CN105816879A - 用于提高冻干病毒疫苗在常温下保存的效力的冻干稳定剂 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于提高冻干病毒疫苗在常温下保存效力的冻干稳定剂,含有这种冻干稳定剂和一种或多种病毒免疫原的病毒疫苗冻干制剂，以及制备所述病毒疫苗冻干制剂的方法。具体地，所述冻干稳定剂包括：氨基酸、氨基酸盐、表面活性剂、多元醇、磷酸缓冲液、二糖、人血白蛋白，其中所述氨基酸和氨基酸盐以配对形式存在。本发明与现有的病毒疫苗冻干制剂相比，通过对冻干过程中的稳定剂组分进行优化，实现了病毒疫苗冻干制剂在常温下的长期稳定性，在45℃下贮存3个月后效价仅有轻微变化，且没有产生聚集体。

Description

用于提高冻干病毒疫苗在常温下保存的效力的冻干稳定剂

技术领域

本发明涉及病毒疫苗领域。更具体地，涉及一种用于提高冻干病毒疫苗在常温下保存效力的冻干稳定剂，含有这种冻干稳定剂和一种或多种病毒免疫原的病毒疫苗冻干制剂，以及制备所述病毒疫苗冻干制剂的方法。

背景技术

疫苗作为人体接种的预防性生物制品，能帮助人体有效地控制传染性疾病，在世界范围内已被广泛使用。疫苗的稳定性是一个很大的问题。通常，这些产品需要配制、储存和运输。随着时间不可避免地受到来自温度改变的影响和其他物理或化学影响，所产生的物质失去它们最初的有效量或所需的定性特征。

几乎所有新疫苗都是在发达国家研制出来而得到应用的，每个生产商都对这些国家提出用冷链和贮存设备来稳定疫苗。病毒疫苗从出厂到使用，一般要经历如下“冷链”过程:疫苗出厂-冷藏运输一省市防疫站冷冻保存-冷藏运输-县乡级防疫站冷冻保存-冷藏运输-户直接使用或冷冻保存。以上各环节中，冷藏是指在2～8℃，冷冻一般是指在-15℃。只要有一个环节未达到“冷链”的要求，疫苗效价就要降低甚至失效。

在发展中国家或地区，特别是那些常年气温超过30度的国家或地区，电力系统不完善，缺少储存空间及冷链运输系统，维持疫苗的冷却状态显得格外困难，从而导致这些国家或地区的疫苗接种率较低。疫苗的冷链运输和储存要求在发展中国家已成为主要的经济负担和妨碍疫苗接种的主要障碍，尤其是在偏远地区进行大规模疫苗接种时更显突出。

目前已有多项研究对多种疫苗在脱冷链状态下的稳定性进行了探索，最近由印度Pune血清研究所生产的脑膜炎A疫苗MenAfriVac可以在40℃存放4天。2012年11月该疫苗第一家被WHO预认证为可在40度及以下温度存放不超过4天的疫苗，由于不影响疫苗的安全性及有效性，该疫苗开创了短时间简单温度控制链保存疫苗的先例。据统计，如果疫苗不需要全程冷链运输而改为温度控制链运输，部分地区接种疫苗费用可以节省65％。

由于病毒效价对于免疫效力的重要性，所以使用使病毒效价得到最大程度保护的稳定剂是必不可少的。稳定剂是可在疫苗制备的不同阶段加入的化学的和/或生物的化合物，从而确保疫苗在使用时(有时可能在开始贮存之后数年)时有最大效力。

已经试验了许多化合物对不同病毒疫苗的稳定能力，但本技术领域现有稳定剂组合物未能使病毒疫苗具有足够的稳定性，这样使常温贮存病毒疫苗的可能性受到限制。

狂犬病病毒致死率100％，在中国致死人数常年位于传染病前三位。国内上市产品冻干人用狂犬病疫苗(地鼠肾细胞)的稳定剂配方中因含有易致敏反应的明胶成分，同时存在热稳定性不好的情况。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于提高冻干病毒疫苗在常温下保存的效力的冻干稳定剂，尤其是用于狂犬病毒疫苗的冻干制剂，能够使病毒疫苗在45℃下保存3个月之久。

本发明的目的采用下述技术方案实现：

一种用于提高冻干病毒疫苗在常温下保存的效力的冻干稳定剂，所述冻干稳定剂包括：氨基酸、氨基酸盐、表面活性剂、多元醇、磷酸缓冲液、二糖、人血白蛋白，其中所述氨基酸和氨基酸盐以配对形式存在。以配对形式存在的氨基酸和氨基酸盐可以抑制磷酸盐产生结晶，防止pH值改变，进而阻止蛋白质失活；还能使制品的塌陷温度上升，防止制品塌陷影响外观；还能缓解微生物聚集状态，进而提高病毒冻干保护率。

作为对上述技术方案的进一步改进，其中所述氨基酸为精氨酸和谷氨酸，其浓度范围为0.1～1mg/ml，优选为0.2～0.5mg/ml，所述氨基酸盐为精氨酸盐和谷氨酸盐，优选为精氨酸盐酸盐和谷氨酸钠，精氨酸盐的浓度范围为1～10mg/ml，优选为2～5mg/ml；谷氨酸盐的浓度范围0.1～1mg/ml，优选为0.5～0.8mg/ml。在各种氨基酸和氨基酸盐中，同时存在精氨酸、谷氨酸、精氨酸盐酸盐和谷氨酸钠时效果最佳，具体机制尚不清楚，推断可能是精氨酸的氨基和谷氨酸的a羧基协同竞争二糖的羟基，其抑制病毒的羧基与葡萄糖发生反应。

作为对上述技术方案的进一步改进，其中所述表面活性剂为非离子表面活性剂，优选为泊洛沙姆188或吐温88，更优选为泊洛沙姆188，其浓度范围为0.01～0.1mg/ml，优选为0.01～0.05mg/ml。表面活性剂在冻干过程中能降低水-冰界面的表面张力，从而减少制品脱水变形的风险。并且在生物制品溶解过程中，能发挥重褶皱剂及润湿剂的功能。

作为对上述技术方案的进一步改进，其中所述多元醇为山梨醇或甘露醇，其浓度范围为5～50mg/ml，优选为5～20mg/ml。多元醇的官能团为羟基，在多种多元醇中，山梨醇的溶解度较甘露醇大，可以减少疫苗制剂的裂纹、易碎性，且不会形成结晶现象，甘露醇冻干易形成结晶现象。

作为对上述技术方案的进一步改进，其中所述磷酸缓冲液为磷酸氢二钠和磷酸二氢钠组成的磷酸缓冲液，其浓度范围为20～100mM，优选为20～50mM。蛋白质溶液冻干过程中，由于水分减少，溶液浓度渐渐升高。当溶液浓度达到很高时将会改变系统的pH值，pH值浮动会导致蛋白质失活变性，所以在保护剂配制过程中可以加入适宜的缓冲剂，保证生物制品pH值调节到生物活性物质最适宜范围之内。

作为对上述技术方案的进一步改进，其中所述二糖为蔗糖、乳糖、海藻糖、麦芽糖中的一种或多种，其浓度范围为30～100mg/ml，优选为30～50mg/ml。在本发明中二糖作为填充剂，可以防止病毒随着水蒸气逸散到冻干机箱中，并改善冻干制品多孔层结构的稳定性。

作为对上述技术方案的进一步改进，其中所述人血白蛋白的浓度范围为1％～10％，优先地为2～5％。

本发明的另一目的是提供含有上述冻干稳定剂和一种或多种病毒免疫原的病毒疫苗冻干制剂。

作为对上述技术方案的进一步改进，其中所述病毒为狂犬病毒。冻干稳定剂的保护功能不仅与稳定剂的组分、配比有关，病毒种类不同、本身结构的差异(如病毒粒子有无囊膜)、对外界抵抗力强弱和培养方法的不同也是重要的影响因素。本发明的冻干稳定剂在狂犬病毒的冻干制剂应用中效果最佳。

本发明的再一目的是提供制备病毒疫苗冻干制剂的制备方法，包括以下制备过程:

1)将冻干稳定剂配制成10X浓度；

2)把上述10X冻干稳定剂按10％浓度混合后调节pH至7.0～9.0；

3)用0.1～0.2um滤膜除菌过滤；

4)将所述除菌过滤后的冻干稳定剂加入到纯化后的病毒免疫原液中；

5)冻干制成病毒疫苗冻干制剂。

作为对上述技术方案的进一步改进，若所述病毒为狂犬病毒，其中每毫升病毒免疫原液中免疫原的含量为8～12IU，所述病毒疫苗冻干制剂的制剂规格为0.5ml。

现有的冻干稳定剂包括填充剂、防冻剂、抗氧化剂、酸碱调整剂及缓冲剂等多种组分。本发明人经过长期大量的试验，从这几大类物质中选择出本发明冻干稳定剂的组分，由于这些组分及含量的合理搭配，其相互作用使得本发明的冻干稳定剂在冻干过程及保存期间不发生倒塌变形，不产生聚集体，在不同温度下均有良好的稳定性，尤其是在45℃的高温下稳定性长达3个月之久。

附图说明

图1是采用本发明实施例的冻干稳定剂制备的病毒疫苗半成品经过冻融后的粒径变化曲线图。

图2是采用本发明实施例的冻干稳定剂制备的病毒疫苗冻干制剂加速实验的粒径变化曲线图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明作进一步地详细描述。

实施例1：冻干稳定剂配制

冻干稳定剂1：

精氨酸：0.1mg/ml

谷氨酸：0.1mg/ml

精氨酸盐酸盐：5mg/ml

谷氨酸钠：0.1mg/ml

泊洛沙姆：0.01mg/ml

山梨醇：5mg/ml

磷酸缓冲液：20mM

蔗糖：30mg/ml

人血白蛋白：3％

冻干稳定剂2：

精氨酸：1mg/ml

谷氨酸：0.5mg/ml

精氨酸盐酸盐：10mg/ml

谷氨酸钠：1mg/ml

吐温80：0.01mg/ml

山梨醇：20mg/ml

磷酸缓冲液：50mM

海藻糖：50mg/ml

人血白蛋白：1％

冻干稳定剂3：

精氨酸：0.2mg/ml

谷氨酸：0.5mg/ml

精氨酸盐酸盐：1mg/ml

谷氨酸钠：0.1mg/ml

泊洛沙姆：0.05mg/ml

山梨醇：20mg/ml

磷酸缓冲液：20mM

海藻糖：30mg/ml

人血白蛋白：5％

冻干稳定剂4：

精氨酸：0.1mg/ml

谷氨酸：1mg/ml

精氨酸盐酸盐：10mg/ml

谷氨酸钠：0.5mg/ml

泊洛沙姆：0.1mg/ml

山梨醇：50mg/ml

磷酸缓冲液：100mM

海藻糖：100mg/ml

人血白蛋白：10％

实施例2：半成品病毒疫苗的制备

狂犬病毒的制备过程：用狂犬病毒固定株接种Vero细胞，培养后收获病毒；取狂犬病病毒收获液，用0.8+0.65umSartocleanGF的滤器澄清过滤后进行超滤浓缩，然后用β-丙内酯按终浓度1：4000进行灭活24小时，37度水解2小时；再把此浓缩液上样至Sepharose4FF凝胶层析柱中，收集紫外吸光值为280nm处的病毒洗脱峰作为原液，使每毫升原液抗原含量为8-12IU。

把上述原液分为空白组与稳定剂组，空白组为用PBS稀释原液到对应比例，得到狂犬病毒半成品空白组。

稳定剂组的配制：

把稳定剂1～4的冻干稳定剂分别配制成10X浓度；然后把这些10X浓度稳定剂按10％浓度混合后调节pH至7.0～9.0，再用0.1～0.2um滤膜除菌过滤，最后把除菌后的稳定剂加入到纯化后的狂犬病毒原液中，得到稳定剂组1～4。

实施例3：比较半成品稳定剂组1～4与空白组在冻融情况下效价稳定性

将稳定剂组1～4和空白组分别冻融六次，其中放置-70℃冰箱冷冻，然后常温20℃解冻为冻融一次，冻融六次后分别用NIH小鼠体内免疫法进行冻融后半成品的效力测定，测定结果见表1。

表1：稳定剂组与空白组冻融后效价对比

以上测定结果表明，空白组在没有稳定剂保护下，经过冻融后半成品的病毒效价明显下降。而加了本发明的稳定剂后，半成品的效价稳定性明显比空白组的要高。

实施例4：比较半成品冻融后的粒度变化

将稳定剂组1冻融六次后分别使用BECKMANDelsaMax仪器进行粒度分析，观察有无聚集体产生从而比较冻融前后粒度的稳定性，测定结果见图1。粒度结果表明，稳定剂组在冻融六次之后并没有产生聚集体。

实施例5：比较半成品稳定剂组与空白组的加速稳定性

将稳定剂组1和空白组后分别放置37±2℃的恒温箱中贮存0个月、0.5个月、1个月、3个月，到期后采用NIH小鼠体内免疫法进行稳定性效力测定，测定结果见图2。

表2：半成品的加速稳定性结果

以上测定结果表明，空白组在没有稳定剂保护下，经过加速稳定实验后半成品的病毒效价明显下降。而加了本发明的稳定剂后，半成品的效价稳定性明显比空白组的要高。

实施例6：加入冻干稳定剂的冻干制剂的持续稳定性与加速稳定性

稳定剂组冻干制剂的制备：把上述稳定剂1～4的冻干稳定剂分别配制成10X浓度；然后把这些10X浓度稳定剂按10％浓度混合后调节pH至7.0～9.0，再用0.1～0.2um滤膜除菌过滤，把除菌后的稳定剂加入到纯化后的狂犬病毒原液中，最后用冻干机冻干制成狂犬病毒病毒疫苗冻干制剂，得到狂犬病毒冻干制剂1～4。

把冻干制剂分别放置-70±2℃的超冷冻冰箱中贮存3个月、5±2℃、25±2℃、37±2℃的恒温箱中贮存0个月、1个月、3个月以及在45±2℃的恒温箱中贮存0周、1周、1个月、3个月，到期后采用NIH小鼠体内免疫法进行稳定性效力测定。

表3：冻干制剂的持续稳定性及加速稳定性

以上测定结果表明，狂犬病毒疫苗在加了本发明所述的冻干稳定剂后，制备的冻干制剂在各不同温度均有良好的稳定性。

实施例7：比较冻干制剂放置高温(加速稳定)的粒度变化

将加速稳定性样品冻干制剂1在37℃和45℃的加速稳定性样品分别用注射用水溶解后，使用BECKMANDelsaMax仪器进行粒度分析，观察有无聚集体产生，从而比较冻干制剂长时间放置高温后粒度的稳定性，测定结果见附图2。

粒度结果表明，狂犬病毒疫苗在加了本发明的稳定剂后，制备的冻干制剂经过持续稳定性和加速稳定性实验均没有产生聚集体。

以上所揭露的仅为本发明一种较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。

Claims (10)

1.一种用于提高冻干病毒疫苗在常温下保存的效力的冻干稳定剂,所述冻干稳定剂包括：氨基酸、氨基酸盐、表面活性剂、多元醇、磷酸缓冲液、二糖、人血白蛋白，其中所述氨基酸和氨基酸盐以配对形式存在。

2.如权利要求1所述的冻干稳定剂，其中所述氨基酸为精氨酸和谷氨酸，其浓度范围为0.1～1mg/ml，所述氨基酸盐为精氨酸盐和谷氨酸盐，精氨酸盐的浓度范围为1～10mg/ml；谷氨酸盐浓度范围0.1～1mg/ml。

3.如权利要求1所述的冻干稳定剂，其中所述表面活性剂为非离子表面活性剂，其浓度范围为0.01～0.1mg/ml。

4.如权利要求1所述的冻干稳定剂，其中所述多元醇为山梨醇，其浓度范围为5～50mg/ml；所述磷酸缓冲液为磷酸氢二钠和磷酸二氢钠组成的缓冲液，其浓度范围为20～100mM。

5.如权利要求1所述的冻干稳定剂，其中所述二糖为蔗糖、乳糖、海藻糖、麦芽糖中的一种或多种，其浓度范围为30～100mg/ml。

6.如权利要求1所述的冻干稳定剂，其中所述人血白蛋白浓度范围为1％～10％。

7.含有如权利要求1～6任一项所述的冻干稳定剂和一种或多种病毒免疫原的病毒疫苗冻干制剂。

8.如权利要求7所述的病毒疫苗冻干制剂，其中所述病毒为狂犬病毒。

9.一种制备病毒疫苗冻干制剂的制备方法，包括以下制备过程:

1)把权利要求1～6任一项所述的冻干稳定剂配制成10X浓度；

2)把上述10X冻干稳定剂按10％浓度混合后，调节pH至7.0～9.0；

3)用0.1～0.2um滤膜除菌过滤；

4)将所述除菌过滤后的冻干稳定剂加入到纯化后的病毒免疫原液中；

5)冻干制成病毒疫苗冻干制剂。

10.如权利要求9所述的病毒疫苗冻干制剂的制备方法，若所述病毒为狂犬病毒，其中每毫升病毒免疫原液中免疫原的含量为8～12IU，所述病毒疫苗冻干制剂的制剂规格为0.5ml。