CN105814201A - 用接头键合对具有免疫球蛋白G(IgG)的Fc部分的蛋白质具有亲和力的多个结构域之间而成的蛋白质 - Google Patents
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Abstract
【课题】提供了使对含有对具有免疫球蛋白G(IgG)的Fc部分的蛋白质具有亲和力的结构域的蛋白Ｇ及蛋白Ａ那样的野生型蛋白质以及含有其结构域突变体的突变型蛋白质(改性蛋白质)所具有的免疫球蛋白的Fc区域在中性区域的抗体结合活性提高、进一步、具有与这些蛋白质相比在弱酸性区域的与免疫球蛋白的Fc区域的结合性更加降低的优异pH应答性的新型蛋白质等。【解决手段】前述蛋白质，其是用接头键合对具有免疫球蛋白G(IgG)的Fc部分的蛋白质具有亲和力的多个结构域之间而成的蛋白质，特征在于该接头的最大限伸长的长度为80?～240?。
Description
技术领域
本发明涉及用接头键合对具有免疫球蛋白G(IgG)的Fc部分的蛋白质具有亲和力的多个结构域之间而成的蛋白质，特别是特征在于该接头的最大限伸长的长度为约80Å～240Å的前述蛋白质等。
背景技术
历来，以抗体为首的蛋白质的纯化是生物化学研究中的重要课题，已知亲和层析、凝胶过滤层析、离子交换层析等各种技术。亲和层析是利用与目标蛋白质的特异性亲和性而纯化目标蛋白质的方法。该方法能够容易选择性地回收蛋白质，其亲和性非常强，因此为了解离吸附于层析填充剂的蛋白质，一般而言，大多需要用pH2．5左右的酸性缓冲液进行洗脱。在那样的强酸性条件下，容易引起蛋白质的变性等活性降低，要求在更温和的条件下进行纯化。
作为来源于链球菌的蛋白质的蛋白G是在链球菌(Streptococcus)属链球菌的细胞膜中存在的膜蛋白质，已知具有对免疫球蛋白G(为抗体中的一种)的Fc区域的特异性结合活性(非专利文献1、专利文献1)。蛋白G是由多个结构域组成的多结构域型膜蛋白质，显示对具有免疫球蛋白G的Fc区域的蛋白质的结合活性(以下，称为“抗体结合活性”)的是其中的一部分的细胞膜外结构域(非专利文献2)。例如在图1中显示的来源于G148株的蛋白G的情况下，显示抗体结合活性的是B1、B2、B3这3个结构域(文献也记作C1、C2、C3结构域)。另外，在GX7805株的蛋白G中存在3个抗体结合结构域，在GX7809的蛋白G中存在2个抗体结合结构域。已知这些均为将近60个氨基酸的小型蛋白质，在其氨基酸序列之间显示了高同一性)。另外已知，即使切断蛋白G而单独分离各结构域，仍保持抗体结合活性(非专利文献3)。
对于蛋白G的细胞膜外结构域而言，现在，利用其选择性的抗体结合活性的多种含有蛋白G细胞膜外结构域的制品(例如，用于抗体纯化的亲和层析用载体(专利文献3、4)、用于检测抗体的检查试剂、研究试剂等)已上市。已知蛋白G的细胞膜外结构域和抗体的结合力在中性～弱酸性区域高，在强酸性区域低(非专利文献4)。所以，当以抗体的分离、回收、纯化为目的时，首先，使血清等的含有抗体的样品溶液处于中性状态，使其接触固定化蛋白G的细胞膜外结构域的珠等的水不溶性的固相支持体，选择性地吸附抗体。此后，用中性～弱酸溶液(pH5～8)清洗而除去抗体以外的成分。最后，通常添加pH2.4～3.5的强酸性溶液而使抗体从固定化的蛋白G脱离，与强酸性溶液一同洗脱(专利文献3)。由此，可以高纯度分离、回收、纯化抗体。
然而，抗体置于pH2.4～3.5的强酸性溶液的话会因变性凝集等而劣化，根据抗体的种类的不同，有时还会丧失原本的功能(非专利文献4)。为了防止这些情况，尝试在比pH2.4～3.5更高的pH的弱酸性区域进行处理，但由于蛋白G的细胞膜外结构域和抗体的结合力强，在弱酸性区域抗体不从蛋白G洗脱，得不到足够的回收量。另一方面，已知蛋白G细胞膜外结构域还与Fab结合(非专利文献2)、一个抗体分子可在Fc区域和Fab区域这2个区域与蛋白G细胞膜外结构域结合。变成这样的结合状态时，抗体和蛋白G的细胞膜外结构域不能容易地解离，难以回收抗体。
至今本发明人等开发了由具有热稳定性、对变性剂的化学稳定性、及对蛋白质分解酶的抗性等(将这些特性总称，也简称为“蛋白质稳定性”)的蛋白G的细胞膜外结构域突变体组成的改性蛋白质(专利文献5及专利文献6)、进而也开发了在弱酸性区域的和免疫球蛋白的Fc区域的结合性和/或同Fab区域的结合性降低的改性蛋白质(专利文献7)。然而，这些改性蛋白质均仅含有显示抗体结合活性的1个结构域。
进一步，本发明人等开发了由上述改性蛋白质的串联型多聚体组成的蛋白质(专利文献8)。对于这样的蛋白质，与野生型的蛋白G・B1结构域的串联型多聚体相比，与IgG1及IgG3这样的不同亚类的人免疫球蛋白G的Fc区域的在弱酸性区域的结合性更大降低，在填充了含有该蛋白质的本发明的捕获剂的蛋白质分离纯化用层析用柱中，能够在弱酸性区域(pH4～5左右)以不变性的状态更容易地洗脱捕获的人免疫球蛋白G。
另外，作为来源于金黄色葡萄球菌的蛋白质的蛋白Ａ已知具有对免疫球蛋白Ｇ(为抗体的一种)的Fc区域的特异性结合活性(非专利文献5、非专利文献6)。蛋白A是由多个结构域组成的多结构域型膜蛋白质，显示对具有免疫球蛋白Ｇ的Fc区域的蛋白质的结合活性(以下称为抗体结合活性)的是其中的一部分的细胞膜外结构域(非专利文献6)。例如，在来源于NCTC8325株的蛋白Ａ的情况下，显示抗体结合活性的是E、D、A、B、C这5个结构域。这些是将近60个氨基酸的小型蛋白质，在其氨基酸序列之间显示了高同一性。另外，已知即使切断蛋白Ａ而单独分离各结构域，仍保持抗体结合活性(非专利文献7)。另一方面，Ｚ结构域是基于Ｂ结构域的序列合成的人工蛋白质(非专利文献7)，与Ｂ结构域相差2个氨基酸残基。已知利用其Ala1Val和Gly29Ala这2个取代，不会丧失抗体结合性且结构稳定化，其热变性温度变为90℃以上(非专利文献7)。
对于蛋白A的细胞膜外结构域(E、D、A、B、C)及Z结构域而言，现在已上市利用其选择性的抗体结合活性的多种制品(例如，用于抗体纯化的亲和层析用载体、用于检测抗体的检查试剂、研究试剂等)。已知蛋白Ａ的细胞膜外结构域和抗体的结合力在中性区域高，在强酸性区域低(非专利文献8)。所以，以抗体的分离、回收、纯化作为目的时，首先，使血清等含有抗体的样品溶液处于中性状态，使其接触到固定化蛋白Ａ的细胞膜外结构域的珠等的水不溶性的固相支持体，选择性地吸附抗体。此后，用pH7的中性溶液清洗而除去抗体以外的成分。最后，通常添加pH3.0的强酸性溶液而使抗体从固定化的蛋白Ａ解吸，与强酸性溶液一同洗脱。由此，可以高纯度分离、回收、纯化抗体。
关于蛋白A，本发明人等至今开发了在弱酸性区域的易解离性提高的含有蛋白Ａ的细胞膜外结构域突变体的突变型蛋白质及抗体互补剂(专利文献9)以及在酸性区域的亲和性降低的含有蛋白A的细胞膜外结构域突变体的突变型蛋白质及抗体互补剂(专利文献10)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特表平03－501801公报
专利文献2：日本专利第2764021号公报
专利文献3：日本特开平03－128400号公报
专利文献4：日本特开2003－088381号公报
专利文献5：日本特开2009-95322号公报
专利文献6：日本特开2009-118749号公报
专利文献7：日本特开2009-297018号公报
专利文献8：国际公开第2013/018880号
专利文献9：日本特开2010-81866号公报
专利文献10：国际公开第2012/165544号
非专利文献
非专利文献1 : Bjorck L, Kronvall G. (1984) Purification and someproperties of streptococcal protein G, a novel IgG-binding reagent. JImmunol. 133, 969-974.
非专利文献2 : Boyle M. D.P., Ed. (1990) Bacterial Immunoglobulin BindingProteins. Academic Press, Inc., San Diego, CA, USA.
非专利文献3 : Gallagher T, Alexander P, Bryan P, Gilliland GL. (1994) Twocrystal structures of the B1 immunoglobulin-binding domain of streptococcalprotein G and comparison with NMR. Biochemistry 19, 4721-4729.
非专利文献4 : Gagnon P. (1996) Purification Tools for MonoclonalAntibodies, Validated Biosystems Inc., Tucson, AZ, USA.
非专利文献5 : Forsgren A and Sjoquist J (1966) "Protein A" from S.Aureus. J Immunol. 97, 822-827.
非专利文献6 : Boyle M. D.P., Ed. (1990) Bacterial Immunoglobulin BindingProteins. Academic Press, Inc., San Diego, CA, USA.
非专利文献7 : Tashiro M, Montelione GT. (1995) Structures of bacterialimmunoglobulin-bindingdomains and their complexes with immunoglobulins. CurrOpin Struct Biol. 5, 471-481.
非专利文献8 : Gagnon P. (1996) Purification Tools for MonoclonalAntibodies, Validated Biosystems Inc., Tucson, AZ, USA.
非专利文献9 : Evers TH, van Dongen EM, Faesen AC, Meijer EW, Merkx M.,(2006) Quantitative understanding of the energy transfer between fluorescentproteins connected via flexible peptide linkers, Biochemistry. Nov 7;45(44):13183-92。
发明内容
发明要解决的课题
本发明要解决的课题是提供使对含有对具有免疫球蛋白G(IgG)的Fc部分的蛋白质具有亲和力的结构域的蛋白Ｇ及蛋白Ａ那样的野生型蛋白质以及含有其结构域突变体的突变型蛋白质(改性蛋白质)所具有的免疫球蛋白的Fc区域的在中性区域的抗体结合活性提高、进一步、具有与这些蛋白质相比在弱酸性区域的与免疫球蛋白的Fc区域的结合性更加降低的优异pH应答性的新型蛋白质等。
进一步，提供了特征在于该蛋白质固定化的、作为抗体纯化用亲和层析填充剂等有用的抗体、免疫球蛋白G或具有免疫球蛋白G的Fab区域的蛋白质(抗体等)的捕获剂、填充该捕获剂而成的蛋白质分离纯化用层析用柱，特别是抗体纯化用的亲和层析用柱。
本发明人发现，可以通过在上述野生型蛋白质及其突变型蛋白质中将键合各结构域的接头的长度调整至适当范围而解决上述课题，从而完成了本发明。
即，本发明的各实施方式如下。
［实施方式1］
用接头键合对具有免疫球蛋白G(IgG)的Fc部分的蛋白质具有亲和力的多个结构域之间而成的蛋白质，其特征在于，该接头的最大限伸长的长度为80Å～240Å。
［实施方式2］
根据实施方式1所述的蛋白质，其中接头为多肽接头。
［实施方式3］
根据实施方式2所述的蛋白质，其特征在于，接头由22～66个氨基酸残基的多肽组成。
［实施方式4］
根据实施方式3所述的蛋白质，其中接头的氨基酸序列由GlyGlySerGlyGlySer的4～10个重复单位组成。
［实施方式5］
根据实施方式4所述的蛋白质，其中接头的氨基酸序列由GlyGlySerGlyGlySer的6～10个重复单位组成。
［实施方式6］
根据实施方式1～5中任一项所述的蛋白质，其中结构域来源于蛋白G或蛋白A。
［实施方式7］
根据实施方式6所述的蛋白质，其中结构域为野生型蛋白G・B1、B2、或B3结构域中任一个的突变体。
［实施方式8］
根据实施方式1～7中任一项所述的蛋白质，其中结构域彼此相同。
［实施方式9］
根据实施方式1～8中任一项所述的蛋白质，其中2个结构域是键合而成的二聚体。
［实施方式10］
根据实施方式7～9中任一项所述的蛋白质，其中结构域突变体是以下的突变体蛋白质：
野生型蛋白G·B1结构域蛋白质的突变体蛋白质，其由以下的(a)所示的氨基酸序列组成，或由在(a)所示的氨基酸序列中1个或多个氨基酸残基缺失、取代、插入或添加的氨基酸序列组成，具有对免疫球蛋白G的Fc区域的结合活性，并且与野生型蛋白G·B1结构域蛋白质相比，至少对免疫球蛋白G的Fab区域的结合活性和/或对Fc区域在弱酸性区域的结合活性降低：
(上述氨基酸序列中，各自地，X35表示Asn或Lys，X36表示Asp或Glu，X37表示Asn、His、或Leu，X47表示Asp或Pro，X48表示Ala、Lys或Glu，X22表示Asp或His，X25表示Thr或His，X32表示Gln或His，X40表示Asp或His，X42表示Glu或His，X11表示Thr或Arg，X17表示Thr或Ile。但是，排除同时地X35是Asn或Lys、X36是Asp或Glu、X37是Asn或Leu、X47是Asp或Pro、X48是Ala、Lys或Glu、X22是Asp、X25是Thr、X32是Gln、X40是Asp、X42是Glu、X11是Thr、并且X17是Thr的情况。)。
［实施方式11］
根据实施方式7～9中任一项所述的蛋白质，其中结构域突变体是以下的突变体蛋白质：
野生型蛋白G·B2结构域蛋白质的突变体蛋白质，其由以下的(b)所示的氨基酸序列组成，或由在(b)所示的氨基酸序列中1个或多个氨基酸残基缺失、取代、插入或添加的氨基酸序列组成，具有对免疫球蛋白G的Fc区域的结合活性，并且与野生型蛋白G·B2结构域蛋白质相比，至少对免疫球蛋白G的Fab区域的结合活性和/或对Fc区域在弱酸性区域的结合活性降低：
(上述氨基酸序列中，各自地，X35表示Asn或Lys，X36表示Asp或Glu，X37表示Asn、His、或Leu，X47表示Asp或Pro，X48表示Ala、Lys或Glu，X22表示Asp或His，X25表示Thr或His，X32表示Gln或His，X40表示Asp或His，X42表示Glu或His，X11表示Thr或Arg，X17表示Thr或Ile。但是，排除同时地X35是Asn或Lys、X36是 Asp或Glu、X37是Asn或His、X47是Asp或Pro、X48是Ala、Lys或Glu、X22是Asp、X25是Thr、X32是Gln、X40是Asp、X42是Glu、X11是Thr、并且X17是Thr的情况。)。
［实施方式12］
根据实施方式7～9中任一项所述的蛋白质，其中结构域突变体是以下的突变体蛋白质：
野生型蛋白G·B3结构域蛋白质的突变体蛋白质，其由以下的(c)所示的氨基酸序列组成，或由在(c)所示的氨基酸序列中1个或多个氨基酸残基缺失、取代、插入或添加的氨基酸序列组成，具有对免疫球蛋白G的Fc区域的结合活性，并且与野生型蛋白G·B3结构域蛋白质相比，至少对免疫球蛋白G的Fab区域的结合活性和/或对Fc区域在弱酸性区域的结合活性降低：
(上述氨基酸序列中，各自地，X35表示Asn或Lys，X36表示Asp或Glu，X37表示Asn、His、或Leu，X47表示Asp或Pro，X48表示Ala、Lys或Glu、X22表示Asp或His，X25表示Thr或His，X32表示Gln或His，X40表示Asp或His，X11表示Thr或Arg，X17表示Thr或Ile。但是，排除同时地X35是Asn或 Lys、X36是Asp或Glu、X37是Asn或His、X47是Asp或Pro、X48是Ala、Lys或Glu、X22是Asp、X25是Thr、X32是Gln、X40是Asp、X11是Thr、并且X17是Thr的情况。)。
［实施方式13］
根据实施方式7～9中任一项所述的蛋白质，其中结构域突变体是以下的突变体蛋白质：
野生型蛋白G·B1结构域蛋白质的突变体蛋白质，其由以下的(d)所示的氨基酸序列组成，或由在(d)所示的氨基酸序列中1个或多个氨基酸残基缺失、取代、插入或添加的氨基酸序列组成，具有对免疫球蛋白G的Fc区域的结合活性，并且，与野生型蛋白G·B1结构域蛋白质相比，对免疫球蛋白G的Fab区域的结合活性和/或对Fc区域在弱酸性区域的结合活性降低：
(上述氨基酸序列中，各自地，X22表示Asp或His，X25表示Thr或His，X32表示Gln或His，X40表示Asp或His，X42表示Glu或His，X11表示Thr或Arg，X17表示Thr或Ile。但是，排除同时地X22是Asp、X25是Thr、X32是Gln、X40是Asp、X42是Glu、X11是Thr、并且X17是Thr的情况。)。
［实施方式14］
根据实施方式7～9中任一项所述的蛋白质，其中结构域突变体是以下的突变体蛋白质：
野生型蛋白G·B2结构域蛋白质的突变体蛋白质，其由以下的(e)所示的氨基酸序列组成，或由在(e)所示的氨基酸序列中1个或多个氨基酸残基缺失、取代、插入或添加的氨基酸序列组成，具有对免疫球蛋白G的Fc区域的结合活性，并且与野生型蛋白G·B2结构域蛋白质相比，对免疫球蛋白G的Fab区域的结合活性和/或对Fc区域在弱酸性区域的结合活性降低：
(上述氨基酸序列中，各自地，X22表示Asp或His，X25表示Thr或His，X32表示Gln或His，X40表示Asp或His，X42表示Glu或His，X11表示Thr或Arg，X17表示Thr或Ile。但是，排除同时地X22是Asp、X25是Thr、X32是Gln、X40是Asp、X42是Glu、X11是Thr、并且X17是Thr的情况。)。
［实施方式15］
根据实施方式7～9中任一项所述的蛋白质，其中结构域突变体是以下的突变体蛋白质：
野生型蛋白G·B3结构域蛋白质的突变体蛋白质，其由以下的(f)所示的氨基酸序列组成，或由在(f)所示的氨基酸序列中1个或多个氨基酸残基缺失、取代、插入或添加的氨基酸序列组成，具有对免疫球蛋白G的Fc区域的结合活性，并且与野生型蛋白G·B3结构域蛋白质相比，对免疫球蛋白G的Fab区域的结合活性和/或对Fc区域在弱酸性区域的结合活性降低：
(上述氨基酸序列中，各自地，X22表示Asp或His，X25表示Thr或His，X32表示Gln或His，X40表示Asp或His，X11表示Thr或Arg，X17表示Thr或Ile。但是，排除同时地X22是Asp、X25是Thr、X32是Gln、X40是Asp、X11是Thr、并且X17是Thr的情况。)。
［实施方式16］
根据实施方式7～9中任一项所述的蛋白质，其中结构域突变体是以下的突变体蛋白质：
野生型蛋白G·B1结构域蛋白质的突变体蛋白质，其由以下的(g)所示的氨基酸序列组成，或由在(g)所示的氨基酸序列中1个或多个氨基酸残基缺失、取代、插入或添加的氨基酸序列组成，具有对免疫球蛋白G的Fc区域的结合活性，并且与野生型蛋白G·B1结构域蛋白质相比，对Fc区域在弱酸性区域的结合活性降低：
(上述氨基酸序列中，各自地，X22表示Asp或His，X25表示Thr或His，X32表示Gln或His，X40表示Asp或His，X42表示Glu或His。但是，排除同时地X22是Asp、X25是Thr、X32是Gln、X40是Asp、并且X42是Glu的情况。)。
［实施方式17］
根据实施方式7～9中任一项所述的蛋白质，其中结构域突变体是以下的突变体蛋白质：
野生型蛋白G·B2结构域蛋白质的突变体蛋白质，其由以下的(h)所示的氨基酸序列组成，或由在(h)所示的氨基酸序列中1个或多个氨基酸残基缺失、取代、插入或添加的氨基酸序列组成，具有对免疫球蛋白G的Fc区域的结合活性，并且与野生型蛋白G·B2结构域蛋白质相比，对Fc区域在弱酸性区域的结合活性降低：
(上述氨基酸序列中，各自地，X22表示Asp或His，X25表示Thr或His，X32表示Gln或His，X40表示Asp或His，X42表示Glu或His。但是，排除同时地X22是Asp、X25是Thr、X32是Gln、X40是Asp、并且X42是Glu的情况。)。
［实施方式18］
根据实施方式7～9中任一项所述的蛋白质，其中结构域突变体是以下的突变体蛋白质：
野生型蛋白G·B3结构域蛋白质的突变体蛋白质，其由以下的(i)所示的氨基酸序列组成，或由在(i)所示的氨基酸序列中1个或多个氨基酸残基缺失、取代、插入或添加的氨基酸序列组成，具有对免疫球蛋白G的Fc区域的结合活性，并且与野生型蛋白G·B3结构域蛋白质相比，对Fc区域在弱酸性区域的结合活性降低：
(上述氨基酸序列中，各自地，X22表示Asp或His，X25表示Thr或His，X32表示Gln或His，X40表示Asp或His。但是，排除同时地X22是Asp、X25是Thr、X32是Gln、并且X40是Asp的情况。)。
［实施方式19］
根据实施方式7～9中任一项所述的蛋白质，其中结构域突变体是具有以下的氨基酸序列(SEQ ID NO:19)的突变体蛋白质：
［实施方式20］
蛋白质，其为融合蛋白质，所述融合蛋白质由连结实施方式1～19中任一项所述的蛋白质的氨基酸序列和其他蛋白质的氨基酸序列的氨基酸序列组成。
［实施方式21］
根据实施方式20所述的蛋白质，其具有SEQ ID NO:41～45中任一个所示的氨基酸序列。
［实施方式22］
核酸，其编码实施方式1～21中任一项所述的蛋白质。
［实施方式23］
重组载体，其含有实施方式22所述的核酸。
［实施方式24］
转化体，其导入了实施方式23所述的重组载体。
［实施方式25］
免疫球蛋白G或具有免疫球蛋白G的Fc区域或Fab区域的蛋白质的捕获剂，其特征在于实施方式1～21中任一项所述的蛋白质被固定化到水不溶性的固相支持体。
［实施方式26］
免疫球蛋白G或具有免疫球蛋白G的Fc区域或Fab区域的蛋白质的纯化用亲和层析，其含有实施方式25所述的捕获剂。
［实施方式27］
纯化免疫球蛋白G或具有免疫球蛋白G的Fc区域或Fab区域的蛋白质的方法，其使用实施方式26所述的纯化用亲和层析。
发明的效果
通过本发明发现，通过使键合对具有免疫球蛋白G(IgG)的Fc部分的蛋白质具有亲和力(特异性结合活性)的多个结构域之间的接头的最大限伸长的长度处于约80Å～240Å的范围，与该结构域之间含有由22个～66个左右的氨基酸组成的肽的蛋白G及蛋白A那样的野生型蛋白质、以及含有其结构域突变体的现有的突变型蛋白质(改性蛋白质)相比，对免疫球蛋白的Fc区域在中性区域的抗体结合活性显著提高，进一步，与这些蛋白质相比，在弱酸性区域中与免疫球蛋白的Fc区域的结合性更加降低，成功实现了优异的pH应答性。
其结果，通过利用本发明的蛋白质作为捕获剂，令人惊讶地，可以维持对人IgG等免疫球蛋白在中性的抗体结合性，同时在弱酸性区域在更温和的条件下解离・洗脱免疫球蛋白，即使对在酸性易于变性的免疫球蛋白，也能够通过亲和纯化在中性附近的pH区域中回收，而没有由酸导致的变性的风险。
附图简单说明
[图1]显示蛋白G的细胞膜外结构域突变体串联型二聚体(PG2LL10、PG2LL7、PG2LL6、PG2LL5、PG2LL4、PG2LL1)的结构。
[图2-1]是显示蛋白G的细胞膜外结构域突变体串联型二聚体(PG2LL5、PG2LL4、PG2LL1)的比较的、在相同质量的蛋白质固定化条件下的SPR测定的结果。
[图2-2]是显示蛋白G的细胞膜外结构域突变体串联型二聚体(PG2LL10、PG2LL7、PG2LL6)的比较的在相同质量的蛋白质固定化条件下的SPR测定的结果。
[图3]是显示蛋白G的细胞膜外结构域突变体串联型二聚体(PG2LL10、PG2LL7、PG2LL6、PG2LL5、PG2LL4、PG2LL1)的抗体结合率的比较的图。从抗体添加结束500秒后的PGLL1的SPR反应记为0%、PG2LL10的SPR反应记为100%时的PG2LL4-6的SPR计算出抗体结合率(相对结合稳定性(Relative binding stability)(%))。
[图4]显示利用本发明的重组PG固定化柱的pH梯度亲和层析的结果。
具体实施方式
本发明的蛋白质是用接头键合对具有免疫球蛋白G(IgG)的Fc部分的蛋白质具有亲和力的多个结构域之间而成的蛋白质，其特征在于该接头的最大限伸长的长度被调整为约80Å～240Å的范围内。
本发明的蛋白质中含有的接头的化学结构没有特别限定，例如，优选为由氨基酸构成的多肽接头。构成该肽接头的氨基酸的种类・序列没有特别限制。例如，也可以由多个氨基酸构成的肽的重复单位构成。作为这样的重复单位(单位)的适宜例子，可列举出“GlyGlySerGlyGlySer”。这种序列是该技术领域中单链抗体等蛋白质的设计过程中通常利用的氨基酸序列，具有免疫原性低、对活体的影响小等有利性质。
每一个该单位“GlyGlySerGlyGlySer”的最大限伸展的结构的长度为21.6Å左右(“最大限伸长的长度”基于ハーパー生物化学 第19版 第34页 丸善株式会社的记载来计算)，因此，以其作为重复单位使用时，该单位数目为4～11个(氨基酸的总数为24～66个)组成的肽接头的最大限伸长的长度变为约86Å～240Å、该单位数目为4～10个(氨基酸的总数为24～60个)的肽接头的最大限伸长的长度变为约86Å～216Å。
因此，作为构成本发明的蛋白质中含有的肽接头的氨基酸的数目，根据氨基酸的种类(化学结构)，通常为22～66个左右，优选为24～60个左右。作为其优选例，可列举出由单位“GlyGlySerGlyGlySer”的4～10个、更优选6～10个的重复单位组成的肽接头。
本发明的蛋白质中含有的结构域，只要对具有免疫球蛋白G(IgG)的Fc部分的蛋白质具有亲和力，其种类・结构・来源等没有特别限制，可以使用本领域技术人员公知的任意结构域。作为其优选例，可列举出来源于蛋白G或蛋白A的结构域，例如，其野生型结构域以及改变野生型蛋白G・B1、B2、或B3结构域中的任一个的突变体的各野生型结构域的氨基酸序列的一部分而得到的结构域突变体。这样的结构域突变体的优选例在本说明书中更具体公开。这样的改性蛋白质的氨基酸序列中的突变，例如，如专利文献8的实施例中所记载，可以用本领域技术人员公知的任意方法来实施。
进一步，本发明的蛋白质中含有的结构域的数目可以根据该蛋白质的用途及结构域的种类等进行适宜选择。例如，可以为二聚体、三聚体、四聚体、或五聚体。进一步，本发明的蛋白质中含有的结构域可以彼此不同或彼此相同。
需要说明的是，抗体Fc区域以2价与蛋白G相互作用的复合体中的蛋白G的2个结构域之间距离，使用通用的结构绘图软件(例如，ViewerLite 5.0 (Accelrys Inc))由公知的结构信息(参考文献：Sauer-Eriksson AE, Kleywegt GJ, Uhlen M, Jones TA. Crystalstructure of the C2 fragment of streptococcal protein G in complex with theFc domain of human IgG. Structure. 1995 Mar 15;3(3):265-78.)来计算，将蛋白G的结构域之间距离推算为约66Å。因此，以2个结构域进行二价相互作用时，具有该距离以上的长度的接头变得必要。与此相比，野生型蛋白G的接头为14个氨基酸残基，即使考虑伸展结构也仅约50Å。如果增加蛋白质中含有的结构域数目，其变得足够长，但结构域数目增加时，蛋白质的结构变得复杂，因此，在培养过程中，例如，容易引起溶液中容易生成沉淀等问题，进一步，结构域数目增加且蛋白质整体变大时，在载体内的扩散变差。
与此相比，在本发明的蛋白质的情况下，键合结构域之间的接头的最大限伸长的长度被调整于约80Å～240Å的范围内，因此，即使为含有2个结构域的二聚体，也能够在空间上与抗体Fc区域合理地以2价进行相互作用，也没有上述那样的问题。
需要说明的是，作为免疫球蛋白G的实例，包括人及人以外的动物，尤其是大鼠、小鼠、仓鼠、山羊及兔等哺乳类的各种抗体以及人IgG的Fab片段等各抗体的各种片段。只要具有Fc部分或Fab部分，则其结构或构成要素没有特别限制，包括本领域技术人员公知的任意各种类型的抗体分子及其片段分子。即，除了通常的(完全的)IgG型抗体分子之外，例如，可列举出单链抗体(scFv)、单链抗体的二聚体、双特异性抗体、双抗体型双特异性抗体、及多聚体化低分子抗体，以及Fab片段、F(ab’)2及Fab’等的各种的抗体片段。
作为本发明的蛋白质中包含的上述结构域突变体的优选的实施方式，列举以下的突变体蛋白质。
A.本发明的突变体蛋白质的第1实施方式如以下的(1)、(2)所示。
(1) 以由SEQ ID NO: 1或2所示的氨基酸序列组成的野生型蛋白G·B1或同B2结构域蛋白质中的Asp22、Ala24、Thr25、Lys28、Val29、Lys31、Gln32、Asn35、Asp36、Gly38、Asp40、Glu42、Thr44之中之任何1个以上的氨基酸残基作为突变对象部位而被其他氨基酸残基取代的突变体蛋白质，特征在于该突变对象部位的各氨基酸残基被以下(i)～(iii)之中任何一个所示的氨基酸残基取代，所述突变体蛋白质对免疫球蛋白G的Fc区域具有结合活性，并且与野生型蛋白G·B1或B2结构域蛋白质相比，对免疫球蛋白G的Fc区域的在弱酸性区域的结合活性降低。
(i) 在突变对象部位的氨基酸残基是非带电荷氨基酸残基时，向带电荷氨基酸残基的取代
(ii) 在突变对象部位的氨基酸残基是带电荷氨基酸残基时，向显示相反电荷的带电荷氨基酸残基的取代
(iii) 突变对象部位的氨基酸残基的向组氨酸残基的取代。
(2) 以由SEQ ID NO: 3所示的氨基酸序列组成的野生型蛋白G·B3结构域蛋白质中的Asp22、Thr25、Lys28、Lys31、Gln32、Asn35、Asp36、Gly38、Asp40、Thr44之中之任何1个以上的氨基酸残基作为突变对象部位而被其他氨基酸残基取代的突变体蛋白质，特征在于该突变对象部位的各氨基酸残基被以下(i)～(iii)之中任何一个所示的氨基酸残基取代，所述突变体蛋白质对免疫球蛋白G的Fc区域具有结合活性，并且与野生型蛋白G·B3结构域蛋白质相比，对免疫球蛋白G的Fc区域的在弱酸性区域的结合活性降低。
(i) 在突变对象部位的氨基酸残基是非带电荷氨基酸残基时，向带电荷氨基酸残基的取代
(ii) 在突变对象部位的氨基酸残基是带电荷氨基酸残基时，向显示相反电荷的带电荷氨基酸残基的取代
(iii) 突变对象部位的氨基酸残基的向组氨酸残基的取代。
上述(1)及(2)的突变体蛋白质是基于如下选定的突变对象部位及取代该部位的氨基酸残基进行设计，利用基因工程学的方法得到的。
〔基于与Fc的结合表面解析的突变对象部位的选定和取代的氨基酸残基的特别指定〕
导入用于设计本发明的突变体蛋白质的氨基酸序列的突变的部位使用蛋白G·B2结构域和免疫球蛋白G的Fc区域结合的复合物的立体结构原子座标数据(参考文献4)进行选定。为了降低在弱酸性区域的蛋白G的细胞膜外结构域的抗体结合性，只要将与和Fc区域的结合直接相关的蛋白G的细胞膜外结构域的结合表面的氨基酸残基及其周边的氨基酸残基从野生型取代为非野生型即可。从而，首先，在蛋白G·B2结构域和免疫球蛋白G的Fc区域结合的复合物中，特别指定在距Fc区域一定距离的范围内存在的蛋白G·B2结构域的氨基酸残基，将其作为突变对象部位的候选。接下来，为了使伴随氨基酸取代的蛋白G的细胞膜外结构域的结构不稳定化处于最小限度，上述候选之中，仅将露出到蛋白G·B2结构域的分子表面的氨基酸残基确定为突变对象部位。
从而，具体而言，如后述实施例中所示，通过将上述距离范围设定为6.5Å以内，并且将露出表面积比设为40%以上，蛋白G·B2结构域的野生型氨基酸序列(SEQ ID NO: 2)之中的Asp22、Ala24、Thr25、Lys28、Val29、Lys31、Gln32、Asn35、Asp36、Gly38、Asp40、Glu42、Thr44这13个被选定为突变对象部位。
另外，如上所述，由于蛋白G的各细胞膜外结构域序列同一性极其高，也几乎无B1、B2、B3结构域的立体结构的差异，对B2结构域-Fc复合物的立体结构的见解也可适用于B1及B3结构域-Fc复合物。从而，对于从B2结构域-Fc复合物的立体结构导出的13个是突变对象部位，只要在相当的位置有相同种类的氨基酸，不仅是在B2结构域，在B1及B2结构域中也可选定为突变对象部位。即，蛋白G·B1结构域的野生型氨基酸序列(SEQ ID NO: 1)之中的Asp22、Ala24、Thr25、Lys28、Val29、Lys31、Gln32、Asn35、Asp36、Gly38、Asp40、Glu42、Thr44这13个，另外，蛋白G·B3结构域的野生型氨基酸序列(SEQ ID NO: 3)之中的Asp22、Thr25、Lys28、Lys31、Gln32、Asn35、Asp36、Gly38、Asp40、Thr44这10个被选定为突变对象部位。
另一方面，取代该突变对象部位的原来的氨基酸残基的氨基酸残基特别指定以下的(i)～(iii)中的任何一种。
(i) 突变对象部位的野生型的氨基酸残基具有非带电荷的侧链的氨基酸(Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Ser、Thr、Asn、Gln、Phe、Tyr、Trp、Met、Cys、Pro)时，被具有带电荷的侧链的氨基酸(Asp、Glu、Lys、Arg、His)取代。带电荷氨基酸依赖于pH而化学状态变化大，所以可使蛋白G·B2结构域的抗体结合性在中性区域和弱酸性区域变化。
(ii) 突变对象部位的野生型的氨基酸残基是带电荷氨基酸时，被显示相反电荷的带电荷氨基酸取代。与上述同样地，带电荷氨基酸依赖于pH而化学状态变化大，所以可使蛋白G·B2结构域的抗体结合性在中性区域和弱酸性区域变化。
(iii) 突变对象部位的野生型的氨基酸残基是组氨酸以外的情况时，被组氨酸取代。组氨酸在中性区域和弱酸性区域化学状态变化大，所以可使蛋白G·B2结构域的抗体结合性在中性区域和弱酸性区域变化。
具体而言，如后述实施例中所示，作为取代位置的氨基酸残基，对于Asp22特别指定Lys、Arg、或His，对于Ala24(仅B1，B2结构域)特别指定Asp、Glu、Lys、Arg、或His，对于Thr25特别指定Asp、Glu、Lys、Arg、或His，对于Lys28特别指定Asp、Glu、或His，对于Val29(仅B1，B2结构域)特别指定Asp、Glu、Lys、Arg、或His，对于Lys31特别指定Asp、Glu、或His，对于Gln32特别指定Asp、Glu、Lys、Arg、或His，对于Asn35特别指定Asp、Glu、Lys、Arg、或His，对于Asp36特别指定Lys、Arg、或His，对于Gly38特别指定Asp、Glu、Lys、Arg、或His，对于Asp40特别指定Lys、Arg、或His，对于Glu42(仅B1，B2结构域)特别指定Lys、Arg、或His，对于Thr44特别指定Asp、Glu、Lys、Arg、或His。然而，利用这些氨基酸残基的特别指定的氨基酸序列除去Asn35被Lys取代和/或Asp36被Glu取代、该取代位置以外的氨基酸序列成为与野生型蛋白G的各细胞膜结构域的氨基酸序列相同的情况。由此，与后述的本发明人的申请中涉及的提高蛋白G细胞膜结构域的稳定性的突变体蛋白质区别开来。
B.本发明的突变体蛋白质的第2实施方式如以下的(3)所示。
(3)突变体蛋白质，其特征在于将由SEQ ID NO: 1～3中任何一个所示的氨基酸序列组成的野生型蛋白G·B1、B2或B3结构域蛋白质中的Lys10、Thr11、Lys13、Gly14、Glu15、Thr16、Thr17、Asn35、Asp36、Gly38之中任何1个以上的氨基酸残基作为突变对象部位，取代为除了半胱氨酸之外的其他种类的氨基酸残基，其对免疫球蛋白G的Fc区域具有结合活性，并且与各对应的野生型蛋白G·B1、B2或B3结构域蛋白质相比，对免疫球蛋白G的Fab区域的结合性降低。上述(3)的突变体蛋白质是基于如下选定的突变对象部位及取代该部位的氨基酸残基进行设计，利用基因工程学方法得到的。
〔基于与Fab的结合表面解析的突变对象部位的选定和取代的氨基酸残基的特别指定〕
导入用于设计本发明的突变体蛋白质的氨基酸序列的突变的部位使用蛋白G·B3结构域和免疫球蛋白G的Fab区域结合的复合物的立体结构原子座标数据(参考文献5)进行选定。已知蛋白G的细胞膜外结构域对于免疫球蛋白G的Fc区域也结合，对于Fab区域也结合(参考文献2)。从而，1个抗体分子可同时与多个蛋白G的细胞膜外结构域结合，成为这样的状态时，抗体和蛋白G的细胞膜外结构域的相互作用成为多价，变得不容易切断。因此，为了降低在弱酸性区域的蛋白G的细胞膜外结构域的抗体结合性，只要将与和Fab区域的结合直接相关的蛋白G的细胞膜外结构域的结合表面的氨基酸残基从野生型取代为非野生型即可。从而，首先，在蛋白G·B3结构域和免疫球蛋白G的Fab区域结合的复合物中，特别指定在距Fab区域一定距离的范围内存在的蛋白G・各细胞膜B3结构域的氨基酸残基，将其作为突变对象部位的候选。接下来，为了使伴随氨基酸取代的蛋白G的细胞膜外结构域的结构不稳定化处于最小限度，上述候选之中，仅将露出到蛋白G·B3结构域的分子表面的氨基酸残基确定为突变对象部位。
具体而言，如后述实施例中所示，通过将上述距离范围设定为4.0Å以内，并且使露出表面积比成为40%以上，［SEQ ID NO: 3］所示的蛋白G·B3结构域的野生型氨基酸序列之中的Lys10、Thr11、Lys13、Gly14、Glu15、Thr16、Thr17、Asn35、Asp36、Gly38这10个被选定为突变对象部位。另外，如上所述，蛋白G的各细胞膜外结构域如上所述同一性极其高，这些的突变对象部位在B1、B2、B3的任何结构域中也共同存在。从而，这些不仅是在B3结构域，在B1及B2结构域中也可被选定为突变对象部位。
另一方面，取代该突变对象部位的原来的氨基酸残基的氨基酸残基可用以下的方法特别指定。(iV)被野生型的氨基酸和半胱氨酸以外的其他种类的氨基酸残基取代。由此，除了避免伴随半胱氨酸的导入的交联反应的危险性，还可导致由野生型的氨基酸的突变导致的与Fab区域的结合性的降低。
具体而言，如后述实施例中所示，作为取代野生型蛋白G各细胞外结构域蛋白质的氨基酸残基，对于Lys10特别指定Lys和Cys之外的残基，对于Thr11特别指定Thr和Cys之外的残基，对于Lys13特别指定Lys和Cys之外的残基，对于Gly14特别指定Gly和Cys之外的残基，对于Glu15特别指定Glu和Cys之外的残基，对于Thr16特别指定Thr和Cys之外的残基，对于Thr17特别指定Thr和Cys之外的残基，对于Asn35特别指定Asn和Cys之外的残基，对于Asp36特别指定Asp和Cys之外的残基，对于Gly38特别指定Gly和Cys之外的残基。然而，利用这些的氨基酸残基的选定的氨基酸序列除去Asn35被Lys和/或Asp36被Glu取代、该取代位置以外的氨基酸序列成为与野生型蛋白G的各细胞膜结构域的氨基酸序列相同的情况。由此，与后述的本发明人的申请中涉及的提高蛋白G细胞膜结构域的稳定性的突变体蛋白质区别开来。
C.本发明的突变体蛋白质的第3实施方式共有用于改良对上述免疫球蛋白Fc区域的结合性的氨基酸残基的取代和用于改良向Fab区域的结合性的氨基酸残基的取代。
〔基于与Fc及Fab的结合表面解析的突变对象部位的选定和取代的氨基酸残基的特别指定〕
将基于上述与Fc的结合表面解析特别指定的突变对象部位和取代的氨基酸残基、及基于上述与Fab的结合表面解析特别指定的突变对象部位和取代的氨基酸残基组合，进行突变对象部位的选定和取代的氨基酸残基的特别指定。具体而言，作为突变对象部位，蛋白G·B1、B2结构域的野生型氨基酸序列(SEQ ID NO: 1，2)之中的Asp22、Ala24、Thr25、Lys28、Val29、Lys31、Gln32、Asp40、Glu42、Thr44、Lys10、Thr11、Lys13、Gly14、Glu15、Thr16、Thr17、Asn35、Asp36、Gly38这20个被选定为突变对象部位。其中Asp22、Ala24、Thr25、Lys28、Val29、Lys31、Gln32、Asp40、Glu42、Thr44是用于改良对Fc区域的结合性的靶部位，另外，Lys10、Thr11、Lys13、Gly14、Glu15、Thr16、Thr17是用于改良对Fab区域的结合性的靶部位。此处，Asn35、Asp36、Gly38是对Fc区域的结合性的改良部位的同时也是对Fab区域的结合性的改良部位。从而，被用于对于Asn35、Asp36、Gly38的对Fc区域的结合性的改良的上述A中所示的氨基酸残基取代也同时是用于对Fab区域的结合性的改良的除了半胱氨酸残基之外的向其他氨基酸残基的取代。
即，本说明书中所述的氨基酸残基取代的“共有”是指，在用于对Fc区域的结合性的改良的突变对象部位和用于对Fab区域的结合性的改良的突变对象部位被不同地选定时，除了组合氨基酸残基的取代的情况之外，作为用于这两者的结合性的改良的突变对象部位，选定相同的部位，在进行上述A中所示的氨基酸残基的取代时也以该意义定义。
作为取代的氨基酸残基，对于Asp22选定Lys、Arg、或His，对于Ala24选定Asp、Glu、Lys、Arg、或His，对于Thr25选定Asp、Glu、Lys、Arg、或His，对于Lys28选定Asp、Glu、或His，对于Val29选定Asp、Glu、Lys、Arg、或His，对于Lys31选定Asp、Glu、或His，对于Gln32选定Asp、Glu、Lys、Arg、或His，对于Asp40选定Lys、Arg、或His，对于Glu42选定Lys、Arg、或His，对于Thr44选定Asp、Glu、Lys、Arg、或His，对于Lys10选定Lys和Cys之外的残基，对于Thr11选定Thr和Cys之外的残基，对于Lys13选定Lys和Cys之外的残基，对于Gly14选定Gly和Cys之外的残基，对于Glu15选定Glu和Cys之外的残基，对于Thr16选定Thr和Cys之外的残基，对于Thr17选定Thr和Cys之外的残基，对于Asn35选定Asn和Cys之外的残基，对于Asp36选定Asp和Cys之外的残基，对于Gly38选定Gly和Cys之外的残基。
另一方面，对于蛋白G·B3结构域而言，野生型氨基酸序列(SEQ ID NO: 3)之中的Asp22、Thr25、Lys28、Lys31、Gln32、Asp40、Thr44、Lys10、Thr11、Lys13、Gly14、Glu15、Thr16、Thr17、Asn35、Asp36、Gly38这17个被选定为突变对象部位。其中Asp22、Thr25、Lys28、Lys31、Gln32、Asp40、Thr44是用于改良对Fc区域的结合性的突变对象部位，另外，Lys10、Thr11、Lys13、Gly14、Glu15、Thr16、Thr17是用于改良对Fab区域的结合性的突变对象部位。其中Asn35、Asp36、Gly38是对Fc区域的结合性的改良部位的同时也是对Fab区域的结合性的改良部位，在这一点是共同的，被用于对于Asn35、Asp36、Gly38的对Fc区域的结合性的改良的上述A中所示的氨基酸残基取代也同时是用于对Fab区域的结合性的改良的除半胱氨酸残基之外的向其他氨基酸残基的取代，这与上述蛋白G·B1或B2结构域相同。
然而，基于上述氨基酸残基的选定而设定的氨基酸序列除去Asn35被Lys取代和/或Asp36被Glu取代、该取代位置以外的氨基酸序列成为与野生型蛋白G的各细胞膜结构域的氨基酸序列相同的情况。由此，与后述的本发明人的申请中涉及的提高蛋白G细胞膜结构域的稳定性的突变体蛋白质区别开来。
本发明的突变体蛋白质的具体例如以下(a)～(c)中所示。
(a) 是野生型蛋白G·B1结构域蛋白质的突变体蛋白质，其由以下的(a)所示的氨基酸序列组成，或由在(a)所示的氨基酸序列中1个或多个氨基酸残基缺失、取代、插入或添加的氨基酸序列组成，具有对免疫球蛋白G的Fc区域的结合活性，并且，与野生型蛋白G·B1结构域蛋白质相比，至少，对免疫球蛋白G的Fab区域的结合活性和/或对Fc区域在弱酸性区域的结合活性降低。
(上述氨基酸序列中，各自地，X35表示Asn或Lys，X36表示Asp或Glu，X37表示Asn、His、或Leu，X47表示Asp或Pro，X48表示Ala、Lys或Glu，X22表示Asp或His，X25表示Thr或His，X32表示Gln或His，X40表示Asp或His，X42表示Glu或His，X11表示Thr或Arg，X17表示Thr或Ile。但是，排除同时地X35是Asn或Lys、X36是Asp或Glu、X37是Asn或Leu、X47是Asp或Pro、X48是Ala、Lys或Glu、X22是Asp、X25是Thr、X32是Gln、X40是Asp、X42是Glu、X11是Thr、并且X17是Thr的情况。)。
(b)是野生型蛋白G·B2结构域蛋白质的突变体蛋白质，其由以下的(b)所示的氨基酸序列组成，或由在(b)所示的氨基酸序列中1个或多个氨基酸残基缺失、取代、插入或添加的氨基酸序列组成，具有对免疫球蛋白G的Fc区域的结合活性，并且，与野生型蛋白G·B2结构域蛋白质相比，至少，对免疫球蛋白G的Fab区域的结合活性和/或对Fc区域在弱酸性区域的结合活性降低。
(上述氨基酸序列中，各自地，X35表示Asn或Lys，X36表示Asp或Glu，X37表示Asn、His、或Leu，X47表示Asp或Pro，X48表示Ala、Lys或Glu，X22表示Asp或His，X25表示Thr或His，X32表示Gln或His，X40表示Asp或His，X42表示Glu或His，X11表示Thr或Arg，X17表示Thr或Ile。但是，排除同时地X35是Asn或Lys、X36是Asp或Glu、X37是Asn或Leu、X47是Asp或Pro、X48是Ala、Lys或Glu、X22是Asp、X25是Thr、X32是Gln、X40是Asp、X42是Glu、X11是Thr、并且X17是Thr的情况。)。
(c)是野生型蛋白G·B3结构域蛋白质的突变体蛋白质，其由以下的(c)所示的氨基酸序列组成，或由在(c)所示的氨基酸序列中1个或多个氨基酸残基缺失、取代、插入或添加的氨基酸序列组成，具有对免疫球蛋白G的Fc区域的结合活性，并且，与野生型蛋白G·B3结构域蛋白质相比，至少，对免疫球蛋白G的Fab区域的结合活性和/或对Fc区域在弱酸性区域的结合活性降低。
(上述氨基酸序列中，各自地，X35表示Asn或Lys，X36表示Asp或Glu，X37表示Asn、His、或者Leu，X47表示Asp或Pro，X48表示Ala、Lys或Glu、X22表示Asp或His，X25表示Thr或His，X32表示Gln或His，X40表示Asp或His，X11表示Thr或Arg，X17表示Thr或Ile。但是，排除同时地X35是Asn或Lys、X36是Asp或Glu、X37是Asn或Leu、X47是Asp或Pro、X48是Ala、Lys或Glu、X22是Asp、X25是Thr、X32是Gln、X40是Asp、X42是Glu、X11是Thr、并且X17是Thr的情况。)。
需要说明的是，上述(a)～(c)的氨基酸残基的定义中，条件是与野生型蛋白G的各细胞膜结构域蛋白质及后述的本发明人的申请中涉及的提高蛋白G细胞膜结构域的稳定性的突变体蛋白质区别开来。
更具体的本发明的突变体蛋白质如以下的(d)～(i)中所示。
(d) 是野生型蛋白G·B1结构域蛋白质的突变体蛋白质，其由以下的(d)所示的氨基酸序列组成，或由在(d)所示的氨基酸序列中1个或多个氨基酸残基缺失、取代、插入或添加的氨基酸序列组成，具有对免疫球蛋白G的Fc区域的结合活性，并且与野生型蛋白G·B1结构域蛋白质相比，对免疫球蛋白G的Fab区域的结合活性和/或对Fc区域在弱酸性区域的结合活性降低。
(上述氨基酸序列中，各自地，X22表示Asp或His，X25表示Thr或His，X32表示Gln或His，X40表示Asp或His，X42表示Glu或His，X11表示Thr或Arg，X17表示Thr或Ile。但是，排除同时地X22是Asp、X25是Thr、X32是Gln、X40是Asp、X42是Glu、X11是Thr、并且X17是Thr的情况。)。
(e)是野生型蛋白G·B2结构域蛋白质的突变体蛋白质，其由以下的(e)所示的氨基酸序列组成，或由在(e)所示的氨基酸序列中1个或多个氨基酸残基缺失、取代、插入或添加的氨基酸序列组成，具有对免疫球蛋白G的Fc区域的结合活性，并且与野生型蛋白G·B2结构域蛋白质相比，对免疫球蛋白G的Fab区域的结合活性和/或对Fc区域在弱酸性区域的结合活性降低。
(上述氨基酸序列中，各自地，X22表示Asp或His，X25表示Thr或His，X32表示Gln或His，X40表示Asp或His，X42表示Glu或His，X11表示Thr或Arg，X17表示Thr或Ile。但是，排除同时地X22是Asp、X25是Thr、X32是Gln、X40是Asp、X42是Glu、X11是Thr、并且X17是Thr的情况。)。
(f)是野生型蛋白G·B3结构域蛋白质的突变体蛋白质，其由以下的(f)所示的氨基酸序列组成，或由在(f)所示的氨基酸序列中1个或多个氨基酸残基缺失、取代、插入或添加的氨基酸序列组成，具有对免疫球蛋白G的Fc区域的结合活性，并且与野生型蛋白G·B3结构域蛋白质相比，对免疫球蛋白G的Fab区域的结合活性和/或对Fc区域在弱酸性区域的结合活性降低。
(上述氨基酸序列中，各自地，X22表示Asp或His，X25表示Thr或His，X32表示Gln或His，X40表示Asp或His，X11表示Thr或Arg，X17表示Thr或Ile。但是，排除同时地X22是Asp、X25是Thr、X32是Gln、X40是Asp、X11是Thr、并且X17是Thr的情况。)。
(g)是野生型蛋白G·B1结构域蛋白质的突变体蛋白质，其由以下的(g)所示的氨基酸序列组成，或由在(g)所示的氨基酸序列中1个或多个氨基酸残基缺失、取代、插入或添加的氨基酸序列组成，具有对免疫球蛋白G的Fc区域的结合活性，并且，与野生型蛋白G·B1结构域蛋白质相比，对Fc区域在弱酸性区域的结合活性降低。
(上述氨基酸序列中，各自地，X22表示Asp或His，X25表示Thr或His，X32表示Gln或His，X40表示Asp或His，X42表示Glu或His。但是，排除同时地X22是Asp、X25是Thr、X32是Gln、X40是Asp、并且X42是Glu的情况。)。
(h)是野生型蛋白G·B2结构域蛋白质的各突变体蛋白质，其由以下的(h)所示的氨基酸序列组成，或由在(h)所示的氨基酸序列中1个或多个氨基酸残基缺失、取代、插入或添加的氨基酸序列组成，具有对免疫球蛋白G的Fc区域的结合活性，并且与野生型蛋白G·B2结构域蛋白质相比，对Fc区域在弱酸性区域的结合活性降低。
(上述氨基酸序列中，各自地，X22表示Asp或His，X25表示Thr或His，X32表示Gln或His，X40表示Asp或His，X42表示Glu或His。但是，排除同时地X22是Asp、X25是Thr、X32是Gln、X40是Asp、并且X42是Glu的情况。)。
(i)是野生型蛋白G·B3结构域蛋白质的各突变体蛋白质，其由以下的(i)所示的氨基酸序列组成，或由在(i)所示的氨基酸序列中1个或多个氨基酸残基缺失、取代、插入或添加的氨基酸序列组成，具有对免疫球蛋白G的Fc区域的结合活性，并且与野生型蛋白G·B3结构域蛋白质相比，对Fc区域在弱酸性区域的结合活性降低。
(上述氨基酸序列中，各自地，X22表示Asp或His，X25表示Thr或His，X32表示Gln或His，X40表示Asp或His。但是，排除同时地X22是Asp、X25是Thr、X32是Gln、并且X40是Asp的情况)。需要说明的是，上述(d)～(i)的氨基酸残基的定义中，条件是，与野生型蛋白G的各细胞膜结构域蛋白质区别开来。
从上述可知，在本发明的突变体蛋白质的设计中，选定的突变对象部位及取代该部位的氨基酸残基不限于各一个，因此可从突变对象部位及取代该部位的氨基酸残基之中适宜选择，设计突变体蛋白质的氨基酸序列。例如，为了对免疫球蛋白G的Fc区域的结合性的改良，作为突变对象部位，选择野生型蛋白G·B1或B2结构域的氨基酸序列中的Asp22、Thr25、Gln32、Asp40、及Glu42，作为与其对应的取代的氨基酸残基，选择Asp22His、Thr25His、Gln32His、Asp40His、及Glu42His，通过对蛋白G·B1或B2结构域的野生型氨基酸序列(SEQ ID NO: 1、2)进行任何1个氨基酸取代或组合这些氨基酸取代的至最大5个突变位置/5个取代的点突变或多重突变，可设计多个突变体蛋白质的氨基酸序列。上述的(g)、(h)的氨基酸序列显示这样的至最大5个突变位置/5个取代的点突变及多重突变，是本发明的突变体蛋白质的一个实例。
另外，作为除了对上述免疫球蛋白G的Fc区域的结合性的改良之外、进一步增加对Fab区域的结合性的改良的突变体蛋白质的实例，例如，可列举出对蛋白G·B1或B2结构域的野生型氨基酸序列进行最大7个突变位置/7个取代的突变的突变体蛋白，其中选择野生型蛋白G·B1或B2结构域的Thr11及Thr17，作为与其对应的取代的氨基酸残基，选择Thr11Arg及Thr17Ile，将它们添加到上述至最大5个突变位置/5个取代的突变而导入最大7个突变位置/7个取代。上述(d)及(e)的氨基酸序列显示这样的至最大7个突变位置/7个取代的点突变或多重突变的实例，这些氨基酸序列之中，具有Thr11Arg和/或Thr17Ile的突变，并且具有上述Asp22His、Thr25His、Gln32His、Asp40His、及Glu42His所示的突变之中任何一个以上的突变的氨基酸序列，除了对免疫球蛋白G的Fc区域的结合性的改良之外，进一步改良对Fab区域的结合性。
另一方面，上述(i)的氨基酸序列是野生型蛋白G·B3的突变体蛋白质的氨基酸序列的实例，但除了成为作为上述用于对Fc区域的结合性改良的突变的Asp22His、Thr25His、Gln32His、Asp40His中的任何1个以上、至最大4个突变位置/4个取代的突变之外，与(g)、(h)的氨基酸序列同样地设计。另外，上述(f)的氨基酸序列是野生型蛋白G·B3的突变体蛋白质的氨基酸序列的实例，但除了成为作为上述用于对Fc区域的结合性改良的突变的Asp22His、Thr25His、Gln32His、Asp40His，作为上述用于对Fab区域的结合性的改良的突变的Thr11Arg、Thr17Ile中的任何1个以上、至最大6个突变位置/6个取代的突变之外，与(d)、(e)的氨基酸序列同样地设计。
在本发明中，除了这样的突变之外，进一步可再添加已知使蛋白G的细胞膜外结构域的性质优化的突变。由本发明人等的从前的研究可知，例如，提高对蛋白G的细胞膜外结构域的热稳定性、对变性剂的化学稳定性、及对分解酶的抗性的突变方法(专利文献6)。即，Asn35Lys、Asp36Glu、Asn37His、Asn37Leu、Asp47Pro、Ala48Lys、及Ala48Glu中的一个以上的突变的导入提高蛋白G·B1、B2或B3结构域的上述稳定性。这些的突变可通过组合本发明中的用于对免疫球蛋白G的Fc区域的结合特性和/或对Fab区域的结合特性的改良的上述突变，使本发明的突变体蛋白质变得更有用。
例如，通过对蛋白G·B1或B2结构域的野生型氨基酸序列(SEQ ID NO: 1，2)进行将这些突变添加到上述的最大7个突变位置/7个取代而导入的至最大12个突变位置/14个取代的多重突变，可设计进一步稳定化的多个突变体蛋白质的氨基酸序列。
上述的(a)、(b)的氨基酸序列显示这样的最大12个突变位置/14个取代的点突变及多重突变，但排除添加到野生型的序列而仅用于稳定化的突变。
这些(a)、(b)的氨基酸序列中，Asn35Lys、Asp36Glu、Asn37His、Asn37Leu、Asp47Pro、Ala48Lys及Ala48Glu之中的任何一个以上的突变的导入，除了作为上述的最大7个突变位置/7个取代的效果的对免疫球蛋白G的Fab区域的结合特性和/或对Fc区域在弱酸性区域的结合特性的改良之外，还提高蛋白G·B1或B2结构域突变体蛋白质的稳定性。
另一方面，上述(c)显示野生型蛋白G·B3的突变体蛋白质的氨基酸序列的实例，显示最大11个突变位置/13个取代的点突变及多重取代，但除了成为上述用于对Fc区域的结合性改良用的突变的Asp22His、Thr25His、Gln32His、Asp40His中的任何1个以上、至最大4突变位置/4个取代的突变之外，与(a)、(b)的氨基酸序列同样地设计。从而，(c)的氨基酸序列中，Asn35Lys、Asp36Glu、Asn37His、Asn37Leu、Asp47Pro、Ala48Lys及Ala48Glu之中，任何一个以上的突变的导入，除了对免疫球蛋白G的Fab区域的结合特性和/或对Fc区域在弱酸性区域的结合特性的改良之外，同样地提高蛋白G·B3结构域突变体蛋白质的稳定性。
本发明中的突变对象部位，如上所述使用蛋白G的B2结构域-Fc复合物及同B3结构域-Fab复合物的各立体结构原子座标数据选定，但B1结构域不仅是在氨基酸序列(图2)、在立体结构上也与B2结构域几乎无差异，所以上述选定的突变的效果对各自的结构域等同有效。另外，B3结构域，不仅在氨基酸序列(图2)、在立体结构上也与B2结构域几乎无差异，所以B2结构域中的上述选定的突变的效果对各结构域等同有效。
例如，上述选定的12个突变位置的野生型氨基酸残基在上述B2结构域和上述B1结构域之间全部共同。从而，对与B2结构域同一性高的B1氨基酸序列导入将上述选定的5个突变位置/5个取代、或者7个突变位置/7个取代、或者12个突变位置/14个取代组合的点突变及多重突变，可作为B1结构域的突变体蛋白质的氨基酸序列。另外，上述选定的12个突变位置的野生型氨基酸只要除去42位，在上述B2结构域和上述B3结构域之间全部共同(42位的野生型氨基酸残基在B2结构域中是Glu42、在B3结构域中是Val42)。从而，对与B2结构域同一性高的B3结构域的氨基酸序列，导入将从上述选定的5个突变位置/5个取代、或者7个突变位置/7个取代、或者12个突变位置/14个取代除去仅42位的突变位置的4个突变位置/4个取代、或者6个突变位置/6个取代、或者11个突变位置/13个取代组合的点突变及多重突变，可作为B3结构域的突变体蛋白质的氨基酸序列。这如后述实施例中所示，还可从使用蛋白G的B2结构域-Fc复合物及同B3结构域-Fab复合物的各立体结构原子座标数据选定的B1结构域的突变体蛋白质具有期望的性能得知。
以上，本发明的突变体蛋白质的氨基酸序列不限于一个，存在多个，这些之中，具体示例优选的序列时，例如，可列举出，［SEQ ID NO: 13］、[SEQ ID NO: 14]、［SEQ ID NO:15］、[SEQ ID NO: 16]、［SEQ ID NO: 17］、[SEQ ID NO: 18]、［SEQ ID NO: 19］、或者［SEQID NO: 20］所示的氨基酸序列。
[SEQ ID NO: 13]所示的突变体蛋白质是，对［SEQ ID NO: 1］所示的蛋白G·B1结构域的野生型氨基酸序列，向从发明人等的从前的研究得知提高对蛋白G的细胞膜外结构域的热稳定性、对变性剂的化学稳定性、及对分解酶的抗性的部位导入突变的蛋白质，［SEQID NO: 14］、[SEQ ID NO: 15]、［SEQ ID NO: 19］、及［SEQ ID NO: 20］所示的突变体蛋白质是，除此之外，向基于与Fc的结合表面解析选定的部位导入突变的蛋白质。
另一方面，［SEQ ID NO: 16］、[SEQ ID NO: 17]、及［SEQ ID NO: 18］所示的突变体蛋白质是，对［SEQ ID NO: 1］所示的蛋白G·B1结构域的野生型氨基酸序列，向由发明人等的从前的研究得知提高蛋白G的细胞膜外结构域的热稳定性、对变性剂的化学稳定性、及对分解酶的抗性的部位，和基于Fab的结合表面解析选定的部位导入突变的蛋白质。
本发明的突变体蛋白质只要对抗体或免疫球蛋白G或具有免疫球蛋白G的Fc区域的蛋白质具有结合活性，与野生型的蛋白G的各细胞膜外结构域蛋白质相比，至少，对免疫球蛋白G的Fab区域的结合活性和/或对Fc区域在弱酸性区域的结合活性降低，则在上述本发明的突变体蛋白质中任何一个所示的氨基酸序列中，一个或多个(例如，2个～5个)的氨基酸残基可发生缺失、取代、插入、添加等的突变，从而，它们对成为基准的各氨基酸序列的序列同一性是90%以上、优选为95%以上、更优选为98%以上。
进一步，作为以下实施例中使用的蛋白质中含有的结构域突变体，可列举出具有以下特定氨基酸序列[SEQ ID NO:19]的多肽。
(j)AspThrTyrLysLeuIleLeuAsnGlyLysThrLeuLysGlyGluThrThrThrGluAlaValAspAlaAlaThrAlaGluLysValPheLysHisTyrAlaAsnGluHisGlyValHisGlyHisTrpThrTyrAspProGluThrLysThrPheThrValThrGlu。
另外，本发明的蛋白质也可作为由在N末端侧或C末端侧连结任意其他蛋白质的氨基酸序列而成的融合型氨基酸序列组成的融合蛋白质。例如，也可作为[氨基酸序列(a)]-接头序列E-蛋白A，或者，蛋白质B-接头序列F-[氨基酸序列(a)]-接头序列G-蛋白质C-接头序列H-[氨基酸序列(c)]。作为这样的融合蛋白质中使用的其他氨基酸序列，例如，可列举出［SEQ ID NO:31］所示的草酰乙酸脱羧酶α-亚基c-末端结构域(OXADac)的氨基酸序列。此时的OXADac-蛋白G 突变体融合蛋白质在单一分子中可以具有来源于OXADac区域的亲和素结合活性和来源于蛋白G突变体区域的抗体结合活性的多个功能。
例如，以His标签附带或与其他蛋白质的融合蛋白质的形态合成本发明的蛋白质时，即使合成之后将标签和突变体蛋白质之间、或者其他蛋白质和本发明的蛋白质之间用序列特异性蛋白分解酶分解，也有在本发明的蛋白质的N末端侧或C末端侧残留1个至多个氨基酸残基的情况，另外，在使用大肠杆菌等生产本发明的蛋白质的过程中，可以在N末端侧添加起始密码子来源的甲硫氨酸等，通过这些的氨基酸残基的添加，如下所示，本发明的蛋白质的活性不变。另外，通过这些氨基酸残基的添加，也不会丧失设计的突变带来的效果。因此，本发明的蛋白质当然也含有这些突变。需要说明的是，为了制成无这样的氨基酸残基的添加的本发明的蛋白质，例如，可将使用大肠杆菌等生产的蛋白质进一步使用甲硫氨酰氨基肽酶等酶来选择性地切断N末端的氨基酸残基(参考文献7)、由反应混合物通过层析等分离纯化而得到。
本说明书中，除了用接头键合对具有免疫球蛋白G(IgG)的Fc部分的蛋白质具有亲和力的多个结构域之间而成的蛋白质之外，也包括以上的融合蛋白质，也简称为“蛋白质”。本发明进一步涉及编码相关蛋白质的核酸、含有该核酸的重组载体、导入该重组载体的转化体。
另外，还涉及特征在于上述蛋白质被固定化到水不溶性的固相支持体的免疫球蛋白G或具有免疫球蛋白G的Fc区域或Fab区域的蛋白质(也称为“免疫球蛋白G等”)的捕获剂、含有该捕获剂的抗体、免疫球蛋白G等的纯化用亲和层析、使用该纯化用亲和层析来纯化免疫球蛋白G等的方法等。此处，“具有亲和力”是指例如，层析中可以吸附免疫球蛋白G等。如以下实施例中所示，通过使用本发明的蛋白质，能够充分吸附某种免疫球蛋白G，例如，人IgG的Fab片段及大鼠IgG，因此，上述捕获剂作为其纯化用捕获剂是特别非常有用的。
本发明的纯化方法中，为了利用上述蛋白质作为抗体互补剂，优选使用将填充剂填充于玻璃管等柱的亲和柱，所述填充剂为将蛋白质固定化到以琼脂糖珠为代表的水不溶性载体(水不溶性的固相支持体)而成。
作为吸附缓冲液，只要使用pH为中性附近的缓冲液且所用盐类能够调节pH，则任何皆可，代表性地使用将氯化钠等电解质溶解于磷酸缓冲液、Tris缓冲液中的缓冲液。作为吸附缓冲液的pH，使用为9.0～6.5、优选为pH8.0～7.0的缓冲液。另外，作为洗脱缓冲液，只要在目标免疫球蛋白G等洗脱的pH区域即可，使用pH6.5～2.0的缓冲液。作为洗脱缓冲液的种类，可以是本领域技术人员公知的任意种类，作为代表例，可列举出磷酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、醋酸缓冲液、甘氨酸缓冲液等。
本发明的纯化方法中的操作本身可以用本领域技术人员公知的通常的操作来实施。即，与通常的亲和纯化相同，首先，将含有待纯化的免疫球蛋白G等的样品溶液注入用吸附缓冲液稳定化了的柱中，使免疫球蛋白G等吸附于上述填充剂。然后，用吸附缓冲液洗去柱中残留的非吸附成分之后，用洗脱缓冲液洗脱吸附的免疫球蛋白G等，将免疫球蛋白G等回收于洗脱液中。需要说明的是，吸附缓冲液及洗脱缓冲液的流量(流速)及柱温度等其他亲和纯化的条件可以由本领域技术人员适当决定。
只要样品溶液是血清・腹水培养液等含有免疫球蛋白G等的物质，其来源・其他成分没有限制。进一步，本发明的纯化方法中，作为纯化手段，只要利用含有结构域突变体(人工突变的结构域)的蛋白质与免疫球蛋白G等之间的亲和力即可，除了使用柱的方法以外，还可以使用免疫沉淀法、该蛋白质固定化到磁珠等本领域技术人员公知的任意手段。
作为本发明中的蛋白质中含有的野生型蛋白G・B1结构域的突变体的优选例，可列举出上述专利文献8中记载的突变体蛋白质。这样的突变体蛋白质，根据专利文献7或专利文献8中记载的方法，只要是本领域技术人员，就可以用例如以下的方法容易地制备。
1.蛋白质的制备
(1) 利用基因工程学方法的蛋白质的制备
a.编码突变体蛋白质的基因
在本发明中为了制备上述设计的蛋白质，可使用基因工程学方法。
这样的方法中使用的基因是由编码下列的核酸组成：上述A～C中所示的蛋白质、更具体而言，上述(a)～(i)中的任一个所示的氨基酸序列；或者在(a)～(i)中任何一个所示的氨基酸序列中1或多个氨基酸残基具有缺失、取代或添加的氨基酸序列的蛋白质，其与抗体或免疫球蛋白G或具有免疫球蛋白G的Fc区域的蛋白质具有结合活性，并且与中性区域相比在弱酸性区域的结合活性降低；例如，更具体而言，是由［SEQ ID NO: 22］～［SEQ IDNO: 29］所示的任一个的碱基序列组成的核酸。
另外，作为本发明中使用的基因，可列举出与由与以上的核酸的碱基序列互补的序列组成的核酸在严格的条件下杂交的核酸，其编码对抗体或免疫球蛋白G或具有免疫球蛋白G的Fc区域的蛋白质具有结合活性、并且与对应的各野生型蛋白G・细胞膜外结构域蛋白质相比对免疫球蛋白G的Fab区域的结合活性和/或对Fc区域在弱酸性区域的结合活性降低的上述突变体蛋白质。此处，严格的条件是指，形成特异性的杂交体，不形成非特异性的杂交体的条件。例如，是指具有高同一性(同一性为60%以上、优选为80%以上、更优选为90%以上、最优选为90%以上)的核酸杂交的条件。更具体而言是指，钠浓度为150～900mM、优选为600～900mM，温度为60～68℃、优选为65℃的条件。例如，杂交条件是65℃，清洗的条件是在含有0.1%SDS的0.1×SSC中65℃、10分钟的情况下，利用惯例方法、例如DNA印迹、点印迹杂交等确认杂交情况下，称之为在严格的条件下杂交。
作为编码本发明的蛋白质的基因，根据本发明的蛋白质的希望的结构，含有以上的核酸和编码上述任意的接头序列的核酸。也可为编码构成串联型多聚体的各突变体蛋白质的核酸和编码接头序列的核酸分别交替多个连结，或者也可将该核酸和编码任意的蛋白质的氨基酸序列的核酸连结，设计为编码融合型氨基酸序列。
b.基因、重组载体及转化体
上述本发明的基因可利用化学合成、PCR、盒突变法、位点特异性突变导入法等合成。例如，可通过化学合成多个在末端具有20个碱基对左右的互补区域的至100个碱基左右的寡核苷酸，将这些组合进行重叠延伸法(参考文献8)来全部合成目标基因。
本发明的重组载体可通过向适当的载体连结(插入)含有上述碱基序列的基因而得到。作为本发明中使用的载体，只要是可在宿主中复制的或可将目标基因整合进宿主基因组的，就没有特别限定。例如，可列举出噬菌体、质粒、粘粒、噬菌粒等。
作为质粒DNA，可列举出放线菌来源的质粒(例如pK4，pRK401，pRF31等)、大肠杆菌来源的质粒(例如pBR322，pBR325，pUC118，pUC119，pUC18等)、枯草芽孢杆菌来源的质粒(例如pUB110，pTP5等)、酵母来源的质粒(例如YEp13，YEp24，YCp50等)等，作为噬菌体DNA，可列举出λ噬菌体(λgt10、λgt11、λZAP等)。进一步，也可使用逆转录病毒或痘苗病毒等的动物病毒、杆状病毒等的昆虫病毒载体。
为了在载体中插入基因，首先采用，将纯化的DNA用适当的限制酶切断，插入适当的载体DNA的限制酶部位或多克隆位点而连结到载体的方法等。基因有必要以表达本发明的突变体蛋白质的方式整合入载体。此处，在本发明的载体中，除启动子、基因的碱基序列之外，根据期望可连结增强子等的顺式元件、剪接信号、聚A添加信号、选择标志、核糖体结合序列(SD序列)、起始密码子、终止密码子等。另外，也可连结用于容易进行制备的蛋白质的纯化的标签序列。作为标签序列，可利用编码His标签、GST标签、MBP标签、BioEase标签等的公知的标签的碱基序列。
是否基因被插入载体的确认可利用公知的基因工程学技术进行。例如，在质粒载体等的情况中，可通过使用感受态细胞将载体亚克隆，提取DNA后，使用DNA测序仪确定其碱基序列来确认。对于其他载体也可使用细菌或其他宿主进行亚克隆，可利用同样的方法。另外，利用药剂抗性基因等的选择标志物的载体筛选也是有效的。
转化体可通过将本发明的重组载体以本发明的突变体蛋白质可表达的方式导入宿主细胞来得到。作为转化中使用的宿主，只要可表达蛋白质或多肽，就没有特别限定。例如，可列举出细菌(大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等)、酵母、植物细胞、动物细胞(COS细胞、CHO细胞等)、昆虫细胞。
在以细菌作为宿主时，优选重组载体可在该细菌中自主复制的同时，由启动子、核糖体结合序列、起始密码子、编码本发明的突变体蛋白质的核酸、转录终止序列构成。作为大肠杆菌，例如，可列举出大肠杆菌(Escherichia coli)BL21等，作为枯草芽孢杆菌，例如，可列举出枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)等。对于向细菌导入重组载体的方法，只要是向细菌导入DNA的方法，就没有特别限定。例如可列举出热休克法、使用钙离子的方法、电穿孔法等。
以酵母作为宿主时，使用例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)等。向酵母导入重组载体的方法，只要是向酵母导入DNA的方法，就没有特别限定，例如，可列举出电穿孔法、原生质球法、醋酸锂法等。
以动物细胞作为宿主时，使用猴细胞COS-7、Vero、中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)、小鼠L细胞、大鼠GH3、人FL细胞等。作为向动物细胞导入重组载体的方法，例如，可列举出电穿孔法、磷酸钙法、脂转染法等。
以昆虫细胞作为宿主时，使用Sf9细胞等。作为向昆虫细胞导入重组载体的方法，例如，可列举出磷酸钙法、脂转染法、电穿孔法等。
基因是否被导入宿主的确认可利用PCR法、DNA杂交法、RNA杂交法等进行。例如，从转化体制备DNA，设计DNA特异性引物来进行PCR。接下来，对于PCR的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳或毛细管电泳等，利用溴化乙啶、SyberGreen液等染色，通过作为1条条带而检测扩增产物，可确认转化。另外，也可使用预先利用荧光染料等标记的引物进行PCR，检测扩增产物。
c. 利用转化体培养的蛋白质的取得
在作为重组蛋白质制备时，本发明的蛋白质可通过培养上述转化体、从该培养物采集而得到。培养物是指，培养上清、培养细胞或培养菌体或细胞或菌体的破碎物中的任一种。培养本发明的转化体的方法根据宿主的培养中使用的通常方法来进行。
培养以大肠杆菌、酵母菌等微生物作为宿主而得到的转化体的培养基含有微生物可利用的碳源、氮源、无机盐类等，只要是可有效进行转化体的培养的培养基，可使用天然培养基、合成培养基中的任一种。作为碳源，可列举出葡萄糖、果糖、蔗糖、淀粉等的碳水化物，醋酸、丙酸等的有机酸，乙醇、丙醇等的醇类。作为氮源，除了氨、氯化铵、硫酸铵、醋酸铵、磷酸铵等的无机酸或有机酸的铵盐或其他含氮化合物之外，还可列举出胨、肉提取物、玉米浆等。作为无机物，可列举出磷酸一钾、磷酸二钾、磷酸镁、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、硫酸锰、硫酸铜、碳酸钙等。培养，通常在振荡培养或通气搅拌培养等的好氧的条件下，于20～37℃进行12小时～3天。
培养后，在菌体内或细胞内生产本发明的蛋白质时，通过重复实施超声波处理、冷冻融解，均浆器处理等破碎菌体或细胞而采集该蛋白质。另外，在菌体外或细胞外生产该蛋白质时，直接使用培养液，或利用离心分离等除去菌体或细胞。其后，通过单独或适宜组合使用蛋白质的分离纯化中使用的一般生物化学方法，例如硫酸铵沉淀、凝胶层析、离子交换层析、亲和层析等，可从上述培养物中分离纯化本发明的蛋白质。
另外，利用混合仅仅蛋白质的生物合成反应中涉及的因子(酶、核酸、ATP、氨基酸等)的所谓的无细胞合成系统时，不使用活细胞，可由载体在试管内合成本发明的突变体蛋白质(参考文献9)。其后，使用与上述同样的纯化法，可从反应后的混合溶液分离纯化本发明的突变体蛋白质。
为了确认分离纯化的本发明的蛋白质是否是由目标氨基酸序列组成的蛋白质，分析含有该蛋白质的样品。作为分析方法，可利用SDS-PAGE、蛋白印迹、质谱分析、氨基酸分析、氨基酸测序仪等(参考文献10)。
(2)利用其他方法的蛋白质的制备
本发明的蛋白质也可利用有机化学方法、例如固相肽合成法等制备。利用这样的方法的蛋白质的生产方法在现有技术领域公知，以下进行简洁说明。
利用固相肽合成法化学制备蛋白质时，优选利用自动合成机，通过重复活化的氨基酸衍生物的缩聚反应，在树脂上合成具有本发明的蛋白质的氨基酸序列的保护多肽。接下来，将此保护多肽从树脂上切断，则一同地侧链的保护基也同时切断。已知在此切断反应中，根据树脂、保护基的种类、氨基酸的组成，存在适宜的混合物(参考文献11)。此后，从有机溶剂层将粗纯化蛋白质移到水层，纯化目标蛋白质。作为纯化法，可利用逆相层析等(参考文献11)。
2.蛋白质的固定化
本发明纯化方法中使用的蛋白质，利用其抗体结合性，作为抗体等的捕获剂进行利用。
本发明的抗体捕获剂只要含有本发明的蛋白质，就可为任何形态，优选为，将本发明的突变体蛋白质固定化到水不溶性的固相支持体的形态是适宜的。作为使用的水不溶性载体，可列举出玻璃珠、硅胶等的无机载体，交联聚乙烯基醇、交联聚丙烯酸酯、交联聚丙烯酰胺、交联聚苯乙烯等的合成高分子，结晶性纤维素、交联纤维素、交联琼脂糖、交联葡聚糖等的多糖类制成的有机载体，还有由这些的组合得到的有机-有机、有机-无机等的复合载体等，其中，亲水性载体非特异吸附比较少，抗体或免疫球蛋白G或具有免疫球蛋白G的Fc区域的蛋白质的选择性良好，故而优选。此处所述的亲水性载体是指，使构成载体的化合物成为平板状时与水的接触角是60度以下的载体。作为这样的载体，可列举出纤维素、壳聚糖、葡聚糖等的多糖类，聚乙烯基醇、乙烯-醋酸乙烯酯共聚物皂化物、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚甲基丙烯酸甲酯、聚丙烯酸接枝化聚乙烯、聚丙烯酰胺接枝化聚乙烯、玻璃等制成的载体作为代表例。
作为市售品，可例示作为多孔质纤维素凝胶的GCL2000、GC700、用共价键交联烯丙基葡聚糖和亚甲基双丙烯酰胺的Sephacryl S-1000、作为丙烯酸系的载体的Toyopearl、作为琼脂糖系的交联载体的SepharoseCL4B、作为由环氧基活化的聚甲基丙烯酰胺的EupergitC250L等。然而，在本发明中不仅限于这些载体、活化载体。上述载体可各自单独使用，也可将任意2种以上混合。另外，作为本发明中使用的水不溶性载体，从本抗体捕获剂的使用目的及方法来看，表面积大是期望的，具有多数适当大小的细孔即多孔质是优选的。
作为载体的形态，珠状、纤维状、膜状(也包括中空丝)等均可，可选任意的形态。从具有特定的排除极限分子量的载体制作的容易度来看，特别优选使用珠状。对于珠状的平均粒径，10～2500µm的平均粒径容易使用，尤其是，从配体固定化反应的容易度的观点来看，25µm～800µm的范围是优选的。
进一步，在载体表面存在在配体的固定化反应中使用的官能基时，适合于配体的固定化。作为这些官能基的代表例，可列举出羟基、氨基、醛基、羧基、巯基、硅烷醇基、酰胺基、环氧基、琥珀酰亚胺基、酸酐基、碘乙酰基等。
在向上述载体的突变体蛋白质的固定化中，通过使突变体蛋白质的立体障碍变小来提高捕捉效率，进一步，为了抑制非特异性的结合，经由亲水性间隔物进行固定化是更优选的。作为亲水性间隔物，例如，使用将两末端用羧基、氨基、醛基、环氧基等取代的聚亚烷基氧化物的衍生物是优选的。
导入上述载体的突变体蛋白质及作为间隔物使用的有机化合物的固定化方法及条件没有特别限定，一般而言例示将蛋白质、肽固定化到载体时采用的方法。可列举出使载体与溴化氰、表氯醇、二缩水甘油基醚、甲苯磺酰氯化物、三氟乙磺酰氯化物、肼等反应而活化载体(由载体原本具有的官能基变成作为配体固定化的化合物易反应的官能基)、与作为配体固定化的化合物反应、固定化的方法，另外，通过向载体和作为配体固定化的化合物存在的系统添加如碳二亚胺一样的缩合试剂或者如戊二醛一样分子中具有多个官能基的试剂而缩合、交联的固定化方法，但适用在捕获剂的灭菌时或利用时蛋白类不容易从载体脱离的固定化方法是更优选的。
3. 蛋白质及抗体捕获剂的性能确认试验
如上所述制备的突变体蛋白质及蛋白质(以下，也简称为“蛋白质”)、及抗体捕获剂可进行以下的性能确认试验选择良好的物质，本发明的蛋白质及抗体捕捉材料均具有良好的性能。
(1)抗体结合性试验
本发明的蛋白质的抗体结合性可利用蛋白印迹、免疫沉降、拉下测定(pull-downassay)、ELISA(酶联免疫吸附测定)、表面等离子体共振(SPR)法等进行确认・评价。其中，SPR法由于可无需标记地实时经时观察活体间的相互作用，所以可从速度论的观点定量评价突变体蛋白质的结合反应。
另外，固定化到水不溶性的固相支持体的突变体蛋白质的抗体结合性可用上述SPR法、液相层析法进行确认・评价。其中，液相层析法可的确地评价给抗体结合性带来的pH依赖性。
(2) 蛋白质的热稳定性试验
本发明的突变体蛋白质的热稳定性可利用圆二色性(CD)光谱、荧光光谱、红外分光法、示差扫描热量测定法、加热后的残留活性等进行评价。其中，CD光谱由于是敏锐反映蛋白质的二级结构的变化的分光学分析方法，所以观测突变体蛋白质对温度的立体结构的变化，可热力学地定量评价结构稳定性。
〔参考文献〕
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参考文献11；大野茂男、西村善文监修(1997)蛋白质实验流程2-结构解析编、秀润社。
需要说明的是，在本说明书中，各种氨基酸残基用以下的缩写记载。Ala；L-丙氨酸残基、Arg；L-精氨酸残基、Asp；L-天冬氨酸残基、Asn；L-天冬酰胺残基、Cys；L-半胱氨酸残基、Gln；L-谷氨酰胺残基、Glu；L-谷氨酸残基、Gly；L-甘氨酸残基、His；L-组氨酸残基、Ile；L-异亮氨酸残基、Leu；L-亮氨酸残基、Lys；L-赖氨酸残基、Met；L-甲硫氨酸残基、Phe；L-苯丙氨酸残基、Pro；L-脯氨酸残基、Ser；L-丝氨酸残基、Thr；L-苏氨酸残基、Trp；L-色氨酸残基、Tyr；L-酪氨酸残基、Val；L-缬氨酸残基。另外，在本说明书中，将肽的氨基酸序列，以其氨基末端(以下称为N末端)位于左侧、羧基末端(以下称为C末端)位于右侧的方式，根据常规方法进行记述。
更具体而言，专利文献8中具体公开了以下内容。
实施例1中记载了基于[SEQ ID NO:1]所示的蛋白G・B1结构域的野生型氨基酸序列、[SEQ ID NO:2]所示的蛋白G・B2结构域的野生型氨基酸序列及[SEQ ID NO:3]所示的蛋白G・B3结构域的野生型氨基酸序列，选定用于设计向蛋白G的B1、B2、或B3结构域中导入突变的用于本发明中的蛋白质中含有的突变体蛋白质(此后称为“改性蛋白G”)的氨基酸序列的导入突变的部位，特别指定取代的氨基酸残基。
实施例2中记载了利用选定的突变对象部位和上述特定的取代的氨基酸残基的信息来设计[SEQ ID NO:4] ～[SEQ ID NO:19]所示的多个改性蛋白G的氨基酸序列，进一步，最终选择[SEQ ID NO:13]～[SEQ ID NO:20]作为具体的氨基酸序列，实际合成显示该序列的改性蛋白G，评价其分子特性。
实施例3中记载了使用编码改性蛋白G的氨基酸序列的核酸的碱基序列([SEQ IDNO:13]～[SEQ ID NO:20])及草酰乙酸脱羧酶α-亚基c-末端结构域 (OXADac)的碱基序列[SEQ ID NO:31] 的突变体蛋白质的碱基序列。
实施例4中记载了使用由[SEQ ID NO:21]～[SEQ ID NO:29]的碱基序列组成的PG基因，合成含有编码改性蛋白G的基因的质粒载体，然后使用大肠杆菌来制备草酰乙酸脱羧酶α-亚基c-末端结构域(OXADac) [SEQ ID NO:31]与突变体蛋白质的融合蛋白质。
实施例5中记载了使用各种引物([SEQ ID NO:32]～[SEQ ID NO:35])，合成含有编码改性蛋白G的基因的质粒载体，然后使用大肠杆菌制备Met添加改性蛋白G。
实施例6中记载了用聚丙烯酰胺凝胶电泳法确认改性蛋白G的纯度；实施例7中记载了通过用MALDI-TOF型质谱分析仪测量改性蛋白G的分子量鉴定制备的蛋白质；实施例8中记载了通过使用固定化OXADac-PG融合蛋白质的柱进行pH 梯度亲和层析、研究单克隆抗体洗脱的pH而评价改性蛋白G在弱酸性区域的抗体解离性；实施例9中记载了通过使用固定化OXADac-PG融合蛋白质的柱进行逐步pH亲和层析、以几个pH研究单克隆抗体的洗脱而评价改性蛋白G在弱酸性区域的抗体解离性；实施例10中记载了利用表面等离子体共振(SPR)法评价突变体蛋白质(蛋白G突变体)的结合解离性；实施例11中记载了在中性区域、及组氨酸残基的95%以上质子化的弱酸性区域，利用表面等离子体共振(SPR)法评价突变体蛋白质的抗体结合性；实施例12中记载了评价突变体蛋白质的热稳定性；实施例13中记载了制成突变体蛋白质的单晶，利用Ｘ射线衍射解析确定立体结构。
进一步，实施例14中记载了使用掺入编码在羧基末端侧添加半胱氨酸残基、His标签的三聚体野生型PG(CGB01H-3D，SEQ ID NO:36)或作为本发明的蛋白质的突变型PG的串联型三聚体(CGB19H-3D，SEQ ID NO:37)的基因的2种人工合成质粒，制备蛋白G的细胞膜外结构域突变体的串联型多聚体及制成使用该蛋白质的亲和层析柱及利用该柱纯化人IgG1抗体或IgG3抗体等。
实施例15中记载了关于与IgG1类型的人源化单克隆抗体的抗体结合解离性比较蛋白G的细胞膜外结构域突变体的串联型多聚体和同单聚体。
实施例16中记载了使用掺入编码在羧基末端添加半胱氨酸残基、His标签的突变型PG的单聚体突变型PG(CGB19H-1D、图4、SEQ ID NO:38)、突变型PG的串联型四聚体PG(CGB19H-4D、图4、SEQ ID NO:39)、及突变型PG的串联型五聚体PG(CGB19H-5D、图4、SEQ IDNO:40)的基因的3种人工合成表达用质粒，制备蛋白G的细胞膜外结构域突变体的单聚体及串联型四聚体、五聚体。
实施例17中记载了将蛋白G的细胞膜外结构域突变体的单聚体及串联型多聚体经由羧基末端的半胱氨酸残基固定化到固相，利用SPR法比较评价各突变蛋白质对IgG1类型的人源化单克隆抗体的抗体结合性。
以下，使用实施例来具体说明本发明。然而，本发明的技术范围不限定于这些实施例。
实施例1
蛋白G的细胞膜外结构域突变体串联型二聚体的制备
本实施例中制备了本发明的接头长度不同的蛋白G的细胞膜外结构域突变体串联型二聚体。
合成了掺入编码在羧基末端添加半胱氨酸残基及His标签、在结构域之间含有限制酶识别部位的以由甘氨酸及丝氨酸组成的6残基为单位的10次重复的60残基接头的二聚体突变型PG(PG2LL10，图1，SEQ ID NO:41)基因的表达用质粒。接下来，基于Evers等的方法(非专利文献9)通过利用接头序列内存在的限制酶部位的部分消化反应和随后环状化反应制备编码接头长度不同的二聚体突变型PG(PG2LL7、PG2LL6、PG2LL5、PG2LL4、PG2LL1，图1，SEQ ID NO:42～46)的表达用质粒。利用各种接头长度的二聚体突变型PG质粒转化表达用大肠杆菌BL21(DE3)株(Novagen)。将预培养的转化体以2ml / 200ml在2YT培养基中传代，振荡培养至达到 O.D.600=0.8～1.0为止。为了表达目标蛋白质，添加0.5mM IPTG，进一步在37℃振荡培养2小时。将回收的菌体悬浮于10mL的PBS中，进行超声波破碎后过滤灭菌，将其作为全蛋白质溶液。使重组PG吸附于Ni Sepharose(GE Healthcare)2ml柱，用20mM咪唑清洗后，用500mM 咪唑洗脱，作为纯化蛋白质。
实施例2
蛋白G的细胞膜外结构域突变体串联型二聚体的抗体结合性的评价
本实施例中，将本发明的接头长度不同的蛋白G的细胞膜外结构域突变体(SEQ ID NO:19)的串联型二聚体经由位于羧基末端的半胱氨酸残基固定化到固相，利用SPR法比较评价各突变蛋白质的抗体结合性。
首先，将实施例1中制备的接头长度不同的蛋白G的细胞膜外结构域突变体串联型二聚体(PG2LL1、PG2LL4、PG2LL5、PG2LL6、PG2LL7、PG2LL10)各自利用使用EMCH (N-[ε-马来酰亚胺己酸]酰肼，三氟乙酸)(Thermo scientific)的马来酰亚胺偶联法固定化到传感器芯片CM-5(GE Healthcare)的测定池。固定化量以使相同质量的蛋白质固定化的方式进行。接下来，将IgG1类型的人源化单克隆抗体溶解于运行缓冲液(10mM HEPES pH7.4，150mMNaCl，0.005%v/v表面活性剂P20)，调整 10μM和1μM的样品溶液。使用Biacore T100(GEHealthcare)，在反应温度25℃进行SPR测定(图2－1，图2－2)。
使样品抗体流过以相同质量固定化本发明的接头长度不同的蛋白G的细胞膜外结构域突变体串联型二聚体的芯片，500秒后，测定芯片上结合的抗体量，其结果，观察到随着接头长度增加，抗体结合率上升，在固定化含有42个残基的接头的二聚体(PG2LL7)的芯片上，见到最大的抗体结合率(图3)。另外，观察到样品抗体浓度減少和各接头长度间的抗体结合率的差异变大(图3)。由以上可知，本发明的串联型二聚体中，存在适合于有效结合样品抗体的接头长度。
实施例 3
蛋白G的细胞膜外结构域突变体的制备及使用该蛋白质的柱的制作
(1)重组PG的表达和纯化
利用实施例1中构建的突变体之中的PG2LL7 及专利文献8的实施例16中记载的含有作为在羧基末端添加半胱氨酸残基、His标签的串联型四聚体PG的rPG-A4(CGB19H-4D，SEQ IDNO:39)的基因的表达质粒转化的大肠杆菌在LB培养基中传代，振荡培养至达到O.D.600 =0.8～1.0为止。为了表达目标蛋白质，添加0.5mM IPTG，进一步在37℃振荡培养3小时。将回收的菌体悬浮于PBS 中，进行超声波破碎后离心，将所得上清作为全蛋白质溶液。使重组PG吸附于HisTrap FF (GE Healthcare Bioscience) 1ml柱，用20mM 咪唑清洗后，用500mM咪唑洗脱，作为纯化蛋白质。
(2)重组PG的固定化和柱制作
将Sepharose4FastFlow(GE Healthcare)用玻璃滤器过滤分离，用超纯水清洗而得到载体10ml。将载体移到烧瓶中，添加2M氢氧化钠水溶液3ml和丁二醇二缩水甘油醚4g，在25℃振荡4小时而进行反应。用玻璃滤器过滤分离，用超纯水清洗而得到活化载体。将活化载体1mL采集到玻璃滤器中，用偶联缓冲液(0.1M磷酸钠，1.0M硫酸钠，1mM EDTA，pH 8.0)清洗。将活化载体移到烧瓶中，添加重组PG(PG2LL7)为5.4mg/ml的含有重组PG的溶液1.5ml、偶联缓冲液2mL，在37℃以150rpm 振荡25小时而经由重组PG的半胱氨酸残基进行固定化。用玻璃滤器过滤分离，用偶联缓冲液清洗。接下来将载体移到烧瓶中，添加1M硫代甘油、0.1M磷酸钠、1mM EDTA、pH8.0的溶液3ml，在37℃以150rpm振荡4小时而遮蔽未反应活性基团。用玻璃滤器过滤分离，用清洗液1(0.1M Tris盐酸，0.5M 氯化钠，pH8.0)、清洗液2(0.1M醋酸，0.5M氯化钠，pH4.0) 15ml 交替清洗3个循环。将固定化载体1ml用超纯水清洗，填装到Tricon 5/50柱。另外，rPG-A4也通过与PG2LL7相同的操作制作柱。
实施例 4
重组PG固定化柱的抗体吸附容量
将实施例3中制作的重组PG固定化柱安装于液相层析装置AKTAexplore (GEHealthcare Bioscience)，使吸附缓冲液(20mM 磷酸缓冲液，150mM 氯化钠、pH7.2)在1mL/min 或0.4mL/min的条件下流过而平衡化之后，注入制备成1mg/mL的人IgG (东方酵母(オリエンタル酵母))。继续注入直至洗脱液的280nm处的吸光度达到注入样品的吸光度的15%为止，然后，用吸附缓冲液洗涤后，将吸附缓冲液置换为20 mM柠檬酸(pH2.4)。
从除去洗脱液的280 nm处的非吸附成分的吸光度达到注入样品的吸光度的10 %为止而注入的样品量计算动态结合容量(DBC)。各固定化柱的DBC显示于表1。发现PG2LL7和rPG-A4呈现基本上相同的DBC，通过延长接头部分、适当控制两末端的抗体结合结构域之间的距离而代替插入抗体结合结构域，显示高结合容量。
[表1]
实施例 5
pH梯度亲和层析
将重组PG固定化柱安装于液相层析装置AKTAexplore (GE Healthcare Bioscience)，使吸附缓冲液(20mM 磷酸缓冲液，150mM 氯化钠，pH7.2)在1 ml/min的条件下流过而平衡化之后，注入制备成1mg/mL的人IgG(东方酵母(オリエンタル酵母))。用吸附缓冲液清洗后，置换为20 mM柠檬酸缓冲液(pH6.0)，以1.0mL/min的流速经80min连续地置换为20mM 柠檬酸 (pH2.4)。
人IgG洗脱峰在PG2LL7固定化柱中为pH3.9附近，在rPG-A4固定化柱中为pH4.4附近(图4)。由此可知，PG2LL7固定化柱有与rPG-A4相同的DBC，同时能够在更温和的酸性条件下洗脱。
工业实用性
现在，野生型的蛋白G细胞膜外结构域作为抗体纯化用亲和层析载体或抗体检测用的检查试剂而市售，在生命科学各领域广泛利用。另外，随着近年的以抗体医药为首的抗体关联产业的发展，这些制品的需要飞跃性地扩大。因此，通过使用在中性区域的结合活性与以往的蛋白质至少相同、能够在弱酸性区域在更温和的条件下解离・洗脱免疫球蛋白的本发明的蛋白质来代替蛋白质Ｇ及蛋白质Ａ那样的野生型蛋白质、以及含有其结构域突变体的以往的突变型蛋白质(改性蛋白质)，能够降低伴随酸洗脱的抗体的劣化，在处理来源于各种动物物种的抗体的广泛技术领域中，大大有助于其技术发展。
Claims (27)
1.用接头键合对具有免疫球蛋白G(IgG)的Fc部分的蛋白质具有亲和力的多个结构域之间而成的蛋白质，其特征在于，该接头的最大限伸长的长度为80Å～240Å。
2.根据权利要求1所述的蛋白质，其中接头为多肽接头。
3.根据权利要求2所述的蛋白质，其特征在于，接头由22～66个氨基酸残基的多肽组成。
4.根据权利要求3所述的蛋白质，其中接头的氨基酸序列由GlyGlySerGlyGlySer的4～10个重复单位组成。
5.根据权利要求4所述的蛋白质，其中接头的氨基酸序列由GlyGlySerGlyGlySer的6～10个重复单位组成。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的蛋白质，其中结构域来源于蛋白G或蛋白A。
7.根据权利要求6所述的蛋白质，其中结构域为野生型蛋白G・B1、B2、或B3结构域中任一个的突变体。
8.根据权利要求1～7中任一项所述的蛋白质，其中结构域彼此相同。
9.根据权利要求1～8中任一项所述的蛋白质，其中2个结构域是键合而成的二聚体。
10.根据权利要求7～9中任一项所述的蛋白质，其中结构域突变体是以下的突变体蛋白质：
野生型蛋白G·B1结构域蛋白质的突变体蛋白质，其由以下的(a)所示的氨基酸序列组成，或由在(a)所示的氨基酸序列中1个或多个氨基酸残基缺失、取代、插入或添加的氨基酸序列组成，具有对免疫球蛋白G的Fc区域的结合活性，并且与野生型蛋白G·B1结构域蛋白质相比，至少对免疫球蛋白G的Fab区域的结合活性和/或对Fc区域在弱酸性区域的结合活性降低：
(上述氨基酸序列中，各自地，X35表示Asn或Lys，X36表示Asp或Glu，X37表示Asn、His、或Leu，X47表示Asp或Pro，X48表示Ala、Lys或Glu，X22表示Asp或His，X25表示Thr或His，X32表示Gln或His，X40表示Asp或His，X42表示Glu或His，X11表示Thr或Arg，X17表示Thr或Ile，但是，排除同时地X35是Asn或Lys、X36是Asp或Glu、X37是Asn或Leu、X47是Asp或Pro、X48是Ala、Lys或Glu、X22是Asp、X25是Thr、X32是Gln、X40是Asp、X42是Glu、X11是Thr、并且X17是Thr的情况)。
11.根据权利要求7～9中任一项所述的蛋白质，其中结构域突变体是以下的突变体蛋白质：
野生型蛋白G·B2结构域蛋白质的突变体蛋白质，其由以下的(b)所示的氨基酸序列组成，或由在(b)所示的氨基酸序列中1个或多个氨基酸残基缺失、取代、插入或添加的氨基酸序列组成，具有对免疫球蛋白G的Fc区域的结合活性，并且与野生型蛋白G·B2结构域蛋白质相比，至少对免疫球蛋白G的Fab区域的结合活性和/或对Fc区域在弱酸性区域的结合活性降低：
(上述氨基酸序列中，各自地，X35表示Asn或Lys，X36表示Asp或Glu，X37表示Asn、His、或Leu，X47表示Asp或Pro，X48表示Ala、Lys或Glu，X22表示Asp或His，X25表示Thr或His，X32表示Gln或His，X40表示Asp或His，X42表示Glu或His，X11表示Thr或Arg，X17表示Thr或Ile，但是，排除同时地X35是Asn或Lys、X36是 Asp或Glu、X37是Asn或His、X47是Asp或Pro、X48是Ala、Lys或Glu、X22是Asp、X25是Thr、X32是Gln、X40是Asp、X42是Glu、X11是Thr、并且X17是Thr的情况)。
12.根据权利要求7～9中任一项所述的蛋白质，其中结构域突变体是以下的突变体蛋白质：
野生型蛋白G·B3结构域蛋白质的突变体蛋白质，其由以下的(c)所示的氨基酸序列组成，或由在(c)所示的氨基酸序列中1个或多个氨基酸残基缺失、取代、插入或添加的氨基酸序列组成，具有对免疫球蛋白G的Fc区域的结合活性，并且与野生型蛋白G·B3结构域蛋白质相比，至少对免疫球蛋白G的Fab区域的结合活性和/或对Fc区域在弱酸性区域的结合活性降低：
(上述氨基酸序列中，各自地，X35表示Asn或Lys，X36表示Asp或Glu，X37表示Asn、His、或Leu，X47表示Asp或Pro，X48表示Ala、Lys或Glu、X22表示Asp或His，X25表示Thr或His，X32表示Gln或His，X40表示Asp或His，X11表示Thr或Arg，X17表示Thr或Ile，但是，排除同时地X35是Asn或 Lys、X36是Asp或Glu、X37是Asn或His、X47是Asp或Pro、X48是Ala、Lys或Glu、X22是Asp、X25是Thr、X32是Gln、X40是Asp、X11是Thr、并且X17是Thr的情况)。
13.根据权利要求7～9中任一项所述的蛋白质，其中结构域突变体是以下的突变体蛋白质：
野生型蛋白G·B1结构域蛋白质的突变体蛋白质，其由以下的(d)所示的氨基酸序列组成，或由在(d)所示的氨基酸序列中1个或多个氨基酸残基缺失、取代、插入或添加的氨基酸序列组成，具有对免疫球蛋白G的Fc区域的结合活性，并且，与野生型蛋白G·B1结构域蛋白质相比，对免疫球蛋白G的Fab区域的结合活性和/或对Fc区域在弱酸性区域的结合活性降低：
(上述氨基酸序列中，各自地，X22表示Asp或His，X25表示Thr或His，X32表示Gln或His，X40表示Asp或His，X42表示Glu或His，X11表示Thr或Arg，X17表示Thr或Ile，但是，排除同时地X22是Asp、X25是Thr、X32是Gln、X40是Asp、X42是Glu、X11是Thr、并且X17是Thr的情况)。
14.根据权利要求7～9中任一项所述的蛋白质，其中结构域突变体是以下的突变体蛋白质：
野生型蛋白G·B2结构域蛋白质的突变体蛋白质，其由以下的(e)所示的氨基酸序列组成，或由在(e)所示的氨基酸序列中1个或多个氨基酸残基缺失、取代、插入或添加的氨基酸序列组成，具有对免疫球蛋白G的Fc区域的结合活性，并且与野生型蛋白G·B2结构域蛋白质相比，对免疫球蛋白G的Fab区域的结合活性和/或对Fc区域在弱酸性区域的结合活性降低：
(上述氨基酸序列中，各自地，X22表示Asp或His，X25表示Thr或His，X32表示Gln或His，X40表示Asp或His，X42表示Glu或His，X11表示Thr或Arg，X17表示Thr或Ile，但是，排除同时地X22是Asp、X25是Thr、X32是Gln、X40是Asp、X42是Glu、X11是Thr、并且X17是Thr的情况)。
15.根据权利要求7～9中任一项所述的蛋白质，其中结构域突变体是以下的突变体蛋白质：
野生型蛋白G·B3结构域蛋白质的突变体蛋白质，其由以下的(f)所示的氨基酸序列组成，或由在(f)所示的氨基酸序列中1个或多个氨基酸残基缺失、取代、插入或添加的氨基酸序列组成，具有对免疫球蛋白G的Fc区域的结合活性，并且与野生型蛋白G·B3结构域蛋白质相比，对免疫球蛋白G的Fab区域的结合活性和/或对Fc区域在弱酸性区域的结合活性降低：
(上述氨基酸序列中，各自地，X22表示Asp或His，X25表示Thr或His，X32表示Gln或His，X40表示Asp或His，X11表示Thr或Arg，X17表示Thr或Ile，但是，排除同时地X22是Asp、X25是Thr、X32是Gln、X40是Asp、X11是Thr、并且X17是Thr的情况)。
16.根据权利要求7～9中任一项所述的蛋白质，其中结构域突变体是以下的突变体蛋白质：
野生型蛋白G·B1结构域蛋白质的突变体蛋白质，其由以下的(g)所示的氨基酸序列组成，或由在(g)所示的氨基酸序列中1个或多个氨基酸残基缺失、取代、插入或添加的氨基酸序列组成，具有对免疫球蛋白G的Fc区域的结合活性，并且与野生型蛋白G·B1结构域蛋白质相比，对Fc区域在弱酸性区域的结合活性降低：
(上述氨基酸序列中，各自地，X22表示Asp或His，X25表示Thr或His，X32表示Gln或His，X40表示Asp或His，X42表示Glu或His，但是，排除同时地X22是Asp、X25是Thr、X32是Gln、X40是Asp、并且X42是Glu的情况)。
17.根据权利要求7～9中任一项所述的蛋白质，其中结构域突变体是以下的突变体蛋白质：
野生型蛋白G·B2结构域蛋白质的突变体蛋白质，其由以下的(h)所示的氨基酸序列组成，或由在(h)所示的氨基酸序列中1个或多个氨基酸残基缺失、取代、插入或添加的氨基酸序列组成，具有对免疫球蛋白G的Fc区域的结合活性，并且与野生型蛋白G·B2结构域蛋白质相比，对Fc区域在弱酸性区域的结合活性降低：
(上述氨基酸序列中，各自地，X22表示Asp或His，X25表示Thr或His，X32表示Gln或His，X40表示Asp或His，X42表示Glu或His，但是，排除同时地X22是Asp、X25是Thr、X32是Gln、X40是Asp、并且X42是Glu的情况)。
18.根据权利要求7～9中任一项所述的蛋白质，其中结构域突变体是以下的突变体蛋白质：
野生型蛋白G·B3结构域蛋白质的突变体蛋白质，其由以下的(i)所示的氨基酸序列组成，或由在(i)所示的氨基酸序列中1个或多个氨基酸残基缺失、取代、插入或添加的氨基酸序列组成，具有对免疫球蛋白G的Fc区域的结合活性，并且与野生型蛋白G·B3结构域蛋白质相比，对Fc区域在弱酸性区域的结合活性降低：
(上述氨基酸序列中，各自地，X22表示Asp或His，X25表示Thr或His，X32表示Gln或His，X40表示Asp或His，但是，排除同时地X22是Asp、X25是Thr、X32是Gln、并且X40是Asp的情况)。
19.根据权利要求7～9中任一项所述的蛋白质，其中结构域突变体是具有以下的氨基酸序列(SEQ ID NO:19)的突变体蛋白质：
。
20.蛋白质，其为融合蛋白质，所述融合蛋白质由连结权利要求1～19中任一项所述的蛋白质的氨基酸序列和其他蛋白质的氨基酸序列的氨基酸序列组成。
21.根据权利要求20所述的蛋白质，其具有SEQ ID NO:41～45中任一个所示的氨基酸序列。
22.核酸，其编码权利要求1～21中任一项所述的蛋白质。
23.重组载体，其含有权利要求22所述的核酸。
24.转化体，其导入了权利要求23所述的重组载体。
25.免疫球蛋白G或具有免疫球蛋白G的Fc区域或Fab区域的蛋白质的捕获剂，其特征在于，权利要求1～21中任一项所述的蛋白质被固定化到水不溶性的固相支持体。
26.免疫球蛋白G或具有免疫球蛋白G的Fc区域或Fab区域的蛋白质的纯化用亲和层析，其含有权利要求25所述的捕获剂。
27.纯化免疫球蛋白G或具有免疫球蛋白G的Fc区域或Fab区域的蛋白质的方法，其使用权利要求26所述的纯化用亲和层析。
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| WO2015050153A1 (ja) | 2015-04-09 |
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| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20160727 |
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| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |