CN105722856A

CN105722856A - Rsv融合蛋白的表位以及识别其的抗体

Info

Publication number: CN105722856A
Application number: CN201480013927.7A
Authority: CN
Inventors: 郑子峥; 贾森·S·麦克莱伦; 陈曼; 赵敏; 黄粱敏; 巴尼·S·格雷厄姆; 夏宁邵
Original assignee: Xiamen University; Xiamen Innovax Biotech Co Ltd; US Department of Health and Human Services
Current assignee: Represented By Minister Of Health And Human Services United States,; Yang Sheng Tang Co Ltd; Xiamen University
Priority date: 2013-03-15
Filing date: 2014-03-17
Publication date: 2016-06-29
Anticipated expiration: 2034-03-17
Also published as: EP2975052A4; JP2016516400A; EP2975052B1; WO2014139476A1; CA2906960A1; AU2014231357A1; EP2975052A1; WO2014139476A8; CN105722856B; US9856313B2; JP6462599B2; CA2906960C; US20160031972A1; AU2014231357B2

Abstract

本发明提供了可用于预防呼吸道合胞病毒感染的表位肽或其变体和包含该表位肽或其变体与载体蛋白的重组蛋白，以及它们的用途。本发明还提供了针对这些表位肽的抗体和产生所述抗体的细胞株，以及它们的用途。另外，本发明还提供了包含所述重组蛋白的疫苗或包含所述抗体的药物组合物，其可用于预防呼吸道合胞病毒感染相关的症状。

Description

RSV融合蛋白的表位以及识别其的抗体技术领域

本发明涉及分子病毒学领域，特别是呼吸道合胞病毒

( Respiratory syncytial virus , RSV ) 的疫苗预防领域。具体而言，本发明涉及可用于预防呼吸道合胞病毒感染的表位肽（或其变体），包含此类表位肽（或其变体）以及载体蛋白的重组蛋白，以及此类表位肽（或其变体）和重组蛋白的用途。本发明还涉及针对此类表位肽的抗体，编码所述抗体的核酸分子，产生所述抗体的细胞林，以及它们的用途。本发明还涉及可用于预防呼吸道合胞病毒感染相关的一种或多种症状的疫苗或药物组合物，它们分别包含本发明的重组蛋白或抗体。背景技术

自从 20世纪 50年代被发现以来，人类呼吸道合胞病毒 ( Respiratory syncytial virus , RSV )一直是耍幼儿下呼吸道感染最主要的病原。在美国， RSV是引起 1岁以下耍儿住院的首要原因（D. K. Shay, R. C. Hoi man. et al. , JAMA, 282 (1999) 1440-1446) , 5岁以下儿童临床约诊的主要原因之一（C. B. Hal l, G. A. Weinberg, et al.， N Engl J Med, 360 (2009) 588—598)。全球范围内每年有超过 3000万例下呼吸道感染由 RSV引起，其中超过 300万的人需住院治疗。 RSV是小于 5岁的儿童最常见的住院原因 (H. Nair, W. A. Brooks, et al. , Lancet, 378 (2011) 1917-1930)。早产儿、支气管及肺发育不良者、先天性心脏病及免疫缺陷的耍幼儿 RSV感染率高达 50- 70% ( A. C. Cooper, N. C. Banasiak, P. J. Al len, Pediatr Nurs, 29 (2003) 452—456)。每年有 16- 60万儿童死亡病例与 RSV有关（T. S. Howard, L. H. Hoffman, et al. J Pediatr, 137 (2000) 227-232; S. Leader, K. Kohlhase. J Pediatr, 143 (2003) S127- 132)。耍幼儿感染 RSV所导致的住院治疗时间可达 2. 5个月，由此引发的相关医疗费用在美国每年可高达 3. 6—5. 7亿美元（E. A. Simoes. Lancet, 354 (1999) 847-852) _β 老年人也是 RSV易感人群，每年由 RSV感染导致死亡的老年人数大于 12000位，约为同一人群中流感死亡率的 1/3 (A. R. Fal sey, P. A. Hennessey, et al. N Engl J Med, 352 (2005) 1749-1759; W. W. Thompson, D. K. Shay, E. Weintraub, et al. JAMA, 289 (2003) 179-186) _β 在我国由于缺乏本国研发的 RSV诊断试剂， RSV检测由于过高的成本而得不到推广，这导致了 RSV在我国的流行情况及危害性至今不完全清楚，但针对部分地区的研究表明 RSV感染也是中国儿童下呼吸道感染的重要诱因（徐关仁，孙颂文，徐旭卿等. 疾病控制杂志， 4 (2000) 37-39; 谢健屏，谢健屏，何翠娟，等. 中华儿科杂志， 35 (1997) 402-403; 朱汝南，邓洁，王芳，等. 21 (2003) 25-28) _β

至今 RSV依然没有安全有效的疫苗，只有一林识别 RSV表位融合糖蛋白 F的中和抗体（Pal ivizumab, 商品名： Synagi s )能在新生儿身上产生被动免疫效果，降低新生儿发病率。该抗体药物被批准在早产儿、患有慢性肺部疾病的、支气管及肺发育异常的、先天性心脏病的高危耍幼儿患者中应用（H. W. Kim, J. G. Canchola, C. D. Brandt, et al. Am J Epidemiol, 89 (1969) 422-434) , 以预防由 RSV引起的严重下呼吸道感染。该抗体药物自身中和效价不足同时生产成本过高导致上市后价格高昂，其使用被限制在 "高感染风险耍幼儿" 这一狭窄范围，而不能得到广泛应用。 Syang i s的应用表明结合 RS V- F蛋白的中和性单抗可以用于临床保护， F蛋白上存在有效的中和活性位点。而且 F蛋白位于病毒表面对病毒入胞和合胞体形成在是必须的，因此， F蛋白是筛选预防和保护性抗体的重要靶标蛋白。

RSV是副粘病毒科肺炎病毒属的单股负链非节段性 RNA病毒，有 15222个核苷酸，编码 10种主要蛋白。其中， F蛋白全长为 574 个 ^酸是 N-糖基化的 I型跨膜糖蛋白，作为主要跨膜蛋白是 RSV 感染过程中的重要表面分子。 F蛋白膜融合的机制及触发过程仍完全不清楚，猜测是从处于高能量、亚稳定状态的融合前 F构象 ( pre-fus ion F, pre- F )与靶细胞结合后发生构象变化，形成高度稳定的融合后 F蛋白（post- fus ion F， pre-F )，导致病毒膜与细胞膜的融合。亚稳定的 pre- F构象和稳定的 post- F构象的自由能差异很大导致膜融合的过程是不可逆的。 McLel lan等（J. S. McLel lan, M. Chen, J. S. Chang, et al. J Virol, 84 (2010) 12236- 12244. )利用哺乳动物表达系统获得了稳定的 post- F蛋白结构。

由于 pre- F蛋白的结构不稳定，存在多种中间体，通过制备晶体研究 pre- F蛋白的结构相当困难。因此， McLel lan等（J. S. McLel lan, M. Chen, J. S. Chang, et al. J Virol, 84 (2010) 12236- 12244. )利用已知结构的 HPIV3 pre- F蛋白对 RSV pre- F蛋白的结构进行模拟和预测，提出 RSV F蛋白可能存在 pre- F构象，并提出了上述融合机制假说。对于 pre- F构象的准确结构，及其融合过程中的变构过程都有待获得稳定的 pre- F构象蛋白并进一步确认。

现阶段用于研究 F蛋白抗原表位的抗体大部分是分离至 BalB/c老鼠，通过多肽定位，抗体竟争与逃逸突变等方法对中和表表位位进进行行鉴鉴定定。。作作为为病病毒毒最最主主要要的的表表面面结结构构蛋蛋白白之之一一，， FF蛋蛋白白表表面面存存在在大大量量的的中中和和抗抗体体识识别别表表位位。。目目前前已已知知的的 RRSSVV FF蛋蛋白白的的中中和和抗抗体体主主要要针针对对以以下下抗抗原原表表位位（（JJ.. SS.. MMccLLeell llaann,, YY.. YYaanngg,, eett aall.. JJ VViirrooLL 8855 ((22001111)) 77778888--77779966;; MM.. MMaaggrroo,, DD.. AAnnddrreeuu,, eett aall.. JJ VViirrooll,,

8844 ((22001100)) 77997700——77998822.. ))。。

II表表位位：：针针对对 II表表位位的的抗抗体体有有已已上上市市的的预预防防性性单单抗抗 SSyynnaaggiiss以以及及它它的的等等效效衍衍生生物物 mmoottaavviizz麵麵 bb，，主主要要识识别别 FF11亚亚基基 aa.. aa.. 225555-- aa.. aa.. 227755。。 MMccLLeell llaann等等 ((JJ.. SS.. MMccLLeell llaann,, MM.. CChheenn,, JJ.. SS.. CChhaanngg,, eett aall.. JJ VViirrooll,, 8844 ((22001100)) 1122223366—— 1122224444.. ))通通过过解解析析 mmoottaavviizzuummaabb单单抗抗与与 FF 蛋蛋白白 aa.. aa.. 225533-- aa.. aa.. 227777残残基基肽肽的的晶晶体体结结构构证证实实这这个个区区域域形形成成""螺螺旋旋 --转转角角--螺螺旋旋""二二级级结结构构为为的的结结构构。。晶晶体体结结构构显显示示 mmoottaavviizzuummaabb单单抗抗结结合合在在 ""螺螺旋旋--转转角角--螺螺旋旋"" 结结构构的的一一头头，，并并且且使使得得氢氢键键和和离离子子键键作作用用于于 226688位位 AAssnn与与 227722位位 LLyyss，，在在这这两两个个点点的的突突变变可可引引起起抗抗体体逃逃逸逸。。 mmoottaavviizzuummaabb结结合合的的抗抗原原表表位位 AA的的结结构构在在 ppoosstt-- ffuuss iioonn的的结结构构中中保保留留的的非非常常完完整整，，抗抗体体结结合合位位点点暴暴露露充充分分。。 mmoottaavviizzuummaabb与与！！)) ooss tt--FF 蛋蛋白白的的结结构构揭揭示示了了 SSyynnaaggiiss和和 mmoottaavviizzuummaabb单单抗抗具具有有中中和和活活性性的的机机制制。。而而 RRSSVV pprree-- FF蛋蛋白白的的模模拟拟结结构构显显示示，，该该表表位位在在 pprree-- FF蛋蛋白白处处于于构构象象的的内内部部，，在在天天然然的的 RRSSVV FF蛋蛋白白上上并并不不能能暴暴露露出出来来。。 GGrraahhaamm等等证证实实，， SSyynnaaggiiss和和 mmoottaavviizzuummaabb单单抗抗只只能能够够抑抑制制 RRSSVV与与细细胞胞的的融融合合，，却却不不能能抑抑制制 RRSSVV的的吸吸附附（（JJ.. SS.. MMccLLeell llaann,, YY.. YYaanngg,, eett aall.. JJ VVii rrooll,,

8855 ((22001111)) 77778888--77779966;; JJ.. SS.. MMccLLeell llaann,, MM.. CChheenn,, AA.. KKiimm,, eett aall.. NNaatt SSttrruucctt MMooll BBiiooll,, 1177 ((22001100)) 224488--225500))。。当当然然，，只只有有通通过过 pprree-- FF蛋蛋白白的的晶晶体体结结构构才才能能对对此此进进行行确确认认。。

IIII表表位位：：识识别别 IIII表表位位的的抗抗体体有有 113311-- 22aa，，其其识识别别 FF11的的半半胱胱氨氨酸酸富富集集区区。。这这类类抗抗体体最最多多阻阻断断 5500%% RRSSVV病病毒毒感感染染，，

后后的的多多相相性性，，或或者者这这些些抗抗体体通通过过间间接接效效应应如如病病毒毒的的聚聚沉沉起起中中和和效效果。不像识别表位 A和表位 C的抗体，这些抗体部分地阻断病毒吸附靶细胞。很可能这个表位在 pre- F蛋白的构象中靠近病毒的细胞膜，但是在 post- F蛋白的构象中位于顶点。

IV表位：识别区域为 a. a. 422- a. a. 438，是 19和 101F等单抗抗体的靶点。该表位位于 F1中的构象相对保守的区域。 McLel lan等 (J. S. McLel lan, Y. Yang, et al. J Virol, 85 (2011) 7788-7796) 已经解出了 101F与 F蛋白（a. a. 422-a. a. 438 )肽段复合物的晶体结构。该区域的核心表位为 a. a. 427- a. a. 437，已知的逃逸突变 Arg429和 Lys433的氢键和离子键与 101F相互作用。 101F与游离肽的亲和力比与 post- F的亲和力低几千倍， 101F在 post- F的结构上显示 101F表位比线性肽更复杂。

针对上述三个表位的中和抗体与已上市的 Synagis相比均没有太大的中和效价提升，且均与 pre- F以及 post- F有反应性。因此，以 RSV F蛋白为靶标筛选针对 pre- F且具有更高中和活性的单抗，将为 RSV的预防与治疗奠定基础。发明内容

在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的细胞培养、分子遗传学、核酸化学、免疫学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。

如本文中所使用的，术语 "RSV融合蛋白"或 " F蛋白"是指，呼吸道合胞病毒 (RSV)的融合蛋白 ( Fus ion protein, F protein )，其是本领域技术人员公知的（参见，例如 NCBI GENBANK数据库登录号： P03420 ) 。如本文中所使用的，当提及 F蛋白的列时，其使用

SEQ ID NO: 15所示的序列来进行描述。例如，表述 "F蛋白的第 196-209 位氨基酸残基" 是指， SEQ ID NO: 15 所示的多肽的第 196-209位 ^酸残基。然而，本领域技术人员理解，在 F蛋白的氨基酸序列中，可天然产生或人工引入突变或变异（包括但不限于，置换，缺失和 /或添加，例如不同基因型或基因亚型的 F 蛋白），而不影响其生物学功能。因此，在本发明中，术语 "F 蛋白" 应包括所有此类序列，包括例如 SEQ ID NO: 15所示的序列以及其天然或人工的变体。并且，当描述 F蛋白的序列片段时，其不仅包括 SEQ ID NO: 15的序列片段，还包括其天然或人工变体中的相应序列片段。例如，表述 "F蛋白的第 196- 209位 ^ 酸残基" 包括， SEQ ID NO: 15的第 196-209位氨基酸残基，以及其变体（天然或人工）中的相应片段。根据本发明，表述 "相应序列片段" 或 "相应片段" 是指，当对序列进行最优比对时，即当序列进行比对以获得最高百分数同一性时，进行比较的序列中位于等同位置的片段。

之前的研究显示， F 蛋白存在 1 种确定的构象， post-F。 Mc 11 an等结合副流感病毒 ( arainf luenza virus , PIV ) 的 F 蛋白研究结果推测， RSV 的 F 蛋白可能还存在 pre- F 构象 (McLel lan 等（2010)， J Vriol , 84: 12236-12244) _β 在通常情况下， pre- F构象是不稳定的，其将自发转变为稳定的 post- F构象。因此，从细胞中表达和纯化的 F 蛋白主要以 post- F 构象存在 ( McLel lan等 ( 2010 ) ， J Vriol , 84: 12236-12244 ) 。

如本文中所使用的，术语 "pre- F蛋白" 是指，以 pre- F构象存在的 F蛋白。如本文中所使用的，术语 "post- F蛋白"是指，以 post- F构^ ^在的 F蛋白。如本文中所使用的，术语 "抗体" 是指，通常由两对多肽链

(每对具有一条 "轻" （L )链和一条 "重" （H )链）组成的免疫球蛋白分子。抗体轻链可分类为 κ和 λ轻链。重链可分类为 μ、 δ、 γ、 α或 ε，并且分别将抗体的同种型定义为 IgM、 IgD、 IgG、 IgA和 IgE。在轻链和重链内，可变区和恒定区通过大约 12或更多个氨基酸的 "J" 区连接，重链还包含大约 3个或更多个氨基酸的 "D" 区。各重链由重链可变区（V_H)和重链恒定区（C_H)组成。重链恒定区由 3个结构域（C_H1、 C_H2和 C_H3)组成。各轻链由轻链可变区（VL)和轻链恒定区（CJ组成。轻链恒定区由一个结构域 CL组成。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子，包括免疫系统的各种细胞（例如，效应细胞）和经典补体系统的第一组分（C 1 q) 的结合。 V_H和 VL区还可被细分为具有高变性的区域 (称为互补决定区（CDR) )，其间散布有较保守的称为构架区（FR ) 的区域。各 V_H 和 VL由按下列顺序: FR1、 CDR1、 FR2、 CDR2、 FR3、 CDR 3 , FR4 从氨基末端至羧基末端排列的 3个 CDR和 4个 FR组成。各重链 / 轻链对的可变区（V_H和 V 分别形成抗体结合部位。氨基酸至各区域或结构域的分配遵循 Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interes t (Nat ional Ins ti tutes of Heal th, Bethesda, Md. (1987 and 1991) ) , 或 Chothia & Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196: 901-917; Chothia 等人 (1989) Nature 342: 878-883 的定义。术语 "抗体" 不受任何特定的产生抗体的方法限制。例如，其包括，特别地，重组抗体、单克隆抗体和多克隆抗体。抗体可以是不同同种型的抗体，例如， IgG (例如， IgGl , IgG2, IgG3或 IgG4亚型）， IgAl , IgA2, IgD, IgE或 IgM抗体。

如本文中所使用的，术语抗体的 "抗原结合片段" 是指包含全长抗体的片段的多肽，其保持特异性结合全长抗体所结合的相同抗原的能力，和 /或与全长抗体竟争对抗原的特异性结合，其也被称为 "抗原结合部分" 。通常参见， Fundamental Immunology, Ch. 7 (Paul, W. , ed. , 第 2版， Raven Press, N. Y. (1989)，其以其全文通过引用合并入本文，用于所有目的。可通过重组 DNA 技术或通过完整抗体的酶促或化学断裂产生抗体的抗原结合片段。在一些情况下，抗原结合片段包括 Fab、 Fab' , F (ab' ) ₂、 Fd、 Fv、 dAb 和互补决定区（CDR)片段、单链抗体（例如， scFv)、嵌合抗体、双抗体（diabody)和这样的多肽，其包含足以赋予多肽特异性抗原结合能力的抗体的至少一部分。

如本文中所使用的，术语 "Fd片段" 意指由 V_H和 C_H1结构域组成的抗体片段；术语 "Fv 片段" 意指由抗体的单臂的 VL和 VH 结构域组成的抗体片段；术语 "dAb片段" 意指由 V_H结构域组成的抗体片段 (Ward 等人， ature 341: 544-546 (1989) )；术语" Fab 片段"意指由、 V_H、^和 C_H1结构域组成的抗体片段;术语" F (ab' ) ₂ 片段" 意指包含通过铰链区上的二硫键连接的两个 Fab片段的抗体片段。

在一些情况下，抗体的抗原结合片段是单链抗体（例如， scFv) , 其中 VL和 V_H结构域通过使其能够产生为单个多肽链的连接体配对形成单价分子（参见，例如， Bird 等人， Science 242: 423-426 (1988)和 Huston等人， Pro Nat l. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883 (1988) )。此类 scFv分子可具有一般结构： H₂-V - 接头- VH- C00H或 NH₂- VH-接头- Vi~C00H。合适的现有技术接头由重复的 GGGGS氨基酸序列或其变体组成。例如，可使用具有氨基酸序列（GGGGS) ₄的接头，但也可使用其变体（Hol l iger等人（1993)， Proc. Nat l. Acad. Sci. USA 90: 6444—6448)。可用于本发明的其他接头由 Alf than等人（1995)， Protein Eng. 8: 725-731 , Choi等人（2001)， Eur. J. Immunol. 31: 94- 106， Hu等人（1996)， Cancer Res. 56: 3055-3061 , Kipr iyanov 等人（1999)， J. Mol. Biol. 293: 41-56和 Roovers等人（2001)， Cancer Immunol.描述。

在一些情况下，抗体的抗原结合片段是欢抗体，即，欢价抗体，其中 V_H和 VL结构域在单个多肽链上表达，但使用太短的连接体以致不允许在相同链的两个结构域之间配对，从而迫使结构域与另一条链的互补结构域配对并且产生两个抗原结合部位（参见，例如， Hol l iger P. 等人， Proc. Nat l. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993) ，和 Pol jak R. J. 等人， Structure 2: 1121-1123 (1994) )。

可使用本领域技术人员已知的常规技术（例如，重组 DNA技术或酶促或化学断裂法）从给定的抗体（例如本发明提供的单克隆抗体 5C4 )获得抗体的抗原结合片段（例如，上述抗体片段），并且以与用于完整抗体的方式相同的方式就特异性筛选抗体的抗原结合片段。

在本文中，除非上下文明确指出，否则当提及术语 "抗体" 时，其不仅包括完整抗体，而且包括抗体的抗原结合片段。

如本文中所使用的，术语 "单抗" 和 "单克隆抗体" 是指，来自一群高度同源的抗体分子中的一个抗体或抗体的一个片段，也即除可能自发出现的自然突变外，一群完全相同的抗体分子。单抗对抗原上的单一表位具有高特异性。多克隆抗体是相对于单克隆抗体而言的，其通常包含至少 2种或更多种的不同抗体，这些不同的抗体通常识别抗原上的不同表位。单克隆抗体通常可采用 Kohler 等首次报道的杂交瘤技术获得（ Nature, 256: 495 , 1975 ) ，但也可采用重组 DNA技术获得（如参见 U. S. P 4, 816, 567)。例如，可以如下来制备单克隆抗体。首先用免疫原（必要时候添加佐剂）免疫注射小鼠或其它合适的宿主动物。免疫原或佐剂的注射方式通常为皮下多点注射或腹腔注射。可将免疫原预先偶联到某些已知蛋白，如血清白蛋白或大豆胰酶抑制剂上，以增强抗原在宿主内的免疫原性。佐剂可以是弗氏佐剂或 MPL- TDM等。动物在接受免疫后，体内将产生分泌特异性结合免疫原的抗体的淋巴细胞。另外，淋巴细胞也可以利用体外免疫获得。收集目的淋巴细胞，并用合适的融合剂，如 PEG, 使其与骨髄瘤细胞融合以获得杂交瘤细胞 (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103, Academic Press, 1996)。上述制备的杂交瘤细胞可以接种到合适的培养液中生长，培养液中优选含有一种或多种能够抑制未融合的、母体骨髄瘤细胞生长的物质。例如，对于缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸转移酶（ HGPRT 或 HPRT ) 的母体骨髄瘤细胞，在培养液中添加次黄嘌呤、氨基喋呤和胸腺嘧啶（HAT培养基）等物质将可以抑制 HGPRT^fe:陷细胞的生长。优选的骨髄瘤细胞应该具有融合率高，抗体分泌能力稳定，对 HAT培养液敏感等特征。其中，骨髄瘤细胞首选鼠源骨髄瘤，如 MOP- 21或 MC- 11小鼠肿瘤衍生林（THE Salk Insti tute Cel l Distribution Center, San Diego, Cal if. USA ) , 和 SP-2/0 或 X63-Ag8-653 细胞林 ( American Type Culture Collection, Rockvi l le, Md. USA ) 。另外也有研究报道，利用人骨髄瘤和人鼠异源骨髄瘤细胞林制备人单抗（Kozbor, J. Immunol. , 133: 3001 (1984)； Brodeur et al. , Monoclonal Antibody Production Techniques and Appl ications, pp. 51-63, Marcel Dekker, Inc. New York, 1987)。生长杂交瘤细胞的培养液用于检测针对特异抗原的单抗的产生。测定杂交瘤细胞产生的单抗的结合特异性的方法包括例如，免疫沉淀或体外结合试验，如放射免疫试验（RIA )、酶联免疫吸附试验 ( ELISA ) 。例如，可利用 Munson等在 Anal. Biochem. 107: 220 (1980)描述的 Scatchard分析法来测定单抗的亲和力。当确定了杂交瘤产生的抗体的特异性、亲和力和反应性之后，目的细胞林可以通过 (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103, Academic Press, 1996) 所描述的标准的有限稀释法进行亚克隆化。合适的培养液可以是 DMEM或 RPMI- 1640等。另外，杂交瘤细胞还可以腹水瘤的形式在动物体内生长。利用传统的免疫球蛋白纯化方法，如蛋白 A琼脂糖凝胶、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析等，可以将亚克隆细胞分泌的单抗从细胞培养液、腹水或血清中分离出来。

还可以通过基因工程重组技术获得单克隆抗体。利用特异性结合单抗重链和轻链基因的核酸引物进行 PCR扩增，可以从杂交瘤细胞中分离得到编码单抗重链和轻链基因的 DNA分子。将所得的 DNA分子插入表达载体内，然后转染宿主细胞（如 E. col i细胞、 COS细胞、 CH0细胞、或其它不产生免疫球蛋白的骨髄瘤细胞），并在合适的条件下进行培养，可以获得重组表达的目标抗体。

如本文中所使用的，术语 "嵌合抗体" 是指这样的抗体，其轻链或 /和重链的一部分源自一个抗体（其可以源自某一特定物种或属于某一特定抗体类或亚类），且轻链或 /和重链的另一部分源自另一个抗体（其可以源自相同或不同的物种或属于相同或不同的抗体类或亚类），但无论如何，其仍保留对目标抗原的结合活性（U. S. P 4, 816, 567 to Cabi l ly et al.； Morrison et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851 6855 (1984) )。

如本文中所使用的，术语 "人源化抗体" 是指，人源免疫球蛋白（受体抗体）的全部或部分 CDR区被一非人源抗体（供体抗体）的 CDR区替换后得到的抗体或抗体片段，其中的供体抗体可以是具有预期特异性、亲和性或反应性的非人源（例如，小鼠、大鼠或兔）抗体。此外，受体抗体的构架区（FR ) 的一些氨基酸残基也可被相应的非人源抗体的氨基酸残基替换，或被其他抗体的氨基酸残基替换，以进一步完善或优化抗体的性能。关于人源化抗体的更多详细内容，可参见例如， Jones et al.， Nature, 321: 522 525 (1986) ; Reichmann et al. , Nature, 332: 323 329 (1988) ; Presta, Curr. Op. Struct. Biol. , 2: 593 596 (1992) ; 和 Clark, Immunol. Today 21: 397 402 (2000)。

如本文中所使用的， "中和抗体" 是指，能清除或显著降低目标病毒的毒力（例如，感染细胞的能力）的抗体或抗体片段。

如本文中所使用的，术语 "表位" 是指，抗原上被免疫球蛋白或抗体特异性结合的部位。 "表位" 在本领域内也称为 "抗原决定簇" 。表位或抗原决定簇通常由分子的化学活性表面基团例如氨基酸或碳水化合物或糖侧链组成并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。例如，表位通常以独特的空间构象包括至少 3， 4， 5， 6， 7， 8， 9， 10, 11， 12, 13， 14或 15个连续或非连续的氨基酸，其可以是 "线性的"或 "构象的" 。参见，例如， Epi tope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, 第 66卷， G. E. Morris , Ed. (1996)。在线性表位中，蛋白质与相互作用分子（例如抗体）之间的所有相互作用的点沿着蛋白质的一级氨基酸序列线性存在。在构象表位中，相互作用的点跨越彼此分开的蛋白质 ^酸残基而存在。

如本文中所使用的，术语 "表位肽" 是指，抗原上能够用作表位的肽段。在一些情况下，单独的表位肽即能够被针对所述表位的抗体特异性识别 /结合。在另一些情况下，可能需要将表位肽与载体蛋白融合，以便表位肽能够被特异性抗体识别。如本文中所使用的，术语 "载体蛋白" 是指这样的蛋白，其可以充当表位肽的载体，即，其可以在特定位置处（例如蛋白内部， N 端或 C 端）插入表位肽，以便该表位肽能够呈现出来，从而该表位肽能够被抗体或免疫系统识别。此类载体蛋白是本领域技术人员熟知的，包括例如， HPV L1蛋白（可以将表位肽插入在所述蛋白的第 130-131 位氨基酸之间或在第 426-427 位氨基酸之间，参见 Slupetzky, K.等 Chimeric papi l lomavirus- l ike particles expressing a foreign epi tope on caps id surface loops [J] . J Gen Virol, 2001, 82: 2799-2804 ; Varsani, A.等 Chimeric human papi l lomavirus type 16 (HPV-16) LI particles presenting the common neutral izing epi tope for the L2 minor caps id protein of HPV-6 and HPV-16 [J] . J Virol, 2003, 77: 8386-8393 ) ， HBV 核心抗原（可以用表位肽替换所述蛋白的第 79-81位 ^酸，参见 Koletzki, D. , et al. HBV core particles al low the insertion and surface exposure of the entire potential ly protective region of Puumala hantavirus nucleocaps id protein [J] . Biol Chem, 1999, 380: 325-333 ) ，土拨鼠肝炎病毒核心蛋白（可以用表位肽替换所述蛋白的第 79-81 位氨基酸，参见 Sabine Konig, Gertrud Beterams and Michael Nassal , J. Virol. 1998， 72 (6) : 4997 ) , CRM197蛋白 (可以将表位肽连接至该蛋白或其片段的 N末端或 C末端）。任选地，可以在表位肽与载体蛋白之间使用连接体（例如柔性或刚性连接体），以促进二者各自的折叠。

可使用本领域技术人员已知的常规技术，就与相同表位的结合竟争性筛选抗体。例如，可进行竟争和交叉竟争研究，以获得彼此竟争或交叉竟争与抗原（例如， RSV 融合蛋白）的结合的抗体。基于它们的交叉竟争来获得结合相同表位的抗体的高通量方法描述于国际专利申请 W0 03/48731中。因此，可使用本领域技术人员已知的常规技术，获得与本发明的单克隆抗体 (例如，单克隆抗体 5C4)竟争结合 RSV融合蛋白上的相同表位的抗体及其抗原结合片段（即，抗原结^分）。

如本文中所使用的，术语 "分离的" 或 "被分离的"指的是，从天然状态下经人工手段获得的。如果自然界中出现某一种 "分离" 的物质或成分，那么可能是其所处的天然环境发生了改变，或从天然环境下分离出该物质，或二者情况均有发生。例如，某一活体动物体内天然存在某种未被分离的多聚核苷酸或多肽，而从这种天然状态下分离出来的高纯度的相同的多聚核苷酸或多肽即称之为分离的。术语 "分离的" 或 "被分离的" 不排除混有人工或合成的物质，也不排除存在不影响物质活性的其它不纯物质。

如本文中所使用的，术语 "大肠杆菌表达系统" 是指由大肠杆菌（菌林)与载体组成的表达系统，其中大肠杆菌（菌林）来源于市场上可得到的菌林，例如但不限于： GI698, ER2566, BL2KDE3) , B834 (DE3) , BLR (DE3) _β

如本文中所使用的，术语 "载体（vector ) " 是指，可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体 ( YAC )、细菌人工染色体 ( BAC )或 P1来源的人工染色体 ( PAC ); 噬菌体如 λ噬菌体或 M13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒（包括慢病毒）、腺病毒、目关病毒、疱渗病毒（如单纯疱渗病毒）、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒（如 SV40 )。一种载体可以含有多种控制表达的元件，包括但不限于，启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。

如本文中所使用的，术语 "宿主细胞" 是指，可用于导入载体的细胞，其包括但不限于，如大脉杆菌或枯草菌等的原核细胞，如酵母细胞或曲霉菌等的真菌细胞，如 S2果蝇细胞或 Sf9等的昆虫细胞，或者如纤维原细胞， CH0细胞， COS细胞， NS0细胞， HeLa 细胞， BHK细胞， HEK 293细胞或人细胞等的动物细胞。

如本文中所使用的，术语 "同一性" 用于指两个多肽之间或两个核酸之间序列的匹配情况。当两个进行比较的序列中的某个位置都被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据时（例如，两个 DNA 分子的每一个中的某个位置都被腺嘌呤占据，或两个多肽的每一个中的某个位置都被赖氨酸占据），那么各分子在该位置上是同一的。两个序列之间的 "百分数同一性" 是由这两个序列共有的匹配位置数目除以进行比较的位置数目 x lOO 的函数。例如，如果两个序列的 10个位置中有 6个匹配，那么这两个序列具有 60% 的同一性。例如， DNA序列 CTGACT和 CAGGTT共有 50%的同一性（总共 6个位置中有 3个位置匹配）。通常，在将两个序列比对以产生最大同一性时进行比较。这样的比对可通过使用，例如，可通过计算机程序例如 Al ign 程序（DNAstar, Inc. ) 方便地进行的 Needleman等人（ 1970 ) J. Mol. Biol. 48: 443-453 的方法来实现。还可使用已整合入 ALIG 程序（版本 2. 0)的 E. Meyers和 W. Mi l ler (Comput. Appl Biosci. , 4: 11-17 (1988) )的算法，使用 PAM120权重残基表 ( weight res idue table ) 、 12的缺口长度罚分和 4的缺口罚分来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。此外，可使用已整合入 GCG软件包（可在 www. gcg. com上获得）的 GAP 程序中的 Needleman 和 Wunsch (J Mo I Biol. 48: 444-453 (1970) )算法，使用 Blossum 62矩阵或 PAM250矩阵以及 16、 14、 12、 10、 8、 6或 4的缺口权重（gap weight )和 1、 2、 3、 4、 5或 6的长度权重来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。

如本文中使用的，术语 "保守置换" 意指不会不利地影响或改变包含 ^酸序列的蛋白 /多肽的必要特性的氨基酸置换。例如，可通过本领域内已知的标准技术例如定点诱变和 PCR介导的诱变引入保守置换。保守氨基酸置换包括用具有相似侧链的氨基酸残基替代氨基酸残基的置换，例如用在物理学上或功能上与相应的氨基酸残基相似（例如具有相似大小、形状、电荷、化学性质，包括形成共价键或氢键的能力等）的残基进行的置换。已在本领域内定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链（例如，赖氨酸、精氨酸和组氨酸）、酸性侧链 (例如天冬氨酸、谷氨酸）、不带电荷的极性侧链（例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸）、非极性侧链（例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸）、 P分支侧链（例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸）和芳香族侧链（例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸）的 ^¾ ^酸。因此，优选用来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基替代相应的氨基酸残基。鉴定氨基酸保守置换的方法在本领域内是熟知的（参见，例如， Br u隨 el l等人， Biochem. 32: 1180-1187 (1993) ; Kobayashi 等人 Protein Eng. 12 (10) : 879-884 (1999) ; 和 Burks等人 Pro Natl Acad. Set USA 94: 412-417 (1997)，其通过引用并入本文）。

如本文中使用的，术语 "免疫原性（ i隨 unogenici ty ) " 是指，能够刺激机体形成特异抗体或致敏淋巴细胞的能力。其既指，抗原能刺激特定的免疫细胞，使免疫细胞活化、增殖、分化，最终产生免疫效应物质如抗体和致敏淋巴细胞的特性，也指抗原刺激机体后，机体免疫系统能形成抗体或致敏 T淋巴细胞的特异性免疫应答。免疫原性是抗原最重要的性质，一种抗原能否成功地诱导宿主产生免疫应答取决于三方面的因素：抗原的性质、宿主的反应性和免疫方式。

如本文中使用的，术语 "特异性结合" 是指，两分子间的非随机的结合反应，如抗体和其所针对的抗原之间的反应。在某些实施方式中，特异性结合某抗原的抗体（或对某抗原具有特异性的抗体）是指，抗体以小于大约 10—5 M, 例如小于大约 10— ⁶ M、 10 ⁷ M、 10 ⁸ M、 10 ⁹ M或 10 ¹⁰ M或更小的亲和力 ( K_D )结合该抗原。

如本文中所使用的，术语 "K_D" 是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数，其用于描述抗体与抗原之间的结合亲和力。平衡解离常数越小，抗体-抗原结合越紧密，抗体与抗原之间的亲和力越高。通常，抗体（例如，本发明的单克隆抗体 5C4 ) 以小于大约 10 ⁵ M, 例如小于大约 10 ⁶ M、 10 ⁷ M、 10 ⁸ M、 ^^！^或 ^) ¹。

M或更小的解离平衡常数（K_D )结合抗原（例如， RSV融合蛋白 )，例如，如使用表面等离子体共振术（SPR)在 BIAC0RE仪中测定的。

如本文中所使用的，术语 "单克隆抗体" 和 "单抗" 具有相同的含义且可互换使用；术语 "多克隆抗体" 和 "多抗" 具有相同的含义且可互换使用；术语 "多肽" 和 "蛋白质" 具有相同的含义且可互换使用。并且在本发明中， ^酸通常用本领域公知的单字母和三字母缩写来表示。例如，丙氨酸可用 A或 Ala表示。

如本文中所使用的，术语 "杂交瘤" 和 "杂交瘤细胞林" 可互换使用，并且当提及术语 "杂交瘤" 和 "杂交瘤细胞林" 时，其还包括杂交瘤的亚克隆和后代细胞。例如，当提及杂交瘤细胞林 RSV- Y- 5C4- 2 (其在本文中也简称为，杂交瘤细胞林 5C4 ) 时，其还指杂交瘤细胞林 RSV-Y-5C4-2的亚克隆和后代细胞。

如本文中所使用的，术语"药学上可接受的载体和 /或赋形剂 " 是指在药理学和 /或生理学上与受试者和活性成分相容的载体和 / 或赋形剂，其是本领域公知的（参见例如 Remington' s Pharmaceutical Sciences. Edi ted by Gennaro AR, 19th ed. Pennsylvania: Mack Publ ishing Company, 1995 ) ，并且包括但不限于： pH调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂。例如， pH调节剂包括但不限于磷酸盐緩冲液；表面活性剂包括但不限于阳离子，阴离子或者非离子型表面活性剂，例如 Tween-80; 离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。

如本文中所使用的，术语 "佐剂"是指非特异性免疫增强剂，当其与抗原一起或预先递送入机体时，其可增强机体对抗原的免疫应答或改变免疫应答类型。佐剂有很多种，包括但不限于铝佐剂（例如氢氧化铝）、弗氏佐剂（例如完全弗氏佐剂和不完全弗氏佐剂）、短小棒状杆菌、脂多糖、细胞因子等。弗氏佐剂是目前动物试验中最常用的佐剂。氢氧化铝佐剂则在临床实验中使用较多。

如本文中所使用的，术语 "蛋白疫苗" 是指，基于多肽的疫苗，其任选地还包含佐剂。疫苗中的多肽可以是通过基因工程技术获得的，也可以是通过化学合成方法获得的。如本文中所使用的，术语 "核酸疫苗" 是指，基于 DNA或 RNA (例如质粒，如表达盾粒）的疫苗，其任选地还包含佐剂。

如本文中所使用的，术语 "有效量" 是指足以获得或至少部分获得期望的效果的量。例如，预防疾病（例如 RSV感染或与 RSV 感染相关的疾病）有效量是指，足以预防，阻止，或延迟疾病（例如 RSV感染或与 RSV感染相关的疾病）的发生的量；治疗疾病有效量是指，足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并发症的量。测定这样的有效量完全在本领域技术人员的能力范围之内。例如，对于治疗用途有效的量将取决于待治疗的疾病的严重度、患者自己的免疫系统的总体状态、患者的一般情况例如年龄，体重和性别，药物的施用方式，以及同时施用的其他治疗等等。

如本文中所使用的，本发明的表位肽的生物学功能包括但不限于选自下列的一种或多种：

1 )与抗体 5C4的特异性结合；

2 )在受试者体内降低 RSV融合蛋白的血清水平的能力（任选地，在将所述表位肽与载体蛋白融合后）；

3 )诱发有效清除体内的 RSV和被 RSV感染的细胞的抗体应答的能力（任选地，在将所述表位肽与载体蛋白融合后）；和

4 )治疗受试者的 RSV感染或与 RSV感染相关的疾病（例如肺炎）的能力（任选地，在将所述表位肽与载体蛋白融合后）。本发明人经过大量的实验研究，出人意料地发现： RSV 融合蛋白中的某些表位（例如， RSV融合蛋白的第 148- 216位基酸中包含的表位，或者包含 RSV融合蛋白的第 62- 69位和第 196-209 位 ^酸 ¾ ^的表位）以及识别这些表位的抗体促进了 F蛋白的 pre- F构象的稳定和维持，并且这些表位以及 pre- F构象的稳定和维持对于机体免疫应答的诱导具有重要意义，并且所述的抗体具有特别优良的生物学活性（例如，特别高的中和活性），从而特别适合用于预防或治疗 RSV感染或与 RSV感染相关的疾病（例如肺炎，如小儿肺炎) 。因此，在一个方面，本发明提供了一种分离的表位肽或其变体，其中，所述表位肽由呼吸道合胞病毒融合蛋白的第 148-216 位 ^酸 ¾ ^或其片段组成，且至少包含呼吸道合胞病毒融合蛋白的第 196-209位氨基酸残基，并且所述变体与其所源自的表位肽相异仅在于 1个或几个（例如， 1个， 2个， 3个， 4个， 5个， 6个， 7个， 8个或 9个）氨基酸残基的保守置换，且保留了其所源自的表位肽的生物学功能。

在本发明的各种实施方案中，优选地，本发明的表位肽以其在 pre- F蛋白中的空间构象存在，并且所述变体保留了其所源自的表位肽的空间构象。

在一个优选的实施方案中，所述表位肽由呼吸道合胞病毒融合蛋白的第 196- 209位氨基酸残基组成，并且所述变体与其所源自的表位肽相异仅在于 1个或几个（例如， 1个， 2个， 3个或 4 个）氨基酸残基的保守置换，且保留了其所源自的表位肽的生物学功能。

在另一个优选的实施方案中，所述表位肽由呼吸道合胞病毒融合蛋白的第 196- 216位氨基酸残基组成，且所述变体与其所源自的表位 J f目异仅在于 1个或几个（例如， 1个， 2个， 3个， 4 个， 5个， 6个， 7个， 8个或 9个）氨基酸残基的保守置换，且保留了其所源自的表位肽的生物学功能。在另一个优选的实施方案中，所述表位肽由呼吸道合胞病毒融合蛋白的第 185- 216位氨基酸残基组成，且所述变体与其所源自的表位 J f目异仅在于 1个或几个（例如， 1个， 2个， 3个， 4 个， 5个， 6个， 7个， 8个或 9个）氨基酸残基的保守置换，且保留了其所源自的表位肽的生物学功能。

在另一个优选的实施方案中，所述表位肽由呼吸道合胞病毒融合蛋白的第 185- 216位 ^酸残基组成，其中第 185- 194位氨基酸在蛋白质 2级结构上形成 p折叠，且所述变体与其所源自的表位肽相异仅在于 1个或几个（例如， 1个， 2个， 3个， 4个， 5 个， 6个， 7个， 8个或 9个）氨基酸残基的保守置换，且保留了其所源自的表位肽的生物学功能。

在另一个优选的实施方案中，所述表位肽由呼吸道合胞病毒融合蛋白的第 176- 216位氨基酸残基组成，且所述变体与其所源自的表位 J f目异仅在于 1个或几个（例如， 1个， 2个， 3个， 4 个， 5个， 6个， 7个， 8个， 9个）氨基酸残基的保守置换，且保留了其所源自的表位肽的生物学功能。

在另一个优选的实施方案中，所述表位肽由呼吸道合胞病毒融合蛋白的第 176- 216位 ^酸残基组成，其中第 176- 181位氨基酸与第 185-194位氨基酸在蛋白质 2级结构上形成 P折叠，且所述变体与其所源自的表位肽相异仅在于 1 个或几个（例如， 1 个， 2个， 3个， 4个， 5个， 6个， 7个， 8个， 9个）氨基酸残基的保守置换，且保留了其所源自的表位肽的生物学功能。

在另一个优选的实施方案中，所述表位肽由呼吸道合胞病毒融合蛋白的第 148- 216位氨基酸残基组成，且所述变体与其所源自的表位 J f目异仅在于 1个或几个（例如， 1个， 2个， 3个， 4 个， 5个， 6个， 7个， 8个， 9个）氨基酸残基的保守置换，且保留了其所源自的表位肽的生物学功能。

在另一个优选的实施方案中，所述表位肽由呼吸道合胞病毒融合蛋白的第 148- 216位氨基酸残基组成，其中第 176- 181位氨基酸与第 185-194位氨基酸在蛋白质 2级结构上形成 P折叠，且所述变体与其所源自的表位肽相异仅在于 1 个或几个（例如， 1 个， 2个， 3个， 4个， 5个， 6个， 7个， 8个， 9个）氨基酸残基的保守置换，且保留了其所源自的表位肽的生物学功能。

在另一个方面，本发明提供了一种分离的表位肽或其变体，其由第一肽和第二肽构成，其中第一肽由呼吸道合胞病毒融合蛋白的第 148- 216位 ^酸残基或其片段组成且至少包含呼吸道合胞病毒融合蛋白的第 196- 209位氨基酸残基，并且第二肽由呼吸道合胞病毒融合蛋白的第 62- 69位或第 62- 76位 ^酸组成，其中所述变体与其所源自的表位肽相异仅在于 1个或几个（例如， 1 个， 2个， 3个， 4个， 5个， 6个， 7个， 8个， 9个）氨基酸残基的保守置换，且保留了其所源自的表位肽的生物学功能。

在本发明的各种实施方案中，优选地，所述第一肽和第二肽以其在 pre- F蛋白中的空间构象存在，并且所述变体保留了其所源自的表位肽的空间构象。

在一个优选的实施方案中，所述第一肽与第二肽共同构成了存在于 RSV融合蛋白的 pre- F构象中的空间结构。

在一个进一步优选的实施方案中，所述第一肽由呼吸道合胞病毒融合蛋白的第 196- 209位氨基酸残基组成。在另一个优选的实施方案中，所述第一肽由呼吸道合胞病毒融合蛋白的第 196-216 位氨基酸残基组成。在另一个优选的实施方案中，所述第一肽由呼吸道合胞病毒融合蛋白的第 185- 216位 ^¾ ^酸残基组成。在另一个优选的实施方案中，所述第一肽由呼吸道合胞病毒融合蛋白的第 185- 216位 ^酸残基组成，其中第 185- 194位氨基酸在蛋白质 2级结构上形成 p折叠。在另一个优选的实施方案中，所述第一肽由呼吸道合胞病毒融合蛋白的第 176- 216位氨基酸残基组成。在另一个优选的实施方案中，所述第一肽由呼吸道合胞病毒融合蛋白的第 176-216 位氨基酸残基组成，其中第 176-181位 ^酸与第 185-194位 ^¾ ^酸在蛋白质 2级结构上形成 P折叠。在另一个优选的实施方案中，所述第一肽由呼吸道合胞病毒融合蛋白的第 148- 216位氨基酸残基组成。在另一个优选的实施方案中，所述第一肽由呼吸道合胞病毒融合蛋白的第 148-216 位氨基酸残基组成，其中第 176-181 位氨基酸与第 185-194位 ^¾ ^酸在蛋白质 2级结构上形成 P折叠。本领域技术人员知晓，可以将表位肽或其变体与载体蛋白融合，以增强表位肽或其变体的免疫原性，使得表位肽或其变体能够被机体的免疫系统识别，并诱发有效预防病毒感染。

因此，在一个方面，本发明还提供了一种重组蛋白，其包含本发明的分离的表位肽或其变体以及载体蛋白，并且所述重组蛋白不是天然存在的蛋白或其片段。在所述重组蛋白中，所位肽或其变体可以连接至载体蛋白的 N末端或 C末端，插入载体蛋白的内部，或替换载体蛋白的部分 ^ 列，视所使用的具体载体蛋白而定。此外，任选地，所述表位肽或其变体通过连接体 (刚性或柔性连接体，例如（GGGGS) ₃ ) 与载体蛋白相连接。本发明的重组蛋白不受其产生方式的限定，例如，其可以通过基因工程方法（重组技术）产生，也可以通过化学合成方法产生。

在另一个方面，本发明还提供了一种分离的核酸分子，其包含编码本发明的表位肽或其变体或本发明的重组蛋白的核苷酸序列。在另一个方面，本发明还提供了一种载体，其包含如上所述的分离的核酸分子。本发明的载体可以是克隆载体，也可以是表达载体。在一个优选实施方案中，本发明的载体是例如质粒，粘粒，噬菌体，柯斯盾粒等等。在一个优选实施方案中，所述载体能够在受试者（例如哺乳动物，例如人）体内表达本发明的表位肽或其变体或本发明的重组蛋白。

在另一个方面，还提供了包含本发明的分离的核酸分子或载体的宿主细胞。此类宿主细胞包括但不限于，原核细胞例如大脉杆菌细胞，以及真核细胞例如酵母细胞，昆虫细胞，植物细胞和动物细胞（如哺乳动物细胞，例如小鼠细胞、人细胞等）。本发明的细胞还可以是细胞系，例如 293T细胞。

在另一个方面，还提供了制备本发明的重组蛋白的方法，其包括，在合适的条件下培养本发明的宿主细胞，和从细胞培养物中回收本发明的重组蛋白。在另一个方面，本发明提供了一种蛋白疫苗，其包含本发明的表位肽（或其变体）或重组蛋白，以及药学上可接受的载体和 / 或赋形剂（例如佐剂）。在一个优选实施方案中，所述蛋白疫苗包含一个或多个本发明的表位肽，且这些表位肽可以是单独的或串联的、修饰的或未经修饰的、偶联至其他蛋白的或不偶联至其他蛋白的。

在另一个方面，本发明提供了用于预防、治疗或抑制受试者的 RSV感染或与 RSV感染相关的疾病（例如肺炎，如小儿肺炎）的方法，其包括，给有此需要的受试者施用治疗有效量的本发明的表位肽（或其变体）或重组蛋白或蛋白疫苗。

在另一个方面，提供了本发明的表位肽（或其变体）或重组蛋白在制^ ^白疫苗中的用途，所述蛋白疫苗用于预防、治疗或抑制受试者的 RSV感染或与 RSV感染相关的疾病（例如肺炎，如小儿肺炎）。

在另一个方面，提供了本发明的表位肽（或其变体）或重组蛋白，其用于预防、治疗或抑制受试者的 RSV感染或与 RSV感染相关的疾病（例如肺炎，如小儿肺炎）。

在另一个方面，本发明提供了一种基因疫苗，其包含本发明的分离的核酸分子或载体，以及药学上可接受的载体和 /或赋形剂 (例如佐剂）。在一个优选实施方案中，所述基因疫苗包含 DNA 或 RNA。在此类实施方案中，所述 DNA或 RNA可以是裸露的或可以包裹于具有传递或 /和保护功能的外壳内。在一个进一步优选的实施方案中，所述外壳可以是腺病毒、腺相关病毒、慢病毒、逆转录病毒等的外壳，也可以是采用化学方法合成的能行使相似功能的其他材料。

在另一个方面，本发明提供了用于预防、治疗或抑制受试者的 RSV感染或与 RSV感染相关的疾病（例如肺炎，如小儿肺炎）的方法，其包括，给有此需要的受试者施用治疗有效量的本发明的基因疫苗或分离的核酸分子或载体。

在另一个方面，提供了本发明的分离的核酸分子或载体在制备基因疫苗中的用途，所述基因疫苗用于预防、治疗或抑制受试者的 RSV感染或与 RSV感染相关的疾病（例如肺炎，如小儿肺炎）。

在另一个方面，提供了本发明的分离的核酸分子或载体，其用于预防、治疗或抑制受试者的 RSV感染或与 RSV感染相关的疾病（例如肺炎，如小儿肺炎）。

在另一个方面，本发明提供了一种组合物，其包含本发明的表位肽（或其变体）或重组蛋白或分离的核酸分子或载体，以及药学上可接受的载体和 /或赋形剂（例如佐剂）。在一个优选实施方案中，所述药物组合物包含一个或多个本发明的表位肽，且这些表位肽可以是单独的或串联的、修饰的或未经修饰的、偶联至其他蛋白的或不偶联至其他蛋白的。在另一个方面，本发明提供了制备能够特异性结合并中和呼吸道合胞病毒并且稳定和维持 F蛋白的 pre- F构象的抗体的方法，其包括：

1 )用本发明的表位肽（或其变体 )或重组蛋白免疫非人动物 (例如小鼠），以使所述动物产生抗体；和

2 ) 筛选对呼吸道合胞病毒具有中和活性且与 post- F蛋白不具有反应性（即，不结合或基本上不结合 pos t- F蛋白）的抗体。

在另一个方面，本发明提供了能够特异性结合并中和呼吸道合胞病毒并且稳定和维持 F蛋白的 pre- F构象的抗体或其抗原结合片段，其通过如上所述的方法制备获得。在一个方面，本发明提供了一种单克隆抗体及其抗原结合片段，其中，所述单克隆抗体能够特异性结合本发明的表位肽。优选地，所述单克隆抗体能够特异性结合呼吸道合胞病毒融合蛋白的第 148- 216位氨基酸残基或其片段（例如呼吸道合胞病毒融合蛋白的第 196- 209位 ^酸残基），和 /或，呼吸道合胞病毒融合蛋白的第 62- 69位或第 62- 76位 ^¾ ^酸 ¾J^。

在一个优选的实施方案中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段选自 Fab、 Fab'、 F (ab' ) ₂、 Fd、 Fv、 dAb、互补决定区片段、单链抗体（例如， scFv)、小鼠抗体、兔抗体、人源化抗体、全人抗体、嵌合抗体（例如，人鼠嵌合抗体）或双特异或多特异抗体。在一个优选的实施方案中，所述的单克隆抗体包括非- CDR区，且所述非- CDR区来自不是鼠类的物种，例如来自人抗体。

在一个优选的实施方案中，所述的单克隆抗体特异性结合呼吸道合胞病毒，且对所述病毒具有中和活性。在一个优选的实施方案中，所述的单克隆抗体不结合或基本上不结合 pos t- F蛋白，而是结合并稳定 pre- F蛋白。

在一个优选的实施方案中，所述的单克隆抗体包含下列 CDR:

1 )如 SEQ ID 1«): 20所示的重链00111；

2 )如 SEQ ID ：21所示的重链00112；

3 )如 SEQ ID ：22所示的重链00113；

4 )如 SEQ ID ：23所示的轻链00111；

5 )如 SEQ ID ：24所示的轻链00112；和

6 )如 SEQ ID ：25所示的轻链00113。

在一个优选的实施方案中，所述的单克隆抗体包含：

a )如 SEQ ID NO: 17所示的重链可变区；和

b )如 SEQ ID NO: 19所示的轻链可变区。

在一个优选的实施方案中，所述的单克隆抗体衍生自选自下列的单克隆抗体，或是选自下列的抗体：

杂交瘤细胞林 5C4所产生的单克隆抗体，其中，杂交瘤细胞林 5C4 保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC) , 且具有保藏号 CCTCC NO: C2012147 _e 在另一个方面，本发明提供了一种单克隆抗体及其抗原结合片段，其能够阻断本发明的表位肽或 pre- F蛋白与由杂交瘤细胞林 5C4所产生的抗体的结合至少 50%, 优选至少 60%, 优选至少 70%,优选至少 80%,优选至少 90%,优选至少 95%或优选至少 99%, 其中，所述杂交瘤细胞林 5C4 保藏于中国典型培养物保藏中心 (CCTCC) , 且具有保藏号 CCTCC NO: C2012147 _e

此类单抗所识别的表位与单抗 5C4识别的表位相同，或者在空间上存在重叠，从而此类单抗能够降低单抗 5C4与本发明的表位肽或 pre- F蛋白的结合至少 50%,优选至少 60%,优选至少 70%, 优选至少 80%, 优选至少 90%, 优选至少 95%或优选至少 99%。本发明还提供了分离的核酸分子，其编码本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段。此类核酸分子可以从杂交瘤细胞中分离得到，也可以利用基因工程重组技术或化学合成方法获得。

在一个方面，本发明提供了分离的核酸分子，其包含能够编码本发明的单克隆抗体的重链可变区的核酸序列。

在一个优选的实施方案中，所述重链可变区如 SEQ ID NO: 17 所示。在另一个优选的实施方案中，所述核酸分子具有 SEQ ID NO: 16所示的核苷酸序列。

在另一个方面，本发明提供了分离的核酸分子，其包含能够编码本发明的单克隆抗体的轻链可变区的核酸序列。

在一个优选的实施方案中，所述轻链可变区如 SEQ ID NO: 19 所示。在另一个优选的实施方案中，所述核酸分子具有 SEQ ID NO: 18所示的核苷酸序列。

在另一个方面，本发明提供了一种载体，其包含本发明的分离的核酸分子。本发明的载体可以是克隆载体，也可以是表达载体。

在一个优选实施方案中，本发明的载体是例如质粒，粘粒，噬菌体，柯斯质粒等等。

在另一个方面，还提供了制备本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的方法，其包括，在合适的条件下培养本发明的宿主细胞，和从细胞培养物中回收本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段。在另一个方面，本发明提供了一种杂交瘤细胞林 5C4, 其保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC)，且具有保藏号 CCTCC NO: C2012147。

可通过常规方法，从单克隆抗体 5C4中获得抗体所包含的重链可变区、轻链可变区、重链可变区 CDR和轻链可变区 CDR的氨基酸序列和 /或核苷酸序列。

单克隆抗体 5C4的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列分别如 SEQ ID NO: 17和 19所示；编码核苷酸序列分别如 SEQ ID NO: 16和 18所示。

单克隆抗体 5C4的重链可变区 CDR和轻链可变区 CDR的氨基酸序列分别如 SEQ ID NO: 20- 25所示。在另一个方面，本发明提供了一种试剂盒，其包括本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段。在一个优选的实施方案中，本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段还包括可检测的标记。在一个优选的实施方案中，所述试剂盒还包括第二抗体，其特异性识别本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段。优选地，所述第二抗体还包括可检测的标记。此类可检测的标记是本领域技术人员熟知的，包括但不限于，放射性同位素，荧光物质，发光物质，有色物质和酶（例如辣根过氧化物酶）等。

在另一个方面，本发明提供了稳定 pre- F蛋白的方法，其包括使用本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段，或者 D25或 AM22 单克隆抗体或其抗原结合片段。

在另一个方面，本发明提供了检测 pre- F蛋白在样品中的存在或或其水平的方法，其包括使用本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段。在一个优选的实施方案中，本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段还包括可检测的标记。在另一个优选的实施方案中，所述方法还包括，使用携带可检测的标记的第二抗体来检测本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段。所述方法可以用于诊断目的，或者非诊断目的（例如，所述样品是细胞样品，而非来自患者的样品）。

在另一个方面，本发明提供了诊断受试者是否感染了 RSV的方法，其包括：使用本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段检测 RSV在来自所述受试者的样品中的存在。在一个优选的实施方案中，本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段还包括可检测的标记。在另一个优选的实施方案中，所述方法还包括，使用携带可检测的标记的第二抗体来检测本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段。

在另一个方面，提供了本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段或者 D25或 AM22单克隆抗体或其抗原结合片段在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于稳定 pre- F蛋白，或检测 pre- F蛋白在样品中的存在或其水平，或用于诊断受试者是否感染了 RSV。在另一个方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段，以及药学上可接受的载体和 / 或赋形剂。

在另一个方面，本发明提供了用于预防或治疗受试者的 RSV 感染或与 RSV感染相关的疾病（例如肺炎，如小儿肺炎）的方法，其包括，给有此需要的受试者施用预防或治疗有效量的本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段，或者本发明的药物组合物。

在另一个方面，提供了本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段在制备药物组合物中的用途，所述药物组合物用于预防或治疗受试者的 RSV感染或与 RSV感染相关的疾病（例如肺炎，如小儿肺炎) 。

在另一个方面，提供了本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段，用于预防或治疗受试者的 RSV感染或与 RSV感染相关的疾病 (例如肺炎，如小儿肺炎) 。本发明所提供的疫苗（蛋白疫苗和基因疫苗）、药物和药物组合物可以单独使用或联合使用，也可以与其他药学活性剂（例如干扰素类药物，如干扰素或聚乙二醇干扰素）联合使用。在另一个方面，本发明提供了表达 pre- F蛋白或抗原-抗体复合物的方法，其包括，在细胞中共表达编码本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段或者 D25或 AM22单克隆抗体或其抗原结合片段的核酸，以及编码 F蛋白的核酸。

在另一个方面，本发明提供了试剂盒，其包含编码本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段或者 D25或 AM22单克隆抗体或其抗原结合片段的核酸，以及编码 F蛋白的核酸。发明的有益效果

本发明人首次发现了呼吸道合胞病毒融合蛋白（F 蛋白）的新表位，并且出人意料地发现，该新表位以及特异性识别该新表位的抗体对于 F蛋白的 pre- F构象的稳定和维持具有重要作用。

此外，本发明人还发现，与现有技术已知的针对呼吸道合胞病毒融合蛋白的抗体相比，本发明的特异性识别该新表位的抗体具有更高的中和活性，这表明 F蛋白的 pre- F构象以及本发明所发现的新表位对于抗呼吸道合胞病毒的免疫应答的诱导具有重要作用。

因此，本发明的表位肽或含有该表位肽的重组蛋白能有效用作蛋白疫苗，用于预防受试者的呼吸道合胞病毒感染或与呼吸道合胞病毒感染相关的疾病（例如小儿肺炎）。

此外，本发明的单克隆抗体及其抗原结合片段具有更高的中和活性，从而能够以更低的剂量有效阻断呼吸道合胞病毒对细胞的感染，进而可有效用于预防或治疗受试者的呼吸道合胞病毒感染或与呼吸道合胞病毒感染相关的疾病（例如小儿肺炎）。下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。附图说明

图 1显示了检测 5C4单抗与 post- F之间的反应性的 ELISA 测定法。结果显示，相比于商业化抗体帕利珠单抗（ pal ivizumab, Synagis )和莫维珠单抗 ( Motavizumab ) ， 5C4抗体对 ost-F无明显的反应性。

图 2显示了 5C4单抗的中和活性的测定。结果显示， 5C4单抗对呼吸道合胞病毒具有强中和活性。特别地，相比于商业化抗体帕利珠单抗 ( al ivizumab , Synagis ) 和莫维珠单抗 ( Motavizumab ) ，以及之前已报道的抗体 D (参见，美国专利申请 12/600, 950 )及）及 AM22(参见，美国专利申请 12/898, 325 )， 5C4单抗对呼吸道合胞病毒的中和活性更强。

图 3显示了 5C4单抗的结合抑制活性的测定。结果显示，几株检测单抗均不影响病毒对细胞的吸附。

图 4显示了 5C4单抗的融合抑制活性的测定。结果显示，相比于商业化抗体帕利珠单抗 ( al ivizumab, Synagis )和莫维珠单抗（Motavizumab ) ，以及之前已报道的抗体 D (参见，美国专利申请 1²/600， 9⁵0 ) 及）及 AM²² (参见，美国专利申请 12/898, 325 ) , 5C4抗体的融合抑制活性更强。

图 5显示了 5C4单抗的病毒捕获能力的检测。结果显示， 5C4 单抗与呼吸道合胞病毒的结合具有很强的特异性。特别地，相比于商业化抗体帕利珠单抗 ( al ivizumab, Synagis ) ， 5C4 抗体对呼吸道合胞病毒的捕获能力更强。

图 6显示了 5C4单抗的反应性的 Western Blot检测。结果显示， 5C4单抗为识别构象表位的单抗，其识别非变性的 RSV- A2和 RSV-GFP, 而不识别变性的 RSV- A2和 RSV- GFP。此外， 5C4单抗能特异性识别 RSV- A2、 RSV-GFP, 但与 post- F基本上无反应性。图 7显示了使用 5C4单抗的免疫荧光的检测。结果显示， 5C4 单抗可用于检测 RSV A2对细胞的感染。

图 8显示了 5C4单抗与其他单抗的竟争性结合的分析。结果显示， AM22单抗、 D25单抗与 5C4单抗之间存在竟争结合， 5C4 单抗对 AM22单抗、 D25单抗结合的阻断率最高可达 99%。这表明 5C4单抗与 AM22单抗、 D25单抗识别抗原（ F蛋白）上的相同表位。

图 9显示了 AM22/F蛋白、 5C4/F蛋白与 D25/F蛋白抗原-抗体复合物的电子显微镜观察结果。结果显示， AM22/F蛋白、 5C4/F 蛋白与 D25/F 蛋白抗原-抗体复合物具有相同的结构。这表明， AM22单抗、 5C4单抗与 D25单抗结合 F蛋白上的相同表位，并且结合相同构象的 F蛋白（pre- F构象）。

图 10显示了帕利珠单抗 /F蛋白与 5C4/F蛋白抗原-抗体复合物的电子显微镜结果的比较，其中左图为 pos t- F与帕利珠单抗的复合物的电子显微镜结果；左下图显示，左上图的白框区域中的 pos t- F在电镜下观察到的结构；右图为 pre- F与 5C4的复合物的电子显微镜结果，图中白框区域为 pre- F在电镜下观察到的结构。结果显示，帕利珠单抗 /F蛋白与 5C4/F蛋白抗原-抗体复合物具有显著不同的结构，并且这 2种抗原抗体复合物中的 F蛋白的构象也显著不同，其中帕利珠单抗 /F 蛋白复合物中的 F 蛋白为 pos t- F构象，而 5C4/F蛋白复合物中的 F蛋白为 pre- F构象。

图 11显示了 D25/F蛋白复合物的晶体结构。

图 12显示了 D25单抗与 F蛋白上的表位的结合的空间结构。图 13显示了 D25结合的表位在 pre- F蛋白与 pos t- F蛋白中的三级结构的变化。

图 14显示了 pre- F蛋白的单体和三聚体以及 pos t- F蛋白的单体和三聚体的晶体结构。结果显示， pre- F蛋白与 post- F蛋白具有显著不同的空间结构（构象）。

图 15显示了 pre- F蛋白和 post- F蛋白的空间结构，构成所述空间结构的对应氨基酸序列，以及 D25所识别的表位序列。结果显示， pre- F蛋白和 pos t- F蛋白的空间结构存在着显著的差异。特别地， pr e- F蛋白的空间结构包括 α 1- α 10螺旋和 β1-β23 叠；而 post- F蛋白的空间结构包括 αΐ螺旋， α5- α8螺旋， 10螺旋， PI- Ρ2折叠和 Ρ5- P21折叠。

此外，图 15的结果还显示， D25单克隆抗体在 pre- F蛋白中的核心识别表位为两个空间上相互接近的肽段，即， a. a. 62-69 与 a.a. 196-209。这两个肽段的相互作用界面表明， F蛋白中的两个区段（ a. a.62- 76 与 a. a.137- 216 (或更具体地， a. a.148-216) )或其片段对于这类抗体（本发明的抗体（例如 5C4 )， D25和 AM22 )识别并稳定 pre- F蛋白具有重要的作用，其中 a. a.176-181与 a. a.185- 194这两个区域在 F蛋白的 pre- F构象及 post- F构象之间存在显著的转变：它们在 pre- F蛋白中的构象为 P折叠（ P3- P4折叠），而在 post- F蛋白中的构象为 α螺旋（包含在 5螺旋中）。

本发明涉及的序列的信息提供于下面的表 1中。

表 1: 序列的说明

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40 MVhR 5' -CCAgggRCCARKggATARCANgRTgg-3'

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42 MVkF-B 5' -ATggAgACAgACACACTCCTgCTAT-3'

43 MVkF-C 5' -ATggAgWCAgACACACTSCTgYTATgggT-3'

44 MVkF-Dl 5' -ATgAggRCCCCTgCTCAgWTTYTTggWTCTT-3'

45 MVkF-D2 S' -ATgggC TCAAgATgRAgTCACAK YYC gg-S'

46 MVkF-D3 5' -ATgAgTgTgCYCACTCAggTCCTggSgTT-3'

47 MVkF-El 5' -ATgTggggAYCgKTTTYAMMCTTTTCAATTg-3'

48 MVkF-E2 5' -ATggAAgCCCCAgCTCAgCTTCTCTTCC-3'

49 MVkF-E3 5' -ATgAgMMKTCMTTCATTCYTggg-3'

50 MVkF-Fl 5' -ATgAKgTHCYCgCTCAg YTYCTRg- 3'

51 MVkF-F2 5' -ATggTRTCC CASCTCAgTTCCTTg-3'

52 MVkF-F3 5' -ATgTATATATgTTTgTTgTCTATTTCT-3'

53 MVkF-F4 5' -ATgAAgTTgCCTgTTAggCTgTTggTgCT-3'

54 MVkF-Gl 5' -ATggATTT CARgTgCAgATT TCAgCTT-3'

55 MVkF-G2 5' -ATggTYCTYATVTCCTTgCTgTTCTgg-3'

56 MVkF-G3 5' -ATggTYCTYATVTTRCTgCTgCTATgg-3'

57 MVkR 5' -ACTggATggTgggAAgATggA-3' 生物材料保藏的说明

本发明的杂交瘤细胞林 RSV-Y-5C4-2于 2012年 10月 22日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC，中国湖北省武汉市武汉大学），其具有保藏号 CCTCC NO: C2012147_e 具体实施方式

现参照下列意在举例说明本发明（而非限定本发明）的实施例来描述本发明。

除非特别指明，本发明中所使用的分子生物学实验方法和免疫检测法，基本上参照 J. Sambrook等人，分子克隆：实验室手册，第 2版，冷泉港实验室出版社， 1989，以及 F. M. Ausubel 等人，精编分子生物学实验指南，第 3版， John Wi ley & Sons, Inc. , 1995中所述的方法进行；限制性内切酶的使用依照产品制造商推荐的条件。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。本领域技术人员知晓，实施例以举例方式描述本发明，且不意欲限制本发明所要求保护的范围。实施例 1. RSV病毒的制备

RSV A2病毒林的制备和扩增

RSV A2病毒林由 IH Dr. Barney S. Graham ( Graham et al, 1988 ) 实验室制备并馈赠。

准备汇合率为 80%的 Hep2细胞， 37Ό培养 6小时后，去除上清，加入 1ml RSV A2病毒林，室温孵育 1小时。随后加入 10% MEM 培养基至 15ml， 37Ό培养 4天。收集细胞以及细胞上清至预冷的 50ml离心管，使用手握式超声破碎仪破碎 ( 50%, 破 1秒停 3秒 ) 后，置于冷冻离心机 lOOOrpm, 4Ό离心 15分钟。将上清转移至预冷的 50ml离心管中，随后分装为 1ml/管，置于干水-酒精混合液中速冻。最后置于- 80Ό保存。

RSV GFP病毒的制备和扩增

RSV GFP病毒由 IH Dr. Peter Col l ins制备（ Hal lak et al ) , 且由 NIH Dr. Barney S. Graham实验室馈赠。

准备汇合率为 80%的 Hep2细胞， 37Ό培养 6小时后，去除上清，加入 lml RSV GFP病毒，室温孵育 1小时。随后加入 10% MEM 培养基至 15ml， 37Ό培养 4天。收集细胞以及细胞上清至预冷的 50ml离心管，使用手握式超声破碎仪破碎 ( 50%, 破 1秒停 3秒 ) 后，置于冷冻离心机 lOOOrpm, 4Ό离心 15分钟。将上清转移至预冷的 50ml离心管中，随后分装为 lml/管，置于干水-酒精混合液中速冻。最后置于- 80Ό保存。实施例 2. post-F蛋白的表达和 DNA-F载体的构建

post-F蛋白的表达

post- F蛋白的序列来自 RSV- A2病毒林。为了增强 post- F蛋白的表达，将其 J ^^列中的第 102 ( P102 ) 、 379 ( 1379 )和 447 447 )位氨基酸分别替换成丙氨酸（P102A )、缬氨酸（ I379V ) 以及缬氨酸（M447V ) 。此外，还从 post- F蛋白序列中去除了融合肽段 137-146。将经密码子优化的 post- F序列插入真核表达载体 LEXm中 (由 Regensburg公司合成 ) ，从而获得 ost-F表达质粒 pLEXm- postF, 并且其 C末端还包含 HRV 3C蛋白酶位点以及 8xHis标签。

pLEXm-postF经瞬时转染系统（ TrueFect-Max,购买于 Uni ted BioSystems公司）转入 HEK293F细胞（购买于 Invitrogen公司）中，置于 120rpm、 9% C02摇床上 37 Ό悬浮培养 4- 5天。收集细胞后，先用 Ni2+-NTA Resin (购买于 Qiagen公司）纯化，洗脱緩冲液为 20 fflM Tris-HCl H 7. 5， 200 mM NaCl和 250 mM咪唑， H 8. 0。再才艮据说明书，用 StrepTactin res in (购买于 Novagen 公司）进一步纯化。用 HRV 3C protease (Novagen)酶切蛋白，再重新过 Ni2+- NTA, 除去未切干净的蛋白和亲和标签。蛋白再经过 Superdex 200凝胶过滤柱（购买于 GE Healthcare公司）纯化，緩冲液为 2 mM Tris-HCl pH 7. 5， 150 mM NaCl和 0· 02% NaN3, 最后将蛋白浓缩至约 6mg/mL。

DNA-F的构建

将目的片段（ RSV的全长 F蛋白）构建到穿 M粒 ptrack- CMV 中，获得质粒 pAdTrack- CMV- RSV F。 Pmel单酶切线性化 37Ό 7h 以上，酶切体系为 50uL。在上述管中加 buffer和去磷酸化酶， 37度反应 7h以上。而后乙醇沉淀，离心后用无菌水重悬。转化 BJAdEasy感受态细菌，使 AdTrack-CMV-RSV F与 pAdEasy- 1在 E. col i BJ5183 中重组，再涂布至卡那霉素抗性的 LB平板上， 37Ό选择培养，挑取 6 - 8个小菌落，提取盾粒，鉴定质粒大小（腺病毒盾粒 pAdEasy-l为 33414 bp ) 。用 Pac I酶切鉴定：可切出两个片段，一个是 30kb左右，另一个是 3. Okb 或 4. 5kb的片段，将鉴定正确后的阳性重组子转入 E. col i DH5 c 中，保菌，提取质粒，获高拷贝数的质粒备用。准备 1-2瓶 293 P 5细胞，每瓶 2*10⁶个细胞，培养 24h。用 Pacl消化重组腺病毒盾粒 4ug。乙醇沉淀质粒，用 20uL无菌水重悬。将 4ug经 Pa 消化的质粒和 20uL Lipofectamine ( GIBCO BRL ) 混合到 500uL OptiMem I培养基中 (每瓶细胞），室温孵育 15- 30min。用 4mL无血清培养基洗一遍细胞。每瓶加入 2. 5mL OptiMem I。置 37Ό孵育约 10min。加入 Lipofectamine- DNA混合液至细胞瓶，置 37Ό孵育。 4h后吸掉含 Lipofectamine- DNA混合液的上清，加入 6mL新鲜的完全培养基， 37Ό培养过夜。转染后 7-10天，用橡胶刮棒将细胞刮下（不是胰酶），转至 50mL锥底管。离心后用 2mLHBSS或无菌 PBS重悬。用干水 /甲醇水浴冷冻细胞，再用 37Ό水浴化冻。剧烈震荡。重复上述 "冻 /融 /震"过程 3次，置- 20Ό保存。使用上述病毒悬液感染 293 P 5细胞， 37Ό培养 48h至荧光强时，将感染后的细胞用培养基直接吹起， 3000转离心 3min，沉淀重悬，在液氮中反复冻融 6次至细胞裂解后， 4000转离心 30min，取上清。在超离管中小心加入 5ml40%Cscl， 4. 5mll5% Cscl , 再加入上清，使其分层，平衡后，上超离， 4Ό下 32000转离心 16h，出现两条条带。而后小心吸出位于下层的较粗的条带，在含 5%蔗糖、 MgCl₂的 20mM TB8. 0中透析后，即可得到纯化好的重组腺病毒。实施例 3. 单克隆抗体的制备

杂交瘤的制备：

使用尾静脉注射 DNA免疫方式和 PEG融合方法获得单克隆抗体，详细方法参见 Ed Harlow et al.， "Antibodies A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory 1988。简要过程如下：小鼠免疫：首次免疫使用 RSV全长 F基因的质粒，免疫前将 PBS与弗氏完全佐剂（CFA )等体积混合乳化，经四肢肌肉多点注射，每只每次注射 300ul。使用 PBS将 RSV全长 F基因的质粒稀释至 50ug/ml，每只小鼠经尾静脉高压注射 2ml。首次免疫后 10d 和 17d，分别用同样剂量 PBS加弗氏不完全佐剂（IFA )进行加强免疫后每只小鼠经尾静脉注射 2ml含 106拷贝量 RSV F蛋白全长基因的腺病毒。第二加强后^ 检测 HI的抑制效价，当效价达到 1: 640后，取小鼠脾脏做融合。融合前 72hr再次加强免疫，经脾脏注射 RSV- A2林病毒液 1次， 50ul/只。制备 15块融合板。

融合： ^ k清中抗体中和 RSV GFP的反应滴度最高的小鼠脾脏细胞与小鼠骨髄瘤细胞 SP2/0相融合。先把脾脏研磨得到脾细胞悬液，然后与细胞数低十倍的处于对数生长期的 SP2/0小鼠骨髄瘤细胞混合，经 PEG1500作用 lmin将两种细胞融合一起，然后把融合细胞液 100ml分装到 10块 96孔板中培养。融合培养基为含 HAT和 20 % FBS的 RPMI1640完全筛选培养基。抗原特异性克隆通过间接 ELISA法和中和试验筛选，筛选有中和活性且无 post-F 反应性的单克隆抗体细胞林。经 3次克隆化后，得到稳定的单克隆抗体细胞林。杂交瘤的筛选：融合后细胞在 96孔细胞板上培养 10天后，吸取细胞上清做 RSV- post F酶联免疫法及 RSV- A2中和检测，酶联免疫法或 RSV- A2阳性孔继续克隆化，直至细胞林所分泌的抗体能够稳定阻断 RSV- A2且不与 post F反应为止。

筛选结果：获得一林杂交瘤细胞林 RSV-Y-5C4-2, 其所分泌的单克隆抗体 5C4与 post- F无反应性，且有较高的中和活性。

杂交瘤的培养：稳定的杂交瘤单克隆抗体细胞林先在二氧化碳培养箱中扩增培养，经 96孔转移至 24孔，再转移至 50ml细胞瓶经扩增培养。然后收集细胞瓶内的细胞注射到小鼠腹腔内， 7-10 天后从小鼠腹腔中吸取腹水。

单克隆抗体的纯化：腹水先用 50 %的硫酸铵沉淀处理，然后对 PB， pH7. 4透析，之后用 DEAE柱在 HPLC下纯化，得到纯化后的单克隆抗体，经 SDS- PAGE鉴定纯化后的单克隆抗体纯度。实施例 4. 单克隆抗体 5C4的表征

对 post- F的反应性的 ELISA检测

用 1XCB将 post- F稀释至 20ng八 ΟΟμί的浓度，包被于聚苯乙烯板的微孔中， ΙΟΟμί每孔， 37。C包被 2小时， PBST洗 1次。加入含 2% (质量 /体积比）的 BSA的 PBS 180μί封闭， 37。C孵育 2小时。将待检抗体稀释至 ^g/ml作为原始滴度加入 ΙΟΟμΙ 并且 10倍梯度稀释，用辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠 1: 5000稀释加入 ΙΟΟμί作为检测二抗， ELISA读值大于 0. 5为检测阳性。结果如图 1所示。图 1的结果显示， 5C4单抗与 post- F几乎无结合。相比于商业化抗体帕利珠单抗 ( al ivizumab, Synagis )和莫维珠单抗（Motavizumab ) ， 5C4抗体对 post- F无明显的反应性。中和活性的测定

将待检抗体稀释至 lOO g/ml作为原始滴度，加入 ΙΟΟμί于 U 底板中，并且 4倍梯度稀释。加入 lxl0⁶PFU的 75μί呼吸道合胞病毒悬液， 37。C孵育 1小时。而后将孵育后混合液 lOOul加入铺有 lOOul Hep2细胞的 96孔板上， 37。C孵育 24小时， Paradim检测其中和活性。结果如图 2所示。图 2的结果显示， 5C4单抗对呼吸道合胞病毒具有强中和活性。特别地，相比于商业化抗体帕利珠单抗( al ivizumab, Synagis )和莫维珠单抗 ( Motavizumab )，以及之前已报道的抗体 D25 (参见，美国专利申请 12/600， 950 ) 及）及 AM22 (参见，美国专利申请 12/898， 325 )， 5C4抗体对呼吸道合胞病毒的中和活性更强。结合抑制活性的检测

细胞准备：首先将 5 X 10⁴个八 ΟΟμί的 Hep2细胞铺在 96孔板的每个孔中，置于 37Ό孵育 2小时。随后将其置于 4Ό冷却 1 小时。

样品准备：将 lmg/ml的单抗样品 ΙΟμί加入到 90μί的 MEM 培养基中，随后使用 MEM培养基 4倍稀释 11个梯度。将 75μί病毒样品与 75 L稀释单抗样品混合， 25Ό孵育 1小时。随后冷却至 4Ό。将 ΙΟΟμί单抗-病毒混合物加入 Hep2细胞中， 4Ό共孵育 1小时。

样品检测：去除上清，加入预冷的 PBS ΙΟΟμΙ^ 洗细胞， 4Ό 1700G离心 5分钟。重复两次。 ^加入 ΙΟΟμί标记了 FITC的羊抗 RSV抗体 ( 1: 1000稀释，购买于 Biodes ign International公司）， 4Ό孵育 45分钟，去除上清，加入预冷的 PBSlOO L洗细胞， 4Ό 1700G离心 5分钟。去除上清后，每孔加入 150μί 0. 5% 多聚甲醛固定细胞。最后使用流式细胞仪进行检测。结果示于图

3中。融合抑制活性的检测

细胞准备：首先将 5 X 10⁴个八 ΟΟμί的 Hep2细胞铺在 96孔板的每个孔中，置于 37Ό孵育 2小时。随后将搬置于 4Ό冷却 1 小时。

样品准备：将 lmg/ml的单抗样品 ΙΟμί加入到 90μί的 MEM 培养基中，随后使用 MEM培养基 4倍稀释 11个梯度，置于 4Ό备用。随后使用 MEM培养基将 RSV-GFP稀释 8倍，将 50 RSV-GFP 加入到细胞中， 4Ό孵育 1小时。去除上清，加入预冷的 PBS ΙΟΟμί 洗细胞， 4Ό 1700G离心 5分钟。重复三次。然后将 50μί预冷的 MEM培养基加入细胞中，再将 5 Ομί稀释单抗样品加入细胞中，置于 4Ό孵育 lhr。随后将细胞转移至 37Ό孵育 18小时。

样品检测：去除上清，加入预冷的 PBS ΙΟΟμΙ^ 洗细胞， 4Ό 1700G离心 5分钟。重复两次。每孔加入 150μί 0. 5%多聚甲醛固定细胞。最后使用流式细胞仪进行检测。结果示于图 4中。结果显示，相比于商业化抗体帕利珠单抗（ pal ivizumab, Synagis ) 和莫维珠单抗（Motavizumab ) ，以及之前已报道的抗体 D2⁵ (参见，美国专利申请 1²/600， 9⁵0 )及）及 AM²² (参见，美国专利申请 12/898， 325 ) ， 5C4抗体的融合抑制活性更强。病毒捕获能力的检测

用 20mM PB, H 7. 4把单克隆抗体稀释至 3 g八 ΟΟμί的浓度，包被于聚苯乙烯板的微孔中， 300μί每孔， 4°C包被 10小时，而后 37。C包被 1小时， PBST洗 1次。加入含 2% ( w/v ) BSA的 PBS 350μί封闭， 37。C孵育 2 小时。而后加入病毒量为 lxl0⁶PFU的 200μί呼吸道合胞病毒悬液， 37°C孵育 2小时。孵育完的板洗板 5遍。洗完板后，每孔加入 200μί Tr izol 裂解， 4。C裂解 lOmin 后，提取样品中的呼吸道合胞病毒的 RNA, 进行 Real-t ime PCR 定量实验，结果如图 5所示。图 5的结果显示， 5C4单抗与呼吸道合胞病毒的结合具有很强的特异性。相比于商业化抗体帕利珠单抗 ( al ivizumab, Synagi s ) ， 5C4 抗体对呼吸道合胞病毒的捕获能力更强。

5C4单抗的反应性的 Western Blot检测

将煮沸和未煮沸的 pos t- F、 RSV-A2, RSV- GFP分别 lOul上样于 10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶，进行电泳，而后 35mA电流进行转膜 lh。转膜完毕后，加入 5%脱脂奶 4。C封闭过夜。 TNT洗膜 3次，每次 10min。再将 1: 2000稀释至 1XTN的待检抗体加入膜中，室温下摇床孵育 lh。 TNT洗膜 3次，每次 10min。加入 1: 5000稀释的用辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体作为检测 5C4的二抗，加入 1: 2000 稀释的用辣根过氧化物酶标记的鼠抗人抗体作为检测莫维珠单抗的二抗，室温下摇床孵育 lh。 TNT 洗膜 3 次，每次 10min。显色，拍照。结果如图 6所示。图 6的结果显示， 5C4单抗为识别构象表位的单抗，其识别非变性的 RSV- A2和 RSV- GFP, 而不识别变性的 RSV- A2和 RSV- GFP。此外， 5C4单抗能特异性识别 RSV- A2、 RSV- GFP, 但与 post- F基本上无反应性。免疫荧光的检测

细胞准备：将 1 X 10⁵个 /ml的 Hep2细胞加入铺有玻片的 24 孔板中， 37 Ό孵育 4小时，随后置于 4 Ό冷却 1小时。样品准备：去除细胞培养上清，加入预冷的 ΙΟΟμί RSV-A2 (使用 MEM培养基将 RSV-A2稀释 5倍），置于 4 Ό孵育 1小时后，去除上清，加入 lml MEM培养基。随后分别在 5分钟、 1小时、 6 小时、 16小时以及 24小时取样品进行检测。

样品检测：加入 lml预冷的 PBS, 置于摇床 5分钟，去上清，重复 2次。随后加入 ΙΟΟμί 0. 4%多聚甲醛，室温避光孵育 15分钟后，加入 lml PBS, 置于摇床 5分钟，去上清，重复 3次。再加入 ΙΟΟμί 0. 3% Tri tonX- 100，室温孵育 10分钟后，加入 lml PBS, 置于摇床 5分钟，去上清，重复 3次。随后加入 ΙΟΟμί山羊血清，室温孵育 30分钟后，加入 lml PBS, 置于摇床 5分钟，去上清，重复 3次。再加入 ΙΟΟμί单抗样品（使用 PBS稀幹 10倍），室温孵育 3小时后，加入 lml PBS, 置于摇床 5分钟，去上清，重复 3次。然后加入 ΙΟΟμί标记有 FITC的羊抗鼠多抗（ 1: 600，购买于 Sigma公司），室温避光孵育 30分钟后，加入 lml PBS, 置于摇床 5分钟，去上清，重复 3次。再然后，加入 ΙΟΟμί DAPI ( 1： 2000, 购买于 Invi trogen公司），室温避光孵育 5分钟后，加入 lml PBS, 置于摇床 5分钟，去上清，重复 3次。最后将玻片取出，置于加有封片剂的载玻片上，指甲油封片，使用激光扫描共聚焦显微镜进行观察。结果如图 7所示。图 7的结果显示， 5C4单抗可用于检测 RSV A2对细胞的感染。

5C4单抗重链和轻链的可变区 /CDR序列的确定

将分泌 5C4单抗的杂交瘤细胞林 RSV-Y-5C4-2扩增至 107ml，用吹管吹起半贴壁细胞使之悬浮。取 lml细胞悬浮液，以 1000 rpm 离心 5分钟，去上清。加入 lml PBS ( PH7. 44 )重悬并洗涤细胞，然后以 1000 rpm离心 5分钟，去上清，重复 3次。向细胞沉淀中加入 800μί TrizoK Roche Germany),剧烈震荡，然后静置 lOmin, 以裂解样品。然后加入 200μί DEPC 水，以补充水相。向样品中加入 250μί CHC1₃，剧烈震荡 lOsec, 然后以 12000rpm， 4°C, 离心 5 min。吸取上清水相 500- 600μί至新的 1.5ml EP管中，加入 600μί预冷异丙醇（异丙醇：上清体积比约为 1:1) ，轻柔颠倒混匀， 4。C 静置 lOmin, 然后以 4O12000rpm，离心 10min。吸去上清，留白色沉淀。向沉淀物中加入 700μί 75%乙醇，并以 4。C 12000rpm, 离心 5min。吸去上清，使用抽干仪抽干或烘干，直至白色沉淀变为透明状。向沉淀物中加入 20μί DEPC水以溶解 mR A, 将其分装成两管。每管加入 lul反转录引物，其中一管加入的反转录引物为 MVkR (5'- ACT ggA Tgg Tgg gAA gAT ggA-3' ) ，用于扩增轻链可变区基因；另一管加入的反转录引物为 MVhR (5'-CCA ggg RCC ARK ggA TAR CAN gRT gg-3' ) ，用于扩增重链可变区基因。然后，向每管中再加入 luldNTP, 置于 72Ό水浴 lOmin, 然后立即放到水浴中置 5 min，然后加入 10ul 5x反转录緩冲液， lul AMV (10u/ul, Pormega) ， lul Rnasin (40u/ul,Promega)_e 将混合物混匀后于 42 Ό进行逆转录反应，以将 RNA反转录成 cDNA。抗体基因可变区的分离采用聚合 ϋ¼式反应 (PCR) 法。合成重链可变区上游引物组合（表 2) ，轻链可变区上游引物组合（表 3)。另外，将 MVkR用作轻链可变区基因扩增的下游引物，将 MVhR 用作重链可变区基因扩增的下游引物。 PCR模板即为以上合成的两种 cDNA。 PCR^H 为： 94Ό 5min; (94Ό 40s， 53Ό lmin, 72Ό 50s)x35个循环； IVC 15min。回收扩增产物，并克隆至 pMD 18-T 载体中，然后送至上海博亚公司进行测序。抗体的可变区序列和 CDR 序列如表 4-5所示，其中互补决定区 ( complementary determinant region, CDR )序列通过 Kabat方法来确定 (Kabat EA, Wu TT, Perry HM, Gottesman KS， Coel ler K. Sequences of proteins of immunological interest, U. S Department of Health and Human Services, PHS, NIH, Bethesda, 1991)。

表 2: 扩增单抗重链可变区基因的上游引物序列

表 3: 扩增单抗轻链可变区基因的上游引物序列

MVkF-Fl 5 '-ATgAKgTHCYCgCTCAgYTYCTRg- 3 '

MVkF-F2 5 '-ATggTRTCC CASCTCAgTTCCTTg- 3，

MVkF-F3 5 '-ATgTATATATgTTTgTTgTCTATTTCT- 3 '

MVkF-F4 5'-ATgAAgTTgCCTgTTAggCTgTTggTgCT-3'

MVkF-Gl 5 '-ATggATTT CARgTgCAgATT TCAgCTT-3 '

MVkF-G2 5 '-ATggTYCTYATVTCCTTgCTgTTCTgg- 3'

MVkF-G3 5 '-ATggTYCTYATVTTRCTgCTgCTATgg- 3' 表 4: 单克隆抗体的重链和轻链可变区的核苷酸和 ^ 列

表 5: 通过 Kabat方法确定的单克隆抗体 CDR序列

J ^列序列号

CDR1 GFNIKDTF SEQ ID NO: 20 重链 (Vh) CDR2 IDPADGHT SEQ ID NO: 21

CDR3 ATTITAVVPTPYNAMDY SEQ ID NO: 22

CDR1 ESVDSFDNSF SEQ ID NO: 23 轻链 ( Vk ) CDR2 LAS SEQ ID NO: 24

CDR3 QQSNEDPFT SEQ ID NO: 25

V K是指 kappa链可变区，其是轻链可变区（VL ) 的一种, 实施例 5. 5C4单抗与其他单抗的竟争性结合分析

在 RSV感染的 HEp- 2细胞上进行抗体的竟争性结合， HEp-2 细胞用 3倍感染量的 RSV感染 18到 20小时，感染后采用细胞离散方法（细胞剥离器、 Mediatech Inc. , Herndon, VA )进行细胞分离，然后用 PBS洗细胞。最后细胞在 U型底部的 96孔板中以每孔 5 x 10⁴的细胞量溶于 PBS中进行孵育。单克隆抗体 5C4、 AM22, D25和 101F (参见 McLel lan等（ 2010 )， J Vriol , 84: 12236-12244) 均以起始的稀释浓度为 lOO g/ml 的量加入 HEp- 2细胞中。半个小时后，加入 lOOul Alexa 488与浓度为 1 g/ml D25的结合物，在 4°C孵育 1小时。孵育完的细胞第一遍用 PBS洗，然后用 0. 5% 的多聚甲酪进行填充， D25与 Alexa 488在细胞上结合后产物通过流式细胞仪检测 ( LSR II instrument, Becton Dickinson, San Jose, CA )，检测的数据采用 FlowJo软件8· 5版本（Tree Star， San Carlos, CA)进行分析。结果如图 8所示。图 8的结果显示， AM22、 D25与 5C4之间存在竟争结合， 5C4对 AM22、 D25结合的阻断率最高可达 99%。这表明 5C4单抗与 AM22、 D25单抗识别抗原（ F蛋白 ) 上的相同表位。实施例 6. 抗原-抗体复合物的分析

抗原-抗体复合物的制备

RSV F蛋白来源于 RSV A2亚型的病毒林 P03420, 它包含了 3 个自然发生的氨基酸突变（P102A, I379V和 M447V)。将经过哺乳动物密码子优化的 RSV F蛋白 1-513位氨基酸与 T4噬菌体的次要纤维蛋白 Fibri tin的 C末端融合，并构建到哺乳动物细胞表达载体 pLEXm上，该质粒同时带上了凝血酶位点、 His标签与链球菌素标签。将表达 RSV F蛋白、 D25抗体的轻链和重链（在铰链区含有或不含有种子密码子）的质粒同时转染悬浮的 HEK293 GnTI 细胞，或者先只转染表达 RSV F蛋白的质粒，在转染后 3小时，将之前纯化好的 D25抗体的 Fab加入 GnTI细胞。经过 4-5天的表达，收集细胞上清、离心分离，过滤并浓缩。所获得的细胞上清首先通过 Ni柱（Qiagen, Valencia, CA)纯化，洗脱液为 20mM的 Tris-HCl pH7. 5, 200mM NaCl , 250 mM咪唑， pH 8. 0。之后，产物经过浓缩后，再按照制造商的说明书（Novagen, Darmstadt, Germany)用亲和素树脂柱进行纯化。经过凝血酶蛋白酶的过夜处理以去除 His和链霉素标签后，加入过量的 D25抗体 Fab与复合物混合，然后经过 Superose6 凝胶过滤柱（GE Healthcare) , 穿透液为 2 mM Tris-HCl H 7. 5， 350 mM NaCl, and 0. 02% NaN ₃。洗脱下来的复合物用等体积的水稀释后浓缩至大约 5mg/ml。同样的方法用来表达和纯化 AM22/F蛋白或者 5C4/F蛋白的抗原 -抗体复合物。复合物的电子显微镜检测

样品被新排出的碳涂层的网格辉光吸收，短暂地用水冲洗，然后用新配制的 0. 75%的铀酰甲酸盐染色。图像通过带有 Eagle CCD相机的 FEI T20显微镜采集。图像分析及二维平均采用 Bsoft ( J. Struct. Biol. 157， 3 (2007) )及 EMAN (J. Struct. Biol. 128, 82 (1999) )来进行。结果示于图 9中。结果显示， AM22/F蛋白、 5C4/F蛋白与 D25/F蛋白抗原-抗体复合物具有相同的结构。这表明， AM22单抗、 5C4单抗与 D25单抗结合 F蛋白上的相同表位，并且结合相同构象的 F蛋白（pre- F构象）。

进一步，比较了帕利珠单抗 /F蛋白与 5C4/F蛋白抗原-抗体复合物的电子显微镜结果。结果示于图 10中，其中左图为 post-F 与帕利珠单抗的复合物的电子显微镜结果；左下图显示，左上图的白框区域中的 post- F 在电镜下观察到的结构；右图为 pre-F 与 5C4的复合物的电子显微镜结果，图中白框区域为 pre- F在电镜下观察到的结构。结果显示，帕利珠单抗 /F蛋白与 5C4/F蛋白抗原-抗体复合物具有显著不同的结构，并且这 2种抗原抗体复合物中的 F蛋白的构象也显著不同，其中帕利珠单抗 /F蛋白复合物中的 F蛋白为 post- F构象，而 5C4/F蛋白复合物中的 F蛋白为 pre-F构象。

图 9和 10的结果表明， F蛋白中的该表位以及识别该表位的抗体对于稳定和维持 F蛋白的 pre- F构象具有重要作用。复合物的结晶

起始晶体通过气象扩散法培养， 20Ό下将复合物与 O. lul保存溶液（40% (w/v) PEG 400， 5% (w/v) PEG 3350, 和 0· 1 M醋酸钠， H 5. 5)混合（54 ) 。晶体在悬滴中再生长， 3. 6A衍射的晶体生长于含有 30% (w/v) PEG 400， 3. 75% (w/v) PEG 3350， 0. 1 M HEPES pH 7. 5, 和 1% (v/v) 1， 2-丁二醇的保存液中。在液氮中将晶体直接冻住，在 SER- CAT光束线 ID- 22，波长 1. 00A下得到 X射线衍射数据。复合物晶体的衍射及解构

通过 HKL200 ( Z. Otwinowski, W. Minor, in Methods Enzymol. (Academic Press, 1997)， vol. 276, pp. 307—326 )整合、梳理 X 射线衍射数据，通过 PHASER ( A. J. McCoy et al. , Phaser crystal lographic sof tware. J. Appl. Crystallogr. 40， 658 (2007) )解决分子替换问题，使用伸展的 D25 Fab结构和来源于 RSV F蛋白的 post- F结构（PDB ID: 3RRR, ( J. Virol. , 85， 7788 (2011) ) )的 29—42， 49-60, 78-98, 219-306, 313-322, 333-343 和 376-459片段作为探究模型。通过一个 NaAuC14衍生物的 6个位点定位得到活性侧链（F 残基 Met97/Hisl59, Met264/Met274, His317, 和 Met396; D25重链残基 Metl9/His81和 His 58)。通 it C00T( Acta Crys tal logr D Biol Crys tal logr, 66, 486 (2010) ) 建立了手工模型，建立过程中首先建立了二级结构元素。通过 PHENIX ( Acta Crys tal logr D Biol Crys tal logr 66, 213 (2010) ) 进行了单个位点、 TLS参数以及单个 B因素的确定，在精确过程中应用伸展的 D25 Fab 结构以及 RSV F pos t- F结构作为参照模型。除了 F2 C端至 Met97的残基外，建立了成熟蛋白中的所有 RSV F残基。最后的数据整理和精确统计概括于表 6 中。复合物的晶体结构示于图 11-13中。

表 6. 晶体结构相关数据

D25 Fab D25 Fab + RSV F

PDB ID 4JHA 4JHW

Data collection

Space group P6122 P213

Cell constants

108.7, 108.7, 152.3, 152.3, a, b, c (A)

139.9 152.3

α, β, γ(。） 90.0, 90.0, 120.0 90.0, 90.0, 90.0

Wavelength (A) 1.00 1.00

50.0-1.6 50.0-3.6

Resolution (A)

(1.63-1.60) (3.73-3.60)

Rmerge 11.2 (68.0) 12.7 (81.4)

I/SI 27.3 (2.1) 16.4 (2.0)

Completeness (%) 98.3 (86.1) 99.6 (99.3)

Redundancy 11.0 (5.3) 6.5 (5.2)

Refinement

35.4-1.6 42.2-3.6

Resolution (A)

(1.62-1.60) (3.88-3.60)

No. reflections 63,360 (2,241) 13,877 (2,742)

Rwork/Rfree (%) 24.1/25.5 21.3/26.7

No. atoms

Protein 3,305 6,778

Ligand/ion 0 0

Water 270 0 β-factors

Protein 53.0 128.1

Ligand/ion

Water 44.1

R.m.s. deviations

Bond lengths (A) 0.007 0.003

Bond angles (°) 1.20 0.91

Ramachandran

Favored (%) 96.5 92.0

Allowed (%) 3.0 7.3

Outliers (%) 0.5 0.7 另外，还使用相同方法分析了 pre- F蛋白的单体和三聚体以及 pos t- F蛋白的单体和三聚体的晶体结构。结果示于图 14中。结果显示， pre- F蛋白与 pos t- F蛋白具有显著不同的空间结构（构象）。复合物晶体的衍射及解构的结果显示， D25 单抗识别的表位位于 RSV F蛋白的远膜端的头部，其中， D25的重链结合一个单体，轻链结合与该单体相邻的另一个单体（如图 11- 12所示）。

D25抗体自身 6个 CDR区中的 5个与 RSV F蛋白相结合，其中重链的 CDR3与 F蛋白第 4号 α螺旋（由 F蛋白的第 196-209位 ^ 酸残基构成缃结合，并且结合第 2号 p折叠（由 F蛋白的第 38-60 位氨基酸残基构成）与第 1号 α螺旋（由 F蛋白的第 74-96位氨基酸残基构成）之间的环形结构（由 F蛋白的第 62- 72位氨基酸残基构成）。虽然 D25结合的表位在 pre- F蛋白与 pos t- F蛋白中的二级结构变化不大，但在三级结构上变化显著：第 4号 α螺旋反生 180° 转向并且远离第 2号 p折叠（如图 13所示）。 D25结合的表位的三级结构的变化揭示了，为什么 D25抗体仅结合 pre-F 蛋白，而不结合 post- F蛋白，并且解释了， D25抗体为什么能稳定 pre- F蛋白的结构并由此中和 RSV。

根据图 11-13以及表 2的结果可以确定， D25单抗所识别的 F 蛋白表位由呼吸道合胞病毒融合蛋白的第 148- 216位 ^酸残基或其片段组成，且至少包含呼吸道合胞病毒融合蛋白的第 196-209 位氨基酸残基。此外，还发现，呼吸道合胞病毒融合蛋白的第 62-69位或第 62-76位氨基酸残基对 D25单抗 /F蛋白的特异性结合具有促进作用。通过类似的方法可以确定， AM22单抗和 5C4单抗同样识别 F蛋白的上述表位。

上述结果还显示于图 15中。图 15显示了 pre- F蛋白和 post-F 蛋白的空间结构，构成所述空间结构的对应氨基酸序列，以及 D25 所识别的表位序列。图 15的结果显示， pre- F蛋白和 post- F蛋白的空间结构存在着显著的差异。特别地， pre- F蛋白的空间结构包括 αΐ- αΐθ螺旋和 PI- P23折叠；而 post- F蛋白的空间结构包括 αΐ螺旋， α5— α8螺旋， αΐθ螺旋， βΐ— β2折叠和 β5— P21折叠。

此外，图 15的结果还显示， D25单克隆抗体在 pre- F蛋白中的核心识别表位为两个空间上相互接近的肽段，即， a. a. 62-69 与 a.a. 196-209。这两个肽段的相互作用界面表明， F蛋白中的两个区段（ a. a.62- 76 与 a. a.137- 216 (或更具体地， a. a.148-216 ) )或其片段对于这类抗体 (例如，本发明的抗体（例如 5C4 )， D25和 AM22 )识别并稳定 pre- F蛋白具有重要的作用，其中 a. a.176-181与 a. a.185-194这两个区域在 F蛋白的 pre-F 构象及 ost-F构象之间存在显著的转变：它们在 pre- F蛋白中的构象为 P折叠（ P3- P4折叠），而在 post- F蛋白中的构象为 α 螺旋（包含在 5螺旋中 )。这些结果表明， D25单抗、 AM22单抗和 5C4单抗识别 F蛋白上的相同表位，并且通过与该表位的相互作用，稳定和维持了 F 蛋白的 pre- F构象。本发明所发现的 F蛋白的新表位，以及识别该表位的抗体可用于稳定 F蛋白的 pre- F构象。

此外，上文的结果显示，识别该表位的抗体均具有强中和活性。这表明， F蛋白的 pre- F构象和该新表位对于诱导强机体免疫应答具有重要作用；并且，识别该新表位的抗体可用于有效预防和治疗 RSV感染和与 RSV感染相关的疾病。尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人员将理解：根据已经公开的所有教导，可以对细节进行各种修改和变动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims

权利要求

1. 一种单克隆抗体及其抗原结合片段，其中，所述单克隆抗体能够特异性结合呼吸道合胞病毒融合蛋白的第 148- 216位氨基酸残基或其片段（例如呼吸道合胞病毒融合蛋白的第 196- 209位氨基酸残基），和 /或，呼吸道合胞病毒融合蛋白的第 62- 69位或第 62-76位氨基酸残基，

优选地，所述的单克隆抗体包含下列 CDR: 1 )如 SEQ ID NO: 20 所示的重链 CDR1; 2 )如 SEQ ID NO: 21所示的重链 CDR2; 3 )如 SEQ ID NO: 22所示的重链 CDR3; 4 )如 SEQ ID NO: 23所示的轻链 CDR1; 5 )如 SEQ ID NO: 24所示的轻链 CDR2;和， 6 )如 SEQ ID NO: 25 所示的轻链 CDR3;

优选地，所述的单克隆抗体包含 a )如 SEQ ID NO: 17所示的重链可变区；和， b )如 SEQ ID NO: 19所示的轻链可变区；

优选地，所述单克隆抗体或其抗原结合片段选自 Fab、 Fab' , F (ab, ) ₂、 Fd、 Fv、 dAb、互补决定区片段、单链抗体（例如， scFv)、小鼠抗体、兔抗体、人源化抗体、全人抗体、嵌合抗体（例如，人鼠嵌合抗体 )或欢特异或多特异抗体；

优选地，所述的单克隆抗体包括非- CDR 区，且所述非- CDR 区来自不是鼠类的物种，例如来自人抗体；

优选地，所述的单克隆抗体特异性结合呼吸道合胞病毒，且对所述病毒具有中和活性；

优选地，所述的单克隆抗体不结合或基本上不结合 post-F 蛋白，而是结合并稳定 pre- F蛋白；

优选地，所述的单克隆抗体衍生自下述单克隆抗体，或是下述单克隆抗体：杂交瘤细胞林 5C4所产生的单克隆抗体，其中，杂交瘤细胞林 5C4保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC)，且具有保藏号 CCTCC NO: C2012147o
2. 一种分离的核酸分子，其编码权利要求 1的单克隆抗体或其抗原结合片段。
3. 一种分离的核酸分子，其包含能够编码权利要求 1的单克隆抗体的重链可变区的核酸序列。
4. 一种分离的核酸分子，其包含能够编码权利要求 1的单克隆抗体的轻链可变区的核酸序列。
5. 一种载体，其包含权利要求 2-4任一项的分离的核酸分子。
6. 一种宿主细胞，其包含权利要求 2-4任一项的分离的核酸分子或权利要求 5的载体。
7. 一种杂交瘤细胞林 5C4, 其保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC) , 且具有保藏号 CCTCC NO: C2012147<sub>e</sub>
8. 稳定 pre- F蛋白的方法，其包括使用权利要求 1的单克隆抗体或其抗原结合片段，或者 D25或 AM22单克隆抗体或其抗原结合片段。
9. 权利要求 1 的单克隆抗体或其抗原结合片段或者 D25 或 AM22单克隆抗体或其抗原结合片段在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于稳定 pre- F蛋白，或检测 pre- F蛋白在样品中的存在或其水平，或用于诊断受试者是否感染了 RSV。
10. 一种试剂盒，其包括权利要求 1的单克隆抗体或其抗原结合片段。
11. 一种药物组合物，其包含权利要求 1的单克隆抗体或其抗原结合片段，以及药学上可接受的载体和 /或赋形剂。
12. 权利要求 1的单克隆抗体或其抗原结合片段在制备药物组合物中的用途，所述药物组合物用于预防或治疗受试者的 RSV感染或与 RSV感染相关的疾病（例如肺炎，如小儿肺炎）。
13. 表达 pre- F蛋白或抗原-抗体复合物的方法，其包括，在细胞中共表达编码权利要求 1的单克隆抗体或其抗原结合片段或者 D25或 AM22单克隆抗体或其抗原结合片段的核酸，以及编码 F 蛋白的核酸。
14. 一种试剂盒，其包含编码权利要求 1的单克隆抗体或其抗原结合片段或者 D25或 AM22单克隆抗体或其抗原结合片段的核酸，以及编码 F蛋白的核酸。
15. 一种分离的表位肽或其变体，其中，所述表位肽由呼吸道合胞病毒融合蛋白的第 148- 216位 ^酸残基或其片段组成，且至少包含呼吸道合胞病毒融合蛋白的第 196-209位 ^酸残基，并且所述变体与其所源自的表位肽相异仅在于 1个或几个（例如， 1个， 2个， 3个， 4个， 5个， 6个， 7个， 8个或 9个）氨基酸残基的保守置换，且保留了其所源自的表位肽的生物学功能；例如，所述表位肽由呼吸道合胞病毒融合蛋白的第 196-209 位氨基酸残基组成，并且所述变体与其所源自的表位肽相异仅在于 1个或几个（例如， 1个， 2个， 3个或 4个）氨基酸残基的保守置换，且保留了其所源自的表位肽的生物学功能；

例如，所述表位肽由呼吸道合胞病毒融合蛋白的第 196-216 位氨基酸残基组成，且所述变体与其所源自的表位肽相异仅在于 1个或几个（例如， 1个， 2个， 3个， 4个， 5个， 6个， 7个， 8 个或 9个）氨基酸残基的保守置换，且保留了其所源自的表位肽的生物学功能；

例如，所述表位肽由呼吸道合胞病毒融合蛋白的第 185-216 位氨基酸残基组成，且所述变体与其所源自的表位肽相异仅在于 1个或几个（例如， 1个， 2个， 3个， 4个， 5个， 6个， 7个， 8 个或 9个）氨基酸残基的保守置换，且保留了其所源自的表位肽的生物学功能；

例如，所述表位肽由呼吸道合胞病毒融合蛋白的第 185-216 位 ^酸组成，其中第 185-194位 ^酸在蛋白质 2级结构上形成 P折叠，且所述变体与其所源自的表位肽相异仅在于 1个或几个（例如， 1个， 2个， 3个， 4个， 5个， 6个， 7个， 8个或 9个）氨基酸残基的保守置换，且保留了其所源自的表位肽的生物学功能；

例如，所述表位肽由呼吸道合胞病毒融合蛋白的第 176-216 位氨基酸残基组成，且所述变体与其所源自的表位肽相异仅在于 1个或几个（例如， 1个， 2个， 3个， 4个， 5个， 6个， 7个， 8 个， 9 个）氨基酸残基的保守置换，且保留了其所源自的表位肽的生物学功能；

例如，所述表位肽由呼吸道合胞病毒融合蛋白的第 176-216 位氨基酸残基组成，其中第 176- 181位氨基酸与第 185- 194位氨基酸在蛋白质 2级结构上形成 p折叠，且所述变体与其所源自的表位肽相异仅在于 1个或几个（例如， 1个， 2个， 3个， 4个， 5 个， 6个， 7个， 8个， 9个）氨基酸残基的保守置换，且保留了其所源自的表位肽的生物学功能；

例如，所述表位肽由呼吸道合胞病毒融合蛋白的第 148-216 位氨基酸残基组成，且所述变体与其所源自的表位肽相异仅在于 1个或几个（例如， 1个， 2个， 3个， 4个， 5个， 6个， 7个， 8 个， 9 个）氨基酸残基的保守置换，且保留了其所源自的表位肽的生物学功能；

例如，所述表位肽由呼吸道合胞病毒融合蛋白的第 148-216 位氨基酸残基组成，其中第 176- 181位氨基酸与第 185- 194位氨基酸在蛋白质 2级结构上形成 p折叠，且所述变体与其所源自的表位肽相异仅在于 1个或几个（例如， 1个， 2个， 3个， 4个， 5 个， 6个， 7个， 8个， 9个）氨基酸残基的保守置换，且保留了其所源自的表位肽的生物学功能。
16. 一种分离的表位肽或其变体，其由第一肽和第二肽构成，其中第一肽由呼吸道合胞病毒融合蛋白的第 148- 216位氨基酸残基或其片段组成且至少包含呼吸道合胞病毒融合蛋白的第 196-209 位氨基酸残基，并且第二肽由呼吸道合胞病毒融合蛋白的第 62- 69位或第 62- 76位氨基酸组成，其中所述变体与其所源自的表位 J f目异仅在于 1个或几个（例如， 1个， 2个， 3个， 4 个， 5个， 6个， 7个， 8个， 9个）氨基酸残基的保守置换，且保留了其所源自的表位肽的生物学功能；

优选地，所述第一肽与第二肽共同构成了存在于 RSV融合蛋白的 pre- F构象中的空间结构；

例如，所述第一肽由呼吸道合胞病毒融合蛋白的第 196-209 位 ^酸组成；

例如，所述第一肽由呼吸道合胞病毒融合蛋白的第 196-216 位 ^酸组成；

例如，所述第一肽由呼吸道合胞病毒融合蛋白的第 185-216 位 ^酸组成；

例如，所述第一肽由呼吸道合胞病毒融合蛋白的第 185-216 位 ^酸组成，其中第 185-194位 ^酸在蛋白质 2级结构上形成 P折叠；

例如，所述第一肽由呼吸道合胞病毒融合蛋白的第 176-216 位 ^酸组成；

例如，所述第一肽由呼吸道合胞病毒融合蛋白的第 176-216 位氨基酸残基组成，其中第 176- 181位氨基酸与第 185- 194位氨基酸在蛋白质 2级结构上形成 p折叠；

例如，所述第一肽由呼吸道合胞病毒融合蛋白的第 148-216 位 ^酸组成；

例如，所述第一肽由呼吸道合胞病毒融合蛋白的第 148-216 位氨基酸残基组成，其中第 176- 181位氨基酸与第 185- 194位氨基酸在蛋白质 2级结构上形成 p折叠。
17. 一种重组蛋白，其包含权利要求 15或 16的分离的表位肽或其变体以及载体蛋白，并且所述重组蛋白不是天然存在的蛋白或其片段.
18. 一种分离的核酸分子，其包含编码权利要求 15或 16的表位肽或其变体或权利要求 17的重组蛋白的核苷酸序列。
19. 一种载体，其包含权利要求 18的分离的核酸分子。
20. 一种宿主细胞，其包含权利要求 18 的分离的核酸分子或权利要求 19的载体。
21. 一种蛋白疫苗，其包含权利要求 15或 16的表位肽或其变体或权利要求 17的重组蛋白，以及药学上可接受的载体和 /或赋形剂（例如佐剂）。
22. 一种基因疫苗，其包含权利要求 18 的分离的核酸分子或权利要求 19的载体，以及药学上可接受的载体和 /或赋形剂（例如佐剂）。
23. 制备能够特异性结合并中和呼吸道合胞病毒并且稳定和维持 F蛋白的 pre- F构象的抗体的方法，其包括：

1 )用权利要求 15或 16的表位肽或其变体或权利要求 17的重组蛋白免疫非人动物（例如小鼠），以使所述动物产生抗体；和

2 ) 筛选对呼吸道合胞病毒具有中和活性且与 pos t- F蛋白不具有反应性的抗体。
24. 能够特异性结合并中和呼吸道合胞病毒并且稳定和维持 F 蛋白的 pre- F构象的抗体或其抗原结合片段，其通过权利要求 23 的方法制备获得。
25. 权利要求 15或 16的表位肽或其变体或权利要求 17的重组蛋白在制备蛋白疫苗中的用途，所述蛋白疫苗用于预防、治疗或抑制受试者的 RSV感染或与 RSV感染相关的疾病（例如肺炎，如小儿肺炎）。
26. 权利要求 18的分离的核酸分子或权利要求 19的载体在制备基因疫苗中的用途，所述基因疫苗用于预防、治疗或抑制受试者的 RSV感染或与 RSV感染相关的疾病（例如肺炎，如小儿肺炎）。