CN105664248B - 一种基于压电喷印方式的蛋白质支架制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提出一种基于压电喷印方式的蛋白质支架制备方法，涉及细胞由患者自身组织干细胞培养而来，两种蛋白质支架溶液由患体血纤蛋白和热休克蛋白配置而成。本发明压电式喷墨打印技术，根据模型依次打印热休克蛋白层、血纤蛋白层，随后使用发热灯管照射血纤蛋白使变性形成凝固的蛋白质支架，再打印细胞在该支架上，如此往复，蛋白层和细胞层交替打印，最终形成具有一定三维结构的生物支架。本发明所用的细胞和蛋白均来源于患体，排斥小，高温使血纤蛋白变性为物理变性，不影响血纤蛋白为细胞生长提供营养物质，同时热休克蛋白层保护细胞层不受发热灯管的高温伤害，通过设定从底层开发的压电喷头驱动参数高效率地打印出高分子的蛋白质溶液和细胞液。

Description

一种基于压电喷印方式的蛋白质支架制备方法

技术领域

本发明涉及一种用于细胞三维成型的生物支架的构建方法，尤其是一种基于压电喷印方式的蛋白质支架制备方法。

背景技术

3D打印技术是目前全球最尖端的技术之一，随着3D打印技术的普及和交叉学科的不断融合，该技术在生物制造领域中的应用获得更大发展。在医疗方面，3D打印的生产模式会改变医师现有的治疗流程，技术的持续创新和应用的逐渐拓广可为临床医师提供广阔的应用前景。生物三维打印是以生物材料或活细胞进行三维打印，以构建复杂生物三维结构，如个性化植入体、可再生人工骨、体外细胞三维结构体、人工器官等。

有关器官打印技术的研究引起广泛的关注，其原因在于该领域具有明显的学科交叉与渗透融合的特点，它处于生命科学与快速成型技术、生物制造技术、生物科学和材料科学的交汇点，它为组织工程学突破二维研究的局限性,在三维尺度上精确控制与人体组织或器官相似的三维构造体方面的研究提供了一种新的思路。

近年来，细胞打印的可行性被不断地验证，新的打印方法被不断提出，常见的打印方式有，喷墨细胞打印技术、喷射细胞打印技术、激光细胞打印技术、声控细胞打印技术等，打印方式各有优劣。压电式的打印方法有其独特的优势，效率高和分辨率高，但难打印高粘度液体和易堵塞是其最大不足。

随着科学发展，科学研究着眼于细胞成活率，细胞在打印过程中的损伤，高效可控的打印方法，三维堆砌方法等研究上。其中细胞的三维堆砌通常用水凝胶作为生物支架，将细胞液混合在水凝胶中打印或两者分开打印，最终形成具有立体结构的打印体。水凝胶具有高分子网络体系，性质柔软，能保持一定的形状，多孔，可以储存大量营养物质，是培养细胞较为理想的支架；但非蛋白基水凝胶的制备工艺十分复杂，工艺稳定性差。

发明内容

为解决现有技术的问题，本发明提出了一种基于压电喷印方式的蛋白质支架制备方法。该方法中，通过设置打印频率和每个脉冲中驱动电压有效时间和驱动电压来打印大分子的细胞液和蛋白质溶液；采用取自患体自身的蛋白质固化后作为支架，既解决了异体排斥问题，蛋白质支架更有利于细胞生长繁殖，可以被细胞吸收，也解决了复杂的制备问题，可以通过打印的方式将细胞液和蛋白液依次打印到载体上。

已有大量的研究和实验证明高温可以使蛋白质变性凝固，基于此原理，本方法使用压电喷头将蛋白液和细胞液依次打印，解决了低效率的蛋白质层覆盖和细胞种植问题；其次本方法使用了耐70度高温以上的热休克蛋白层保护细胞内的蛋白质不受影响，并控制发热灯管照射的时间使血纤蛋白层固化而热休克蛋白层受较小影响或不受影响。

本方法通过提取患体自身的血纤蛋白和热休克蛋白，利用参数定制的压电喷头打印出两层蛋白层，用发热灯管照射使表层血纤蛋白变性固化形成支架，然后在支架上打印细胞层，如上细胞层与蛋白层交替打印，从而形成具有一定立体结构的生物支架。

具体的技术方案为：

所述一种基于压电喷印方式的蛋白质支架制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

步骤1：获取患者自身的待打印细胞，对待打印细胞培养并诱导分化，制成细胞打印液；获取患者自身的血纤蛋白和热休克蛋白，将血纤蛋白加入培养液中制备血纤蛋白溶液，将热休克蛋白加入培养液中制备热休克蛋白溶液；

步骤2：将细胞打印液、血纤蛋白溶液和热休克蛋白溶液分别装入生物3D打印设备的对应储液腔中，每个储液腔都连接对应的压电喷头；所述生物3D打印设备的控制系统内存储有待打印的患者组织3D模型的分层模型；

步骤3：调整三个喷头的喷孔与载玻片的初始距离为5mm，喷孔直径为50μm，喷头驱动电压均为28-35v，频率为2-4khz，喷头喷印速度为5.0m/s；

步骤4：生物3D打印设备根据步骤2所述的分层模型，使用连接热休克蛋白溶液储液腔的喷头在载玻片上打印一层热休克蛋白层，喷头移动速度为0.015m/s，热休克蛋白层厚度为25um-35um；

步骤5：生物3D打印设备根据步骤2所述的分层模型，使用连接血纤蛋白溶液储液腔的喷头在热休克蛋白层上打印一层血纤蛋白层，喷头移动速度为0.015m/s，血纤蛋白层厚度为25um-35um；

步骤6：使用发热灯管距离血纤蛋白层50mm处照射血纤蛋白层10秒，随后冷却20-30s；

步骤7：生物3D打印设备根据步骤2所述的分层模型，使用连接细胞打印液储液腔的喷头在血纤蛋白层上打印细胞液，再等待20-30s；

步骤8：重复步骤4～步骤7，直至得到与待打印的患者组织3D模型一致的蛋白支架。

进一步的优选方案，所述一种基于压电喷印方式的蛋白质支架制备方法，其特征在于：步骤1中的细胞打印液浓度不低于104cells/ml，血纤蛋白溶液浓度为12mg/ml，热休克蛋白溶液浓度为20mg/ml。

进一步的优选方案，所述一种基于压电喷印方式的蛋白质支架制备方法，其特征在于：所述压电喷头型号为赛尔Xaar128。

有益效果

与现有技术相比，本发明具有显著优点：

(1)本发明利用压电式的喷头打印，可以高效率地按照导入模型打印蛋白液和细胞液，精确得到定点打印细胞的生物支架。

(2)本发明使用的蛋白支架原料来自患体自身，极小排斥，可降解为细胞培养提供营养物质。

(3)本发明使用的支架固化方法为热变性，利用耐热的热休克蛋白层保护细胞层，可以短时间内使支架层蛋白质变性固化而不伤害底下的细胞层。

(4)本发明通过设置压电喷头驱动频率、驱动电压、单个脉冲有效驱动电压时间的方法来打印含大分子物质的细胞液和蛋白液。

附图说明

图1为生物压电打印成型机的工作示意图。

图中：1打印平台，2压电喷头组，3储液腔组，4生物支架，5发热灯管，6打印热休克蛋白的喷头，7打印血纤蛋白的喷头，8打印细胞的喷头，9装热休克蛋白的储液腔，10装血纤蛋白的储液腔，11装细胞的储液腔，12细胞层，13血纤蛋白层，14热休克蛋白层，15喷头移动支架，16升降平台。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

本发明的目的在于提出一种基于压电喷印方式的蛋白质支架制备方法，为细胞打印或器官打印提供一种新的生物支架制备方法。该方法中待打印细胞、热休克蛋白及血纤蛋白均取自患体；利用底层设定的压电打印方式打印一层热休克蛋白层，一层血纤蛋白层，经过发热灯管照射后，使血纤蛋白变性形成固化的蛋白质支架，而热休克蛋白层不受影响；然后在蛋白质支架上精确定点地打印指定细胞；如此往复打印细胞层与蛋白层，最后形成具有一定三维结构的生物支架。

本实施例以皮肤损伤患者为对象，在对伤患处进行CT扫描后，通过修补和重构，建立待打印的患者组织3D模型，再对3D模型进行逐层分离解析，得到生物3D打印设备能够识别的分层模型。

具体步骤如下：

步骤1：获取患者自身的待打印细胞，对待打印细胞培养并诱导分化，制成细胞打印液；获取患者自身的血纤蛋白和热休克蛋白，将血纤蛋白加入培养液中制备血纤蛋白溶液，将热休克蛋白加入培养液中制备热休克蛋白溶液。

本实施例中制备皮肤干细胞液的过程为：

①取患体包皮皮肤一小块，然后将皮肤组织剪碎，用含2000u/L青霉素、200mg/L链霉素及2.5mg/L两性霉素B的无钙镁离子PBS液反复冲洗3次；②将冲洗干净的皮片组织置于0.25％中性蛋白酶Ⅱ中消化20min，再置于0.25％胰蛋白酶和0.02％EDTA中，37℃消化30min，200目金属网过滤，收获细胞悬液，1000r/min离心5～10min，再用无钙镁的Hanks液洗涤离心2次；③将消化洗涤后的细胞加入含有15％胎牛血清、4mmol/L谷氨酰胺、0.4μg/mL氢化可的松、5μg/mL转铁蛋白、5μg/mL胰岛素、10ng/mL表皮生长因子、1.8×10-4mmol/L腺嘌呤、100u/mL青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM和F12(V∶V＝3∶1)培养基中，培养瓶底用Ⅳ型胶原包被，于37℃、5％二氧化碳孵育箱中孵育，次日吸出培养液及未贴壁细胞，再加入新鲜培养液，2-3天换液1次，细胞长至70％～80％时取出细胞，加入PSB缓冲液，配置成104-107cells/ml的细胞液。

本实施例中制备蛋白质溶液的过程为：

从患体体内提取出出血纤细胞，培养数代，提取出血纤蛋白待用。从患体体内提取出热休克细胞，在体外培养，用热刺激刺激热休克细胞表达热休克蛋白，提取热休克蛋白待用。分别将两种蛋白加入DMEM培养液，制成浓度为12mg/ml和20mg/ml的蛋白质溶液。

步骤2：将细胞打印液、血纤蛋白溶液和热休克蛋白溶液分别装入生物3D打印设备的对应储液腔中，每个储液腔都连接对应的压电喷头，压电喷头为赛尔Xaar128；所述生物3D打印设备的控制系统内存储有待打印的患者组织3D模型的分层模型。

步骤3：调整三个喷头的喷孔与载玻片的初始距离为5mm，喷头与喷头间距10mm，喷孔直径为50μm，喷头驱动电压均为28-35v，频率为2-4khz，喷头喷印速度为5.0m/s。

开始打印时，先输入打印模型数据至驱动板，驱动板得到分层后的单层打印数据，然后按照下面步骤4至步骤7的过程进行单层打印：

步骤4：生物3D打印设备根据步骤2所述的分层模型，使用连接热休克蛋白溶液储液腔的喷头在载玻片上打印一层热休克蛋白层，喷头移动速度为0.015m/s，重复打印一次，热休克蛋白层厚度为25um-35um。

步骤5：生物3D打印设备根据步骤2所述的分层模型，使用连接血纤蛋白溶液储液腔的喷头在热休克蛋白层上打印一层血纤蛋白层，喷头移动速度为0.015m/s，重复打印一次，血纤蛋白层厚度为25um-35um。

步骤6：打印完成后，喷头组移开，控制发热灯管表面温度恒温100℃，使用发热灯管距离血纤蛋白层50mm处照射血纤蛋白层10秒，随后移开发热灯管，冷却20-30s。

步骤7：生物3D打印设备根据步骤2所述的分层模型，使用连接细胞打印液储液腔的喷头在血纤蛋白层上指定位置打印细胞液，再等待20-30s。

步骤8：完成一层打印后，打印平台往下移动100um，重复步骤4～步骤7，直至得到与待打印的患者组织3D模型一致的蛋白支架。支架上分层附着了指定位置的细胞，细胞层间具有丰富的营养物质，蛋白支架具有与导入模型一致的形状，具有弹性和支撑性。

将得到的包含皮肤干细胞和蛋白质支架的生物支架在体外培养一段时间，植入皮肤损伤处即可。

本实施例制取出来的皮肤干细胞支架，不仅具有高效率地特点，且几乎无排斥，使用自身蛋白质作为生物支架更有利于细胞生长繁殖，还可随着细胞的繁殖不断降解，植入安全性较之水凝胶有很大的优势，且使用压电式的细胞打印方式，可以保证很高的打印速率。区别于其它生物支架的方法，本方法使用压电喷头打印蛋白质液和细胞液，用蛋白质作为支架，使用短暂高温固化支架的同时，用耐高温的热休克蛋白保护细胞，是一种切实有效的制造发明。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (3)

1.一种基于压电喷印方式的蛋白质支架制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

步骤1：获取患者自身的待打印细胞，对待打印细胞培养并诱导分化，制成细胞打印液；获取患者自身的血纤蛋白和热休克蛋白，将血纤蛋白加入培养液中制备血纤蛋白溶液，将热休克蛋白加入培养液中制备热休克蛋白溶液；

步骤2：将细胞打印液、血纤蛋白溶液和热休克蛋白溶液分别装入生物3D打印设备的对应储液腔中，每个储液腔都连接对应的压电喷头；所述生物3D打印设备的控制系统内存储有待打印的患者组织3D模型的分层模型；

步骤3：调整三个喷头的喷孔与载玻片的初始距离为5mm，喷孔直径为50μm，喷头驱动电压均为28-35v，频率为2-4khz，喷头喷印速度为5.0m/s；

步骤4：生物3D打印设备根据步骤2所述的分层模型，使用连接热休克蛋白溶液储液腔的喷头在载玻片上打印一层热休克蛋白层，喷头移动速度为0.015m/s，热休克蛋白层厚度为25um-35um；

步骤5：生物3D打印设备根据步骤2所述的分层模型，使用连接血纤蛋白溶液储液腔的喷头在热休克蛋白层上打印一层血纤蛋白层，喷头移动速度为0.015m/s，血纤蛋白层厚度为25um-35um；

步骤6：使用发热灯管距离血纤蛋白层50mm处照射血纤蛋白层10秒，随后冷却20-30s；

步骤7：生物3D打印设备根据步骤2所述的分层模型，使用连接细胞打印液储液腔的喷头在血纤蛋白层上打印细胞液，再等待20-30s；

步骤8：重复步骤4～步骤7，直至得到与待打印的患者组织3D模型一致的蛋白支架。

2.根据权利要求1所述一种基于压电喷印方式的蛋白质支架制备方法，其特征在于：步骤1中的细胞打印液浓度不低于10⁴cells/ml，血纤蛋白溶液浓度为12mg/ml，热休克蛋白溶液浓度为20mg/ml。

3.根据权利要求1所述一种基于压电喷印方式的蛋白质支架制备方法，其特征在于：所述压电喷头型号为赛尔Xaar128。