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CN105814080A - 特异于fcrn的抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明公开涉及特异于FcRn的抗体、包含其的制剂、各自在疗法中的用途、表达并可选地配制所述抗体的方法、编码这些抗体的DNA及包含所述DNA的宿主。

Description

特异于FCRN的抗体
本发明公开涉及特异于FcRn的抗体、包含其的制剂、各自在疗法中的用途、表达并可选地配制所述抗体的方法、编码这些抗体的DNA及包含所述DNA的宿主。
FcRn是膜蛋白FcRn的α链与β2微球蛋白(β2M)的非共价复合体。在成年哺乳动物中，FcRn作为结合并挽救IgG亚型抗体的受体在维持血清抗体水平上起到关键作用。IgG分子被内皮细胞内吞，并且如果其结合了FcRn则重新回收而从细胞中转移出去，进入例如循环。相反，未结合FcRn的IgG分子会进入细胞，并成为溶酶体途径的靶标而被降解。其中His435突变为丙氨酸的变体IgG1导致选择性丢失FcRn结合，并显著降低血清半衰期(Firan等人2001,InternationalImmunology13:993)。
有假说认为FcRn是至少部分由自身抗体引起的特定自身免疫障碍的潜在治疗靶标。目前对所述特定障碍的治疗方法包括血浆置换。有时同时采用血浆置换和免疫抑制疗法以长期控制所述疾病。血浆置换是最快移除有害自身抗体的短期方案。然而，抑制免疫系统产生自身抗体也是可取的，例如通过使用药物如泼尼松、环磷酰胺、环孢菌素、霉酚酸酯、利妥昔单抗或其混合物。
能通过血浆置换治疗的疾病的实例包括：格林-巴利综合征；慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病；肺出血肾炎综合征；高粘滞综合征；冷球蛋白血症；副蛋白血症；华氏巨球蛋白血症；重症肌无力；血栓性血小板减少性紫癜(TTP)/溶血性尿毒症综合症；韦格纳肉芽肿；兰伯特-伊顿综合征；抗磷脂抗体综合征(APS或APLS)；显微镜多血管炎；移植肾中复发性局灶节段性肾小球硬化；HELLP综合征；PANDAS综合征；雷弗素姆病；白塞氏综合征；HIV相关的神经病；在新生儿及婴幼儿中的Graves病；寻常型天疱疮；多发性硬化症、横纹肌溶解症和自身免疫疾病。
血浆置换有时被用作挽救疗法用于移除含有Fc的治疗剂，例如在需要减轻严重副反应的紧急情况下。
尽管血浆置换在特定医疗条件下是有用的，但该疗法可能有潜在的风险和并发症。插入相当大的静脉导管可导致出血、肺穿刺(取决于导管插入位点)，且如果导管置入时间过长，可导致感染和/或对静脉的损坏，这样就限制了重复此过程的可能性。
此过程还有其他相关的并发症，例如当患者血液流出身体通过血浆置换设备时，血液有凝结的倾向。为减少这种倾向，一个通用的操作流程是在血液流过循环线路的同时输注柠檬酸盐。柠檬酸盐结合血液中的钙，而钙对于血液凝结是关键。柠檬酸盐对于防止血液凝结十分有效，然而，使用它可能导致钙水平降低，甚至危及生命。这一点可由沃斯特克氏征或特鲁索氏征的症状而检测到。为防止这种并发症，在患者进行血浆置换的同时静脉内输注钙；此外，还可经口施用钙补充剂。
此过程的其他并发症包括：低血压；潜在的暴露于血液制品(这会伴随有输血反应或输血传染疾病风险)；患者免疫系统受抑制以及出血或更换针头导致的出血或血肿。
此外，提供血浆置换的机构有限，此过程亦非常昂贵。
血浆置换的一个备选方案为静脉注射免疫球蛋白(intravenousimmunoglobulin，IVIG)，这是一种含有提取自数千名献血者血浆的混合多克隆IgG的血液制品。该疗法在静脉内施用，持续时间区段为2周至3个月。
IVIG治疗的并发症包括头痛、皮炎、治疗剂产品污染导致的病毒感染，如HIV或肝炎病毒感染、肺水肿、过敏反应、急性肾衰竭、静脉血栓和无菌性脑膜炎。
因此，对那些更少侵入并让患者能较少发生医疗并发症的自身免疫障碍疗法有显著却未满足的需求。
这样，阻断或减少IgG对FcRn结合的试剂可用于治疗或预防所述自身免疫和炎性疾病。抗-FcRn抗体于在先专利WO2009/131702、WO2007/087289和WO2006/118772中有所描述。
然而，仍然有对改进的抗-FcRn抗体的需要。
发明概述
因此，在一方面，提供了抗-FcRn抗体或其结合片段，其包含重链或具有可变区的重链片段，其中所述可变区包含一个、两个或三个CDR，其独立地选自SEQIDNO:1、SEQIDNO:2和SEQIDNO:3，例如，其中CDRH1为SEQIDNO:1、CDRH2为SEQIDNO:2而/或CDRH3是SEQIDNO:3。
因此，在一个实施方式中，CDRH1为SEQIDNO:1并且CDRH2为SEQIDNO:2，或者CDRH1是SEQIDNO:1并且CDRH3是SEQIDNO:3，或者CDRH2为SEQIDNO:2并且CDRH3是SEQIDNO:3。
在另一方面，提供了抗体或片段，其包含本文限定的序列或序列组合，例如同源对可变区。
本发明公开的抗体阻断IgG对FcRn的结合，这被认为可用于减少FcRn的一种或多种生物学功能，包括缩短循环抗体的半衰期。这样有益之处在于，其允许患者更快速地清除抗体，如自身抗体。因此，本发明公开的抗体减少IgG对FcRn的结合。
重要的是，本发明的抗体能够结合人FcRn，例如在pH6和pH7.4都有类似的高结合亲和力。因此，这些抗体有优势的是能够甚至在内体中也能继续结合FcRn，由此最大程度地阻断FcRn对IgG的结合。
在一个实施方式中，根据本发明公开的抗体或结合片段包含轻链或具有可变区的轻链片段，例如，其包含一个、两个或三个CDR，其独立地选自SEQIDNO:4、SEQIDNO:5或SEQIDNO:7和SEQIDNO:6，具体而言，其中CDRL1为SEQIDNO:4、CDRL2为SEQIDNO:5或SEQIDNO:7，并且CDRL3是SEQIDNO:6。
因此，一个实施方式中，CDRL1是SEQIDNO:4并且CDRL2是SEQIDNO:5或SEQIDNO:7，或者CDRL1为SEQIDNO:1并且CDRL3是SEQIDNO:6，或者CDRL2为SEQIDNO:5或SEQIDNO:7并且CDRL3是SEQIDNO:6。
在一个实施方式中，根据本发明公开的抗体或结合片段包含选自SEQIDNO:1至7的CDR序列，例如其中CDRH1是SEQIDNO:1、CDRH2是SEQIDNO:2、CDRH3是SEQIDNO:3、CDRL1是SEQIDNO:4、CDRL2是SEQIDNO:5或SEQIDNO:7并且CDRL3为SEQIDNO:6。
还提供了一种抗体或结合片段，其与本文明确公开的抗体或结合片段结合相同的表位。因此，提供了抗-FcRn抗体或其结合片段，其结合人FcRn的表位，所述表位包含选自人FcRn细胞外结构域(SEQIDNO:48)的残基E115、W131、P132及E133中的一个、两个、三个或四个氨基酸，并且其中所述抗-FcRn抗体或其结合片段进一步结合选自A81、G83、G84、K85、G86、P87、N113、L135、A136及Q139中的一个或多个(例如全部)残基，并可选地进一步结合选自L82、Y88、L112和D130的一个或多个残基。
在一个实施方式中，提供了一种抗体或结合片段，其交叉阻断针对人FcRn的本文明确公开的抗体或结合片段，或被所述抗体交叉阻断对人FcRn的结合。
在一个实施方式中，本发明公开的抗体和结合片段阻断人IgG对人FcRn的结合。
在一个实施方式中，本发明公开的抗体和结合片段不结合β2微球蛋白。
在一个实施方式中，本发明公开的抗体和结合片段不结合人β2微球蛋白。
在一个实例中，本发明公开的抗体和结合片段减少循环白蛋白水平不会超过50％，优选地不超过25％。
在一个实例中，本发明公开的抗体和结合片段不减少循环白蛋白水平。
本发明公开还扩展至多核苷酸，如DNA，其编码本文描述的抗体或片段，例如其中所述DNA整合于载体中。
还提供的是包含所述多核苷酸的宿主细胞。
本文提供了表达抗体或片段的方法，如为将抗体或片段缀合至多聚物如PEG的方法。
本发明公开还涉及包含所述抗体或片段的药用组合物。
在一个实施方式中，提供了治疗的方法，包括施用治疗有效量的本文描述的抗体、片段或组合物。
本发明公开还扩展至根据本发明公开的抗体、片段或组合物用于治疗，特别是治疗免疫学和/或自身免疫障碍的用途。
因此本发明公开提供抗体、其片段和方法以移除病理性IgG，这是通过加速机体天然的IgG代谢机制达到的。
根据本发明公开的抗体和片段在本质上阻断体内回收IgG的系统。
本疗法可能为使用血浆置换疗法或IVIg疗法的特定疾病提供了替代或补充，而其对患者更有优势。
附图简述
图1显示由LC-MS/MS确定的转基因小鼠中的％hIgG
图1a显示1638IgG4P形式对人FcRn转基因小鼠血清中的人IVIg浓度的效应。
图1b显示1638FabFv和Fab’PEG形式对人FcRn转基因小鼠中的人IVIg浓度的效应。
图1c显示1638IgG4P形式在人FcRn转基因小鼠中的药代动力学。
图1d显示1638FabFv和Fab’PEG形式在人FcRn转基因小鼠中的药代动力学。
图1e1638FabFv和Fab’PEG形式对人FcRn转基因小鼠的血清白蛋白浓度的效应。
图1f1638IgG4P形式对人FcRn转基因小鼠的血清白蛋白浓度的效应。
图2显示CA170_1638.g49IgG4的代表性结合曲线。平均KD值(n＝3)分别为0.20nM(中性缓冲液)，0.22nM(酸性缓冲液)。
图3显示CA170_1638.g49IgG4抑制MDCKII15号克隆细胞中的IgG回收。
图4显示CA170_1638.g49IgG4抑制MDCKII15号克隆细胞中的IgG转胞吞作用。
图5显示CA170_1638.g49FabFv抑制MDCKII15号克隆细胞中的IgG转胞吞作用。
图6显示CA170_1638.g49IgG4的代表性结合曲线。平均KD值(n＝3)分别为0.3(中性缓冲液)、0.43(酸性缓冲液)(见表2)。
图7显示CA170_1638CDR序列
图8根据本发明公开的抗体序列
图9a1638.g49抗体的人源化
图9b1638.g49抗体的人源化
发明详述
如本文所应用的，FcRn指代人IgG受体α链(也即新生Fc受体，在UniProt中其氨基酸序列号码为P55899，其细胞外结构域提供于图8(SEQIDNO:48))与人β2微球蛋白(β2M)(在UniProt中氨基酸序列号码为P61769，本文提供的具有信号肽(SEQIDNO:50)，不含信号肽(SEQIDNO:72))之间的非共价复合物。
本文提到的抗体分子指代抗体或其结合片段。
如本文所使用的，术语“抗体”通常指代完整(完全)抗体，即，包含两条重链和两条轻链这些元件。抗体可进一步包含此外的结合结构域，例如通过如WO2007/024715中公开的分子DVD-Ig，或描述于WO2011/030107的称为(FabFv)2Fc的分子。因此，本文提到的抗体包括二价、三价或四价的全长抗体。
抗体的结合片段包括单链抗体(即全长的重链和轻链)；Fab，修饰的Fab，Fab’，修饰的Fab’，F(ab’)2，Fv，Fab-Fv，Fab-dsFv，单结构域抗体(例如VH或VL或VHH)，scFv，dsscFv，二价、三价或四价抗体，Bis-scFv，双功能抗体，三功能抗体，四功能抗体及上述任意的表位结合片段(见例如Holliger和Hudson,2005,NatureBiotech.23(9):1126-1136；Adair和Lawson,2005,DrμgDesignReviews-Online2(3),209-217)。用创造和生产这些抗体片段的方法是本领域熟知的(见例如Verma等人,1998,JournalofImmunologicalMethods,216,165-181)。Fab-Fv形式首先公开于WO2009/040562，其的二硫键稳定化版本——Fab-dsFv首先公开于WO2010/035012。用于本发明的其他抗体片段包括国际专利申请WO2005/003169、WO2005/003170和WO2005/003171中描述的Fab和Fab’片段。多价抗体可包含多特异性，例如为双特异的，或可以是单特异的(见例如WO92/22583和WO05/113605)。后者的一个这样的实例为三-Fab(或TFM)，如WO92/22583中所描述。
在一个实施方式中，提供了Fab片段。
在一个实施方式中，提供了Fab’片段。
典型的Fab’分子包含重链和轻链对，其中重链包含可变区VH、恒定结构域CH1和天然或修饰的铰链区，及包含可变区VL和恒定区CL的轻链
在一个实施方式中，提供了根据本发明的Fab’的二聚体，以产生F(ab’)2，例如可经由铰链发生二聚化。
在一个实施方式中，所述抗体或其结合片段包含结合结构域。结合结构域通常包含6个CDR，3个来自重链，3个来自轻链。在一个实施方式中，这些CDR在一个框架中，并一起形成可变区。因此，在一个实施方式中，抗体或结合片段包含特异于抗原的结合结构域，其包含轻链可变区和重链可变区。
应当清楚的是，可对本发明提供的CDR或其他序列(如可变结构域)进行一个或多个(例如1、2、3或4个)氨基酸置换、添加和/或删除而不显著改变抗体结合FcRn的能力。任何氨基酸置换、添加和/或删除的效应都可容易地由本领域技术人员进行测试，例如通过使用本文描述的方法，具体而言是使用实施例中的方法，以确定FcRn的结合/阻断。
可对本发明提供的抗体或片段中所用的框架区做出一个或多个(例如1、2、3或4个)氨基酸置换、添加和/或删除，并且保留或增加对FcRn的结合亲和力。
常规地，抗体可变结构域中的残基是根据Kabat等人设计的系统编号的。该系统在Kabat等人1987年SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,USDepartmentofHealthandHumanServices,NIH,USA中提出(后文提为“Kabat等人(见上文)”)。除非另有指出，本说明书中皆使用该编号系统。
Kabat残基定名并不总是直接对应氨基酸序列的线性编号。实际的线性氨基酸序列可能含有比严格的Kabat编号中更少或多余的氨基酸，对应了基础可变结构域结构的结构组分(不论是框架或互补决定区(CDR))的缩短或其中的插入。对于给定抗体，残基的正确Kabat编号可通过将抗体序列中的同源残基与“标准”Kabat编号序列进行比对而确定。
根据Kabat编号系统，重链可变结构域的CDR位于31-35号残基(CDR-H1)、50-65残基(CDR-H2)和95-102号残基(CDR-H3)。然而，根据Chothia(Chothia,C.和Lesk,A.M.J.Mol.Biol.,196,901-917(1987))的方法，等价于CDR-H1的环结构从26号残基延伸至32号残基。因此，除非另有指出，本文应用的‘CDR-H1’意指26至35号残基，如通过Kabat编号系统和Chothia的拓扑环定义的组合所描述的。
根据Kabat编号系统，轻链可变结构域的CDR位于50-56号残基(CDR-L2)和89-97号残基(CDR-L3)。
本发明公开的抗体和片段阻断FcRn，并可由此阻止其在IgG的回收中发挥功能。如本文提到的阻断，指代物理性阻断，如遮挡该受体，但亦包括抗体或片段结合某个表位引起例如构象变化的情况，这意味着受体的天然配体不再与之结合。本发明的抗体结合于FcRn并由此减少或防止(例如抑制)FcRn结合到IgG的恒定区。
在一个实施方式中，所述抗体或其片段作为人FcRn结合人IgG的竞争性抑制剂发挥作用。在一个实施例中，所述抗体或其结合片段结合于FcRn上的IgG结合位点。在一个实施例中，所述抗体阻断IgG结合位点。在一个实施例中，所述抗体或其结合片段不结合β2M。
可使用本领域已知的任何适用方法获得用于本发明公开的抗体。FcRn多肽/蛋白质(包括融合蛋白)、(重组或天然)表达所述多肽的细胞(如活化T细胞)，都可用于产生特异性鉴定单独的FcRn或与β2M组合中的FcRn的抗体。所述多肽可以为“成熟”多肽或其生物学活性片段或衍生物。该人蛋白质在Swiss-Prot中的登记号为P55899。人FcRn的α链的细胞外结构域在SEQIDNO:48中提供。成熟人β2M序列在SEQIDNO:72中提供。
在一个实施方式中，所述抗原为FcRn的突变体形式，其经过工程化以使FcRn在细胞表面呈递，使得在FcRn被细胞内化的地方很少或不会被动态加工，这可通过例如在FcRn的α链的细胞质内尾端制造突变而达成，其中的双亮氨酸突变为双丙氨酸，如描述于Ober等人，2001Int.Immunol.13,1551–1559。
用于免疫宿主的多肽可通过本领域熟知的过程由包含表达系统的遗传工程化宿主细胞而制备，或可从天然生物学来源中回收。在本申请中，术语“多肽”包括肽、多肽和蛋白质。除非另外有指定，否则这些词语都交换使用。FcRn多肽在一些例子中可以为较大蛋白质如融合蛋白质(例如融合于亲和标签或类似成分)的一部分。
在有必要免疫动物时，可通过使用熟知并常规操作流程，将所述多肽施用给动物(，优选地为非人动物)而获得针对FcRn多肽生成的抗体见例如HandbookofExperimentalImmunology,D.M.Weir(ed.),Vol4,BlackwellScientificPublishers,Oxford,England,1986)。可免疫很多恒温动物如兔、小鼠、大鼠、羊、牛、骆驼或猪。然而，小鼠、兔、猪和大鼠通常是最合适的。
单克隆抗体可通过任何本领域已知方法制备，如杂交瘤技术(Kohler&Milstein,1975,Nature,256:495-497)、三元杂交瘤技术、人B细胞杂交瘤技术(Kozbor等人,1983,ImmunologyToday,4:72)以及EBV杂交瘤技术(Cole等人,MonoclonalAntibodiesandCancerTherapy,pp77-96,AlanRLiss,Inc.,1985)。
用于本发明的抗体还可使用单淋巴细胞抗体法生成，通过克隆并表达由经选择产生特异性抗体的单一淋巴细胞的免疫球蛋白可变区cDNA完成，例如可通过下列文献描述的方法进行：Babcook,J.等人,1996,Proc.Natl.Acad.Sci.USA93(15):7843-7848l；WO92/02551；WO2004/051268及国际专利申请号WO2004/106377。
可使用测定法测量对人FcRn的结合及/或测定法测量阻断IgG对受体结合的能力而进行抗体筛选。结合测定法的一个实例是ELISA，特别是使用固定化于平板上的人FcRn和人Fc的融合蛋白质，采用二抗检测结合于融合蛋白的抗-FcRn抗体。合适的拮抗和阻断测定法在下文有所描述。
如本文应用的，“特异的”意指仅鉴定其特异针对的抗原的抗体，或指那些对其特异针对的抗原的结合亲和力比其非特异针对的抗原的结合显著更高的抗体，例如结合亲和力高是至少5、6、7、8、9、10倍。结合亲和力可通过如下文描述的BIAcore技术测量。在一个实例中，本发明的抗体不结合β2微球蛋白(β2M)。在一个实例中，本发明的抗体结合于食蟹猴的FcRn。在一个实例中，本发明的抗体不结合大鼠或小鼠的FcRn。
提供了根据本发明公开的特定抗体的氨基酸序列及多肽序列，且其形成本发明的一个方面。
在一个实施方式中，根据本发明公开的抗体或结合片段完全是人的，例如从噬菌体文库或类似来源制备。
在一个实例中，所述抗体为啮齿动物如大鼠来源的并包含SEQIDNO:8给定的轻链可变结构域序列，以及SEQIDNO:12给定的重链可变结构域序列。
在一个实施方式中，根据本发明公开的抗体或片段为人源化的。
人源化抗体(其包括CDR-嵌合抗体)为具有来自非人物种的一个或多个互补决定区(CDR)以及来自人免疫球蛋白分子的框架区的抗体分子(见例如US5,585,089；WO91/09967)。要清楚的是，仅仅有必要转移CDR的特异性决定残基而非整个CDR(见例如Kashmiri等人,2005,Methods,36,25-34)。可选地，人源化抗体可以任选地进一步包含一个或多个框架残基，其源于前述CDR来源的非人物种。后者常被称为供体残基。
因此在一个实施方式中，如本文所使用的，术语“人源化抗体分子”指代抗体分子，其中重链和/或轻链含有一个或多个来自供体抗体(例如非人抗体如小鼠单克隆抗体)的CDR(如果需要可包括一个或多个修饰的CDR)，这些CDR移植到受体抗体(例如人抗体)的重链和/或轻链可变区框架中，后者可选地进一步包含一个或多个框架残基，其来源于CDR所来源的非人物种(供体残基)。相关综述见Vaughan等人,NatureBiotechnology,16,535-539,1998。在一个实施方式中，仅仅将上文描述的任一CDR中的一个或多个特异性决定残基转移至人抗体框架中，而非转移整个CDR(见例如，Kashmiri等人,2005,Methods,36,25-34)。在一个实施方式中，仅仅将上文描述的一个或多个CDR中的特异性决定残基转移至人抗体框架中。在另一个实施方式中，仅仅将上文描述的每个CDR中的特异性决定残基转移至人抗体框架中。
在CDR或特异性决定残基被移植时，可使用与CDR来源的供体抗体分类/类型相关的任何适当的受体可变区框架序列，包括小鼠、灵长类和人框架区。
合适地，根据本发明的人源化抗体具有可变结构域，其包含人受体框架区以及一个或多个本文具体提供的CDR。因此，在一个实施方式中提供了对结合人FcRn的人源化抗体的阻断，其中的可变结构域包含人受体框架区和非人的供体CDR。
可用于本发明的人框架的实例为KOL、NEWM、REI、EU、TUR、TEI、LAY和POM(Kabat等人，见上文)。例如，KOL和NEWM可用于在重链，REI可用于轻链，而EU、LAY和POM可用于重链和轻链二者。备选地，可使用人种系序列，这些序列可在http://www.imgt.org/上获得。
在本发明的人源化抗体中，受体重链和轻链不必源自相同抗体，并且如果需要，还可包含具有源自不同链的框架区的复合链。
本发明的人源化抗体的重链一个适合的框架区来源于人亚组VH3的序列IGHV3-7以及JH3(SEQIDNO:46和47)。
因此，在一个实施例中，提供了人源化抗体，其包含SEQIDNO:1给定的序列作为CDR-H1，SEQIDNO:2给定的序列作为CDR-H2以及SEQIDNO:3给定的序列作为CDR-H3，其中重链框架区源于人亚组VH3的序列IGHV3-7与JH3。
人JH3序列如下：(DAFDV)WGQGTMVTVS(SEQIDNo:69)。其中DAFDV(SEQIDNO:70)基序是CDR-H3的一部分而不是框架4的一部分(Ravetch,JV.等人,1981,Cell,27,583-591)。
在一个实施例中，所述抗体的重链可变结构域包含SEQIDNO:25或59，如25给定的序列。
本发明的人源化抗体轻链的一个适合框架区来源于人亚组VK1的序列IGKV1-27以及JK4(SEQIDNO:44和45)。
因此，在一个实施例中，提供了人源化抗体，其包含SEQIDNO:4给定的序列作为CDR-L1，SEQIDNO:5或SEQIDNO:7给定的序列作为CDR-L2以及SEQIDNO:6给定的序列作为CDR-L3，其中轻链框架区源于人亚组VK1的序列IGKV1-27和JK4。
JK4序列如下：(LT)FGGGTKVEIK(SeqIDNo:71)。其中LT基序是CDR-L3的一部分，而不是框架4的一部分(Hieter,PA.,等人,1982,J.Biol.Chem.,257,1516-1522)。
在一个实施例中，所述抗体的轻链可变结构域包含SEQIDNO:16或51，例如16给定的序列。
在本发明的人源化抗体中，框架区不必与受体抗体的框架区具有恰好相同的序列。例如，可将不常见残基改变为在受体链分类或类型中更常出现的残基。备选地，可改变受体框架区中选定的残基以使其能对应供体抗体相同位置的残基(见Reichmann等人,1998,Nature,332,323-324)。这些改变应当维持在最少的水平以满足恢复供体抗体亲和力的必要。在WO91/09967中提出了用于选择受体框架区中需改变的残基的操作流程。
因此，在一个实施方式中，框架中1、2、3、4或5个残基都由备选氨基酸残基取代。
因此，在一个实施方式中，提供了人源化抗体，其中重链可变结构域的48和78号位置(Kabat编号)中至少一个残基为供体残基，见例如SEQIDNO:25给定的序列。
在一个实施方式中，重链可变结构域中48号残基由备选的氨基酸如缬氨酸取代。
在一个实施方式中，重链可变结构域中78号残基由备选的氨基酸如亮氨酸取代。
在一个实施方式中，根据本发明的人源化重链可变区的48号残基为缬氨酸而78号残基为亮氨酸。
因此，在一个实施例中提供了人源化抗体，其中轻链可变结构域的70和71号位置(Kabat编号)中至少一个残基为供体残基，见例如SEQIDNO:16给定的序列。
在一个实施方式中，轻链可变结构域中70号残基由备选的氨基酸如天冬氨酸取代。
在一个实施方式中，轻链可变结构域中71号残基由备选的氨基酸如苯丙氨酸取代。
在一个实施方式中，根据本发明的人源化轻链可变区的70号残基为天冬氨酸而71号残基为苯丙氨酸。
在一个实施方式中，本发明公开提供了抗体序列，其在部分或整个相关序列上(如可变结构域序列、CDR序列或不含CDR的可变结构域序列)与本文公开的序列有80％的相似性或同一性，例如具有85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的相似性或同一性。在一个实施方式中，所述相关序列为SEQIDNO:16或51。在一个实施方式中，所述相关序列为SEQIDNO:25或59。
在一个实施方式中，本发明提供了抗体分子，其结合于包含重链的人FcRn，其中所述重链的可变结构域包含与本文序列如SEQIDNO:25或59，如25给定的序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或相似性的序列。
在一个实施方式中，本发明提供了抗体分子，其结合包含轻链的人FcRn，其中所述轻链的可变结构域包含与本文序列如SEQIDNO:16或51，如16给定的序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或相似性的序列。
在一个实施方式中，本发明提供了抗体分子，其结合人FcRn，其中所述抗体的重链可变结构域与本文给定的序列例如SEQIDNO:25中的序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的相似性或同一性，但其中所述抗体分子具有SEQIDNO:1给定的序列作为CDR-H1，SEQIDNO:2给定的序列作为CDR-H2以及SEQIDNO:3给定的序列作为CDR-H3。
在一个实施方式中，本发明提供了抗体分子，其结合人FcRn，其中所述抗体的轻链可变结构域与本文给定的序列例如SEQIDNO:16中的序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的相似性或同一性，但其中所述抗体分子具有SEQIDNO:4给定的序列作为CDR-L1，SEQIDNO:5或SEQIDNO:7给定的序列作为CDR-L2以及SEQIDNO:6给定的序列作为CDR-L3。
在一个实施方式中，本发明提供了抗体分子，其结合人FcRn，其中所述抗体的重链可变结构域与本文给定的序列例如SEQIDNO:25给定的序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的相似性或同一性，而所述抗体的轻链可变结构域与本文给定的序列例如SEQIDNO:16给定的序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的相似性或同一性；但其中所述抗体分子具有SEQIDNO:1给定的序列作为CDR-H1，SEQIDNO:2给定的序列作为CDR-H2，SEQIDNO:3给定的序列作为CDR-H3，SEQIDNO:4给定的序列作为CDR-L1，SEQIDNO:5或SEQIDNO:7给定的序列作为CDR-L2以及SEQIDNO:6给定的序列作为CDR-L3。
如本文所使用的，“同一性”表示在进行比对的序列中任意具体位置，氨基酸残基在序列之间是同一的。如本文所使用的，“相似性”表示在进行比对的序列中任意具体位置，氨基酸残基在序列之间是相似的类型。例如，异亮氨酸或缬氨酸可由亮氨酸置换。其他常可相互置换的氨基酸包括但不限于：
-苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸(具有芳香侧链的氨基酸)；
-赖氨酸、精氨酸和组氨酸(具有碱性侧链的氨基酸)；
-天冬氨酸和谷氨酸(具有酸性侧链的氨基酸)；
-天冬酰胺和谷氨酰胺(具有酰胺侧链的氨基酸)；以及
-半胱氨酸和甲硫氨酸(具有含硫侧链的氨基酸)。同一性和相似性的程度很容易计算(ComputationalMolecularBiology,Lesk,A.M.,ed.,OxfordUniversityPress,NewYork,1988；Biocomputing.InformaticsandGenomeProjects,Smith,D.W.,ed.,AcademicPress,NewYork,1993；ComputerAnalysisofSequenceData,Part1,Griffin,A.M.,andGriffin,H.G.,eds.,HumanaPress,NewJersey,1994；SequenceAnalysisinMolecularBiology,vonHeinje,G.,AcademicPress,1987,SequenceAnalysisPrimer,Gribskov,M.andDevereux,J.,eds.,MStocktonPress,NewYork,1991,可获自NCBI的BLASTTM软件(Altschul,S.F.等人,1990,J.Mol.Biol.215:403-410；Gish,W.&States,D.J.1993,NatureGenet.3:266-272.Madden,T.L.等人,1996,Meth.Enzymol.266:131-141；Altschul,S.F.等人,1997,NucleicAcidsRes.25:3389-3402；Zhang,J.&Madden,T.L.1997,GenomeRes.7:649-656)。
本发明的抗体分子可包含具有全长的重链和轻链或其片段的完整抗体分子也可为以下形式，但不限于此：Fab，修饰的Fab，Fab’，修饰的Fab’，F(ab’)2，Fv，单结构域抗体(例如VH或VL或VHH)，scFv，dsscFv，二价、三价或四价抗体，Bis-scFv，双功能抗体，三功能抗体，四功能抗体及上述任意的表位结合片段(见例如Holliger和Hudson,2005,NatureBiotech.23(9):1126-1136；Adair和Lawson,2005,DrugDesignReviews-Online2(3),209-217)。用创造和生产这些抗体片段的方法是本领域熟知的(见例如Verma等人,1998,JournalofImmunologicalMethods,216,165-181)。用于本发明的其他抗体片段包括国际专利申请WO2005/003169、WO2005/003170和WO2005/003171中描述的Fab和Fab’片段。多价抗体可包含多特异性，例如为双特异的，或可能是单特异的(见例如WO92/22853、WO05/113605、WO2009/04056和WO2010/035012)。
在一个实施方式中，本发明公开的抗体分子为抗体Fab片段，其包括SEQIDNO:16和25中所示的可变区，例如分别用于轻链和重链。在一个实施方式中，所述抗体分子具有包含SEQIDNO:20给定的序列的轻链及包含SEQIDNO:29给定的序列的重链。
在一个实施方式中，本发明公开的抗体分子为抗体Fab片段，其包括SEQIDNO:51和59中所示的可变区，例如分别用于轻链和重链。
在一个实施方式中，本发明公开的抗体分子为抗体Fab或Fab’片段，其包括SEQIDNO:16和25中所示的可变区，例如分别用于轻链和重链。在一个实施方式中，所述抗体分子具有包含SEQIDNO:20给定的序列的轻链及包含SEQIDNO:29(Fab)或SEQIDNO:33(Fab’)给定的序列的重链。
在一个实施方式中，本发明公开的抗体分子为抗体Fab’片段，其包括SEQIDNO:51和59中所示的可变区,例如分别用于轻链和重链。在一个实施方式中，所述抗体分子具有包含SEQIDNO:55给定的序列的轻链及包含SEQIDNO:63给定的序列的重链。
在一个实施方式中，本发明公开的抗体分子为全长IgG1抗体，其包括SEQIDNO:16和25中所示的可变区，例如分别用于轻链和重链。在一个实施方式中，在一个实施方式中，所述抗体分子具有包含SEQIDNO:20给定的序列的轻链及包含SEQIDNO:73给定的序列的重链。
在一个实施方式中，本发明公开的抗体分子为抗体全长IgG1，其包括SEQIDNO:51和59中所示的可变区。
在一个实施方式中，本发明公开的抗体分子为全长IgG4P形式，其包括SEQIDNO:16和25中所示的可变区，例如分别用于轻链和重链。在一个实施方式中，所述抗体分子具有包含SEQIDNO:20给定的序列的轻链及包含SEQIDNO:25给定的序列的重链。
在一个实施方式中，本发明公开的抗体分子为全长IgG4形式，其包括SEQIDNO:51和59中所示的可变区，例如分别用于轻链和重链。在一个实施方式中，所述抗体分子具有包含SEQIDNO:55给定的序列的轻链及包含SEQIDNO:59给定的序列的重链。
在一个实施方式中，本发明公开的抗体分子为全长IgG4形式，其包括SEQIDNO:16和25中所示的可变区，例如分别用于轻链和重链。在一个实施方式中，所述抗体分子具有包含SEQIDNO:20给定的序列的轻链及包含SEQIDNO:37或SEQIDNO:39给定的序列的重链。
在一个实施方式中，本发明公开的抗体分子为全长IgG4P形式，其包括SEQIDNO:51和59中所示的可变区，例如分别用于轻链和重链。在一个实施方式中，所述抗体分子具有包含SEQIDNO:55给定的序列的轻链及包含SEQIDNO:59给定的序列的重链。
本文应用的IgG4P是在野生型IgG4同种型上的突变，其中241号氨基酸被脯氨酸取代，见例如Angal等人,MolecularImmunology,1993,30(1),105-108描述的，其中241号位置的丝氨酸被改变为脯氨酸。
在一个实施方式中，提供了根据本发明公开的抗体作为FcRn结合抗体融合蛋白，其包含免疫球蛋白部分，例如Fab或Fab’片段，以及直接或间接与之相连的一个或两个单结构与抗体(dAb)，例如描述于WO2009/040562、WO2010035012、WO2011/030107、WO2011/061492和WO2011/086091中，其全部并入本文作为参考。
在一个实施方式中，所述融合蛋白包含两个结构域的抗体，例如包含成对的可变重链(VH)和可变轻链(VL)，二者可选地通过二硫键链接。
在一个实施方式中，所述融合蛋白的Fab或Fab’元件针对所述一种或多种单结构域抗体具有相同或类似特异性。在一个实施方式中，Fab或Fab’针对所述一种或多种单结构域抗体具有不同的特异性，这意味着所述融合蛋白为多价的。在一个实施方式中，根据本发明的多价融合蛋白具有白蛋白结合位点，例如VH/VL对，其中提供了白蛋白结合位点。在一个所述实施方式中，重链包含SEQIDNO:42给定的序列而轻链包含SEQIDNO:40给定的序列。
在一个实施方式中，根据本发明公开的Fab或Fab’缀合至PEG分子或人血清白蛋白。
CA170_01638g49和1638.g49在本文交换使用，并用于指代具体的抗体可变区对，可以大量不同的形式使用。所述可变区为SEQIDNO:25中给定的重链序列及SEQIDNO:16中给定的轻链序列。
CA170_01638g28和1638.g28在本文交换使用，其用于指代具体的抗体可变区对，可以大量不同的形式使用。所述可变区为SEQIDNO:59中给定的重链序列及SEQIDNO:51中给定的轻链序列。
本发明的抗体分子若有恒定区结构域，则其可选自与所提出的抗体分子功能相关的那些，具体而言是可能需要的效应功能。例如，恒定区结构域可为人IgA、IgD、IgE、IgG或IgM结构域。具体而言，可使用人IgG恒定区结构域，尤其是在所述抗体分子意欲作为治疗用途且要求有抗体效应功能时，使用IgG1和IgG3同种型。备选地，当所述抗体分子意欲用于治疗目的且不要求有抗体效应功能时，使用IgG2和IgG4同种型。要清楚的是，也可使用这些恒定区结构域的序列变体。例如可使用241号位置的丝氨酸改变为脯氨酸的IgG4分子，如Angal等人,MolecularImmunology,1993,30(1),105-108中描述的。本领域技术人员还要理解的是，这些抗体可能要经过多种翻译后修饰。这些修饰的类型和程度通常取决于用于表达抗体的宿主细胞系以及培养条件。这些修饰可包括糖基化、甲硫氨酸氧化、二酮哌嗪形成、天冬氨酸异构化及天冬酰胺脱酰胺等变动。一种常见的修饰是羧基端碱性残基(如赖氨酸或精氨酸)在羧肽酶的作用下丢失(如描述于Harris,RJ.JournalofChromatography705:129-134,1995)。因此，抗体重链的C末端的赖氨酸可能并不存在。
在一个实施方式中，抗体重链包含CH1结构域且抗体轻链包含CL结构域，为κ或λ链。
在一个实施方式中，轻链具有SEQIDNO:20给定的序列而重链具有SEQIDNO:29给定的序列。
在一个实施方式中，轻链具有SEQIDNO:20给定的序列而重链具有SEQIDNO:33给定的序列。
在一个实施方式中，轻链具有SEQIDNO:20给定的序列而重链具有SEQIDNO:37给定的序列。
在一个实施方式中，轻链具有SEQIDNO:20给定的序列而重链具有SEQIDNO:74给定的序列。
在一个实施方式中，所述抗体分子的C末端氨基酸是在翻译后修饰过程中裂解的。
在一个实施方式中，所述抗体分子的N末端氨基酸是在翻译后修饰过程中裂解的。
本发明还提供了由本发明提供的抗体能结合的人FcRn的特异性区域或表位，具体而言是包含重链序列gH33(SEQIDNO:25)和/或轻链序列gL7(SEQIDNO:16)的抗体或包含重链序列gH2(SEQIDNO:59)及轻链序列gL2(SEQIDNO:51)的抗体。
所述人FcRn多肽的特异性区域或表位可由本领域已知的任意适当的表位作图法结合本发明提供的任意一种抗体得以鉴定。这些方法的实例包括对源自FcRn的不同长度的肽针对本发明抗体的结合进行筛选，筛出特异性结合所述抗体并含有所述抗体鉴定表位序列的最小的片段。可人工生产或通过蛋白裂解消化FcRn多肽生产FcRn肽。结合所述抗体的肽可通过例如质谱分析法鉴定。在另一个实施例中，可使用NMR谱或X光晶体学鉴定被本发明抗体结合的表位。在一个使用了X光晶体学的实施例中，确定距离抗体以内的FcRn多肽上的残基为所述表位。在一个实施例中，确定距离抗体以内的FcRn多肽上的残基为所述表位。一旦被鉴定，结合本发明抗体的所述表位片段在有需要时可用作免疫原以获得其他的结合相同表位的抗体。
在一个实施方式中，根据本发明公开的抗体结合于人FcRnα链的细胞外序列，如下所示：
AESHLSLLYHLTAVSSPAPGTPAFWVSGWLGPQQYLSYNSLRGEAEPCGAWVWENQVSWYWEKETTDLRIKEKLFLEAFKALGGKGPYTLQGLLGCELGPDNTSVPTAKFALNGEEFMNFDLKQGTWGGDWPEALAISQRWQQQDKAANKELTFLLFSCPHRLREHLERGRGNLEWKEPPSMRLKARPSSPGFSVLTCSAFSFYPPELQLRFLRNGLAAGTGQGDFGPNSDGSFHASSSLTVKSGDEHHYCCIVQHAGLAQPLRVELESPAKSS(SEQIDNO：48).
有下划线的残基为已知对于人FcRn与人IgG的Fc区域相互作用关键的残基。黑体的那些为人FcRn多肽的残基，其涉及与包含SEQIDNO:25中给定的重链序列及SEQIDNO:16中给定的轻链序列的抗体的结合，即其在X光晶体学实验中确定位于抗体以内。斜体表示的是那些涉及结合相同抗体位于其处的残基。
在本发明的一方面，提供了抗-FcRn抗体或其结合片段，其结合人FcRn的表位，所述表位包含人FcRn细胞外结构域(SEQIDNO:48)中选自残基E115、W131、P132及E133中的一个、两个、三个或四个氨基酸，且其中所述抗-FcRn抗体或其结合片段进一步结合一个或多个残基，如选自A81、G83、G84、K85、G86、P87、N113、L135、A136和Q139中的两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个，且可选地进一步结合选自L82、Y88、L112和D130中的一个或多个残基。
因此，在一个实施例中，提供了抗-FcRn抗体或其结合片段，其结合人FcRn的表位，所述表位包含选自残基E115、W131、P132及E133中的一个、两个、三个或四个氨基酸，以及选自A81、G83、G84、K85、G86、P87、N113、L135、A136和Q139中的至少一个残基，如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10个残基，且其中所述抗-FcRn抗体或其结合片段可选地进一步结合选自人FcRn细胞外结构域(SEQIDNO:48)中L82、Y88、L112和D130中的一个或多个残基，例如至少2、3或4个。
在一个实施例中，根据本发明此方面的抗体不结合人FcRn细胞外结构域(SEQIDNO:48)中的V105、P106、T107、A108和K109。
在一个实施例中，根据本发明此方面的抗体不结合人FcRn细胞外结构域(SEQIDNO:48)中的E116、F117、M118、N119、F120、D121、L122、K123、Q124、G128和G129。
在一个实施例中，根据本发明此方面的抗体不结合人FcRn细胞外结构域(SEQIDNO:48)中的V105、P106、T107、A108、K109、E116、F117、M118、N119、F120、D121、L122、K123、Q124、G128和G129。
在一个实施例中，本发明提供了抗-FcRn抗体或其结合片段，其结合人FcRn的表位，所述表位包含人FcRn细胞外结构域(SEQIDNO:48)中选自残基E115、W131、P132及E133中的一个、两个、三个或四个，以及选自A81、L82、G83、G84、K85、G86、P87和Y88残基中的至少一个，例如至少2、3、4、5、6、7或8个残基。
在一个实施例中，本发明提供了抗-FcRn抗体或其结合片段，其结合人FcRn的表位，所述表位包含人FcRn细胞外结构域(SEQIDNO:48)中选自残基E115、W131、P132及E133中的一个、两个、三个或四个，以及选自L112、N113、D130、L135、A136和Q139残基中的至少一个，例如至少2、3、4、5或6个残基。
在一个实施例中，本发明提供了抗-FcRn抗体或其结合片段，其结合人FcRn的表位，所述表位包含人FcRn细胞外结构域(SEQIDNO:48)中选自残基E115、W131、P132及E133中的一个、两个、三个或四个，以及选自A81、L82、G83、G84、K85、G86、P87、Y88、L112、N113、D130、L135、A136和Q139残基中的至少一个。
在一个实施例中，本发明提供了抗-FcRn抗体或其结合片段，其结合人FcRn的表位，所述表位包含人FcRn细胞外结构域(SEQIDNO:48)中的E115、W131、P132及E133残基以及选自A81、L82、G83、G84、K85、G86、P87、Y88、L112、N113、D130、L135、A136和Q139残基中的至少一个残基。
在一个实施例中，本发明提供了抗-FcRn抗体或其结合片段，其结合人FcRn的表位，所述表位包含人FcRn细胞外结构域(SEQIDNO:48)中的A81、G83、G84、K85、G86、P87、N113、E115、W131、P132、E133、L135、A136和Q139残基或由人FcRn细胞外结构域(SEQIDNO:48)中A81、G83、G84、K85、G86、P87、N113、E115、W131、P132、E133、L135、A136和Q139残基组成。
在一个实施例中，本发明提供了抗-FcRn抗体或其结合片段，其结合人FcRn的表位，所述表位包含人FcRn细胞外结构域(SEQIDNO:48)中的A81、L82、G83、G84、K85、G86、P87、Y88、L112、N113、E115、D130、W131、P132、E133、L135、A136和Q139残基或由人FcRn细胞外结构域(SEQIDNO:48)中的A81、L82、G83、G84、K85、G86、P87、Y88、L112、N113、E115、D130、W131、P132、E133、L135、A136和Q139残基组成。
在一个实施方式中，本发明提供的结合本文上面描述的表位的抗体完全是人的。在一个实施方式中，其是人源化的。在一个实施例中，其对人FcRn的亲和力为150pM或更低，通常在130pM或更低。
类似地，交叉阻断根据本发明的抗体分子(具体而言为包含SEQIDNO:25中给定重链序列及SEQIDNO:16中给定的轻链序列的抗体分子)的结合的抗体可相似地用于阻断FcRn活性。因此，本发明还提供了抗-FcRn抗体分子，其交叉阻断上文描述的任一抗体分子对人FcRn的结合，和/或被被那些抗体中任一种所交叉阻断与人FcRn的结合。在一个实施方式中，此种的抗体与本文上面描述的抗体结合相同的表位。在另一个实施方式中，所述交叉阻断的中和抗体结合与本文上面描述的抗体结合的表位邻近及/或有重叠的表位。
交叉阻断抗体可使用本领域任何适当的方法鉴定，例如使用竞争性ELISA或BIAcore测定法进行，其中交叉阻断抗体对人FcRn的结合阻止对本发明的抗体的结合，反之亦然。这些交叉阻断测定法可使用分离的天然或重组FcRn或适当的融合蛋白/多肽。在一个实施例中，使用重组人FcRn细胞外结构域(SEQIDNO:48)测量结合与交叉阻断。在一个实施例中，使用所述重组人FcRnα链细胞外结构域与β2微球蛋白(β2M)(SEQIDNO:72)的复合体。
在一个实施方式中，提供了一种抗-FcRn抗体分子，其阻断FcRn对IgG的结合并交叉阻断重链包含SEQIDNO:25给定的序列且轻链包含SEQIDNO:16给定的序列的抗体对人FcRn的结合。在一个实施方式中，本发明提供的交叉阻断对包含SEQIDNO:25中给定的重链序列和SEQIDNO:16中给定的轻链序列的抗体的结合超过80％，例如超过85％，如超过90％，具体而言为超过95％的抑制。
在一个实施方式中，本发明提供的交叉阻断抗体完全是人的。在一个实施方式中，本发明提供的交叉阻断抗体为人源化的。在一个实施方式中，本发明提供的交叉阻断抗体对人FcRn的亲和力为150pM或更低，130pM或更低，或100pM或更低。在一个实施方式中，本发明提供的交叉阻断抗体对人FcRn的亲和力为50pM或更低。可使用下文描述的方法测量亲和力。
生物学分子如抗体或片段含有酸性和/或碱性功能基团，由此赋予分子净的正电荷或负电荷。整体“观察到的”电荷的量取决于实体的绝对氨基酸序列、带电荷基团在3D结构中的局部环境以及分子的环境条件。等电点(pI)是特定pH值，在该pH下具体的分子或溶剂可接触表面不携带净的电负荷。在一个实施例中，本发明的FcRn抗体及片段可经工程化具有恰当的等电点。这可形成具有更强大特性的抗体和/或片段，具体而言是具有适当的溶解性和/或稳定性谱及/或改进的纯化特征。
因此，本发明在一方面提供了人源化FcRn抗体，其经工程化具有与原始鉴定的抗体不同的等电点。所述抗体工程化可通过例如将一个或多个碱性氨基酸残基取代一个酸性氨基酸残基进行氨基酸残基的取代进行。备选地，可引入碱性氨基酸残基或移除酸性氨基酸残基。备选地，如果所述分子具有不可接受的高pI值，则可在需要时引入酸性残基以降低pI。重要的是当操纵pI时，要注意保留抗体或片段的所需活性。因此在一个实施方式中，工程化抗体或片段与“未修饰”抗体或片段具有相同或大体相同的活性。
程序如**ExPASYhttp://www.expasy.ch/tools/pi_tool.html,及http:// www.iut-arles.up.univ-mrs.fr/w3bb/d_abim/compo-p.html,可用于预测抗体或片段的等电点。备选地或此外地，可使用任意适当的标准实验室技术测量pI。
本发明的抗体分子合适地具有高的结合亲和力，具体而言在纳摩尔范围。亲和力可以任意本领域已知的适当方法测量，包括BIAcore，如本文实施例中描述的，使用分离的天然或重组FcRn或适当的融合蛋白/多肽。在一个实施例中，使用如描述于本文实施例中重组人FcRn细胞外结构域测量亲和力(SEQIDNO:48)。在一个实施例中，使用结合人β2微球蛋白(β2M)(SEQIDNO:72)的重组人FcRnα链细胞外结构域(SEQIDNO:48)测量亲和力。合适地，本发明抗体分子具有对分离的人FcRn的结合亲和力为约1nM或更低。在一个实施方式中，本发明的抗体分子具有结合亲和力为约500pM或更低(即更高亲和力)。在一个实施方式中，本发明的抗体分子具有结合亲和力为约250pM或更低。在一个实施方式中，本发明的抗体分子具有结合亲和力为约200pM或更低。在一个实施方式中，本发明的抗体分子具有结合亲和力为约150pM或更低。在一个实施方式中，本发明提供抗-FcRn抗体的结合亲和力为约100pM或更低。在一个实施方式中，本发明提供人源化抗-FcRn抗体的结合亲和力为约100pM或更低。在一个实施方式中，本发明提供抗-FcRn抗体的结合亲和力为约50pM或更低。
在一个实施方式中，本发明的抗体在pH6或较低的pH(具体而言是pH6)及pH7.4或更高pH(具体而言为pH7.4)下都能够结合人FcRn，结合亲和力是可比的。因此，这些抗体的优势在于其可在甚至内体中都能继续结合FcRn，由此最大程度地阻断FcRn对IgG结合。
在一个实施方式中，在pH6和pH7.4下测量到本发明的抗体能够以150pM或更低的结合亲和力结合人FcRn。在一个实施方式中，在pH6和pH7.4下测量到本发明的抗体能够以130pM或更低的结合亲和力结合人FcRn。在一个实施方式中，在pH6下测量到本发明的抗体能够以130pM或更低的结合亲和力结合人FcRn，在pH7.4下测量到结合亲和力为50pM或更低。
本发明的抗体或结合片段的亲和力以及结合试剂(如抗体)对结合的抑制程度都可由本领域普通技术人员使用常规技术确定，例如使用Scatchard等人描述的技术(Ann.KY.Acad.Sci.51:660-672(1949))，或使用诸如BIAcore的系统进行表面等离子共振(surfaceplasmonresonance，SPR)进行确定。对于表面等离子共振，靶标分子被固定化于固相上，并接触流经流体单元的流动相内的配体。如果发生了配体与固定化的靶标的结合，则局部的折射率发生改变，导致SPR角度变化，这可通过检测反射光强度的变化实时监测。可分析SPR信号变化速率生成结合反应的结合及解离相的表观速率常数。这些值确定了表观平衡常数(即亲和力)(见例如Wolff等人,CancerRes.53:2560-65(1993))。
本发明中，通常以如下步骤进行SPR确定测试抗体分子的亲和力。将测试抗体分子捕获于固定相上而与人β2M形成非共价复合物的人FcRn的α链细胞外结构域在流动相中流过捕获的抗体，并确定测试抗体分子对人FcRn的亲和力。可使用任何适当的方法将测试抗体分子捕获于固体相芯片表面，例如使用抗-Fc或抗Fab’的特异捕获试剂。在一个实施例中，确定在pH6的亲和力。在一个实施例中，确定在pH7.4的亲和力。
要清楚的是，本发明提供的抗体的亲和力可通过本领域已知的任意适当方法进行改变。因此，本发明还涉及本发明的抗体分子的变体，其有改进的FcRn亲和力。这些变体可通过大量亲和力成熟的操作流程获得，包括突变CDR(Yang等人,J.Mol.Biol.,254,392-403,1995)，链改组(Marks等人,Bio/Technology,10,779-783,1992)，使用大肠杆菌(E.coli)突变株(Low等人,J.Mol.Biol.,250,359-368,1996)，DNA改组(Patten等人,Curr.Opin.Biotechnol.,8,724-733,1997)，噬菌体展示(Thompson等人,J.Mol.Biol.,256,77-88,1996)以及有性PCR(Crameri等人,Nature,391,288-291,1998)。Vaughan等人(见上文)讨论了这些亲和力成熟的方法。
在一个实施方式中，本发明的抗体分子阻断人FcRn的活性。适合用于确定抗体阻断FcRn的能力的测定法描述于本文实施例部分。用于确定抗体分子在体外阻断IgG再循环能力的合适测定法描述于下文。
若有需要，可将用于本发明的抗体缀合至一种或多种效应分子。要清楚的是所述效应分子可包含单一效应分子或连接而形成可连接于本发明的抗体的单个部分的两个或更多此类分子。若需要获得连接至效应分子的抗体片段，这可通过标准化学或重组DNA步骤而制备，其中所述抗体片段可直接连接或经由缀合试剂连接至效应分子。用于将所述效应分子缀合至抗体的技术在本领域熟知(见Hellstrom等人,ControlledDrugDelivery,2ndEd.,Robinson等人,eds.,1987,pp.623-53；Thorpe等人,1982,Immunol.Rev.,62:119-58及Dubowchik等人,1999,PharmacologyandTherapeutics,83,67-123)。具体的化学步骤包括例如描述于WO93/06231、WO92/22583、WO89/00195、WO89/01476和WO03/031581的方法。备选地，若效应分子为蛋白质或多肽，则可使用重组DNA步骤进行连接，如描述于WO86/01533和EP0392745的方法。
如本文所使用的，术语效应分子包括例如抗肿瘤试剂，药物，毒素，生物活性蛋白质如酶，其他抗体或抗体片段，合成或天然多聚物、核酸及其片段如DNA、RNA及其片段，放射性核素具体而言是放射性碘化物、放射性同位素，螯合金属，纳米颗粒和报告基团，如可通过NMR或ESR光谱检测到的荧光化合物或化合物。
效应分子的实例可包括细胞毒素或细胞毒试剂，包括对细胞有害(例如对细胞致死)的任意试剂。实例包括考布他汀、多拉司他汀、埃博霉素、星形孢菌素、类美登素、海绵毒素、根霉素、软海绵素、杆孢菌素、hemiasterlins、紫杉醇、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、吐根碱、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长春碱、秋水仙碱、阿霉素、柔红霉素、二羟基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光辉霉素、放线菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔和嘌呤霉素及其类似物或同源物。
效应分子还包括但不限于，抗代谢物(如甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶达卡巴)、烷化剂(如氮芥、thioepa苯丁酸氮芥、美法仑、卡莫司汀(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链脲霉素、丝裂霉素C和顺-二氯二胺铂(II)(DDP)顺铂)、蒽环类抗生素(如柔红霉素(以前称为道诺霉素)和阿霉素)、抗生素(如更生霉素(以前称为放线菌素)、博来霉素、光神霉素、氨茴霉素(AMC)、刺孢霉素或多卡米星)、以及抗有丝分裂剂(如长春新碱和长春碱)。
其他效应分子可包括螯合的放射性核素如111In和90Y、Lu177、铋213、锎252、铱192和钨188/铼188；或药物，例如但不限于烷基磷酸胆碱、拓扑异构酶I抑制剂、紫杉烷类和苏拉明。其他效应分子包括蛋白质，肽和酶。感兴趣的酶包括但不限于，蛋白质水解酶、水解酶、裂解酶、异构酶、转移酶。感兴趣的蛋白质，多肽和肽包括但不限于，免疫球蛋白、毒素如相思豆毒蛋白、蓖麻毒素A、假单胞菌外毒素或白喉毒素、蛋白质如胰岛素、肿瘤坏死因子、α-干扰素、β-干扰素、神经生长因子、血小板衍生生长因子或组织纤维蛋白溶酶原活化剂、血栓形成剂或抗血管生成剂，例如血管抑素或内皮抑素，或生物反应调节剂，例如淋巴因子、白介素-1(IL-1)、白介素-2(IL-2)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、神经生长因子(NGF)或其他生长因子及免疫球蛋白。
其他效应分子可包括可检测物质，以用于例如诊断。可检测物质的实例包括多种酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料、放射性核素、正电子发射金属(用于正电子发射断层显像)和非放射性顺磁金属离子。用于诊断的可缀合至抗体的金属离子一般参见美国专利号4,741,900。合适的酶包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶，或乙酰胆碱酯酶；合适的辅基包括链霉亲和素、抗生物素蛋白和生物素；合适的荧光材料包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯荧光素、丹磺酰氯和藻红蛋白；合适的发光材料包括鲁米诺；合适的生物发光材料包括荧光素酶，荧光素和水母发光蛋白；合适的放射性核素包括125I、131I、111In和99Tc。
在另一个实施例中，效应分子可增加抗体的体内半衰期，和/或降低抗体的免疫原性和/或增强抗体穿过上皮屏障进入免疫系统的递送。合适的此类效应分子包括多聚物、白蛋白、白蛋白结合蛋白质或白蛋白结合化合物，如描述于WO05/117984的那些。
在一个实施方式中，效应分子提供的半衰期并不依赖于FcRn，这一点是有优势的。
当效应分子为多聚物时，通常其为合成或天然多聚物，例如为可选地经置换的直链或支链的聚亚烷、聚亚烯烃或聚氧亚烷基聚合物或者分支或不分支的多糖，例如均聚-或杂多糖。
上文提到的合成多聚物上可存在特异性可选的置换物，包括一个或多个羟基、甲基或甲氧基基团。
合成的多聚物的特定实例包括可选地经置换的直链或支链聚(乙二醇)、聚(丙二醇)聚(乙烯醇)或其衍生物，尤其是可选地经置换的聚(乙二醇)，如甲氧基聚(乙二醇)或其衍生物。
具体的天然聚合物包括乳糖、淀粉酶、葡聚糖、糖原或其衍生物。
在一个实施方式中，所述多聚物为白蛋白或其片段，如人血清白蛋白或其片段。
如本文所使用的，“衍生物”意欲包括反应性衍生物，如巯基选择反应性基团如马来酰亚胺等等。所述反应性基团可直接或通过连接子部分连接至多聚物。要理解的是这样的基团的残基在一些情况下作为抗体片段和多聚物之间的连接基团形成产物的一部分。
多聚物的大小可根据需要变化，但通常平均分子量在500Da至50000Da的范围内，例如为5000至40000Da，如从20000至40000Da。聚合物大小具体而言根据产物的预期用途进行选择，例如根据其定位于特定组织如肿瘤的能力或延长循环半衰期的需求进行选择(综述见Chapman,2002,AdvancedDrμgDeliveryReviews,54,531-545)。因此，例如当产物预期要离开循环并渗入组织时，例如在治疗肿瘤的用途中，使用小分子量的多聚物可能更有优势，例如使用分子量大约为5000Da的多聚物。用于产物留在循环中的应用，使用更高分子量的多聚物可能更有优势，例如使用分子量在20000Da至40000Da范围内的多聚物。
合适的多聚物包括聚亚烷多聚物如聚(乙二醇)，或尤其是甲氧基(聚乙二醇)或其衍生物，尤其是其分子量在约15000Da至约40000Da的范围内。
在一个实施例中，用于本发明的抗体连接至聚(乙二醇)(PEG)部分。在一个具体的实施例中，所述抗体为抗体片段，而PEG分子可经过位于氨基酸片段的任意可用的氨基酸侧链或末端氨基酸功能基团(例如任意游离氨基、亚氨基、巯基、羟基或羧基基团)连接。所述氨基酸可天然存在于抗体片段中或可使用重组DNA方法而经工程化于片段中(见例如美国专利号5,219,996；US5,667,425；WO98/25971，WO2008/038024)。在一个实施例中，本发明的抗体分子为修饰的Fab片段，其中的修饰是在其重链C末端添加了一个或多个氨基酸以使效应分子能连接。合适地，所添加的氨基酸形成了修饰的铰链区，其含有一个或多个半胱氨酸残基，而效应分子可连接其上。可使用多重位点以连接两个或更多PEG分子。
合适地，PEG分子是经至少一个位于抗体片段的半胱氨酸残基的巯基基团共价连接的。每个连接于修饰的抗体片段的多聚物分子都可与位于所述片段的半胱氨酸残基的硫原子共价相连。所述共价连接通常为二硫键，或具体而言为硫-碳键。当使用巯基作为连接点连接经过适当活化的效应分子时，可使用巯基选择性衍生物如马来酰亚胺和半胱氨酸衍生物。活化的多聚物可用作制备如上文所述的多聚物修饰的抗体片段的起始材料。所述活化的多聚物可为任意含有巯基反应性基团的多聚物，所述巯基反应性基团例如α-卤素羧酸或酯，如碘乙酰胺，酰亚胺，例如马来酰亚胺，乙烯基砜或二硫化物。这些起始材料可商购获得(例如可来自Nektar，前身为ShearwaterPolymersInc.,Huntsville,AL,USA)，或由商购可得的起始材料通过常规化学步骤制备而得。具体的PEG分子包括20K甲氧基-PEG-酰胺(可获自Nektar,前身为Shearwater；RappPolymere；及SunBio)和M-PEG-SPA(可获自Nektar,前身为Shearwater)。
在一个实施方式中，所述抗体为修饰的Fab片段、Fab’片段或PEG化diFab，即共价连接有PEG(聚(乙二醇))，例如根据EP0948544或EP1090037中公开的方法[另见"Poly(ethyleneglycol)Chemistry,BiotechnicalandBiomedicalApplications",1992,J.MiltonHarris(ed),PlenumPress,NewYork,"Poly(ethyleneglycol)ChemistryandBiologicalApplications",1997,J.MiltonHarris和S.Zalipsky(eds),AmericanChemicalSociety,WashingtonDC及"BioconjugationProteinCouplingTechniquesfortheBiomedicalSciences",1998,M.AslamandA.Dent,GrovePublishers,NewYork；Chapman,A.2002,AdvancedDrugDeliveryReviews2002,54:531-545]。在一个实施例中，PEG连接于铰链区中的半胱氨酸。在一个实施例中，PEG修饰的Fab片段具有马来酰亚胺基团，其共价连接至修饰的铰链区的单个巯基基团。可将赖氨酸残基共价连接于马来酰亚胺基团，且所述赖氨酸残基上各个氨基基团都可连接分子量近似为20,000Da的甲氧基聚(乙二醇)聚合物。因此，连接Fab片段的PEG的总分子量近似为40,000Da。
具体的PEG分子包括N，N'-二(甲氧基聚(乙二醇)MW20,000)的2-[3-(N-马来酰亚氨基)丙酰胺基]乙酰胺修饰的赖氨酸，也被称为PEG2MAL40K(可获自Nektar,前身为Shearwater)。
PEG连接子的备选来源包括NOF，其提供GL2-400MA3(其中下文结构中的m为5)和GL2-400MA(其中m为2)，下文结构中n近似为450:
其中m是2或5。
这意味着每个PEG为约20,000Da。
因此，在一个实施方式中，所述PEG为2,3-双(甲基聚氧乙烯-氧)-1-{[3-(6-马来酰亚胺基-1-氧代乙基)氨基]丙氧基}己烷(2臂分支的PEG,-(CH2)3NHCO(CH2)5-MAL，Mw40,000)，称为SUNBRIGHTGL2-400MA3。
具有下列类型的进一步的备选PEG效应分子:
可获自DrReddy,NOF和Jenkem。
在一个实施方式中，提供了PEG化抗体(例如以本文描述的PEG)，通过链的232号位置氨基酸例如重链的232号氨基酸(通过序列编号)处或附近的半胱氨酸氨基酸残基连接，例如为SEQIDNO:33的232号氨基酸。
在一个实施方式中，本发明公开提供了Fab’PEG分子，其包含一种或多种PEG多聚物，例如1或2种多聚物，如40kDa的一种或多种多聚物。
根据本发明公开的Fab’-PEG分子因为具有不依赖Fc片段的半衰期，而尤其有优势。在一个实施例中，本发明提供了治疗可由阻断人FcRn缓解的疾病的方法，包括施用治疗有效量的抗-FcRn抗体或其结合片段，其中所述抗体或其结合片段具有半衰期不依赖于结合至FcRn的Fc。
在一个实施方式中，提供了缀合至多聚物如PEG分子、淀粉分子或白蛋白分子的Fab’。
在一个实施方式中，提供了缀合至多聚物如PEG分子、淀粉分子或白蛋白分子的scFV。
在一个实施方式中，所述抗体或片段缀合至淀粉分子，例如以增加半衰期。将淀粉缀合至蛋白质的方法描述于US8,017,739中，其并入本文作为参考。
在一个实施方式中，提供了抗-FcRn结合分子(即抗体或其结合片段)，其：
·引起血浆IgG浓度减少50-85％，如减少70％，
·同时血浆白蛋白浓度的减少不超过25％或20％，且/或
·具有重复给药以实现长期维持血浆IgG低浓度的可能性。
本发明还提供分离的DNA序列，其编码本发明的抗体分子的重链和/或轻链。合适地，所述DNA序列编码本发明的抗体分子的重链或轻链。本发明的DNA序列可包含例如由化学加工产生的合成DNA、cDNA基因组DNA或其任意组合。
可通过本领域技术人员熟知的方法获得编码本发明抗体分子的DNA序列。例如，可根据需要从确定的DNA序列合成或根据对应氨基酸序列合成而得到编码部分或全部所述抗体重链和轻链的DNA序列。
编码受体框架序列的DNA对本领域技术人员而言可通过广泛的途径获得，并可容易地由其根据其已知的氨基酸序列合成而得。
分子生物学标准技术可用于制备编码本发明抗体分子的DNA序列。可完全或部分地使用寡核苷酸合成技术合成所需的DNA序列。在适当时可使用定点诱变和聚合酶链反应(PCR)技术。
本文提供了适合的DNA序列的实例。
编码1638.g49轻链可变区的合适DNA序列的实例提供于SEQIDNO:17、SEQIDNO:19和SEQIDNO:21中。
编码1638.g28轻链可变区的合适DNA序列的实例提供于SEQIDNO:52和SEQIDNO:54中。
编码1638.g49重链可变区的合适DNA序列的实例提供于SEQIDNO:26和SEQIDNO:28中。
编码1638.g28重链可变区的合适DNA序列的实例提供于SEQIDNO:60和SEQIDNO:62中。
编码1638.g49轻链(可变区及恒定区)的合适DNA序列的实例提供于SEQIDNO:21、SEQIDNO:22和SEQIDNO:24中，并且对于1638.g28轻链，所述序列在SEQIDNO:54、SEQIDNO:56、SEQIDNO:58中给出，对于1638.g28重链，所述序列在SEQIDNO:64或SEQIDNO:66中给出。
编码1638.g49重链(可变区及恒定区，根据形式)的合适DNA序列的实例在SEQIDNO:30(Fab)、SEQIDNO:34或36(Fab’)、SEQIDNO:38(IgG4P)、SEQIDNO:43(FabFv)及SEQIDNO:74(IgG1)中提供。
因此，在一个实施例中，本发明提供了编码本发明的抗体Fab或Fab’片段的重链的分离的DNA序列，其包含SEQIDNO:30、32、34、36、64或66给定的序列。还提供了编码本发明的抗体Fab或Fab’片段的轻链的分离的DNA序列，其包含SEQIDNO:21、22或56给定的序列。
在一个实施例中，本发明提供了编码本发明的IgG4(P)抗体的重链和轻链的分离的DNA序列，其中所述编码重链的DNA包含SEQIDNO:38给定的序列，而所述编码轻链的DNA包含SEQIDNO:22给定的序列。
在一个实施例中，本发明提供了编码本发明的IgG1抗体的重链和轻链的分离的DNA序列，其中所述编码重链的DNA包含SEQIDNO:74给定的序列，而所述编码轻链的DNA包含SEQIDNO:22给定的序列。
在一个实施例中，本发明提供了编码本发明的Fab-dsFv抗体的重链和轻链的分离的DNA序列，其中所述编码重链的DNA包含SEQIDNO:43给定的序列，而所述编码轻链的DNA包含SEQIDNO:41给定的序列。
本发明还涉及一种克隆或表达载体，其包含一种或多种本发明的DNA序列。因此，提供了一种克隆或表达载体，其包含一种或多种编码本发明抗体的DNA序列。合适地，所述克隆或表达载体包含两种DNA序列，分别编码本发明抗体分子的轻链和重链，以及合适的信号序列。在一个实施例中，所述载体包含位于重链和轻链之间的基因间序列(见WO03/048208)。
构建所述载体的一般方法、转染方法及培养方法是本领域技术人员熟知的。在这方面，参考“CurrentProtocolsinMolecularBiology”,1999,F.M.Ausubel(ed),WileyInterscience,NewYork及ColdSpringHarborPublishing出版的ManiatisManual。
还提供了宿主细胞，其包含一种或多种克隆或表达载体，后者包含一种或多种编码本发明抗体的DNA序列。因此，本发明还提供了宿主细胞，用于表达根据本发明的抗体，其包含：
i)编码所述抗体重链的DNA序列，以及
ii)编码所述抗体轻链的DNA序列，
其中所述DNA序列在一种或多种克隆或表达载体中提供。
任意合适的细胞/载体系统可用于表达编码本发明抗体分子的DNA序列。可使用细菌，例如大肠杆菌，及其他微生物系统(尤其是用于表达抗体片段)，或亦可使用真核如哺乳动物宿主细胞表达系统(尤其用于表达全长抗体)。合适的哺乳动物宿主细胞包括CHO、骨髓瘤或杂交瘤细胞。
用于本发明的合适的中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)可包括CHO和CHO-K1细胞，包括可用DHFR选择性标记的dhfr-CHO细胞如CHO-DG44细胞及CHO-DXB11细胞，或用谷氨酰胺合成酶选择性标记的CHOK1-SV细胞。其他用于表达抗体的细胞类型包括淋巴细胞系例如NSO骨髓瘤细胞及SP2细胞、COS细胞。
本发明还提供了用于生产根据本发明的抗体分子的方法，包括在适合由编码本发明的抗体分子的DNA进行蛋白质表达的条件下培养含有本发明的一种或多种载体的宿主细胞，以及分离所述抗体分子。
所述抗体分子可仅仅包含重链或轻链多肽，该情况下只需要使用重链或轻链多肽的编码序列转染宿主细胞。为生产包含重链及轻链二者的产物，可以使用两种载体转染细胞系，第一种载体编码轻链多肽，第二种载体编码重链多肽。备选地，可使用单一载体，所述载体包括编码轻链及重链多肽的序列。
根据本发明公开的抗体和片段在宿主细胞中的表达水平佳。因此所述抗体和/或片段的特性有利于商业加工。
因此，提供了一种方法，用于培养宿主细胞并表达抗体或其片段，分离后者并可选地将其纯化以提供分离的抗体或片段。在一个实施方式中，所述方法进一步包括将效应分子缀合至分离的抗体或片段的步骤，例如缀合至PEG多聚物，具体而言是本文描述的那些PEG。
在一个实施方式中，提供了纯化抗体(具体而言是根据本发明的抗体或片段)的方法，包括步骤：在非结合模式下进行阴离子交换色谱，使杂质保留在柱子上，而抗体得到洗脱。
在一个实施方式中，所述纯化采用在FcRn柱子进行亲和捕获。
在一个实施方式中，所述纯化采用净化活性兰或类似物质用于纯化白蛋白融合或缀合分子。
用于该方法的合适的离子交换树脂包括Q.FF树脂(由GE-Healthcare供应)。该步骤可在例如约pH8进行。
该方法可进一步包括起始的捕获步骤，其采用阳离子交换色谱，在例如约pH4至5，如pH4.5进行。所述阳离子交换色谱例如采用树脂为例如CaptoS树脂或SP琼脂糖FF(由GE-Healthcare供应)。然后，可采用离子盐溶液如氯化钠(浓度为例如200mM)将所述抗体或片段从树脂上洗脱下来。
因此在适当的情况下所述一个或多个色谱步骤可包括一个或多个洗涤步骤。
所述纯化方法还可包含一个或多个过滤步骤，如渗滤步骤。
因此在一个实施方式中，提供了纯化的抗-FcRn抗体或片段，例如提供了人源化抗体或片段，具体而言为根据本发明的抗体或片段，其大体上是纯化形式，具体而言为不含或大体上不含内毒素和/或宿主细胞蛋白质或DNA。
如上文所使用的，“纯化形式”意指至少90％的纯度，如91、92、93、94、95、96、97、98、99％w/w或更纯。
大体上不含内毒素通常意指内毒素含量为1EU每mg抗体产物或低于如0.5或0.1EU每mg产物。
大体上不含宿主细胞蛋白质或DNA通常意指宿主细胞蛋白质和/或DNA含量为400μg每mg抗体产物或更低，如100μg每mg或更低；具体而言在适当的情况下为20μg每mg。
本发明的抗体分子还可用于诊断，例如用于涉及FcRn的疾病状态的体内诊断和成像。
由于本发明的抗体可用于治疗和/或预防某些病况，本发明还提供了药用或诊断组合物，其包含本发明的抗体分子与一种或多种药用可接受辅料、稀释剂或承载体相组合。因此，提供了本发明的抗体分子用于制造药物的用途。所述组合物常常作为无菌的药用组合物的一部分提供，其通常都包括药物可接受承载体。本发明的药用组合物可此外包含药物可接受辅料。
本发明还提供了制备药用或诊断组合物的方法，包括加入本发明的抗体分子并与一种或多种药物可接受辅料、稀释剂或载体混合。
所述抗体分子可以为所述药用或诊断组合物中唯一的活性成分，或可伴随有其他活性成分，包括其他抗体成分或非抗体成分，如固醇类，或其他药物分子，具体而言是半衰期不依赖FcRn结合的药物分子。
合适地，所述药用组合物包含治疗有效量的本发明的抗体。如本文所使用的术语“治疗有效量”指代治疗剂用于治疗、缓解或阻止目标疾病或病况或显现出可检测的治疗或预防效应所需的量。对任意抗体，都可在起初在细胞培养测定法中或在动物模型中估计治疗有效量，例如在啮齿类、兔、狗、猪或灵长类中。所述动物模型还可用于确定适当的施用浓度范围和施用途径。然后可使用这些信息确定对人施用的有用剂量及施用途径。
对于人受试者的确切治疗有效量取决于疾病状态的严重度，受试者的一般健康状况，受试者的年龄、体重和性别，饮食情况，施用时间和频率，药物组合情况，反应敏感度和对疗法的耐受力/反应。所述量可通过常规实验确定，并在临床医师的判断范围内。通常，治疗有效量为0.01mg/kg至500mg/kg，例如为0.1mg/kg至200mg/kg，如100mg/Kg。
药用组合物可方便地以单位剂量的形式存在，每剂量含有预先确定的本发明的活性剂的量。
根据本发明公开的抗体的治疗剂量未显示显著的体内毒理学效应。
在根据本发明的抗体或片段一个实施方式中，单一剂量可使循环IgG水平有多至70％的减少。在根据本发明的抗体或片段的一个实施例中，单一剂量可提供循环IgG水平多至80％的减少。在根据本发明的抗体或片段的一个实施例中，单一剂量可提供循环IgG水平超过80％的减少。
在施用相关治疗剂量后约1周可观察到循环IgG有最大的治疗性减少。如果不进一步进行治疗给药，在给药后数周内IgG水平会逐渐恢复。如本文提到的恢复指代水平回到类似于初始给药开始前观察到的水平。
根据本发明公开的抗体或片段的优势在于通过连续给药的施用可使体内IgG水平维持在适当的低水平。
组合物可单独施用给患者或可与其他试剂、药物或激素组合施用(例如同时施用，顺序施用或分开施用)。
如本文应用的试剂指代施用时具有生理学效应的实体。
如本文应用的药物指代在治疗剂量下产生适当的生理学效应的化学实体。
在一个实施方式中，根据本发明公开的抗体或片段与免疫抑制疗法一同使用，如类固醇，具体而言为强的松。
在一个实施方式中，根据本发明公开的抗体或片段与利妥昔单抗或其他B细胞疗法一同使用。
在一个实施方式中，根据本发明公开的抗体或片段与任意B细胞或T细胞调制剂或免疫调节剂一同使用。实例包括氨甲喋呤、吗替麦考酚酯和硫唑嘌呤。
本发明的抗体分子的施用剂量取决于要治疗的病况、存在的炎症程度以及抗体分子是用于预防用途或是用于治疗已有病况。
给药频率取决于抗体的半衰期、其目标介导的处置、其的效应持续时间以及抗药物抗体的存在情况。如果抗体半衰期短(数小时)或活性有限，和/或如果需要递送少量的药物体积(例如皮下注射时)，则有必要频繁给药，如一天一次或多次。备选地，如果抗体半衰期长，具有长时间的活性，或可以大体积给药(如输注)，则可低频给药，每天或数天、数周或数月给药一次。在一个实施方式中，给药之间的时间预留了足够使抗药物抗体水平下降的时间。
如本文使用的半衰期意指所述分子在循环，例如在血清/血浆中持续的时间。
如本文所提到的药代动力学指代根据本发明的分子的生物学作用状态，具体而言是其持续时间。
所述药物可接受承载体应当自身不会诱导产生对接受所述组合物治疗的个体有害的抗体，且应当没有毒性。合适的载体可以为大的、代谢缓慢的大分子如蛋白质、多肽、脂质体、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚氨基酸、氨基酸共聚物及灭活病毒颗粒。
可使用药物可接受盐，例如矿物酸盐如盐酸盐、溴酸盐、磷酸盐和磺酸盐，或者有机酸盐，如醋酸盐、丙酸盐、丙二酸盐和苯甲酸盐。
治疗组合物中的药用可接受承载体(carrier)可另外含有液体成分如水、盐水、甘油和乙醇。此外，这些组合物中还可存在佐剂物质，如湿润剂或乳化剂，或pH缓冲物质。这些承载体使得药用组合物可配制为片剂、丸剂、锭剂、胶囊、液化剂、凝胶、糖浆、浆液和混悬剂，由患者摄取。
合适的施用形式包括适合肠道外施用的形式，例如通过注射或输注，例如通过推注或连续输注。当产品是用于注射或输注用途时，其可以为混悬剂、溶液或在油性或水性媒介物的乳化剂形式，且其可含有制剂用试剂，如助悬剂、防腐剂、稳定剂和/或分散剂。备选地，所述抗体分子可以为干燥形式，在使用前以适当的无菌液体配制。
一经配制，本发明的组合物则可直接施用于受试者。要治疗的受试者可为动物。然而，在一个或多个实施方式中，所采用的组合物是用于施用于人受试者的。
合适地，根据本发明公开的制剂中，最终制剂的pH值与所述抗体或片段的等电点值并不类似，例如如果该蛋白质的pI是在8至9的范围内或以上，则制剂的pH为7是适当的。不希望受理论约束，这被认为可最终提供具有改进的稳定性的最终制剂，例如所述抗体或片段维持在溶液中。
在一个实施例中，pH范围为4.0至7.0的药用制剂包含：1至200mg/mL的根据本发明公开的抗体分子，1至100mM的缓冲液，0.001至1％的表面活性剂，a)10至500mM的稳定剂，b)10至500mM的稳定剂和5至500mM的张力剂，或c)5至500mM的张力剂。
本发明的药用组合物可以任意多种途径施用，包括但不限于：经口、静脉内、肌内、动脉内、髓内、鞘内、心室内、透皮、经皮(例如，参见WO98/20734)、皮下、腹膜内，鼻内、肠内、局部，舌下、阴道内或直肠途径。无针注射也可以用于施用本发明的药用组合物。典型地，治疗组合物可以制备为可注射的，可以为液体溶液或混悬液。也可制备固体形式，其适合注射前于液体媒介物中的溶液或混悬液
所述组合物的直接递送一般可通过皮下、腹腔内、静脉内或肌内注射完成，或递送至组织的间隙空间。所述组合物还可施用至在病灶内。剂量治疗可以是单一剂量方案或多剂量方案。
要清楚的是组合物中的活性成分是抗体分子。如此，其会容易在胃肠道中降解。因此，如果所述组合物是通过经胃肠道途径施用，则该组合物将需要含有保护该抗体免于降解的试剂，但一旦其已经从胃肠道中被吸收，则释放抗体。
对药用可接受载体的全面讨论可参见于Remington'sPharmaceuticalSciences(MackPublishingCompany,N.J.1991).
在一个实施方式中，所述制剂是以用于局部施用，包括吸入的制剂提供。
合适的可吸入制备物包括可吸入粉末、含有推进气体的计量气雾剂，或不含推进气体的可吸入溶液。根据本发明的含有活性物质的可吸入粉末可只由上文提到的活性物质构成，或可由上文提到的活性物质与生理可接受辅料的混合物构成。
所述这些可吸入粉末可包括单糖(例如葡萄糖和阿拉伯糖)、二糖(如乳糖，蔗糖，麦芽糖)、寡糖和多糖(例如葡聚糖)、多元醇(例如山梨糖醇，甘露醇，木糖醇)、盐(例如氯化钠，碳酸钙)，或者彼此的混合物。单-或二糖被适当地使用，乳糖或葡萄糖具体而言是以其水合物形式被使用，但这也不是其仅有的形式。
用于在肺中处置的颗粒需要颗粒大小要求低于10微米，例如1至9微米，例如1至5μm，活性成分的颗粒大小(如所述抗体或片段)是首要的。
可用于制备可吸入气雾剂的推进气体在本领域已知。合适的推进气体选自烃类，如正丙烷、正丁烷或异丁烷和卤代烃如甲烷、乙烷、丙烷，丁烷、环丙烷或环丁烷的氯化和/或氟化的衍生物。上述推进剂气体可自身使用或以混合物使用。
具体的合适推进剂气体为卤代烷烃衍生物，选自TG11、TG12、TG134a和TG227。上述卤代烃中，TG134a(1,1,1,2-四氟乙烷)和TG227(1,1,1,2,3,3,3-七氟丙烷)及其混合物是特别合适的。
含推进剂的气体的可吸入气雾剂还可以含有其它成分如助溶剂、稳定剂、表面活性试剂(表面活性剂)、抗氧化剂、润滑剂和调节pH的物质。所有这些成分都是本领域中公知的。
根据本发明的含推进剂的气体的可吸入气雾剂含有活性物质的比例以重量计高达5％。根据本发明的气雾剂含有活性成分的重量比例为例如，0.002至5％(重量)、0.01至3％(重量)、0.015％至2％(重量)、0.1至2％(重量)、0.5至2％(重量)或0.5％至1％(重量)。
备选地局部施用至肺部也可以是通过液体溶液或混悬剂制剂的施用，例如使用雾化器之类的设备，例如，连接压缩机的雾化器(例如，PariLC-JetPlus(R)雾化器连接到由PariRespiratoryEquipment,Inc.,Richmond,Va.制造的PariMaster(R)压缩机)。
本发明的抗体可分散在溶剂内例如以溶液或混悬剂形式进行递送。其可以被悬浮在适当的生理溶液中，例如，盐水或其他药用可接受的溶剂或缓冲溶液。本领域中已知的缓冲溶液的实例可为1ml水中含有0.05mg至0.15mg的乙二胺四乙酸二钠、8.0mg至9.0mg的NaCl、0.15mg至0.25mg的聚山梨醇酯、0.25mg至0.30mg的无水柠檬酸，及0.45mg至0.55mg的柠檬酸钠，使pH值达到约4.0至5.0。混悬剂可以使用例如冻干的抗体。
治疗性悬浮液或溶液制剂还可以包含一种或多种辅料。辅料是本领域熟知的，包括缓冲液(例如，柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液和碳酸氢盐缓冲液)、氨基酸、尿素、醇、抗坏血酸、磷脂、蛋白质(例如，血清白蛋白)、EDTA、氯化钠、脂质体、甘露醇、山梨醇和甘油。溶液或混悬剂可封装于脂质体或可生物降解的微球内。该制剂一般采用无菌制造过程并以大体上无菌的形式提供。
这可以包括生产和灭菌，通过由本领域普通技术人员熟悉的方法过滤用于制剂的经缓冲的溶剂/溶液、将抗体在无菌缓冲的溶剂溶液中重悬，并将所述制剂分配至无菌接收容器中。
可以提供根据本发明公开的喷雾制剂，例如，作为包装在铝箔包内单一剂量单位(例如，密封的塑料容器或小瓶)。每个小瓶在一定体积(例如2毫升)中包含单位剂量的溶剂/溶液缓冲液。
本文公开的抗体可适合于经由雾化递送。
也可以设想的是，本发明的抗体可以通过使用基因疗法进行施用。为了达到这一目的，将在适当的DNA组分的控制下编码所述抗体分子重链和轻链的DNA序列引入患者，使得所述抗体链从所述DNA序列表达和原位装配。
本发明还提供了抗体分子(或包含其的组合物)用于控制自身免疫性疾病的用途、例如急性播散性脑脊髓炎(ADEM)、急性坏死性出血性白质脑炎、阿狄森氏病、丙种球蛋白血症、斑秃、淀粉样变性病、ANCA相关脉管炎、强直性脊柱炎、抗GBM/抗TBM肾炎、抗磷脂综合症(APS)、自身免疫性血管性水肿、自身免疫性再生障碍性贫血、自身免疫性自主神经功能异常、自身免疫性肝炎、自身免疫性高脂血症、自身免疫性免疫缺陷、自身免疫性内耳病(AIED)、自身免疫性心肌炎、自身免疫性胰腺炎、自身免疫视网膜病、自身免疫性血小板减少性紫癜(ATP)、自身免疫性甲状腺疾病、自身免疫性荨麻疹、轴索和纳尔神经病(axonal&nalneuropathies)、巴洛病、白塞氏病、大疱性类天疱疮、心肌病、Castleman病、乳糜泻、恰加斯病、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病(CIDP)、慢性复发性多灶性骨髓炎(CRMO)、丘-斯综合征、瘢痕性类天疱疮/良性粘膜类天疱疮、克罗恩病、Cogans综合征、冷凝集素病、先天性心脏传导阻滞、柯萨奇病毒性心肌炎、CREST病、原发性混合型冷球蛋白血症、脱髓鞘神经病变、疱疹性皮炎、皮肌炎、德维克病(视神经脊髓炎)、扩张型心肌病、盘状红斑狼疮、德雷斯勒氏综合征、子宫内膜异位症、嗜酸性血管中心纤维化、嗜酸性筋膜炎、结节性红斑、实验性变态反应性脑脊髓炎、Evans综合征、纤维性肺泡炎、巨细胞动脉炎(颞动脉炎)、肾小球肾炎、肺出血肾炎综合征、韦格纳肉芽肿(GPA)见韦格纳、格雷夫斯病、格林-巴利综合征、桥本氏脑炎、桥本氏甲状腺炎、溶血性贫血、过敏性紫癜、妊娠疱疹、低丙球蛋白血症、特发性低补体肾小管间质性肾炎、特发性血小板紫癜(ITP)、IgA肾病、IgG4相关疾病、IgG4相关硬化病、免疫调节脂蛋白、炎症性主动脉瘤、炎性假瘤、包涵体肌炎、胰岛素依赖型糖尿病(1型)、间质性膀胱炎、少年关节炎、青少年糖尿病、川崎综合征、库特纳肿瘤、兰伯特-伊顿综合征、白细胞碎裂性血管炎、扁平藓、硬化性癣、木本植物性结膜炎、线状IgA病(LAD)、红斑狼疮(SLE)、莱姆病、慢性、纵隔纤维化病、美尼尔氏病、显微多血管炎、Mikulicz综合征、混合性结缔组织病(MCTD)、蚕蚀性角膜溃疡、木栅-赫伯曼病、多发性纤维硬化、多发性硬化症、重症肌无力、肌炎、发作性睡病、视神经脊髓炎(德维奇氏)、中性粒细胞减少、眼瘢痕性类天疱疮、视神经炎、奥蒙德病(腹膜后纤维化)、复发性风湿病、PANDAS(链球菌相关小儿自身免疫性神经精神障碍)、副肿瘤性小脑变性、副蛋白血症性神经病、阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)、帕里龙贝格综合症、Parsonnage-Turner综合征、平坦部炎(周围葡萄膜炎)、寻常型天疱疮、织脉周炎、动脉周炎、周围神经病变、静脉周围性脑脊髓炎、恶性贫血、POEMS综合征、结节性多动脉炎、I、II、III型自身免疫性多腺体综合征、风湿性多肌痛、多发性肌炎、心肌梗塞后综合征、心包切开术后综合征、黄体酮皮炎、原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎、牛皮癣、牛皮癣关节炎、特发性肺纤维化、坏疽性脓皮、纯红细胞再生障碍、雷诺氏现象、反射交感性营养不良、莱特尔氏综合征、复发性多软骨炎、不宁腿综合征、腹膜后纤维化(奥蒙德氏病)、风湿热、类风湿关节炎、里德尔甲状腺炎、结节病、施密特综合征、巩膜炎、硬皮病、干燥综合征、精子和睾丸自身免疫、僵人综合征、亚急性细菌性心内膜炎(SBE)、Susac综合征、交感性眼炎、大动脉炎、颞动脉炎/巨细胞动脉炎、血栓、血小板性紫癜(TTP)、图卢兹-亨特综合症、横贯性骨髓炎、溃疡性结肠炎、未分化的结缔组织病(UCTD)、葡萄膜炎、血管炎、水疱性皮肤病、白癜风、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、温特发性溶血性贫血和韦格纳肉芽肿病(现在称为肉芽肿性多血管炎(GPA))。
其他适应症还可包括高粘滞综合征、冷球蛋白血症、肾脏移植中的复发性局灶性节段性肾小球硬化、HELLP综合征；Refsum病、HIV相关的神经病变；横纹肌溶解症和同种免疫疾病。
在一个实施方式中，在治疗或预防癫痫或癫痫发作中采用了根据本发明公开的抗体或片段。
在一个实施方式中，在治疗或预防多发性硬化症中采用了根据本发明公开的抗体或片段。
在实施例中本发明公开的抗体和片段用于同种免疫疾病/适应症，其包括：
·由于抗HLA抗体导致的移植供体不合
·胎儿和新生儿免疫性血小板减少症，FNAIT(或新生儿免
疫性血小板减少症，NAITP或NAIT或NAT，或胎儿-母亲同种
免疫血小板减少症，FMAITP或FMAIT)。
其它适应症包括含Fc的生物制药药物从人类患者中的快速清除及抗-FcRn疗法与其他疗法(IVIg、利妥昔单抗、血浆置换)的组合。例如可在利妥昔单抗疗法抗后进行FcRn疗法。此外，抗-FcRn疗法可以被用作快速清晰的成像试剂，如在肿瘤成像中使用的放射性标记抗体。
在一个实施方式中，本发明公开的抗体和片段用于神经障碍如：
·慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病(CIDP)
·格林-巴利综合征
·副蛋白血症性神经病
·视神经脊髓炎(NMO和NMO谱系障碍或NMO谱疾病)，以及
·重症肌无力。
在一个实施方式中，本发明公开的抗体和片段用于皮肤障碍，如：
·大疱性类天疱疮
·寻常型天疱疮
·ANCA相关血管炎
·扩张型心肌病。
在一个实施方式中，本发明公开的抗体和片段用于免疫、血液障碍，如：
·特发性血小板减少性紫癜(ITP)
·血栓性血小板减少性紫癜(TTP)
·温特发性溶血性贫血
·肺出血肾炎综合征
·由于抗HLA抗体产生的移植供体不合。
在一个实施方式中，所述障碍选自：重症肌无力、视神经脊髓炎、CIDP、纪尧姆-巴利综合征、副蛋白血症性神经病变、难治性癫痫、ITP/TTP、溶血性贫血、肺出血肾炎综合征、ABO不合、狼疮性肾炎、肾血管炎、硬皮病、纤维性肺泡炎、扩张型心肌病、严重的疾病、1型糖尿病、自身免疫性糖尿病、天疱疮、硬皮病、红斑狼疮、ANCA血管炎、皮肌炎、干燥综合征和风湿性关节炎。
在一个实施方式中，所述障碍选自：多内分泌腺自身免疫综合征1型(APECED或Whitaker氏综合征)和2型(施密特氏综合征)；普秃；重症肌无力危象；甲状腺危象；甲状腺相关性眼病；甲状腺眼病；自身免疫性糖尿病；自身抗体相关的脑炎和/或脑病；天疱疮；大疱性表皮松解；疱疹样皮炎；西德纳姆舞蹈症；急性运动性轴索神经病(AMAN)；米勒费雪综合征；多灶性运动神经病(MMN)；眼球阵挛；炎症性肌病；艾萨克氏综合征(一种自身免疫性神经性肌强直)、副肿瘤综合征和边缘叶脑炎。
根据本发明公开的抗体和片段可应用于治疗或预防。
本发明公开还提供了减少个体中不期望的抗体浓度的方法，包括步骤：向个体施用治疗有效剂量的本发明描述的抗-FcRn抗体或或其结合片段。
本发明进一步提供了根据本发明的抗体分子在制备药物中的用途，所述药物用于治疗和/或预防本文描述的病理障碍，如自身免疫疾病。
在一个实施方式中，本发明公开包含抗体或其片段用作诊断反应剂的用途，例如缀合至报告分子。因此，提供了经标记的根据本发明公开的抗体或片段。在一方面，提供了包含根据本发明公开的抗体或片段的柱子。
因此，提供了抗-FcRn抗体或结合片段用作反应剂作如下用途：
1)FcRn蛋白质(或其片段)的纯化–所述抗体或片段被缀合至基质作为亲和柱，或(如抗-FcRn的修饰的形式)可作为沉淀剂(例如以可由其他分子鉴定的结构域修饰的形式，可通过添加Fc得到修饰(或以全长IgG生产)，并可选地被抗-Fc反应剂沉淀)。
2)细胞上或细胞内(组织中体外或体内细胞或者细胞切片)的FcRn检测及/或定量。对此的用途可包括对作为生物标志物的FcRn进行定量，以追踪抗-FcRn治疗的效应。用于这些目的，候选物可以以修饰的形式使用(例如通过如同全长IgG的情况添加Fc结构域，或添加一些其他部分如遗传融合蛋白质或化学缀合物，例如添加荧光标签用于检测目的)。
3)纯化或分选通过结合至通过(1)和(2)中示例的方式修饰的候选物而被标记的具有FcRn的细胞。
本发明还提供的是适合评估测试分子如抗体分子阻断FcRn活性的能力，具体而言为细胞回收IgG的能力的测定法。这样的测定法可用于鉴定FcRn活性的抑制，如抗体分子或小分子，这样也可用作该抑制剂生产中的批量释放测定法。
在一方面，提供适合评估测试分子如抗体分子阻断人FcRn活性的能力，具体而言为人FcRn回收IgG的能力的测定法，其中所述方法包括步骤：
a)向表面包被重组表达人FcRnα链和人β2微球蛋白(β2M)的非人哺乳动物细胞，
b)在温和的酸性条件下如约pH5.9将细胞与测试分子和要被细胞回收的IgG接触足够的时间，以使测试分子和IgG都能结合至FcRn，可选地在待回收IgG前加入测试分子并孵育一段足够的时间使测试分子能结合上FcRn。
c)以轻度酸性缓冲液洗涤，及
d)检测内化的及/或由细胞回收的IgG的量。
在一方面，提供适合评估测试分子如抗体分子阻断人FcRn活性的能力，具体而言为人FcRn回收IgG的能力的测定法，其中所述方法包括步骤：
a)向表面包被重组表达人FcRnα链和人β2微球蛋白(β2M)的非人哺乳动物细胞，
b)在温和的酸性条件下如约pH5.9将细胞与测试分子和要被细胞回收的IgG接触足够的时间，以使测试分子和IgG都能结合至FcRn，可选地在待回收IgG前加入测试分子并孵育一段足够的时间使测试分子能结合上FcRn。
c)以轻度酸性缓冲液洗涤以去除未结合的IgG和测试抗体分子，及
d)检测由细胞回收的IgG的量。
在一方面，提供适合评估测试分子如抗体分子阻断人FcRn活性的能力，具体而言为人FcRn回收IgG的能力的测定法，其中所述方法包括步骤：
a)向表面包被重组表达人FcRnα链和人β2微球蛋白(β2M)的非人哺乳动物细胞，
b)在温和的酸性条件下如约pH5.9将细胞与测试分子和要被细胞回收的IgG接触足够的时间，以使测试分子和IgG都能结合至FcRn，可选地在待回收IgG前加入测试分子并孵育一段足够的时间使测试分子能结合上FcRn。
c)以轻度酸性缓冲液洗涤以移除未结合的IgG及测试抗体分子，
d)在中性如约pH7.2的缓冲液中孵育细胞，及
e)通过检测释放至上清的IgG量确定检测由细胞回收的IgG的量。
适合的细胞包括Madin-Darby猴肾(MDCK)II细胞。Claypool等人2002,JournalofBiologicalChemistry,277,31,28038-28050中描述了具有人FcRnα链和人β2微球蛋白(β2M)的MDCKII细胞。该文章还描述了这些转染的细胞对IgG的回收情况。
在测试中用于支持细胞的培养基包括包含MEM(Gibco#21090-022),1x非必需氨基酸(Gibco11140-035),1x丙酮酸钠(Gibco#11360-039)及L-谷氨酰胺(Gibco#25030-024)的完全培养基。
酸性洗涤液可这样制备，使用HBSS+(PAA#H15-008)并加入1MMES至pH达到5.9+/-0.5。还可向其中添加约1％的BSA(Sigma#A9647)。
中性洗涤液可这样制备，使用HBSS+(PAA#H15-008)并加入10MHepes至pH达到7.2+/-0.5。还可向其中添加约1％的BSA(Sigma#A9647)。
用酸性缓冲液洗涤细胞移除未结合的测试抗体及未结合的IgG，并允许进一步进行分析。步骤(b)中使用的酸性条件会促进IgG对FcRn的结合并促进其的内化作用和回收。
通过用中性洗涤液洗涤细胞并分析上清/洗涤液以检测抗体或IgG的数量，可以确定仅存在于细胞表面的测试抗体或片段及IgG的量。重要的是不采用裂解缓冲液。为确定由细胞内化的IgG的量，可首先从细胞表面用中性洗涤液移除抗体并用裂解缓冲液裂解细胞，然而分析内部含量。为确定细胞回收的IgG量，将细胞在中性条件孵育一段合适的时间并分析周围缓冲液的IgG含量。如果要求得出细胞的表面和内部抗体含量，则可用酸性洗涤液洗涤细胞以维持抗体存在细胞表面上，随后进行细胞裂解并分析组合的材料。
当IgG的内化和回收都需要测量时，以重复运行样品并分开进行内化和回收的测试。
合适的裂解缓冲液包括150mMNaCl、20mMTris,pH7.5、1mMEDTA、1mMEGTA、1％Triton-X100，按制造商指南中描述的，向每10ml加入蛋白酶抑制剂/磷酸酶抑制剂。
通常标记待回收的IgG，在一个实施例中，可使用生物素化的人IgG。然后可应用例如链霉亲和素-磺基标签的检测抗体(如MSD#r32ad-5)检测所述IgG，其中使用25mL的浓度为0.2μg/mL的MSD阻断缓冲液。阻断缓冲液可包括500mMTris,pH7.5，1.5MNaCl及0.2％Tween-20和1.5％BSA。
备选地，可用荧光素或类似标签对IgG进行预标记。
在一个实施方式中，合适的表面为塑料平板或孔，如96孔板或类似、玻片或膜。在一个实施例中，以形成单层的密度将细胞包被至所述表面。
在一个实施方式中，本文描述的测定法并非测量抗体从有pH梯度的膜上到膜底部的转胞吞作用，例如膜的一侧为酸性条件而膜的底侧为中性条件。
在一个实施例中，可在例如允许结合的室温酸性条件下将测试抗体或片段与步骤(b)中的细胞孵育约1小时，之后加入待回收的IgG。随后，待在例如允许结合的室温酸性条件下将被细胞回收的IgG与步骤(b)中的细胞孵育约1小时。
中性条件促进IgG向上清中释放。
本说明书的上下文中包含意指包括在内的意思。
当技术上适当时，本发明的不同实施方式可相互组合。
本文描述的实施例包含特定特征/元件。本发明公开还扩展到由所述特征/元件构成或基本上由其构成的分开的实施方式。
技术性参考文献如专利和申请并入本文作为参考。
本发明进一步通过以下实施例中的单独说明得到进一步描述，这些实施例参考下列附图，其中：
图1显示通过LC-MS/MS确定的转基因小鼠中的％hIgG。
图1a显示1638IgG4P形式对人FcRn转基因小鼠血清中的人IVIg浓度的效应。
图1b显示1638FabFv和Fab’PEG形式对人FcRn转基因小鼠中的人IVIg浓度的效应。
图1c显示1638IgG4P形式在人FcRn转基因小鼠中的药代动力学。
图1d显示1638FabFv和Fab’PEG形式在人FcRn转基因小鼠中的药代动力学。
图1e1638FabFv和Fab’PEG形式对人FcRn转基因小鼠中血清白蛋白浓度的效应。
图1f1638IgG4P形式对人FcRn转基因小鼠中血清白蛋白浓度的效应。
图2显示CA170_1638.g49IgG4的代表性结合曲线。平均KD值(n＝3)分别为0.20nM(中性缓冲液)，0.22nM(酸性缓冲液)。
图3显示CA170_1638.g49IgG4抑制MDCKII15号克隆细胞中的IgG回收。
图4显示CA170_1638.g49IgG4抑制MDCKII15号克隆细胞中的IgG转胞吞作用。
图5显示CA170_1638.g49FabFv抑制MDCKII15号克隆细胞中的IgG转胞吞作用。
图6显示代表性的CA170_1638.g49IgG4的结合曲线。平均KD值(n＝3)分别为0.3(中性缓冲液)、0.43(酸性缓冲液)(见表2)。
图7显示CA170_1638CDR序列
图8根据本发明公开的抗体序列
图9a1638.g49抗体的人源化
图9b1638.g49抗体的人源化
实施例
缩写
℃温度，摄氏度
ATRFTIR衰减全反射傅立叶变换红外光谱
CH2恒定重链区2
cIEF毛细管等电聚焦
DSC差示扫描量热
G0F岩藻糖化半乳糖基双触角聚糖
Hchain重链
HPLC高效液相色谱
IgG免疫球蛋白G
Lchain轻链
nLCMS纳米液相色谱质谱
PBS磷酸盐缓冲盐缓冲液
pI等电点
SD标准偏差
SEC尺寸排阻色谱
ToF飞行时间
Tm融解温度
TCEP三(2-羧乙基)膦
THP三(羟丙基)膦
Tris三(羟甲基)氨基甲烷
以下进行的免疫是为了生成用于B细胞培养和抗体筛选的材料。
用共表达突变体人FcRn(L320A；L321A)(Ober等人,2001，Int.Immunol.13,1551–1559)及小鼠β2M的NIH3T3小鼠成纤维细胞注射三次，并用人FcRn的细胞外结构域进行第四次最终加强，对SpragueDawley大鼠进行免疫。
就对在HEK-293细胞上的突变体FcRn的结合及其对Alexafluor488标记的人IgG的结合的阻止能力监测血清。两种方法都通过流式细胞术完成。对于结合，使用藻红蛋白(PE)-标记的抗小鼠或大鼠的Fc特异性二抗反应剂来展示IgG在血清中的结合情况。
使用类似Zubler等人(1985)描述的方法制备B细胞培养物。简言之，在有条形码的96孔组织培养板中以近似5000细胞每孔的密度培养B细胞，组织培养板含有200μl/孔的RPMI1640培养基(GibcoBRL)，补充有10％FCS(PAAlaboratoriesltd)、2％HEPES(SigmaAldrich)、1％L-谷氨酰胺(GibcoBRL)、1％青霉素/链霉素溶液(GibcoBRL)、0.1％β-巯基乙醇(GibcoBRL)、2-5％的活化的兔脾细胞培养物上清以及经γ辐射的EL-4-B5小鼠胸腺瘤细胞(5x104/孔)，在37℃和5％CO2气氛中培养七天。
使用基于均质荧光的结合测定法确定B细胞培养液上清中FcRn特异性抗体的存在情况，使用(表面稳定化的)瞬时转染有突变体FcRn的HEK-293细胞作为靶标抗原来源。用MatrixPlatemate液体分样器，将10μl的上清从有条形码的96孔组织培养板内转移至有条形码的384孔黑色壁测定板，其含有每孔5000个转染后的HEK-293细胞。用羊抗大鼠或小鼠IgGFcγ特异性Cy-5缀合物(Jackson)显示结合情况。在AppliedBiosystems8200细胞检测系统上读平板。从代表38个不同的免疫动物的3800x96孔培养板中鉴定出9800种抗-人FcRn结合子。据估计，这代表对近似25亿个B细胞进行了筛选。
在初级筛选后，用AvisoOnyx精准加样机器人和冻存于-80℃的细胞培养板里的B细胞，将阳性上清固化在96孔条形码编码的主平板上。然后用Biacore测定法筛选主平板以鉴定含有高亲和力抗体的孔及抑制人IgG对FcRn结合的孔(见下文)。
在BIAcoreT200系统(GEHealthcare)上，使用表面等离子共振技术(SPR)对生物分子间相互作用进行分析。经由胺偶联化学，将10mMNaAc，pH5缓冲液中的羊抗大鼠IgG，Fcγ(ChemiconInternationalInc.)固定化于CM5传感芯片上，至捕获水平达到近似19500应答单位(RU)，采用HBS-EP+作为运行缓冲液。在亲和力及阻断测定法中，使用50mM磷酸,pH6+150mMNaCl作为运行缓冲液。将B细胞培养物上清1:5稀释于200mM磷酸，pH6+150mMNaCl中。以5μl/min注射稀释的B细胞上清液，持续600s，用于被固定化的抗大鼠IgG,Fc捕获。以30μl/min注射浓度100nM的人FcRn在捕获的B细胞培养物上清上，持续180s，随后进行360s的解离。以30μl/min注射人IgG(JacksonImmunoResearch)，持续60s，并解离180s。
使用T200评估软件(版本1.0)分析数据以确定抗体的亲和常数(KD)，并确定哪些阻断了IgG结合。
作为备选的测定法，还在基于细胞的人IgG阻断测定法中对主平板上清进行筛选。将来自主平板的25ulB细胞培养物上清加至96孔U形底的聚丙烯平板。然后向各孔加入突变体hFcRn转染的HEK-293细胞(每孔50,000个细胞，在25ul的PBSpH6/1％FCS中)，并在4℃孵育1小时。用150ul的PBS基质洗涤细胞两次。然后将细胞重悬于50ul/孔的PBS/FCS基质中(含有浓度为7.5μg/ml的以Alexafluor488或649标记的人IgG)，并在4℃孵育1小时。然后用150ul的基质洗涤细胞两次，并随后重悬于35ul/孔的含有1％甲醛作为固定剂的PBS/FCS基质中。之后在FACSCanto2流式细胞仪上读板。
为允许从选择的感兴趣孔中回收抗体可变区基因，需要进行去卷积步骤使得能够鉴定在给定的含有异质B细胞群体的孔中抗原特异性B细胞。这是通过荧光焦点的方法实现的。简言之，将来自阳性孔的免疫球蛋白分泌B细胞与包被了亲和素化的人FcRn的链霉亲和素珠子(NewEnglandBiolabs)混合，并加入最终稀释度为1:1200的羊抗大鼠或小鼠Fcγ片段特异性FITC缀合物(Jackson)。37℃静置孵育1小时后，由于B细胞周围存在荧光晕圈，可鉴定抗原特异性B细胞。用Eppendorf微量操作器取出这些用Olympus显微镜鉴定的单个的B细胞并加入PCR管中。在268个选定的孔中都有荧光焦点生成。
通过使用重链和轻链可变区特异引物进行逆转录聚合酶链反应(RT)-PCR，从单个细胞中回收抗体可变区基因。在AvisoOnyx液体处理机器人上进行两轮PCR反应，其中通过2°巢式PCR在3’和5’末端并入限制性位点，这样使可变区能被克隆入小鼠γ1IgG(VH)或小鼠κ(VL)的哺乳动物细胞表达载体。使用Fectin293(Invitrogen)将成对的重链和轻链构建物共转染至HEK-293细胞并以1ml体积在48孔板中培养。表达5-7天后，收集上清并对抗体进行进一步筛选。
PCR成功地从156个选定孔中回收到来自单个B细胞的重链和轻链同源对。对克隆的可变区基因进行DNA序列分析鉴定出大量独特的重组抗体家族。表达后，在人IgGFACS阻断(如上文所述)及IgG回收测定法中对瞬时表达上清进行检查。在一些情况下，生产纯化的小鼠γ1IgG并进行测试(数据有对应标记)。
所述回收测定法使用过表达人FcRn和β2微球蛋白的MDCKII细胞(如下文实施例5、6和7中描述的克隆)，以每孔25,000个细胞铺96孔板。37℃,5％CO2孵育过夜。用HBSS+Ca/MgpH7.2+1％BSA洗涤三次并与50μl不同浓度的HEK-293瞬时表达上清或纯化的抗体在37℃,5％CO2孵育1小时。移除上清并向细胞中加入500ng/ml的生物素化的人IgG(Jackson)(溶于50μlHBSS+Ca/MgpH5.9+1％BSA)并在37℃,5％CO2孵育1小时。用HBSS+Ca/MgpH5.9洗涤细胞三次，并将100μl的HBSS+Ca/MgpH7.2加入细胞，在37℃,5％CO2孵育2小时。移除细胞上清，使用抗人IgG捕获抗体(Jackson)和链霉亲和素-磺基标签指示抗体(MSD)进行MSD测定法来分析上清中总IgG。通过非线性回归分析抑制曲线，确定IC50值。
基于在这些测定法中的表现，选出一个家族的抗体，其包含SEQIDNO1至6中给定的六个CDR。其中抗体CA170_01638具有最佳活性，并选择它进行人源化。
实施例1人源化方法
通过将来自大鼠抗体V区的CDR嵌合到人种系抗体的V区框架来对抗体CA170_01638进行人源化。为恢复抗体活性，在人源化序列中仍保留大量来自大鼠V区的框架残基。这些残基可使用Adair等人(1991)(HumanisedantibodiesWO91/09967)中概述的操作流程选出。大鼠抗体(供体)V区序列与人种系(受体)V区序列的比对显示于图9A和B，同时与设计的人源化序列比对。这些从供体嵌合到受体序列的CDR是按Kabat(Kabat等人,1987)的编号定义的，例外的是CDR-H1中使用了Chothia/Kabat组合定义(见Adair等人,1991Humanisedantibodies.WO91/09967)。人V区IGKV1-27加JK4J区(http://www.imgt.org/)被选作轻链CDR的受体。人V区IGHV3-7加JH3J区(http://www.imgt.org/)被选作重链CDR的受体。
设计了编码大量变体重链和轻链V区序列的基因并通过EntelechonGmbH的自动合成方法来构建。通过寡核苷酸定点诱变对VH和VK基因进行修饰，而创造进一步的重链和轻链V区的变体。将这些基因克隆至大量载体，使人源化的1638Fab或IgG4抗体得以分别在大肠杆菌和哺乳动物细胞中表达。评估各种变体链及其组合相对亲本抗体的效价，其生物物理特性和用于下游加工的适合性，由此选出了gL7轻链嵌合体及gH33重链嵌合体。最终选择的gL7及gH33嵌合物序列分别显示于图9A和B中。此V区配对被命名为1638.g49。
除70和71号残基(根据Kabat编号)外，嵌合体gL7的轻链框架残基皆来自人种系基因，其中分别保留了供体残基组氨酸(H70)和酪氨酸(T71)。这两个残基的保留对维持人源化抗体或Fab的完全效价十分重要。gL7移植物中CDRL2的56号残基由天冬氨酸(D56)突变为谷氨酸(E56)残基，由此从gL7序列中移除了潜在的天冬氨酸异构化位点。除48和78号残基(根据Kabat编号)外，嵌合体gH33中的重链框架残基皆来自人种系基因，其中分别保留了供体残基亮氨酸(L48)和丙氨酸(A78)。这两个残基的保留对维持人源化抗体或Fab的完全效价至关重要。
为在大肠杆菌中表达1638.g49Fab，将人源化的重链和轻链V区基因克隆至UCB表达载体pTTOD，其含有编码人C-κ恒定区(K1m3异种型)和人γ-1CH1区域(可具有或不具有铰链区)(G1m17异种型)的DNA。
为在哺乳动物细胞中表达1638.g49IgG4，将人源化的轻链V区基因连接至编码人C-κ恒定区(K1m3异种型)的DNA序列上，形成连续的轻链基因。将人源化的重链V区基因连接至编码具有铰链稳定化突变S241P的人γ-4重链恒定区(Angal等人,MolImmunol.1993,30(1):105-8)的DNA序列上，形成连续的重链基因。所述重链和轻链基因被克隆至哺乳动物表达载体。
在如下本文所述实施例8A中使用了另一个较早的嵌合体，1638.g28，其在重链(gH2)中含有比1638.g49嵌合体更多的供体残基(F24、L48、K71、T73、A78和V93)。另外，此抗体的轻链(gL2)含有SEQIDNO:5中给出的未修饰的CDRL2而非SEQIDNO:7的的修饰的CDRL2，后者用于1638.g49中。两组抗体序列都在图8中给出。抗体1638.g28表达为Fab’片段，如上文描述的1638.g49的情况。
实施例2制备1638.g49Fab’-PEG缀合物
通过热提取，从细胞中提取表达于大肠杆菌周质的Fab’。通过ProteinG亲和纯化并用酸性洗脱液，纯化Fab’。还原Fab’并用40kDaPEG(SUNBRIGHTGL2-400MA3)进行PEG化。PEG经由马来酰亚胺基团连接至抗体片段中的一个或多个巯基基团。通过SE-HPLC确定PEG化效率。通过阳离子交换色谱从非PEG化的Fab’及diFab’中分离Fab’PEG。通过SE-HPLC和SDS-PAGE分析各级分。进行合并以使杂质水平最小化。对最终的样品进行浓缩和滤析入所需缓冲液。
实施例3hFcRn结合的亲和力
在BIAcoreT200系统(GEHealthcare)上进行使用表面等离子共振技术(SPR)的生物分子间相互作用分析，并确定对人FcRn细胞外结构域的结合。提供了人FcRn细胞外结构域，作为人FcRnα链细胞外结构域(SEQIDNO:48)和β2微球蛋白(β2M)(SEQIDNO:72)之间的非共价复合物形式。经由胺偶联化学将10mMNaAc，pH5缓冲液中的AffinipureF(ab’)2片段羊抗人IgG，Fc片段特异的(用于IgG4捕获)(JacksonImmunoResearchLab,Inc.)以50μg/ml固定于CM5传感芯片上，至捕获水平为5000至6000应答单位(RU)，采用HBS-EP+(GEHealthcare))作为运行缓冲液。
在亲和力测定法中，使用50mM磷酸,pH6+150mMNaCl+0.05％P20或HBS-P+,pH7.4(GEHealthcare)作为运行缓冲液。用运行缓冲液稀释抗体1638.g49IgG4P至1μg/ml。以10μl/min注射IgG4持续60s，用于被固定化的抗人IgG，Fc的捕获。将人FcRn细胞外结构域从20nM滴定至1.25nM，以30μl/min于捕获的抗-FcRn抗体(IgG4)上，持续300s，随后进行1200s的解离。用50mM的HCl作为运行缓冲液以10μl/min在pH6，进行2x60s，或用40mM的NaOH在pH7.4进行60s和10mMNaOH进行30s，以使表面再生。
使用T200评估软件(版本1.0)分析数据，其中使用的是1:1结合模型和局部Rmax值。
表1抗hFcRn1638.g49IgG4P在pH6.0和pH7.4下的亲和数据
由此，确定了1638.49gIgG4的亲和力在pH6.0下为127pM，在pH7.4下为29pM。
实施例4
就生物化学完整性和生物物理稳定性，分析IgG4P全长分子和Fab-dsFv分子，其中1638.g49可变区并入到各形式中的Fab结构域。
方法和结果
1.序列确认。
i)蛋白质测序(Edman化学法)
使用AppliedBiosystemsProcise494仪器获得IgG4和Fab-dsFv样品的N末端氨基酸序列。根据仪器制造商推荐的方法进行操作。将近似100pmole的各样品加至聚偏二氟乙烯盘上(Prosorb,根据制造商的推荐使用)并运行18个循环，其中包括两个空白运行及一个标准样，由此可对所述重链和轻链的首15个氨基酸进行分析。通过SequenceProDataAnalysisApplicationV2.0进行所述分析。
对每个样品，观察到的序列为两个丰度近似相等的序列的混合物：EVQLVESGGGLVQPG(SEQIDNO:67)和DIQMTQSPSSLSASV(SEQIDNO:68)，二者分别与重链和轻链基因序列预期的N末端序列一致。所述丰度近似一致提示2条链分子量相等，很少或没有显著的N末端阻断。
ii)质谱分析
a)完全质量分析
用20mMTCEP还原一小时后，对两批IgG4和Fab-dsFv分子进行完整质谱分析。在装配有芯片立方接口和C8芯片(43mmZorbax300AC8柱子+43nL捕集器)的Agilent6510质谱仪上进行质量测量。在注射前将所有样品用98％水/2％甲醇/0.3％甲酸(溶剂A)中稀释至0.1mg/ml，取0.3μL加至系统中。用梯度至40％乙腈/0.1％甲酸以350nL/min，从芯片上洗脱蛋白质进入质谱仪。以正离子模式收集500至5000m/z之间的ToF-MS数据并使用AgilentMassHunter软件处理数据。
观察到的两种形式的轻链和重链的质量显示于下文(表2)。
表2.两批IgG4和Fab-dsFv中观察到的质量值列表
1预期质量由氨基酸序列加上IgG4:2L-和4H-链间二硫键、G0F糖基化以及从H-链切除C末端Lys，FabFv：3L-和3H-链间二硫键计算得出。
TCEP还原IgG4的完整质谱分析与主要(近似90％)为G0F糖基化和H-链上C末端赖氨酸切除(这是重组IgG的典型现象)的预期序列一致。
类似地，Fab-dsFv链的完全质量谱与序列质量和预期的二硫键数量一致。两条链的观察质量中有一些异质性，大概是由于TCEP对链内二硫键的不完全还原。
b)仅对IgG4进行二硫键作图。
在50℃用0.15％的Rapigest(溶于Tris-HClpH7.5)处理IgG4(50μg)以15分钟，且任何游离半胱氨酸都用碘乙酰胺烷基化。加入胰蛋白酶(1:25w/w)并在室温水解蛋白质过夜，然后通过添加甲酸(5％v/v)淬灭反应，并通过离心移除任何沉淀。将样品储存于-20℃，在加样至LC-MS系统前用水以1:1稀释。将等份试样(～3-5μg)加载到以含0.2％甲酸的水平衡后的2.1x150mmC18柱子上(WatersBEH1.7u)，并用乙腈/1-丙醇进行梯度洗脱，使之进入以+ve-ionMSE模式操作的WatersXevo质谱仪。用MassLynx和BioPharmaLynx软件分析数据。
结果表明观察到了所有预期的二硫键连接肽，除了H-H-链间的肽T19-SS-T19这一类，对其只观察到一个单一的二硫键，且强度很低。没有证据证明有任何扰乱性的二硫键种类或脲甲基化的半胱氨酸残基。
2.生物化学分析
尺寸排阻色谱HPLC(SECHPLC)
尺寸排阻色谱允许对单体和寡聚体材料进行分析。这是通过使用连接于Agilent1100系统的TSKG3000SW(7.7mmI.Dx30.0cmL)柱进行的。在pH7下以1.0ml/min在0.2M磷酸钠中队样品(25μl/25μg注射)进行等度洗脱，在30℃进行30分钟。通过在280nm处的吸收值监测洗脱情况。
洗脱曲线显示IgG4和Fab-dsFv为均质的，并在以SEC标准品(BioRad151-1901)判定的预期保留时间处得到洗脱。
3.分子电荷
进行毛细管等电聚焦(cIEF)来估计pI和酸性种类的含量。
在HPLC级水中将IgG4和Fab-dsFv样品稀释至1mg/ml用于分析(非还原条件)。也对样品进行还原(2mMTHP/30分钟)和烷基化(20mM碘乙酰胺/80分钟)以分析半胱氨酸加合物。
通过混合以下物质制备样品：30μl蛋白质样品、0.35％甲基纤维素、4％pH3-10的两性电解质(Pharmalyte)、合成的pI标志物各1μl(4.65和9.77)、HPLC级水，总体积100μl。随后使用iCE280IEF分析仪(ConvergentBiosciences)分析混合物，在1500V进行1分钟的预聚焦，随后在3000V进行6分钟的聚焦。然后使用Empower软件(来自Waters)整合经校准的电泳图谱。
所得pI被认为是主种类的pI值(最大峰)。
对于IgG4形式，主种类具有7.3的pI值。这被认为是经剪切的亲本分子(C端赖氨酸被移除，由质谱分析证实)，这对于IgG分子并不是非典型。经剪切的分子会比亲本分子(基础峰位于7.4)有更强的酸性。还原和烷基化的之前和之后的pI谱没有变化，表明不存在半胱氨酸加合物。
对于Fab-dsFv形式，pI被认为是主种类(最大峰)的pI值，为9.0。很明显地还有一种更酸性的种类(pI8.8)，其在还原/烷基化之后变得不那么显著了，表明存在有可还原的加合物。
对于两种形式，都存在有次要峰，其可以为酸性(在主峰左侧)或碱性(在主峰右侧)。这些种类可能是主种类的衍生物，但没有得到进一步定性。
4.热稳定性(Tm)
蛋白在加热时易于去折叠，则更稳定折叠的蛋白质结构要求更多的热量使其去折叠。因此，热稳定性(通过融解温度Tm进行测量)是对蛋白质折叠的稳定性的一种度量，或对分子抵抗去折叠(变性)能力的度量，这可能是聚集物形成的一项前提条件。在限定条件下的温度梯度下，50％的分子发生去折叠的温度为Tm。
可通过两种独立的方法对Tm作出估测。
i)Thermofluor测定法，通过荧光染料(SyproOrange)结合至在加热诱导去折叠时暴露的那些已暴露的疏水表面而测量50％的去折叠，及
ii)差示扫描量热法(DSC)。
通常来自两种所述技术的结果是相关的，由于采用方法不同在绝对值上会有微小差异。
i)Thermofluor测定法
样品如下述方法制备：在96孔V形底的平板中置放5μl的30x的syproorange。然后加入45μl以0.1mg/ml的蛋白质样品。吹打该混合物，吸出的四个10μl复样置于384孔板中。384孔板的格局如下：样品1:孔A1、B1、A2、B2；样品2:孔C1、D1、C2、D2。其中包括了不相关的IgG4作为测试间对照。将该对照(0.1mg/ml，溶于PBSpH7.4)加至5μl的30x浓缩染料，取10μl的所述主混合物置于384孔板，4个复样。将平板置于7900HT快速实时PCR系统，并使用1.1℃/min的斜率从20℃加热至99℃；CCD设备同时监测孔中荧光变化。使用修饰的XE模板(IDBS)处理荧光强度数据并考虑了多种过渡。
IgG4及Fab-dsFv分子二者都有两个去折叠过渡进行证明。两种分子的Tm2值代表Fab去折叠结构域，并显示对IgG4形式而言该值略低。Tm1值分别代表IgG4及Fab-dsFv分子的CH2(恒定重链)结构域和dsFv结构域。结果显示在PBSpH7.4中Fab-dsFv形式比IgG形式热稳定性更高。
样品 Tm 1平均值(℃) Tm 1 SD Tm 2平均值(℃) Tm 2 SD36 -->
IgG4 65.4 0.1 81.1 0.4
Fab-dsFv 73.6 0.4 83.1 0.4
ii)DSC法
对Fab-dsFv分子进行DSC分析，仅作为Thermofluor数据的佐证，并确定两种不同缓冲类型对热稳定性的影响(PBSpH7.4及50mM乙酸钠/125mM氯化钠，pH5.0)。
将溶于PBSpH7.4及50mM乙酸钠/125mM氯化钠，pH5.0中的1mg/ml样品与各自参考缓冲液一同加样至MicroCalVPCapillaryDSC仪器，做三个复样。系统设置包括温度扫描从20℃至110℃，扫描速率60℃/hr。使用Origin软件根据制造商说明书处理最终的热力学图谱。使用软件的自动Tm检测算法(计算主要的过渡)确定Tm，而软件未自动检测到的任意其他过渡则手动选取峰。
两种测试缓冲液中可观察到两种不同的过渡。
较低的去折叠过渡(Tm1)代表Fab-dsFv分子的dsFv结构域，而较高的过渡温度(Tm2)代表Fab结构域。
DSC数据与获自Thermofluor测定法的数据有良好的相符性。此技术能够比Thermofluor测定法更容易地区分两个去折叠结构域。
Fab-dsFv分子显示其在50mM乙酸钠/125mM氯化钠,pH5中热稳定性有轻微增加。
5.分子结构:衰减全反射傅立叶变换红外光谱(ATRFTIR)
使用此技术比较分子内部(β-折叠内)及分开的分子之间(β-折叠间)的β-折叠的相互作用程度。
使用BrukerTensor27FTIR光谱仪和BIOATRII细胞采样附件进行分析，所用分辨率为4cm-1；120次扫描；间隙设置6mm，样品体积为20μL，温度为20℃，其中以下步骤仅仅为分析Fab-dsFv进行。
1.测量了五个空气背景谱，使用的方法为BIOATR100610.xpm。
2.向细胞中加入20μL的sigmaPBSpH7.4然后移除。
3.向细胞中加入20μL的sigmaPBSpH7.4并获取光谱，移除缓冲液加入新鲜缓冲液，并获取光谱(重复两次)。
4.向细胞中加入20μL样品并获取光谱，然后从细胞中移除样品。
5.向细胞中加入20μL的sigmaPBSpH7.4并移除。
6.向细胞中加入20μL样品并获取光谱，然后从细胞中移除样品(重复两次)。
7.随后遵循以下步骤清洗细胞：
a.向细胞中加入20μL1％SDS+用Q-tip清洗
b.向细胞中加入20μL1％SDS并移除
c.向细胞中加入20μLH2O并移除，重复5次
d.向细胞中加入20μL缓冲液并移除
8.分析这些数据以遵循以下方式产生最终的数据格式。
a.将Fab-dsFv光谱1减去缓冲液光谱1，然后重复，用Fab-dsFv光谱2减去缓冲液光谱2。
b.将数据剪切为2200cm-1至1000cm-1。
c.取两次重复的平均光谱值。
d.以25点平滑取二阶导数。这即是所示的最终数据格式。
分析结果显示Fab-dsFv具有抗体分子典型的内β折叠特征。
实施例5基于细胞的效价
使用已经稳定转染了人FcRn和人β2M双基因载体(具有遗传霉素选择标志物)的Madin-Darby狗肾(MDCK)II细胞进行基于细胞的测定法。选择能够回收并转胞吞人IgG的稳定的细胞，并用其进行所有随后的研究。该细胞被称为MDCKII15号克隆。
基于细胞,CA170_1638.g49IgG4对人FcRn的亲和力
使用MDCKII15号克隆细胞及AlexaFluor488标记的CA170_1638.g49IgG4进行定量流式细胞术实验。使用一系列抗体浓度下抗体对FcRn的特异性结合情况确定KD。在中性和酸性缓冲液中都进行分析以确定环境pH类似于血浆(pH7.4)中或内体(pH6)中pH时是否对抗体结合有影响。
图2显示了CA170_1638.g49IgG4的代表性结合曲线。平均KD值(n＝3)分别为中性缓冲液中0.20和酸性缓冲液中0.22(见表4)。
表4-CA170_1638.g49IgG4对MDCKII15号克隆细胞的平均KD值(nM)。
抗体形式 人FcRnpH 7.4 人FcRnpH 6.0
1638.g49 IgG4 0.20 0.22
图2显示在酸性和中性pH，CA170_1638.g49IgG4在MDCKII15号克隆细胞上的结合。
MDCKII15号克隆细胞在Facs缓冲液(PBS具有0.2％w/vBSA,0.09％w/vNaN3)中孵育30min，接着加入Alexa-fluor488标记的CA170_1638.g49IgG4，在Facs缓冲液中pH7.4或pH6孵育1小时。最终的抗体浓度范围为从400nM至0.003nM。用冰冷的Facs缓冲液洗涤细胞，然后使用Guavaflowcytometer(Millipore,UK)通过流式细胞术分析细胞。对各种抗体形式还产生了对于同种型对照抗体的滴度数据组作为非特异性结合对照。使用从包含不同量的荧光染料的珠子产生的标准曲线内插值，计算结合的抗体的摩尔数。在细胞和珠子的流式细胞分析中确定几何平均荧光值。用抗-FcRn抗体值减去非特异性结合生成特异性结合曲线，使用位点结合方程(Graphpad)进行非线性回归确定KD。数据代表3次实验的结果。
CA170_1638.g49IgG4可在酸性和中性pH结合细胞上表达的人FcRn。
实施例6基于细胞的功能测定法
FcRn表达主要在细胞内(BorvakJ等人1998,Int.Immunol.,10(9)1289-98及CauzaK等人2005,J.Invest.Dermatol.,124(1),132-139)，并与内体和溶酶体膜相连。IgG的Fc部分在酸性pH(<6.5)结合FcRn，但在中性生理pH(7.4)不能结合(RhagavanM等人1995)，并且这种对pH的依赖性促进IgG的回收。
IgG一旦通过胞饮作用被摄取且进入酸性的内体，结合FcRn的IgG会与FcRn一同到达细胞表面被回收，而在生理学中性pH，IgG会被释放(OberRJ等人2004,TheJournalofImmunology,172,2021-2029)。任意未结合FcRn的IgG都将进入溶酶体降解途径。
建立了一种体外测定法检查CA170_1638.g49IgG4抑制FcRn回收IgG功能的能力。简言之，将MDCKII15号克隆细胞与生物素化人的IgG在酸性缓冲液(pH5.9)中加入或不加1638IgG4孵育使之结合至FcRn。移除所有过剩的抗体并在中性pH缓冲液(pH7.2)中孵育，该步骤使表面暴露的、结合的以及内化的IgG释放进入上清。接着使用MSD测定法检测经回收并由此释放进入上清的IgG量，以确定FcRn的抑制情况。
图3显示CA170_1638.g49IgG4抑制MDCKII15号克隆细胞中IgG的回收。将MDCKII15号克隆细胞以15,000细胞每孔的密度铺平板于96孔板，并在37℃,5％CO2孵育过夜。在37℃,5％CO2，将细胞与1μg/ml的生物素化人的IgG(Jackson)，在HBSS+(Ca/Mg)pH5.9+1％BSA中加入或不加CA170_1638.g49IgG4，孵育1小时，然后在37℃,5％CO2，于HBSS+pH7.2中孵育2小时。从细胞中移除上清并使用MSD测定法分析其中的总IgG(其中使用抗人IgG捕获抗体(Jackson)及链霉亲和素-磺基标签指示抗体(MSD))。通过非线性回归(Graphpad)分析抑制曲线以确定EC50。图代表3次实验的合并数据。如图3中所示，CA170_1638.g49IgG4以浓度依赖的形式抑制IgG回收，平均EC50值(n＝3)为0.31nM。
CA170_1638.g49IgG4和FabFv抑制人IgG的转胞吞作用
FcRn可携带IgG穿过极化内皮细胞层以顶侧至基底侧和基底侧至顶侧两个方向，并由此在允许IgG在粘膜屏障处的循环和腔体之间的移动中起重要作用(Claypool等人2004MolBiolCell15(4):1746-59)。
FcRn可携带IgG穿过极化内皮细胞层以顶侧至基底侧和基底侧至顶侧两个方向，并由此在允许IgG在粘膜屏障处的循环和腔体之间的移动中起重要作用(Claypool等人2004MolBiolCell15(4):1746-59)。
建立了一项体外测定法以检查CA170_1638.g49IgG4和FabFv抑制FcRn依赖的IgG转胞吞作用的能力。简言之，将MDCKII15号克隆细胞铺于24孔transwell平板，使之在3天内形成单层细胞。然后将这些细胞与生物素化的人IgG(加至细胞顶侧)在促进对FcRn结合的酸性缓冲液下一同孵育，其中加或不加CA170_1638.g49IgG4或FabFv。人IgG被转胞吞从顶侧穿到基底侧并被释放进入下室的中性缓冲液中。然后用MSD测定法测量基底侧IgG水平。
图4和5显示CA170_1638.g49IgG4和FabFv抑制MDCKII15号克隆细胞中IgG从顶侧向基底侧的转胞吞作用。将MDCKII15号克隆细胞以500,000细胞每孔的密度铺于24孔transwell平板并在37℃,5％CO2孵育3天以形成单层细胞。在HBSS+(Ca/Mg)缓冲液+1％BSA中将顶部隔区的pH调整为5.9，基底侧的pH调整至7.2。在37℃,5％CO2下，将顶部隔区的细胞与1μg/ml的生物素化人的IgG(Jackson)，其中加入或不加指定浓度CA170_1638.g49IgG4或FabFv，在37℃,5％CO2孵育4小时。收集基底侧培养基并使用MSD测定法测定其中的总IgG(其中使用抗人IgG捕获抗体(Jackson)及链霉亲和素-磺基标签指示抗体(MSD))。通过非线性回归(Graphpad)分析抑制曲线以确定EC50。图代表了3次实验的合并数据。
图4和5中概述显示了CA170_1638.g49IgG4和FabFv能以浓度依赖的形式抑制人IgG从顶侧向基底侧的转胞吞作用，EC50至分别为2.4和0.42nM(n＝3)。
CA170_1638.g49IgG4和FabFv体外效应概述
CA170_1638.g49IgG4和FabFv抑制IgG的回收和转胞吞作用。在IgG回收测定法中达到的0.31nM的EC50与细胞亲和力结合数据是可比的，其中得到的KD值在中性缓冲液中为0.2nM，在酸性缓冲液中为0.22nM。在IgG转胞吞测定法中，对CA170_1638.g49IgG4和FabFv分别获得了2.4nM和0.42nM的EC50，表明IgG4和FabFv之间效价有轻微降低。然而，该节的数据清楚地显示CA170_1638.g49IgG4和FabFv能抑制人FcRn的功能。
实施例7CA170_1638.g49IgG4与非人灵长类FcRn的交叉反应。
为验证CA170_1638.g49IgG4在非人灵长类中的PK/PD研究和临床前毒理学中的用途，检查了其对食蟹猴FcRn的相对亲和力。稳定转染了食蟹猴FcRn和Β2M的MDCKII细胞(MDCKII(40号克隆)被用于基于细胞的测定法，此外还使用了前文描述的以人FcRn和Β2M转染的MDCKII细胞(MDCKII15号克隆)。
图6显示在酸性和中性pH，结合在MDCKII40号克隆细胞上的CA170_1638.g49IgG4。使用一系列抗体浓度下，抗体对FcRn的特异性结合情况确定KD。在中性和酸性缓冲液中都进行了分析以确定环境pH类似于血浆(pH7.4)中或内体(pH6)中pH时是否对抗体结合有影响。
图6显示了CA170_1638.g49IgG4的代表性结合曲线。平均KD值(n＝3)为在中性缓冲液中的0.3和在酸性缓冲液中的0.43(见表5)。
表5-CA170_1638.g49IgG4在MDCKII40号克隆细胞上的平均KD值(nM)。
抗体形式 食蟹猴FcRnpH 7.4 食蟹猴FcRnpH 6.0
1638IgG4 0.30 0.43
实施例8抗-FcRn治疗增强hFcRn转基因小鼠中的hIgG体内清除
在人FcRn转基因小鼠(B6.Cg-Fcgrttm1DcrTg(FCGRT)32Dcr/DcrJ,JAX小鼠)中，确定抗FcRn分子(CA170_01519.g57Fab’PEG(描述于WO2014/019727)和CA170_01638.g28Fab’PEG)对人IVI清除的效应。用500mg/kg的人IgG(人IgI10％Gamunex-c,TalecrisBiotherapeutics)对小鼠进行静脉内输注。24小时后，对这些动物单次给药(100mg/kg)静脉内施用媒介物对照(PBS)或抗-FcRn。在相对抗-FcRn处理时间的-24、8、24、48、72、96、144和192小时获取一系列尾尖血样品。通过LC-MS/MS确定hFcRn小鼠中的血清人IgG水平。图1显示的数据为每个治疗组5至6只小鼠的平均值±SEM。每种测试的抗-FcRn分子对hFcRn的阻断导致hIVIG的加速清除，并使其中观察到的总IgG浓度比对照小鼠更低。
实施例8B.抗-FcRn治疗增强hFcRn转基因小鼠的hIgG在体内的清除
所述抗-人FcRn抗体被发现结合并抑制人IgG对人FcRn的结合，但不结合或抑制小鼠FcRn。因此，我们在人FcRn转基因小鼠(B6.Cg-Fcgrttm1DcrTg(FCGRT)32Dcr/DcrJ,JAX小鼠)中确定了IgG4P形式(1638.g49)、Fab’PEG形式(1638.g28)和FabFv形式的抗-FcRn分子对人IVIg清除的效应。用500mg/kg的人IgG(人IgI10％Gamunex-c,TalecrisBiotherapeutics)对小鼠进行静脉内输注。24小时后，对这些动物单次给药静脉施用媒介物对照(PBS)或抗-FcRn。图1a至1e中指出了剂量、采样时间和重复数。所述样品为系列尾尖血样品。通过LC-MS/MS确定了人IgG、内源小鼠白蛋白和抗-FcRn分子自身的血清水平，其中检测并定量每种这些分析物独特的肽序列。图1a至1e中呈现的数据为每种分析物的几何平均值和95％置信区间。
所述三种测试的抗-FcRn分子中的每个对hFcRn的阻断都导致hIVIg的清除，相比于仅用媒介物或用对照Fab’PEG(A33，非抗-FcRn，与1638Fab’PEG一样缀合至40kDaPEG)处理的对照小鼠中的情况是加快的——见图1a和1b。所述效应是剂量相关的——较大剂量使游离抗-FcRn能在血清中检测到的时期延长(图1c和1d)，这导致从小鼠中清除人IVIg的时间更长、更深入。1638Fab’PEG显示比对照A33Fab’PEG的药代动力学时间更短(在血清中更快速从游离溶液中消失)，提示1638Fab’PEG经历了目标介导的药物处置——通过结合FcRn靶标从游离溶液中消失。尽管小鼠IgG不结合在这些转基因小鼠中存在的人FcRn，但内源小鼠白蛋白确实结合人FcRn，并被其回收。尽管抗-人FcRn对人FcRn的结合不阻断白蛋白在体外测定法中对FcRn的结合，但如果所述抑制发生在体内，则可能导致内源小鼠白蛋白加速清除。数据显示于图1e。由于血清中白蛋白浓度会有或多或少的变化(注射抗-FcRn药物前在30只小鼠的组内为从16.6至59.9mg/mL)，因此为了更容易地比较组间结果，将白蛋白数据标准化并作为图1e时间0处血清白蛋白浓度的百分比。在用Fab’PEG或FabFv形式给药后，发生血浆白蛋白浓度可恢复的效应。对重复的测量进行方差分析(ANOVA)，同时考虑处理的差异及时间差异。对Fab’PEG或FabFv处理的小鼠的每项测量都是与相同时间点相同实验的对照相比较，对照是不相关(非FcRn结合)Fab’PEG或仅为媒介物。这两种形式显示在药物注射后大约48至72小时降低了白蛋白浓度(在数据的ANOVA分析中为降低5％的水平)，此后白蛋白水平恢复到给药前水平。血浆白蛋白浓度最大下降是在施用100mg/kg的Fab’PEG形式(在48小时)后约10％，或在施用250mg/kgFabFv144小时后约25％。对显示1638IgG4P对血浆白蛋白水平效应的数据也进行了类似的ANOVA分析(显示于图1f)。这一点在处理和对照动物中没有显著差异，提示1638的IgG4P形式进行处理不影响血浆白蛋白浓度。
实施例91638.g49Fab:FcRn复合物的晶体结构和分析
将1638.g49Fab与hFcRnα链的ECD区域(SEQIDNO:48)和人β2微球蛋白(SEQIDNO:72)共结晶。这些蛋白质溶于50mM乙酸钠、125mMNaClpH6.0，结晶条件为0.1MTrispH8.5,40％PEG400及0.2MLiSO4.H2O，蛋白质浓度为10mg/mL，在蒸发扩散实验中每滴的体积比为0.4μL蛋白质对于0.4μL样品池溶液。让晶体生长8至21天，随后从微滴中收获晶体，转移至孔缓冲液(因为其已经含有了40％的PEG400)并在10秒内用液氮(-180℃)速冻。使用震荡法收集SOLEIL处的X光数据。晶体的晶胞尺寸为 α＝90度、β＝90度且γ＝90度。确定空间群为P21212。使用Phaser确定分子堆叠，并用Refmac进行细化，使用30至间的数据，给出最终R因子为21.8％，Rfree为27.2％。结果如下所示：
与1638.49Fab’相互作用的残基都在FcRnα链中(不在β2M中)，在下文FcRn细胞外序列中以黑体示出。
AESHLSLLYHLTAVSSPAPGTPAFWVSGWLGPQQYLSYNSLRGEAEPCGAWVWENQVSWYWEKETTDLRIKEKLFLEAFKALGGKGPYTLQGLLGCELGPDNTSVPTAKFALNGEEFMNFDLKQGTWGGDWPEALAISQRWQQQDKAANKELTFLLFSCPHRLREHLERGRGNLEWKEPPSMRLKARPSSPGFSVLTCSAFSFYPPELQLRFLRNGLAAGTGQGDFGPNSDGSFHASSSLTVKSGDEHHYCCIVQHAGLAQPLRVELESPAKSS(SEQIDNO：48).
有下划线的残基已知在人FcRn与人IgG的Fc区域相互作用中至关重要。黑体的为参与在处结合1638.49Fab’的残基。斜体的残基参与在处对相同抗体的结合。
由比更接近的抗体残基决定的表位为:A81、G83、G84、K85、G86、P87、N113、E115、W131、P132、E133、L135、A136、Q139。
由比更接近的抗体残基决定的表位为:A81、G83、G84、K85、G86、P87、N113、E115、W131、P132、E133、L135、A136、Q139、L82、Y88、L112、D130。

Claims (36)

1.抗-FcRn抗体或其结合片段，其包含重链或具有可变区的重链片段，其中所述可变区包含三个CDR，其中CDRH1具有SEQIDNO:1给定的序列，CDRH2具有SEQIDNO:2给定的序列，并且CDRH3具有SEQIDNO:3给定的序列。
2.根据权利要求1的抗-FcRn抗体或其结合片段，其中所述抗体或结合片段进一步包含轻链或具有包含三个CDR的可变区的轻链片段，其中CDRL1具有SEQIDNO:4给定的序列，CDRL2具有SEQIDNO:5或SEQIDNO:7给定的序列，并且CDRL3具有SEQIDNO:6给定的序列。
3.根据权利要求1或权利要求2的抗-FcRn抗体或其结合片段，其具有包含SEQIDNO:12给定的序列的重链和包含SEQIDNO:8给定的序列的轻链。
4.根据权利要求1或权利要求2的抗-FcRn抗体或其结合片段，其中所述抗体是人源化的。
5.根据权利要求1或权利要求2的抗-FcRn抗体或其结合片段，其具有包含SEQIDNO:25给定的序列的重链和包含SEQIDNO:16给定的序列的轻链。
6.根据权利要求1或权利要求2的抗-FcRn抗体或其结合片段，其具有包含SEQIDNO:59给定的序列的重链和包含SEQIDNO:51给定的序列的轻链。
7.结合人FcRn的抗-FcRn抗体或其结合片段，其包含重链，其中重链的可变结构域包含与SEQIDNO:25给定的序列具有至少80％同一性或相似性的序列，并且其中轻链的可变结构域包含与SEQIDNO:16给定的序列具有至少80％同一性或相似性的序列。
8.根据权利要求7的抗-FcRn抗体或其结合片段，其中抗体分子具有SEQIDNO:1给定的序列作为CDR-H1，SEQIDNO:2给定的序列作为CDR-H2，SEQIDNO:3给定的序列作为CDR-H3，SEQIDNO:4给定的序列作为CDR-L1，SEQIDNO:5或SEQIDNO:7给定的序列作为CDR-L2，以及SEQIDNO:6给定的序列作为CDR-L3。
9.根据权利要求1至8中任一项的抗-FcRn抗体或其结合片段，其中所述抗体或结合片段为scFv、Fv、Fab或Fab’片段。
10.根据权利要求9的抗-FcRn抗体Fab’片段，其具有包含SEQIDNO:33给定的序列的重链和包含SEQIDNO:20给定的序列的轻链。
11.根据权利要求6的抗-FcRn抗体Fab’片段，其具有包含SEQIDNO:63给定的序列的重链和包含SEQIDNO:55给定的序列的轻链。
12.根据权利要求1至11中任一项的抗-FcRn抗体或其结合片段，其中所述抗体或结合片段缀合至多聚物，所述多聚物例如选自淀粉、白蛋白和聚乙二醇。
13.根据权利要求12的抗-FcRn抗体或其结合片段，其中所述多聚物为PEG，例如分子量范围为5至50kDa。
14.根据权利要求1至8中任一项的抗-FcRn抗体，其中所述抗体为全长抗体。
15.根据权利要求14的抗-FcRn抗体，其中所述全长抗体选自IgG1、IgG4和IgG4P。
16.根据权利要求5、权利要求14或权利要求15的抗-FcRn抗体，其具有包含SEQIDNO:37、SEQIDNO:39或SEQIDNO:73给定的序列的重链和包含SEQIDNO:20给定的序列的轻链。
17.根据权利要求1至8中任一项的抗-FcRn抗体或其结合片段，其中所述抗体或其结合片段为Fab-dsFv，其具有包含SEQIDNO:42给定的序列的重链和包含SEQIDNO:40给定的序列的轻链。
18.抗-FcRn抗体或其结合片段，其与权利要求5、10或16的抗体结合人FcRn的相同表位。
19.抗-FcRn抗体或其结合片段，其结合人FcRn的表位，所述表位包含人FcRn细胞外结构域(SEQIDNO:48)的选自残基E115、W131、P132和E133中的一个、两个、三个或四个氨基酸，以及选自A81、G83、G84、K85、G86、P87、N113、L135、A136及Q139中的一个或多个残基。
20.根据权利要求19的抗-FcRn抗体或其结合片段，其进一步结合选自L82、Y88、L112和D130的一个或多个残基。
21.根据权利要求17至20中任一项的抗-FcRn抗体或其结合片段，其交叉阻断权利要求5的抗体对人FcRn的结合或被权利要求5的抗体交叉阻断与人FcRn的结合。
22.根据权利要求17至21中任一项的抗-FcRn抗体或其结合片段，其为人源化的或完全人的。
23.根据权利要求17至22中任一项的抗-FcRn抗体或其结合片段，其具有在pH6和pH7.4对人FcRn的结合亲和力为150pM或更低。
24.根据权利要求1至23中任一项的抗-FcRn抗体或其结合片段，其阻断人IgG对人FcRn的结合。
25.根据权利要求1至24中任一项的抗-FcRn抗体或其结合片段，其不结合人β2微球蛋白(SEQIDNO:72)。
26.分离的DNA序列，其编码根据权利要求1至25中任一项的抗体的重链和/或轻链。
27.克隆或表达载体，其包含一种或多种根据权利要求26的DNA序列。
28.根据权利要求27的载体，其中所述载体包含(i)SEQIDNO:30、32、34或36给定的序列和SEQIDNO:21或24给定的序列，或者(ii)SEQIDNO:38给定的序列和SEQIDNO:22给定的序列，或者(iii)SEQIDNO:74给定的序列和SEQIDNO:22给定的序列，或者(iv)SEQIDNO:41给定的序列和SEQIDNO:43给定的序列。
29.宿主细胞，其包含一种或多种根据权利要求27或权利要求28的克隆或表达载体。
30.用于生产具有对人FcRn的结合特异性的抗体的方法，包括培养权利要求29的宿主细胞以及分离所述抗体。
31.药用组合物，其包含权利要求1至25中任一项定义的抗-FcRn抗体或其结合片段，与一种或多种药用可接受辅料、稀释剂或承载体相组合。
32.根据权利要求31的药用组合物，其包含其他活性成分。
33.权利要求1至25中任一项限定的抗体或其结合片段或者权利要求31或32限定的组合物，用于治疗的用途。
34.权利要求1至25中任一项限定的抗体或其结合片段或者权利要求31或32限定的组合物，用于治疗自身免疫疾病的用途，所述自身免疫疾病如重症肌无力、寻常天疱疮、视神经脊髓炎、格林-巴利综合症、狼疮、特发性血小板减少性紫癜和血栓性血小板减少性紫癜。
35.治疗患者的方法，包括施用治疗有效量的权利要求1至25中任一项限定的抗体或其结合片段或者权利要求31或32限定的组合物。
36.根据权利要求35的方法，其中所述治疗是用于自身免疫疾病，如重症肌无力、寻常天疱疮、视神经脊髓炎、格林-巴利综合症、狼疮、特发性血小板减少性紫癜和血栓性血小板减少性紫癜。
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