaladaptiveresponseofthenervoussystemtodamage.AnnualReviewofNeuroscience32，1-32(2009).

3.Fenno，L.，Yizhar，O.&Deisseroth，K.TheDevelopmentandApplicationofOptogenetics.AnnualReviewofNeuroscience34，389-412(2011).

4.Liske，H.etal.Opticalinhibitionofmotornerveandmuscleactivityinvivo.Muscle&Nerve47，916-921(2013).

5.Llewellyn，M.E.，Thompson，K.R.，Deisseroth，K.&Delp，S.L.Orderlyrecruitmentofmotorunitsunderopticalcontrolinvivo.NatureMedicine16，1161-5(2010).

6.Ji，Z.-G.etal.Light-evokedsomatosensoryperceptionoftransgenicratsthatexpresschannelrhodopsin-2indorsalrootganglioncells.PLOSOne7，e32699(2012).

7.Wang，H.&Zylka，M.J.Mrgprd-expressingpolymodalnociceptiveneuronsinnervatemostknowuclassesofsubstantiagclatinosancurons.TheJournalofNeuroscience：theofficialjournnaloftheSocietyforNeuroscience29，13202-9(2009).

8.Daou，1.etal.Light-inducednociception：Remoteoptogeneticcontrolofperipheralpainpathwaysinfreelymovingmice.SocietyforNeuroscienceConference575.06/1111(2012).

9.Mourot，A.etat.Rapidopticalcontrolofnociceptionwithanion-channelphotoswitch.NatureMethods9，396-402(2012).

10.Kokcl，D.etal.PhotochcmicalactivationofTRPA1channclsinncuronsandanimals.NatureChemicalBiology9，257-263(2013).

11.Mattis，J.etal.Principlesforapplyingoptogenetictoolsderivedfromdirectcomparativeanalysisofmicrobialopsins.NatureMethods9，(2012).

12.Williams，J.C.&Denison，T.Fromoptogenetictechnologiestoneuromodulationtherapies.SeienceTranslationalMedicine5，177ps6(2013).

13.Chow，B.Y.&Boyden，E.s.Optogeneticsandtranslationalmedicine.ScienceTranslationalMedicine5，177ps5(2013).

14.Towne，C.，Schneider，B.L.，Kieran，D.，Redmond，D.E.&Aebischer，P.Efficienttransductionofnon-humanprimatemotorneuronsafterintramusculardeliveryofrecombinantAAVserotype6.GeneTherapy(2009).

15.Asokan，A.，Schaffer，D.V&Samulski，R.J.TheAAVvectortoolkit：poisedattheclinicalcrossroads.MolecuiarTherapy20，699-708(2012).

16.Towne，C.，Pertin，M.，Beggah，A.T.，Aebischer，P.&Decosterd，1.Recombinantadeno-associatedvirusserotype6(rAAV2/6)-mediatedgenetransfertonociceptiveneuronsthroughdifferentroutesofdelivery.MolecularPain5，52(2009).

17.Ruscheweyh，R.，Forsthuber，L.&Schoffnegger，D.ModificationofClassicalNeurochemicalMarkersinldentifiedPrimaryAfferentNeuronsWithAβ-，Aδ-，andC-FibersAfterChronicConstrictionInjuryin.TheJournalofComparativeNeurology336，325-336(2007).

18.Mogil，J.S.Animalmodelsofpain：progressandchallenges.NatureReviewsNeuroscience10，283-294(2009).

19.Mason，M.R.J.etal.ComparisonofAAVserotypesforgenedeliverytodorsalrootganglionneurons.MolecularTherapy：thejourrnaloftheAmericanSocietyofGeneTherapy18，715-24(2010).

20.Bennett，G.J.&Xie，Y.K.Aperipheralmononeuropathyinratthatproducesdisordersofpainsensationlikethoseseeninman.Pain33，87-107(19888).

21.Gao，G.-P.etal.Noveladeno-associatedvirusesfromrhesusmonkeysasvectorsforhumangenetherapy.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica99，11854-9(2002).

22.Sohal，V.S.，Zhang，F.，Yizhar，O.&Deisseroth，K.Parvalbuminneuronsandgammarhythmsenhancecorticalcircuitperformance.Nature459，698-702(2009).

23Gold，M.S.Whole-CellRecordinginIsolatedPrimarySensoryNeurons.PainResearch：MethodsinMolecularBiology851，73-97(2012).

24.Hentschke，H.&Stüttgen，M.C.Computationofmeasuresofeffectsizeforneurosciencedatasets.TheEuropeanJournalofNeuroscience34，1887-94(2011).

25.Chaplan，S.R.，Bach，F.W.，Pogrcl，J.W.，Chung，J，M.&Yaksh，T.L.Quantitativcassessmentoftactileallodyniaintheratpaw.JournalofNeuroscienceMethods53，55-63(1994).

26.Dixon，W.J.EfficicntAnalysisofExperimentalObservations.AnnualReviewofPharmacologyandToxicology20，441-462(1980).

27.Sommer，C.&M.PainfulmononeuropathyinC57BL/WldmicewithdelayedWalleriandegeneration：differentialeffectsofcytokineproductionandnerveregenerationonthermalandmechanicalhypersensitivity.BrainResearch784，154-162

28.Schindelin，J.etal.Fiji：anopen-sourceplatformforbiological-imageanalysis.NatureMethods9，676-82(2012).

实施例2：神经内注射的AAV8选择性转导投向脊髓背侧和深脊髓板层的神经元。

大直径的初级传入神经元负责介导不同的感觉过程，包括压力、振动、愉快的接触及疼痛的接触。在疼痛研究的背景中，已知这些神经元在各种慢性疼痛病症中有明显改变。在这些神经元中的自发(‘异位’)放电被认为是炎性和神经性疼痛发展的主要因素之一，通过其直接地驱动中枢性疼痛途径，或通过改变脊髓回路以诱发中枢敏化。这些传入神经元的光遗传抑制将减轻神经性疼痛的症状。这些传入神经元的光遗传刺激还可作用于减轻一些病状中的疼痛，通过形成‘疼痛闸门(paingate)’的一部分的脊髓中的多级回路过程实现。以下所示数据表明腺相关病毒载体(AAV8)可特异性地感染介导接触感觉的大直径的初级传入神经元。

方法

所有手术和行为过程都得到了StanfordUniversityAdministrativePanelonLabAnimalCare的批准。在麻醉下，暴露C57BL/6小鼠(6-8周龄)的坐骨神经；并且将3-5μl的AAV8-CMV-GFP(1-2E10病毒基因组(vg))注射到暴露的神经中。注射之后2-4周，通过穿心灌注对小鼠施以安乐死。将小鼠解剖并切片，并且对来自脊髓、神经及爪的组织成像。

结果

初级传入神经元成功地被投向腰部脊髓中的深脊髓板层(图10A)的AAV8-CMV-GFP感染。在脊髓的更靠嘴侧区域中，表达主要见于脊柱中的果尔氏束中(图10B)。此表达持续直到脑干。

实施例3：光遗传蛋白向三叉神经节的感觉神经元的递送

神经性疼痛可出现在三叉神经节中并且经常表征为阵发性、刺痛性、触发性，常常是电击样面痛。所述疾病可由感染(例如疱疹病毒)、面部外伤、中风或手术神经损伤引起。在此实施例中的数据证明抑制性视蛋白eNpHR3.0向大鼠的三叉神经节的感觉神经元的递送。在此实施例中呈现的数据表明光遗传可用于控制累及三叉神经节的疼痛。

方法

在麻醉下，将10周龄的SpragueDawley大鼠用1×10¹¹vg的AAV5-hSyn-eNpHR3.0立体定位注射到三叉神经节中。4周以后动物被施以安乐死，并且将三叉神经节解剖、切片并且使用共焦显微镜来成像。

结果

直接注射AAV5-eNpHR3.0-YFP之后四周，观察到抑制性蛋白在三叉神经节的感觉神经元中的强表达。这些结果表明除了脊髓背根神经节的那些之外的初级感觉神经元可以视蛋白靶向并且可被抑制以便控制由这些神经元传送的疼痛。数据还论证了使用直接注射进行视蛋白递送的可行性。数据描绘在图11中。

图11.在直接注射到神经节之后eNpHR3.0在三叉神经节感觉神经元中的的表达。eNpHR3.0被融合至黄色荧光蛋白以便于目视观测(绿色)。神经元用Nissl染色(红色)。所有细胞核都用DAPI标记(蓝色)。

实施例4：在具有早先的神经性疼痛的动物中视蛋白的递送和疼痛的抑制。

以下呈现的数据表明在慢性缩窄性损伤(CCI)和疼痛发展之后，NpHR的AAV6递送可减轻疼痛。

方法

使首次接受实验的C57B16小鼠习惯于VonFrey机械测试过程，然后记录基线机械阈值。小鼠接着经受CCI；神经损伤之后10天，记录机械阈值并且仅将已发展神经性疼痛(如通过25％或更大的机械阈值降低所确定)的那些动物保留在研究中。将在人突触蛋白启动子的控制下表达NpHR或YFP的AAV6(总计5×10¹⁰vg)递送至小鼠的坐骨神经。NpHR或YFP递送之后30天，在黄光施加于靶向爪的存在或不存在下记录机械阈值。

结果

AAV6递送之后30天，注意到向靶向爪施加光显著地将表达NpHR而非YFP的动物中的机械阈值水平提高到CCl前水平。数据示于图12中。

图12.使用AAV6在伤害感受纤维中表达GFP或eNpHR3.0的小鼠的机械阈值。CCI之后的40天，在黄光存在或不存在下记录阈值。在eNpHR3.0组中的动物在光存在下具有显著较高的机械阈值(p<0.05)。YFP组中的机械阈值不变。

这些结果表明此处所述的光遗传方法可应用于具有先前存在的神经性疼痛的神经。

尽管已参考其具体实施方案描述本发明，但是本领域技术人员应理解，在不脱离本发明的实际精神和范围下，可以对本发明进行各种修改且用等价物替换。另外，可以进行很多修改，使特定的情形、材料、物质组成、方法、方法步骤适应本发明的目标、精神和范围。所有这类修改旨在落入所附权利要求的范围内。

Claims

1.一种用于控制个体的疼痛的方法，所述方法包括将包含编码视蛋白多肽的核苷酸序列的核酸引入个体的初级传入神经元，所述视蛋白多肽响应于激活视蛋白的波长的光提供初级传入神经元的超极化。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述初级传入神经元是伤害感受器。

3.如权利要求1所述的方法，其中所述光经皮递送。

4.如权利要求1所述的方法，其中所述视蛋白包含与SEQIDNO:1、3、4、6、15及16中的一个具有至少约75％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

5.如权利要求1所述的方法，其中所述疼痛是神经性疼痛。

6.如权利要求1所述的方法，其中所述引入是经由注射到神经中或经由肌内注射。

7.如权利要求1所述的方法，其中所述引入是经由局部、皮内、静脉内、鞘内或胸膜内施用。

8.如权利要求2所述的方法，其中所述伤害感受器一般是通过热、机械或化学刺激激活。

9.如权利要求1所述的方法，其中所述核酸是重组表达载体。

10.如权利要求7所述的方法，其中所述重组表达载体是病毒载体。

11.如权利要求10所述的方法，其中所述病毒载体是慢病毒载体或腺相关病毒(AAV)载体。

12.如权利要求11所述的方法，其中所述AAV载体是AAV6载体或AAV8载体。

13.如权利要求1所述的方法，其中所述核苷酸序列与提供神经元中的选择性表达的启动子可操作地连接。

14.如权利要求13所述的方法，其中所述启动子是突触蛋白-I启动子、人突触核蛋白1启动子、人Thy1启动子或钙/钙调蛋白依赖性激酶1Iα(CAMKIIα)启动子。

15.如权利要求1所述的方法，其中所述个体是哺乳动物。

16.如权利要求15所述的方法，其中所述个体是人、大鼠或小鼠。

17.如权利要求1所述的方法，其中所述视蛋白的激活提供至少10％的疼痛减轻。

18.一种疼痛的非人的动物模型，其中所述非人的动物在所述动物的初级传入神经元中表达包含编码视蛋白多肽的核苷酸序列的核酸，所述视蛋白多肽响应于激活所述视蛋白的波长的光提供所述伤害感受器的去极化。

19.如权利要求18所述的非人的动物模型，其中所述初级传入神经元是伤害感受器。

20.如权利要求18所述的非人的动物模型，其中所述视蛋白包含与SEQIDNO:8-14和19-21中的一个具有至少约75％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

21.如权利要求18所述的非人的动物模型，其中所述核酸是重组表达载体。

22.如权利要求18所述的非人的动物模型，其中所述重组表达载体是病毒载体。

23.如权利要求22所述的非人的动物模型，其中所述病毒载体是慢病毒载体或腺相关病毒(AAV)载体。

24.如权利要求23所述的非人的动物模型，其中所述AAV载体是AAV6载体或AAV8载体。

25.如权利要求18所述的非人的动物模型，其中所述核苷酸序列与提供神经元中的选择性表达的启动子可操作地连接。

26.如权利要求25所述的非人的动物模型，其中所述启动子是突触蛋白-I启动子、人突触核蛋白1启动子、人Thy1启动子或钙/钙调蛋白依赖性激酶IIα(CAMKIIα)启动子。

27.如权利要求18所述的非人的动物模型，其中所述动物是大鼠或小鼠。

28.一种鉴别减轻疼痛的试剂的方法，所述方法包括：

a)向如权利要求18所述的非人动物施用测试试剂；及

b)当去极化光激活的多肽用光来激活时，如果有的话，测定所述测试试剂对疼痛的作用，其中与在所述测试试剂不存在下通过所述去极化光激活多肽的光激活所诱发的疼痛水平相比，测试试剂在所述非人动物中减轻疼痛，表明所述测试试剂是用于减轻疼痛的候选试剂。

29.一种鉴别减轻疼痛的试剂的方法，所述方法包括：

a)向如权利要求18所述的非人动物施用测试试剂；及

b)如果有的话，在施用所述测试试剂之后测定所述测试试剂对诱发疼痛所需的光量的作用，

其中增加诱发疼痛所需的光量的测试试剂是用于减轻疼痛的候选试剂。