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CN105611828A - 干扰基因表达的hd-zip转录因子抑制以产生具有增强的性状的植物 - Google Patents

干扰基因表达的hd-zip转录因子抑制以产生具有增强的性状的植物 Download PDF

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CN105611828A
CN105611828A CN201480055625.6A CN201480055625A CN105611828A CN 105611828 A CN105611828 A CN 105611828A CN 201480055625 A CN201480055625 A CN 201480055625A CN 105611828 A CN105611828 A CN 105611828A
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plant
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recombinant dna
dna construct
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C·L·格里菲斯
A·坎德尔瓦尔
P·J·罗伊达
E·A·莱斯
R·L·汤普森
S·曼琼纳斯
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Original Assignee
Monsanto Technology LLC
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Abstract

公开了重组DNA构建体。当在植物或植物细胞中表达所述重组DNA构建体时，内源性HD-Zip？II类蛋白变得不太能抑制它们通常调控的基因的DNA转录。将所述重组DNA构建体在植物细胞中表达以产生具有增强的表型的植物。还公开了产生包含所述重组DNA构建体的转基因植物的方法和由此产生的植物。

Description

干扰基因表达的HD-ZIP转录因子抑制以产生具有增强的性状的植物
相关申请的交叉引用
本申请要求2013年10月9日提交的美国临时申请第61/888,980号的权益，所述临时申请通过引用整体并入本文。
序列表的并入
将包含在称为“MONS348WO_ST25.txt”(其为548千字节(如在Microsoft中测量的)并于2014年9月24日创建)的文件中的序列表通过电子提交方式与其一起提交并且通过引用整体并入本文。
领域
本公开涉及具有增强的性状的植物的产生，更具体地，涉及用于通过干扰内源性同源结构域-亮氨酸拉链(HD-Zip)II类转录因子抑制基因表达的能力产生具有增强的性状的植物的DNA构建体和方法，连同由此产生的植物。
背景
通过基因修饰改善植物的生长发育通常涉及理解调节所述过程的自然机制。研究表明，HD-Zip转录因子的大家族在植物生长发育的调节中起着重要作用，并且HD-Zip的转录因子介导植物对环境条件的反应。HD-Zip转录因子的大家族包含指定为I、II、III和IV的四个不同的亚家族或种类。尽管研究确定了I类、III类和IV类HD-Zip蛋白在植物生长发育中的作用，但阐明II类HD-Zip蛋白的功能作用的努力一直不太成功，因为这类HD-Zip蛋白的成员中的无效突变未曾产生可检测的表型(Hymus等，JExpBotany64(4)：4479-4490，2013)。已知HD-ZipII类转录因子抑制基因表达。理解这类HD-Zip蛋白在植物生长发育中的作用，有可能使科学家能够通过转基因手段促进植物生长和发育。
本公开描述了HD-ZipII类蛋白ATHB17在植物生长发育的调节中的作用模式。基于该信息，本公开提供了用于产生具有增强的性状的构建体和方法以及由此产生的植物。
概述
本发明人已发现，如果通过此类HD-ZipII类转录因子的转基因操作减少了受HD-ZipII类转录因子调控的基因的抑制，则可增强农作物植物中的农艺性状。本发明人还已发现，一些内源性HD-ZipII转录因子可受编码异源HD-ZipII转录因子的转基因调控。根据本发明的HD-ZipII类转录因子的转基因操作可以例如通过用重组构建体转化植物来进行，所述构建体包含干扰内源性HD-ZipII类转录因子抑制其靶基因的能力的编码蛋白质或RNA的DNA分子。
本文中公开了重组DNA构建体。所述重组DNA构建体包含可操作地连接于异源启动子的编码蛋白质的DNA分子。当在植物或植物细胞中表达所述重组DNA构建体时，其产生干扰内源性HD-ZipII类蛋白抑制受内源性HD-ZipII类蛋白调控的基因的DNA转录的蛋白质。在一些方面，从重组DNA构建体在植物或植物细胞中的表达产生的蛋白质为HD-ZipII类转录因子、小拉链蛋白质或小干扰肽(siPEP)。在一些方面，所产生的蛋白质为在选自由以下组成的组的结构域中具有功能丧失型突变的HD-ZipII类转录因子：转录抑制结构域、同源结构域、亮氨酸拉链结构域和C末端中的CXXCX样基序。在其它方面，所述重组DNA构建体中的编码蛋白质的DNA分子编码具有与具有选自由SEQIDNO：92至SEQIDNO：130组成的组的氨基酸序列的蛋白质具有至少60％同一性的氨基酸序列的蛋白质。在其它方面，当在植物或植物细胞中表达所述重组DNA构建体时，其产生干扰内源性HD-ZipII类蛋白抑制编码HD-ZipII类蛋白例如玉米HD-ZipII类蛋白的基因的DNA转录的能力的蛋白质。在其它方面，此类玉米HD-ZipII类蛋白选自由SEQIDNO：19至SEQIDNO：36组成的组。
还提供了包含可操作地连接于异源启动子的编码RNA的DNA分子的重组DNA构建体。当在植物或植物细胞中表达所述重组DNA构建体时，其产生抑制靶HD-ZipII类蛋白的表达的RNA分子。在一些方面，所述RNA分子为选自由以下组成的组的RNA分子：反义RNA、siRNA、miRNA和长的非编码RNA。在其它方面，当在玉米植物或植物细胞中表达所述重组DNA构建体时，其产生抑制玉米HD-ZipII类蛋白的表达的RNA分子。在其它方面，该玉米HD-ZipII类蛋白选自由SEQIDNO：19至SEQIDNO：36组成的组。
还提供了包含可操作地连接于异源启动子的DNA分子的重组DNA构建体。当在植物或植物细胞中表达所述重组DNA构建体时，其产生内源性HD-ZipII类基因的功能丧失型突变。在一些方面，所述功能丧失型突变存在于选自由以下组成的组的结构域中的基因编码区中：转录抑制结构域、同源结构域、亮氨酸拉链结构域和C末端中的CXXCX样基序。在其它方面，所述功能丧失型突变存在于基因的调控区。在其它方面，内源性HD-ZipII类基因中的功能丧失型突变是敲除突变。在其它方面，当在玉米植物或植物细胞中表达所述重组DNA构建体时，其产生内源性玉米HD-ZipII类基因的功能丧失型突变。在其它方面，该玉米HD-ZipII类蛋白选自由SEQIDNO：19至SEQIDNO：36组成的组。
还提供了包含公开的重组DNA构建体的植物和植物细胞。在一些方面，所述植物和植物细胞包含重组DNA构建体，即，当在植物或植物细胞中表达时，产生(i)干扰内源性HD-ZipII类蛋白抑制由内源性HD-ZipII类蛋白调控的基因的DNA表达的能力的蛋白质，(ii)抑制靶HD-ZipII类蛋白的表达的RNA分子，或(iii)内源性HD-ZipII类基因的功能丧失型突变。在一些方面，所述植物或从包含所述重组DNA构建体的植物细胞生长的植物相对于缺乏所述重组DNA构建体的对照植物具有增强的性状。在其它方面，所述增强的性状选自由以下组成的组：保绿、增加的穗生物质、增加的穗大小、增加的穗径、增加的穗长、增加的种子大小、增加的每植物种子数、增加的种子重量、增加的荚果/角果大小、增加的每植物荚果/角果数、增加的荚果/角果重量、增加的棉铃大小、增加的棉纤维长度、增加的每植物棉铃数目、增加的圆锥花序和增加的产量。在一些方面，所述植物是玉米植物。
在另一个方面，公开了用于产生具有相对于不包含所述重组DNA构建体的对照植物增强的性状的植物的方法。所述方法包括步骤：(a)将重组DNA构建体掺入植物中，所述构建体，当在植物中表达时，产生干扰内源性HD-ZipII类蛋白抑制受内源性HD-ZipII类蛋白调控的基因的DNA转录的能力的蛋白质，和(b)从包含所述重组DNA构建体的植物的亚群选择植物，其中所选择的植物具有相较于缺乏所述重组DNA构建体的对照植物的增强的性状，所述增强的性状选自由以下组成的组：保绿、增加的穗生物质、增加的穗大小、增加的穗径、增加的穗长、增加的种子大小、增加的每植物种子数、增加的种子重量、增加的荚果/角果大小、增加的每植物荚果/角果数、增加的荚果/角果重量、增加的棉铃大小、增加的棉纤维长度、增加的每植物棉铃数目、增加的圆锥花序和增加的产量。在一些方面，从所述重组DNA构建体在转化的植物中的表达产生的蛋白质为HD-ZipII类转录因子。在一些方面，所产生的蛋白质为在选自由以下组成的组的结构域中具有功能丧失型突变的HD-ZipII类转录因子：转录抑制结构域、同源结构域、亮氨酸拉链结构域和C末端中的CXXCX样基序。在甚至另外的方面，利用其转化植物的重组DNA构建体包含编码蛋白质的DNA分子，其编码具有与具有选自由SEQIDNO：92至SEQIDNO：130组成的组的氨基酸序列的蛋白质具有至少60％同一性的氨基酸序列的蛋白质。在另一个方面，由所述方法产生的植物是玉米植物。
在一个方面，公开了用于产生具有相对于不包含所述重组DNA构建体的对照植物的增强的性状的植物的另一种方法。所述方法包括步骤：(a)将重组DNA构建体掺入植物中，所述构建体，当在植物中表达时，产生抑制靶HD-ZipII类蛋白表达的RNA分子，和(b)从包含所述重组DNA构建体的植物的亚群选择植物，其中所选择的植物具有相较于缺乏所述重组DNA构建体的对照植物的增强的性状，所述增强的性状选自由以下组成的组：保绿、增加的穗生物质、增加的穗大小、增加的穗径、增加的穗长、增加的种子大小、增加的每植物种子数、增加的种子重量、增加的荚果/角果大小、增加的每植物荚果/角果数、增加的荚果/角果重量、增加的棉铃大小、增加的棉纤维长度、增加的每植物棉铃数目、增加的圆锥花序和增加的产量。在另一个方面，从所述重组DNA构建体在转化的植物中的表达产生的RNA分子为选自由以下组成的组的RNA分子：反义RNA、siRNA、miRNA和长的非编码RNA。在另一个方面，由所述方法产生的植物为玉米植物并且所述靶HD-ZipII类蛋白为玉米HD-ZipII类蛋白。在另一个方面，所述玉米HD-ZipII类蛋白选自由SEQIDNO：19至SEQIDNO：36组成的组。
在另一个方面，公开了用于产生具有相对于不包含所述重组DNA构建体的对照植物的增强的性状的植物的另一种方法。所述方法包括步骤：(a)将重组DNA构建体掺入植物中，所述构建体，当在植物中表达时，产生内源性HD-ZipII类基因的功能丧失型突变，和(b)从包含所述重组DNA构建体的植物的亚群选择植物，其中所选择的植物具有相对于缺乏所述重组DNA构建体的对照植物的增强的性状，所述增强的性状选自由以下组成的组：保绿、增加的穗生物质、增加的穗大小、增加的穗径、增加的穗长、增加的种子大小、增加的每植物种子数、增加的种子重量、增加的荚果/角果大小、增加的每植物荚果/角果数、增加的荚果/角果重量、增加的棉铃大小、增加的棉纤维长度、增加的每植物棉铃数目、增加的圆锥花序和增加的产量。在另一个方面，从所述重组DNA构建体在转化的植物中的表达产生的功能丧失型突变存在于选自由以下组成的组的结构域中的基因编码区中：转录抑制结构域、同源结构域、亮氨酸拉链结构域和C末端中的CXXCX样基序。在另一个方面，所述功能丧失型突变存在于基因的调控区中。在其它方面，内源性HD-ZipII类基因中的功能丧失型突变为敲除突变。在另一个方面，由所述方法产生的植物为玉米植物并且所述内源性HD-ZipII类蛋白为玉米HD-ZipII类蛋白。在另一个方面，所述玉米HD-ZipII类蛋白选自由SEQIDNO：19至SEQIDNO：36组成的组。
在另一个方面，公开了用于产生具有相对于不包含所述重组DNA构建体的对照植物的增强的性状的植物的另一种方法。所述方法包括步骤：(a)获得由具有增强的性状和包含重组DNA构建体的植物产生的种子，所述构建体，当在植物或植物细胞中表达时，产生(i)干扰内源性HD-ZipII类蛋白抑制受内源性HD-ZipII类蛋白调控的基因的DNA转录的能力的蛋白质，(ii)抑制靶HD-ZipII类蛋白的表达的RNA分子，或(iii)内源性HD-ZipII类基因中的功能丧失型突变，和(b)种植获得的种子，其中从种植的种子生长的植物是具有增强的性状的后代植物，所述增强的性状选自由以下组成的组：保绿、增加的穗生物质、增加的穗大小、增加的穗径、增加的穗长、增加的种子大小、增加的每植物种子数、增加的种子重量、增加的荚果/角果大小、增加的每植物荚果/角果数、增加的荚果/角果重量、增加的棉铃大小、增加的棉纤维长度、增加的每植物棉铃数目、增加的圆锥花序和增加的产量。在一些方面，所述种子包含重组DNA构建体，所述构建体，当在植物或植物细胞中表达时，产生(i)干扰内源性HD-ZipII类蛋白抑制受内源性HD-ZipII类蛋白调控的基因的DNA转录的能力的蛋白质，(ii)抑制靶HD-ZipII类蛋白的表达的RNA分子，或(iii)内源性HD-ZipII类基因中的功能丧失突变。在其它方面，所述植物是玉米植物。
根据上文中提供的详细描述、附图和权利要求，本公开的其它适用性领域将变得显而易见。应当理解，所述详述描述，包括公开的实施方案和附图，在性质上只是示例性的，仅旨在举例说明的目的，并且不旨在限制本发明的范围、其应用或用途。因此，不背离本发明的要旨的变型意图在本发明的范围内。
序列概述
SEDIDNO：1-18：编码玉蜀黍HD-ZipII类蛋白的核苷酸序列。
SEDIDNO：19-36：玉蜀黍HD-ZipII类蛋白的氨基酸序列。
SEDIDNO：37-54：玉蜀黍HD-ZipII类基因的上游启动子区的核苷酸序列。
SEDIDNO：55-56：II类和I类DNA结合位点的核苷酸序列。
SEQIDNO：57：拟南芥基因HB17(ATHB17)的核苷酸序列。
SEQIDNO：58：拟南芥HB17蛋白的氨基酸序列。
SEQIDNO：59：具有N末端113个氨基酸缺失的拟南芥HB17(ATHB17Δ113)的氨基酸序列。
SEQIDNO：60-69：拟南芥HB17Δ113的蛋白质变体的氨基酸序列。
SEQIDNO：70-73：拟南芥HB17的蛋白质变体的氨基酸序列。
SEQIDNO：74：具有N末端73个氨基酸缺失的拟南芥HB17基因(ATHB17Δ73)的蛋白质变体的氨基酸序列。
SEQIDNO：75-76：玉蜀黍miR159a前体和成熟miRNA的核苷酸序列。
SEQIDNO：77-78：工程化miRNA“miRZmhdz26”前体和成熟“miRZmhdz26”miRNA的核苷酸序列。
SEQIDNO：79：玉蜀黍Zmhdz26(SEQIDNO：9)的miRNA识别位点的核苷酸序列。
SEQIDNO：80-82：SEQIDNO：17的靶位点1的TALE结合位点1、TALEN间隔子和TALE结合位点2的核苷酸序列。
SEQIDNO：83-85：SEQIDNO：17的靶位点2的TALE结合位点1、TALEN间隔子和TALE结合位点2的核苷酸序列。
SEQIDNO：86-88：SEQIDNO：17的靶位点3的TALE结合位点1、TALEN间隔子和TALE结合位点2的核苷酸序列。
SEQIDNO：89-91：SEQIDNO：17的靶位点4的TALE结合位点1、TALEN间隔子和TALE结合位点2的核苷酸序列。
SEQIDNO：92-130：玉蜀黍HD-ZipII类蛋白的N末端截短变体的氨基酸序列。
SEQIDNO：131-147：玉蜀黍HD-ZipII类蛋白C末端突变变体的氨基酸序列。
SEQIDNO：148-215：玉蜀黍HD-ZipII类蛋白的EAR样突变变体的氨基酸序列。
SEQIDNO：216-233：玉蜀黍HD-ZipII类蛋白的亮氨酸拉链突变变体的氨基酸序列
SEQIDNO：234-251：玉蜀黍HD-ZipII类蛋白同源结构域突变变体的氨基酸序列。
SEQIDNO：252-259：拟南芥HB17蛋白变体的氨基酸序列。
SEQIDNO：260-267：分别对应于SEQIDNO：252-259的拟南芥HB17蛋白变体的核苷酸序列。
所有具有对应的SEQIDNO的序列列于表1中。
附图简述
图1-显示描绘ATHB17Δ113通过显性负性机制，通过与内源性HD-ZipII类蛋白相互作用和隔离内源性蛋白以阻止其与它们的靶结合，从而导致抑制的解除，或通过与内源性HD-ZipII类蛋白形成异二聚体或形成ATHB17Δ113同二聚体以竞争DNA结合，从而因不能引起活性抑制而导致改变的靶表达来发挥作用的示意图。
图2-显示证明ATHB17Δ113解除由玉米HD-ZipII类蛋白引起的抑制的玉米原生质体转录激活/抑制测定。灰色三角形代表递增量的ATHB17Δ113DNA。报道分子构建体含有II类DNA结合位点(II类：：GUS)，或I类DNA结合位点(I类：：GUS)，或不含I类/II类DNA结合位点(无BS：：GUS)。
图3-显示证明ATHB17Δ113与内源性玉米HD-ZipII类蛋白之间的异二聚体形成的玉米原生质体中的基于珠粒的共免疫沉淀测定。用单独的表达CFP或CFP标记的HD-ZipII类蛋白的构建体(实心条棒)转化或用所述构建体与构建体表达ATHB17Δ113：：MYC-HA(空心条棒)一起共转化玉米叶原生质体。HD-ZipI为Zmhdz3。
图4-显示各种HD-ZipII类蛋白的结构域结构和它们的N末端截短变体的实例。对于每一种蛋白质，在标识了缺失的氨基酸位置(例如，ATHB17Δ113是指ATHB17蛋白的从氨基酸1至氨基酸113的N末端截短)的全长蛋白质下面提供了截短变体。序列内的经典(实心箭头)和假定的(空心箭头)ERF相关脂质双嗜性抑制(EAR)基序被鉴定。
图5-显示在转基因玉米植物中表达的ATHB17的免疫印迹。
图6-显示全长ATHB17蛋白在玉米原生质体转录激活/抑制测定中用作转录阻遏物。
图7A-7C-显示玉米HD-ZipII类基因在玉米的两个杂交种中跨组织和发育阶段的表达水平。
图8-显示包含功能丧失型变体Zmhdz25Δ59(A)和变体Zmhdz18Δ45(B)的转基因玉米植物的田间的产量表现。
图9-显示用于TALEN-介导的突变的Zmhdz34(SEQIDNO：17)的上游启动子区的示意图。框1和2表示I类DNA结合位点，框3和4表示用作用于突变的靶的II类DNA结合位点；反向箭头对代表成对的DNA结合序列。
表1.多核苷酸和多肽。
*对于截短变体，截短符号“Δ”后的数字表示截短的氨基酸残基的数目。例如，ATHB17Δ113意指N末端113个氨基酸被截短，或Zmhdz26_Δ1-102意指Zmhdz26蛋白的1-102被截短。
详述
本公开提供了用于通过干扰内源性同源结构域亮氨酸拉链(HD-Zip)II类转录因子抑制基因表达的能力产生具有增强的性状的植物的构建体和方法以及由此产生的植物。可根据本发明使用导致内源性HD-ZipII类转录因子失去其抑制其靶基因的能力的任何重组DNA构建体。在一些实施方案中，所述重组DNA构建体包含在植物或植物细胞中表达的编码蛋白质的DNA分子，所述DNA分子在所述植物或植物细胞中产生干扰内源性HD-ZipII类蛋白抑制受内源性HD-ZipII类蛋白调控的基因的DNA转录的能力的蛋白质。在其它实施方案中，所述重组DNA构建体包含在植物或植物细胞中表达的编码RNA的DNA分子，所述DNA分子在所述植物或植物细胞中产生抑制靶HD-ZipII类蛋白的表达的RNA分子。在另一个实施方案中，所述重组DNA构建体包含在植物或植物细胞中表达的编码蛋白质的DNA分子，在所述植物或植物细胞中它们转录一种或多种蛋白质，所述蛋白质单独地或作为复合物在其编码区或调控区中切割内源性HD-ZipII类基因的DNA，从而导致所述基因的蛋白质的突变或所述基因的表达的中断或下调。
下列定义和方法被提供来更好地定义本发明和指导本领域普通技术人员实施本发明的。除非另有所指，否则将按照由相关领域中的普通技术人员的常规用法来理解术语。
重组DNA构建体
如本文中所用，术语“DNA”或“DNA分子”是指基因组来源或合成来源的双链DNA分子，即，从5′(上游)末端至3′(下游)末端阅读的脱氧核糖核苷酸碱基或多核苷酸分子的聚合物。本公开的DNA分子包含可编码本公开的蛋白质，或抑制内源性HD-ZipII类蛋白的表达的RNA分子，或在其编码区或调控区中切割内源性HD-ZipII类基因的DNA的一种或多种蛋白，从而导致所述基因的蛋白质的突变或所述基因的表达的中断或下调的多核苷酸。因此，在内源性HD-ZipII类基因表达的中断或下调的背景中的术语“基因”不仅包括编码区而且还包含基因的调控区。如本文中所用，术语“DNA序列”是指DNA分子的核苷酸序列。本文中所用的命名法对应于美国联邦法典§1.822第37条的命名法和WIPOStandardST.25(1998)，附录2，表1和3中的表中所示的命名法。
如本文中所用，术语“重组”是指将两个或更多个大分子(多核苷酸或多肽)组合的技术或从其产生的组合分子。许多本领域技术人员公知的方法可用于分离和操作本公中公开的DNA分子或其片段。例如，PCR(聚合酶链式反应)技术可用于扩增特定起始DNA分子和/或产生原始分子的变体。DNA分子或其片段还可通过其它技术诸如通过利用化学方法合成片段来获得，这通常通过使用自动化寡核苷酸合成仪来实施。所公开的重组DNA构建体可通过本领域已知的标准技术来产生(参见，例如，MolecularCloning：ALaboratoryManual，第3版，第1、2和3卷，J.Sambrook，D.W.Russell和N.Irwin，ColdSpringHarborLaboratoryPress，2000)。
如本文中所用，术语“可操作连接的”是指联接于第二分子的第一分子，其中以使第一分子实现第二分子的功能的方式排列所述分子。通常地，所述第一分子为可操作地连接于第二分子诸如编码蛋白质或RNA的DNA分子的5’的基因调控分子诸如启动子。所述两个分子可以为或可以不为单个连续分子的部分并且可以相邻或可以不相邻。例如，如果启动子在细胞中调控可转录的目标多核苷酸分子的转录，则启动子调控元件可操作地连接于可转录多核苷酸分子。如本文中所用，术语“异源的”是指两个或更多个多核苷酸分子的组合，此时此类组合通常不在自然界中存在。例如，所述两个分子可来源于不同物种和/或所述分子可来源于不同基因，例如，来自相同物种的不同基因或来自不物同物种的相同基因。
在第一实施方案中，公开了重组DNA构建体。所述重组DNA构建体包含编码蛋白质的DNA分子。编码蛋白质的DNA分子可操作地连接于异源启动子。当在植物或植物细胞中表达所述重组DNA构建体时，其产生干扰内源性HD-ZipII类蛋白抑制受内源性HD-ZipII类蛋白调控的基因的DNA转录的能力的蛋白质。
所述重组DNA构建体中的编码蛋白质的DNA分子不限于任何特定的编码蛋白质的DNA分子，而是相反地，可以是编码在植物或植物细胞中干扰HD-ZipII类蛋白(其对于植物或植物细胞是内源的)抑制的DNA转录的能力的蛋白质的任何编码蛋白质的DNA分子。从所述重组DNA构建体表达的蛋白质可以以任何数量的方式(例如，通过与内源性HD-ZipII类蛋白的蛋白质间相互作用或通过与内源性HD-ZipII类蛋白竞争对靶DNA的结合)在植物或植物细胞中干扰内源性HD-ZipII类蛋白抑制的DNA转录的能力(图1)。此外，通过蛋白质间相互作用干扰的蛋白质可在胞质溶胶或细胞核中起作用。通过胞质溶胶中的相互作用干扰的蛋白质可干扰内源性HD-ZipII类蛋白的细胞核定位。通过细胞核中的相互作用干扰的蛋白质可(1)与内源性HD-ZipII类蛋白形成异二聚体和与内源性HD-ZipII类蛋白的同源二聚体竞争相同的DNA结合位点，(2)与内源性HD-ZipII类蛋白形成异二聚体以形成可结合DNA但无活性的复合物，和/或(3)与内源性HD-ZipII类蛋白形成异二聚体以形成不能结合DNA的复合物。编码在植物或植物细胞中干扰内源性HD-ZipII类蛋白抑制DNA转录的能力的蛋白质的DNA分子，可通过将(1)瞬时表达引入的HD-ZipII类蛋白的植物原生质体中的在启动子中包含已知的HD-ZipII类蛋白的DNA结合位点(CAATC/GATTG，SEQIDNO：55)(Sessa等，EMBOJ12：3507-3517，1993)的β-葡糖苷酸酶或uidA基因(GUS)报道分子构建体的表达与(2)其中共表达相同的HD-ZipII类蛋白与如实施例5中描述的假定的干扰蛋白的原生质体中的GUS报道分子构建体的表达相比较，来鉴定。干扰蛋白可被鉴定为在共转化的原生质体中，相对于表达单独的HD-ZipII类蛋白的原生质体提供的增加的来自报道分子的表达的那些蛋白质。当将该方法用于瞬时表达ATHB17Δ113的玉米原生质体时，数据显示ATHB17Δ113干扰所述玉米HD-ZipII类蛋白抑制转录的能力。如图2中所示，当GUS报道分子构建体含有已知的HD-ZipII类蛋白的DNA结合位点(II类：：GUS)时，当玉米HD-ZipII类蛋白与递增量的ATHB17Δ113在玉米原生质体中共表达时，看到增加的来自GUS报道分子构建体的表达。可以例如通过将来自含有已知的HD-ZipII类DNA结合位点的报道分子构建体的GUS表达与缺乏HD-ZipII类DNA结合位点或包含非特异性DNA结合位点的构建体相比较来鉴定干扰HD-ZipII类蛋白抑制活性的蛋白质。干扰HD-ZipII类蛋白抑制活性的蛋白质可被鉴定为在表达具有HD-ZipII类DNA结合位点的GUS报道分子的原生质体中，显示相对于缺乏HD-ZipII类DNA结合位点的那些GUS报道分子的GUS表达的增加的那些蛋白质。可使用如实施例2中描述的表面等离子体共振(SPR)测定体外确认对HD-ZipII类DNA结合位点的结合。还可例如通过酵母双杂交测定来鉴定干扰HD-ZipII类蛋白抑制活性的蛋白质，在所述双杂交测定中将假定的干扰蛋白质用作诱饵并且将植物的总RNA文库用作猎物，如实施例3中所述的。考虑到潜在的假阳性，可通过基于珠粒的共免疫沉淀测定，通过共沉淀植物原生质体中的假定的相互作用蛋白质和通过使用对于每一种假定的相互作用蛋白质上的标签是特异的抗体检测复合物的存在来验证特定的假定的相互作用，如实施例4中所描述的。
在实施方案中，从重组DNA构建体在植物或植物细胞中的表达产生的蛋白质为HD-ZipII类转录因子，小的拉链蛋白或小干扰肽(siPEP)。可如本领域中所述，鉴定小的拉链蛋白(Wenkel等人，PlantCell19：3379-3390，2007)和siPEP(Seo等人，TrendsPlantSci16：541-549，2011)。小的拉链蛋白(Wenkel等人，PlantCell19：3379-3390，2007)和siPEP(Seo等人，TrendsPlantSci16：541-549，2011)不结合DNA，从而不直接调控基因转录，但能够通过与内源性转录因子的蛋白质间相互作用调控转录。
HD-ZipII类转录因子可通过使用如所描述的比较序列分析法(Zhao等人，PLoSOne6：e28488，2011)来进行鉴定，所述比较序列分析法搜索含有紧邻亮氨酸拉链结构域的同源结构域(HD)的蛋白质，并且在这些蛋白质当中鉴定包含氧化还原感测基序(CPXCE样基序)的蛋白质(Ariel等人，TrendsinPlantSci12：419-426，2007)。HD-ZipII类转录因子可通过蛋白质间相互作用或通过竞争DNA结合来干扰内源性HD-ZipII类转录因子抑制转录的能力。图3显示玉米原生质体测定中的ATHB17Δ113与玉米HD-ZipII类蛋白之间的蛋白质间相互作用。如图中所示，标记的ATHB17Δ113与标记的玉米HD-ZipII类蛋白在玉米原生质体中的共表达在基于珠粒的共免疫沉淀测定中产生相对于表达单独的蛋白质(实心框)的原生质体的清除信号(空心框)。当将ATHB17Δ113与HD-ZipI类蛋白(HD-ZipI)共表达时未看到蛋白质相互作用。图2显示ATHB17Δ113干扰HD-ZipII类蛋白的抑制活性的能力。如图中所示，ATHB17Δ113与玉米HD-ZipII类蛋白的共表达从含有HD-ZipII类DNA结合位点的GUS报道分子构建体(II类：：GUS)，而非从含有HD-ZipI类DNA结合位点的报道分子构建体(I类：：GUS)或不具有这两种结合位点的构建体(无BS：：GUS)产生增加的GUS表达。
如本文中所用，“突变”是基因的核苷酸序列的变化。基因中的突变可对基因的产物没有影响或改变所述产物，或阻止基因正确或完全地发挥功能，并且可产生或可以不产生生物体的可观察到的特征(表型)的可辨别的变化。“功能丧失型突变”是导致减小的或消除的基因表达或蛋白质功能的突变。“显性负性突变”具有拮抗性地作用于野生型等位基因的改变的基因产物。这些突变通常导致改变的分子功能(通常是无活性的)并且特征在于显性或半显性表型。本公开的功能丧失型突变导致内源性HD-ZipII类蛋白不能干扰受HD-ZipII类蛋白调控的基因的转录抑制。如本文中所用，术语“变体”是指在组成上与第一多核苷酸或多肽分子相似但不相同的第二多核苷酸或多肽分子。变体可以是第一多核苷酸或多肽分子的较短或截短的形式，和/或第一多核苷酸或多肽分子的序列的改变的形式，诸如具有末端和/或内部缺失、取代和/或手语的形式。
在一些实施方案中，从所述重组DNA构建体在植物或植物细胞中的表达产生的蛋白质为在选自由以下组成的组的结构域中具有一个或多个功能丧失型突变的HD-ZipII类转录因子：转录抑制结构域(也称为转录抑制/激活结构域)、同源结构域、亮氨酸拉链结构域和C末端中的CXXCX样基序。可基于它们的经典结构域结构(如上所述的)鉴定HD-ZipII类转录因子。简言之，这些蛋白质可含有用于转录抑制/激稍大的抑制/激活结构域、用于DNA结合的同源结构域、用于蛋白质二聚化的亮氨酸拉链结构域和参与细胞氧化还原状态感知的C末端。所述抑制/激活结构域实现转录抑制/激活。所述同源结构域实现转录抑制和DNA结合，而亮氨酸拉链结构域和c末端实现转录抑制、DNA结合和蛋白质二聚化。因此，预期这些结构域中的任一个中的任何功能丧失型突变影响蛋白质的转录抑制活性。虽然公开提供了几种特定的HD-ZipII类转录因子和它们的功能丧失型变体的实例，但应当理解，所述范围不限于其，而是相反地，包括具有相同结构域结构的其它蛋白质、其它功能丧失型变体及其组合。
在某些实施方案中，从所述重组DNA构建体在植物或植物细胞中的表达产生的HD-ZipII类转录因子在转录抑制结构域中具有功能丧失型突变。已发现几种HD-ZipII类蛋白含有特征在于其经典序列(LxLxL)并且与转录抑制相关的EAR基序(Ciarbelli等人，PlantMol.Biol.，68：465-478(2008))。在转录抑制结构域中具有功能丧失型突变的HD-ZipII类转录因子从而可通过突变该抑制结构域或类似抑制结构域中的残基来产生。几种具有预期产生转录抑制结构域的功能丧失的突变的HD-ZipII类转录因子公开于表1、图4以及所附的序列表中。在图4中，在标识了缺失的氨基酸位置的全长蛋白质的下方提供了缺失变体的实例。功能丧失型突变包括例如消除抑制功能的非经典残基对抑制结构域中的残基的取代，编码结构域残基的序列的部分或完全缺失，以及结构域内和其中存在多个抑制结构域的蛋白质中的残基的插入，多个结构域之间的残基的插入。在本领域中已描述了EAR基序中的产生抑制功能的丧失的取代(国际专利申请第PCT/US13/35640号；美国临时专利公开第60/621,980号)。
在其它实施方案中，通过DNA构建体的表达产生的HD-ZipII类转录因子中的功能丧失型突变存在于亮氨酸拉链结构域中。经由亮氨酸拉链结构域的二聚化对于同源结构域DNA结合是至关重要的，由此，也调控转录功能。亮氨酸拉链结构域中的突变可被设计来消除或减小蛋白质间的相互作用。减小的蛋白质间相互作用或其的不存在可使用基于珠粒的原生质体来进行定性和/或定量评估，如实施例4中所述的。可使用实施例2中描述的生物传感器进一步验证所选择的变体的DNA结合，如实施例5和6中所述，验证所述变体的转录活性。功能丧失型突变包括例如消除二聚化功能的亮氨酸拉链结构域中的残基的取代，编码结构域残基的序列的部分或完全缺失，以及结构域内的残基的插入。已在本领域中描述了导致亮氨酸拉链结构域的功能丧失的突变(Sessa等EMBOJ，12：3507-3517(1993))。
在其它实施方案中，通过所述DNA构建体的表达产生的HD-ZipII类转录因子中的功能丧失型突变存在于同源结构域中。所述同源结构域在DNA结合中起作用。同源结构域中的突变可影响DNA结合和转录活性。因此，可设计突变并使用如实施例2中所述的生物传感器来测试其的DNA结合，以及如实施例5和6中所述，测试其转录活性。功能丧失型突变包括例如，消除或减少DNA结合的同源结构域中的残基的取代，编码结构域残基的序列的部分或完全检测以及结构域内的残基的插入。已在本领域中描述了导致同源结构域的功能丧失的突变(Sessa等人，J.Mol.Biol274：303-309，1997)。
在其它实施方案中，通过DNA构建体的表达产生的HD-ZipII类转录因子的功能丧失型突变存在于C末端中的CXXCX样基序中。C末端中的CXXCX样基序中的突变可影响DNA结合、蛋白质间相互作用以及转录活性。从而可设计突变，并使用如实施例2中所述的传感器测试其的DNA结合，如实施例4中所述，使用基于珠粒的原生质体测定来定性和/或定量地测定其的蛋白质间相互作用或无相互作用，以及如实施例5和6中所述，测试其的转录活性。功能丧失型突变包括，例如，C末端中尤其是CXXCX样基序中的残基的取代、编码结构域/CXXCX样基序残基的序列的部分或完全缺失以及结构域/CXXCX样基序内的残基的插入。已在本领域中描述了导致C末端/CXXCX样基序的功能丧失的突变(Comelli等人，ArchBiochemBiophys467(1)：41-7，2007)。
在本公开的一些实施方案中，干扰内源性HD-ZipII类蛋白抑制基因转录的能力的功能丧失型突变包括导致蛋白质的部分的氨基酸取代、插入或缺失的编码序列中的突变。特定结构域中，例如转录抑制结构域、同源结构域、亮氨酸拉链结构域或C末端中的CXXCX样基序中的突变可通过包含该特定结构域的天然存在的HD-ZipII类蛋白的编码序列中的遗传工程来产生，或可通过物种特异性选择性剪接来引入。可通过体外DNA合成或基于PCR的定点诱变来将遗传工程化改变引入HD-ZipII类蛋白的编码序列。通过标准技术将遗传工程化编码序列克隆进植物表达载体(Sambrook等人，1989)。或者，可通过物种特异性选择性剪接产生缺乏转录抑制活性的HD-ZipII类蛋白。例如，如下面的实施例1中所述和图5中所示，包含全长拟南芥ATHB17编码序列的玉米植物中的物种特异性选择性剪接产生相对于全长蛋白质(ATHB17)具有来自N末端区域的前113个氨基酸的缺失(包括抑制结构域的部分)的蛋白质(ATHB17Δ113)。还可如实施例5中所述，通过测量植物原生质体中来自GUS报道分子构建体的表达来鉴定在任何结构域中具有导致抑制活性的减小或丧失的功能丧失型突变的HD-ZipII类转录因子。可通过在植物原生质体中表达蛋白质连同具有或不具有II类DNA识别位点序列的GUS报道分子来测试在任何结构域中具有突变的HD-ZipII类蛋白的抑制活性的丧失。缺乏抑制活性的蛋白质可被鉴定为不能在含有具有II类DNA识别位点序列的GUS构建体的原生质体中相对于含有缺乏DNA识别位点的GUS对照构建体的原生质体减少GUS表达的那些蛋白质。图6显示由来自N末端区的前113个氨基酸残基的缺失导致的ATHB17的抑制活性的丧失。如图中所示，虽然全长ATHB17的表达导致来自含有HD-ZipII类DNA识别位点的GUS报道分子构建体(II类：：GUS)相对于缺乏DNA识别位点的对照构建体(无BS：：GUS)的表达的减少，但ATHB17Δ113的表达未引起这样的减少。
在本公开的一些实施方案中，干扰内源性HD-ZipII类蛋白抑制基因转录的能力可经由如下方面来实现：(1)内源性HD-ZipII类基因的编码区中的突变，其导致部分的该蛋白的氨基酸取代、插入、倒位或缺失，(2)基因敲除，(3)通过在内源性HD-ZipII类基因的启动子序列中，例如在II类DNA结合位点中产生变化进行的经修饰的基因表达，和(4)内源性HD-ZipII类蛋白的表达的抑制。特定结构域中，例如，转录抑制结构域、同源结构域、亮氨酸拉链结构域或C末端中的CXXCX样基序中的突变可通过在包含此类结构域的内源性HD-ZipII类基因的编码序列中的遗传工程化变化来产生。
在一个实施方案中，公开了一种或多种重组DNA构建体。每一种重组DNA构建体包含一种或多种编码蛋白质的DNA分子。一种或多种编码蛋白质的DNA分子中的每一种可操作地连接于异源启动子。当在植物或植物细胞中表达所述重组DNA构建体时，它们产生一种或多种蛋白质，所述蛋白质单独地或作为复合物在其编码区或调控区切割内源性HD-ZipII类基因的DNA，从而导致蛋白质的突变或基因的表达的中断或下降。内源性HD-ZipII类基因中的功能丧失型突变诸如基因的表达的中断或下调可使用本领域中公知的技术来实现。其中在基因组中插入、替换DNA或从其除去DNA的基因组编辑使用人工工程化蛋白质或蛋白质复合物，所述蛋白质或蛋白质复合物包含在本领域中已知的DNA修饰酶，诸如内切核酸酶、解旋酶、连接酶、激酶和重组酶。内切核酸酶在基因组中所期望的位置上产生特异性双链断裂，并且利用细胞的内源机制以通过同源重组和非同源末端连接的天然过程修复诱导的断裂。工程化核酸酶的实例包括锌指核酸酶(ZFN)、转录激活物样效应核酸酶(TALEN)、CRISPR和工程化大范围核酸酶。重组酶为基因重组酶。DNA重组酶被广泛地用于多细胞生物体以操作基因组的结构，和控制基因表达。所述酶直接催化对于用于切除/插入、倒位、易位和盒交换的每一种重组酶是特异的短的(30-40个核苷酸)靶位点序列之间的敏感性DNA交换反应。重组酶的实例包括Cre重组酶、FLP重组酶、TALE重组酶和锌指重组酶。其它技术包括，但不限于，程序化II组内含子、锌指或TALE嵌合转座酶以及同源臂介导的基因靶向，任选地使用加/减选择方案。用于在内源性HD-ZipII类蛋白中产生功能丧失型突变的其它方法可由本发明使用。可使用上述方法进行DNA分子的鉴定和确认，所述DNA分子当在植物或植物细胞中表达时，干扰内源性HD-ZipII类蛋白抑制DNA转录的能力。还可使用先前部分中描述的方法，进行通过蛋白质间相互作用或DNA结合干扰HD-ZipII类蛋白抑制DNA转录的能力的突变的鉴定和确认。
HD-Zip蛋白作为同源或异源二聚体结合DNA，并且已知许多HD-Zip蛋白充当基因表达的活性阻遏物和下调HD-Zip家族内的基因的转录。因此，一种HD-ZipII类蛋白的抑制可影响其它HD-ZipII类蛋白的二聚化或DNA结合，从而导致对HD-ZipII类自我调节网络中的DNA转录的抑制的干扰。在一个实施方案中，公开了重组DNA构建体。所述重组DNA构建体包含编码RNA的DNA分子。编码RNA的DNA分子可操作地连接于异源启动子。当在植物或植物细胞中表达所述重组DNA构建体时，其产生抑制靶HD-ZipII类蛋白的表达的RNA分子。
如本文中所用，术语“抑制”是指靶多核苷酸或靶蛋白在植物或植物细胞中相较于所述基因以其天然状态或野生型状态的表达的较低的表达水平。如在抑制的上下文中所用，术语“靶蛋白”是指被抑制的蛋白质；类似地，“靶DNA”或“靶多核苷酸”是指可被抑制或一旦表达，被降解以导致其编码的靶蛋白的抑制的多核苷酸。在一个实施方案中，所述靶基因调节其自身或其它内源性HD-ZipII类基因。在一些实施方案中，所述靶HD-ZipII类蛋白选自由SEQIDNO：19至SEQIDNO：36组成的组。
许多RNA介导的抑制方法在本领域中是已知的。非限定性实例包括，但不限于，反义RNA、miRNA、siRNA和长的非编码RNA。反义RNA是与细胞中转录的信使RNA(mRNA)链互补的单链RNA。当在细胞中表达反义RNA时，其结合特定的信使RNA分子并使其失活。siRNA是双链RNA分子，长度为20-25个碱基对。在分开成单链和整合进活性RISC复合物后，其与其靶mRNA碱基配对并诱导靶mRNA的切割，从而阻止其被用作翻译模板。miRNA为具有通过结合于靶蛋白的mRNA(从而导致靶蛋白mRNA的去稳定或翻译抑制，最终导致靶蛋白的减少)调节靶基因的表达的能力的通常约21个核苷酸的小RNA。用于选择和设计用于基因抑制的siRNA和miRNA的方法在本领域中是公知的。长的非编码RNA(长的ncRNA或lncRNA)是长于200个核苷酸的非蛋白质编码转录物(Perkel，BioTechniques，54(6)：301-304(2013))。与许多在不同物种中表现出强保守性的小RNA相反，长的ncRNA通常缺乏强保守性。长的ncRNA可根据它们与基因组中的编码蛋白质的基因的接近性被分成5类(有义、反义、双向、内含子和基因间ncRNA)，并且通过不同组的机制，诸如通过基因转录(例如，通过基因特异性转录调控和基本转录机器的调控)、转录后调控(例如，通过mRNA剪接、翻译和siRNA指导的基因调控)或通过表观遗传学调控来调控基因表达。siRNA、miRNA或长的非编码RNA对靶基因抑制的作用，可通过将包括HD-ZipII类蛋白(CAATC/GATTG)的已知的DNA结合位点的β-葡糖苷酸酶或uidA基因(GUS)报道分子构建体在瞬时表达单独的引入的HD-ZipII类蛋白的植物原生质体中的表达与GUS报道分子构建体在其中共表达所述相同的HD-ZipII类蛋白与编码RNA的DNA分子的原生质体中的表达相比较来进行评估，与实施例5中针对与编码蛋白质的DNA分子的共表达所描述的类似。可将抑制靶HD-ZipII类蛋白的反义RNA、siRNA、miRNA或长的非编码RNA分子鉴定为在共转化的原生质体中，提供相对于表达单独的HD-ZipII类蛋白的原生质体的增加的来自报道分子的表达的RNA分子。
本公开的其它实施方案包括异源启动子，其以允许所产生的产物在表达内源性HD-ZipII类蛋白的细胞或组织中表达的方式指导可操作地连接的DNA序列的表达。可以例如通过如实施例11中所述的靶向转录物分析鉴定其中表达内源性HD-ZipII类蛋白的细胞或组织。其中此类蛋白在不同发育时间点上于玉米中表达的植物组织示于图7中。已在文献中描述了在植物细胞或组织中具有活性的许多启动子。这些启动子包括存在于植物基因组中的启动子以及来自其它来源的启动子，包括根癌土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)的肿瘤诱导质粒上携带的胭脂碱合酶(NOS)启动子和章鱼碱合酶(OCS)启动子和来自花椰菜花叶病毒的CaMV35S启动子，如美国专利第5,164,316和5,322,938号中公开的。来源于植物基因的有用的启动子见于美国专利第5,641,876号(其公开了水稻肌动蛋白启动子)、美国专利公开第7,151,204号(其公开了玉米叶绿体醛缩酶启动子和玉米醛缩酶(FDA)启动子)和美国专利申请公开2003/0131377,A1(其公开了玉米烟酰胺合酶启动子)。这些启动子和在植物细胞中具有功能的许多其它启动子对于本领域技术人员来说是已知的，并且可获得来用作用于表达本文中公开的可操作地连接的DNA分子的异源启动子。
在一些实施方案中，所述重组DNA构建体包括其它DNA元件。其它构建体组分可包括另外的调控元件，诸如用于增强转录的5’前导序列和内含子，3’非翻译区(诸如多腺苷酸化信号和位点)，转运肽或信号肽的DNA。此类元件在本领域中是已知的。有用的增强子包括水稻肌动蛋白1(参见美国专利第5,641,876号)和水稻肌动蛋白2基因的5’内含子、玉米醇脱氢酶基因的内含子、玉米热激蛋白70基因的内含子(美国专利第5,593,874号)和玉米shrunken1基因的内含子。也参见美国专利申请公开2002/0192813A1，其公开了用于有效的植物表达载体的设计的5’、3’以及内含子元件。在一些实施方案中，所述重组DNA构建体包括来自烟草花叶病毒的5’前导序列的翻译增强子(Shuzeski等人，1990)。公知的3’元件包括来自根癌土壤杆菌基因的那些元件诸如nos3’、tml3’、tmr3’、tms3’、ocs3’、tr73’，例如美国专利第6,090,627中所公开的；来自植物基因诸如小麦(普通小麦(Triticumaesevitum))热激蛋白17(Hsp173’)、小麦泛素基因、小麦果糖-1，6-二磷酸酶基因、水稻谷蛋白基因、水稻乳酸脱氢酶基因和水稻β-微管蛋白基因的3’元件，所有所述元件公开于美国专利申请公开2002/0192813A1中；以及豌豆(豌豆(Pisumsativum))核酮糖二磷酸羧化酶基因的3’元件(rbs3’)和来自宿主植物内的基因的3’元件。所述重组DNA构建体可包括转运肽或信号肽的DNA。在一些实施方案中，所期望的是，所述重组DNA构建体包括核定位信号来将所产生的蛋白质靶向细胞核以促进核HD-ZipII类蛋白的抑制活性的干扰。在转化的实施中，在任何一个转化实验中所述重组DNA构建体通常只被引入小百分比的靶植物细胞中。因此，在一些实施方案中，期望公开的重组DNA构建体还包括允许鉴定转化的细胞的选择性标记。某些选择标记基因提供赋予对选择的试剂诸如抗生素或除草剂的抗性的选择性标记。本发明的植物对其具有抗性的任何除草剂是针对选择标记的有用试剂。将可能转化的细胞暴露于选择试剂。在存活细胞的群体中，存活细胞是其中通常地赋予抗性的基因被整合并且以充足的水平表达以允许细胞存活的那些细胞。可进一步测试细胞以确认外源DNA的稳定整合。通常使用的选择性标记基因包括赋予对抗生素诸如卡那霉素和巴龙霉素(nptII)、潮霉素B(aphIV)、壮观霉素(aadA)和庆大霉素(aac3和aacC4)的抗性或对除草剂诸如草丁膦(bar或pat)、麦草畏(DMO)和草甘膦(aroA或EPSPS)的抗性的那些选择性标记基因。此类选择性标记的实例在美国专利5,550,318、5,633,435、5,780,708和6,118,047号中进行了举例说明。还可使用提供可视地筛选转化体的能力的标记，例如，表达有色或荧光蛋白诸如荧光素酶或绿色荧光蛋白的(GFP)的基因或表达用于其的各种生色底物是已知的GUS蛋白的基因。
在一些实施方案中，受内源性HD-ZipII类蛋白调控基因是编码HD-ZipII类蛋白的基因(HD-ZipII类蛋白的自动调控)。在其它实施方案中，受内源性HD-ZipII类蛋白调控的基因为玉米HD-ZipII类蛋白。在其它实施方案中，受内源性HD-ZipII类蛋白调控的基因为具有选自由SEQIDNO：19至SEQIDNO：36组成的组的氨基酸序列的玉米HD-ZipII类蛋白。经历HD-ZipII类蛋白的转录调控的基因，在干扰HD-ZipII类蛋白抑制基因表达的能力的蛋白质表达后，可经历表达的变化。受内源性HD-ZipII类蛋白调控的基因从而可通过转录物分析来鉴定，所述转录物分析测量缺乏干扰HD-ZipII类抑制活性的蛋白质的植物与表达此类蛋白质的那些植物之间的基因表达的变化。可分析表达此类蛋白质的植物的内源性HD-ZipII类转录物的表达的变化。内源性HD-ZipII类表达的变化可通过靶向转录物分析或通过全局转录组分析来鉴定。
如本文中所用，术语“序列同一性”是指两个最佳比对的多核苷酸序列或两个最佳比对的多肽序列相同的程度。通过人工比对两个序列例如参照序列和另一个序列，以使在序列比对中与适当的内部核苷酸插入、缺失或缺口匹配的核苷酸的数目最大化来产生最佳序列比对。如本文中所用，术语“参照序列”是指例如作为SEQIDNO：92至SEQIDNO：130的多核苷酸序列提供的序列。
如本文中所用，术语“百分比序列同一性”或“百分比同一性”或“同一性％”是同一性分数乘以100。与参照序列最佳比对的序列的“同一性分数”是在最佳比对中匹配的核苷酸数目除以参照序列中的核苷酸的总数，例如整个参照序列的全长中的核苷酸的总数。因此，一个实施方案，所述重组DNA构建体中包含的编码蛋白质的DNA分子编码如下蛋白质，所述蛋白质具有与具有由SEQIDNO：92至SEQIDNO：130中的一个所示的氨基酸序列的蛋白质具有至少60％同一性的氨基酸序列。在其它实施方案中，所述重组DNA构建体中包含的编码蛋白质的DNA分子编码如下蛋白质，所述蛋白质具有在由SEQIDNO：92至SEQIDNO：130中的一个所示的蛋白质的全长上与其具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。与具有由SEQIDNO：92至SEQIDNO：130中的一个所示的氨基酸序列的蛋白质具有至少指定的百分比同一性的蛋白质通过例如手工地比较氨基酸序列，或通过使用基于计算机的工具，利用已知的基于同源性的搜索算法诸如可获自NCBI的BLAST程序的套件比较氨基酸序列来鉴定。
植物和植物细胞
在其它实施方案中，提供了包含所公开的重组DNA构建体的植物和植物细胞。虽然所述植物和植物细胞可以是任何商业植物(例如，大豆、玉米、小麦、水稻、棉花、油菜、甘蔗和甜菜)，但在一个实施方案中，所述植物和植物细胞来自玉米。
可通过经由靶向或随机插入的转化过程产生包含所公开的重组DNA构建体的植物中通过定向或随机插入产生。用于用重组DNA转化植物细胞中的染色体的许多方法在本领域中是已知的，并且用于制备转基因植物细胞和植物的方法。用于此类转化的两个示例性方法为土壤杆菌介导的转化和微粒轰击。微粒轰击法在如下专利或专利申请公开中进行了举例说明：美国专利第5,015,580号(大豆)、第5,550,318号(玉米)、第5,538,880号(玉米)、第5,914,451号(大豆)、第6,160,208号(玉米)；第6,399,861号(玉米)；第6,153,812号(小麦)和第6,365,807号(水稻)，土壤杆菌介导的转化以下专利或专利申请中进行了描述：美国专利第5,159,135号(棉花)、第5,824,877号(大豆)、第5,463,174号(芸苔)、第5,591,616号(玉米)、第5,846,797号(棉花)、第6,384,301号(大豆)、第7,026,528号(小麦)和第6,329,571号(大米)、美国专利申请公开第2004/0087030A1号(棉花)、美国专利申请公开第2013/0055472号(甘蔗)，美国专利申请公开第2013/0152232号(甘蔗)和美国专利申请公开第2001/0042257A1号(甜菜)，所有所述专利或专利申请或专利申请公开中关于使得能够产生转基因植物的内容通过引用并入本文。
还可在引入植物细胞之前体外制备用于基因组编辑的蛋白质。用于制备此类蛋白质的方法取决于它们的类型和性质，并且为本领域技术人员所已知。一旦获得粗制的、部分纯化的或完全纯化的蛋白质，则可经由电穿孔，通过利用涂覆有此类蛋白质的颗粒的微粒轰击，通过化学转染或通过一些用于跨细胞膜转运的其它方法将它们引入例如植物细胞。
除了利用重组DNA直接转化植物材料以外，可通过将具有在细胞核中拥有所述重组DNA或改变的内源性基因的细胞的第一植物与缺乏所述重组DNA或改变的内源性基因的第二植物杂交来制备转基因植物细胞或植物。例如，可将重组DNA引入易于转化的第一植物品系，以及将该品系与第二植物品系杂交来将所述重组DNA渗入所述第二植物品系。在另一个实例中，可通过在第一植物中进行基因组编辑来改变内源性基因，随后可通过杂交将所述改变的内源基因渗入第二植物。可将具有提供增强的本文中公开的性状的重组DNA或改变的内源性基因的植物，与具有赋予另一种性状例如除草剂耐受性或抗虫性的其它重组DNA和/或改变的内源性基因的转基因植物杂交，以产生具有赋予这两种性状的重组DNA和/或改变的内源性基因的后代植物。该杂交的后代将分离，以便一些植物将携带两个亲本性状的DNA，以及一些植物将具有一个亲本性状的DNA；此类植物可通过与亲本重组DNA或改变的内源性基因结合的标记，例如通过所述重组DNA或所述改变的内源性基因的分析进行的标记鉴定，或者在其中选择性标记被包含在所述重组DNA构建体中的情况下，通过应用选择试剂诸如与除草剂耐受性标记一起使用的除草剂，或通过对增强的性状的选择来进行鉴定。可将携带两个亲本性状的DNA的后代植物回交至雌性亲代品系中数次，例如通常6至8代，以产生具有与原始转基因亲本品系基本上相同的基因型，但具有其它转基因亲本品系的所述重组DNA或改变的内源性基因的后代植物。
在其它实施方案中，所述植物和植物细胞包含产生蛋白质的重组DNA构建体，其中所产生的蛋白质为在选自由以下组成的组的结构域中具有功能丧失型突变的HD-ZipII类转录因子：转录抑制结构域、同源结构域、亮氨酸拉链结构域和C末端中的CXXCX样基序。如上所述，通过经由植物品系的转化或杂交引入重组DNA构建体产生此类植物和植物细胞，所述重组DNA构建体，当在植物细胞(如通过关于重组DNA构建体的部分中描述的方法产生的)中表达时，产生在所述结构域中的一个中具有功能丧失型突变的HD-ZipII类转录因子。
在其它实施方案中，所述植物和植物细胞包含产生RNA分子的重组DNA构建体，其中所产生的RNA分子抑制靶HD-ZipII类蛋白的表达。如上所述，通过经由植物品系的转化或杂交引入重组DNA构建体来产生此类植物和植物细胞，所述重组DNA构建体，当在植物细胞(如通过关于重组DNA构建体的部分中描述的抑制方法产生的)中表达时，产生抑制靶HD-ZipII类蛋白的表达的RNA分子。
在其它实施方案中，所述植物和植物细胞包含重组DNA构建体，所述重组DNA构建体，当在植物或植物细胞中表达时，在编码内源性HD-ZipII类蛋白的基因中产生功能丧失型突变，或改变内源性HD-ZipII类蛋白的表达。在一些实施方案中，所述植物或植物细胞包含重组DNA构建体，所述重组DNA构建体，当在植物或植物细胞中表达时，产生增加内源性HD-ZipII类蛋白的表达的功能丧失型突变。此类功能丧失型突变可存在于选自由转录抑制结构域、同源结构域、亮氨酸拉链结构域或C末端中的CXXCX样基序组成的组的结构域中。如上所述，通过经由植物品系的转化或杂交引入重组DNA构建体来产生此类植物和植物细胞，所述重组DNA构建体，当在植物细胞(如通过关于重组DNA构建体的部分中描述的基因组编辑方法产生的)中表达时，在编码内源性HD-ZipII类蛋白的基因中产生功能丧失型突变或改变内源性HD-ZipII类蛋白的表达。
在某些实施方案中，包含所述重组DNA构建体或改变的内源性基因的玉米植物相对于缺乏所述重组DNA构建体或改变的内源性基因的对照玉米植物具有增强的性状。在一些方面，增强的性状为保绿、增加的穗生物质、增加的穗大小、增加的穗径、增加的穗长、增加的种子大小、增加的每植物种子数、增加的种子重量、增加的荚果/角果大小、增加的每植物荚果/角果数、增加的荚果/角果重量、增加的棉铃大小、增加的棉纤维长度、增加的每植物棉铃数目、增加的圆锥花序和增加的产量。具有增加的穗生物质、增加的穗大小、增加的穗径、增加的穗长、增加的种子大小、增加的每植物种子数、增加的种子重量、增加的荚果/角果大小、增加的每植物荚果/角果数、增加的荚果/角果重量、增加的棉铃大小、增加的棉纤维长度、增加的每植物棉铃数目、增加的圆锥花序和增加的产量的植物，可通过测量来自生长至如实施例9中所述的R1阶段的植物的这些特征和鉴定具有所述重组DNA构建体或改变的内源基因的那些植物(所述植物显示相对于缺乏所述重组DNA构建体的那些植物的这些特征的提高)来鉴定。表现出保绿表型的植物，可通过在植物生长的R5阶段鉴定具有显示至少50％的其穗下面积绿色(如实施例10中所述的)的叶子的植物和鉴定显示相对于缺乏所述重组DNA构建体的那些植物的这些性状的增强的具有所述重组DNA构建体或改变的内源性基因的那些植物，来进行鉴定。
表2提供了表达具有部分抑制结构域的ATHB17Δ113的玉米植物的某些表型特征(性状名称(TraitName))的概述。计算来自两个转基因事件(事件(Event))的许多(N)不同植物中的每一个表型的平均(平均(Mean))值，和将所述平均值与非转基因对照的平均值(对照平均值(Controlmean))相比较。基于转基因与非转基因植物之间的每一个表型的绝对(Δ)和百分比变化(Δ％)来评估转基因与非转基因植物之间的变化的统计显著性(P值)。如本文中所用，术语“穗”可指单独的穗，或穗、结合的壳、结合的穗丝组织和结合的柄组织的任意组合。
表2.表达ATHB17Δ113的转基因玉米事件的表型特征
用于产生和培育具有增强的性状的植物的方法
在另一个实施方案中，公开了用于产生具有增强的性状的植物的方法。所述增强的性状可包括，但不限于，保绿、增加的穗生物质、增加的穗大小、增加的穗径、增加的穗长、增加的种子大小、增加的每植物种子数、增加的种子重量、增加的荚果/角果大小、增加的每植物荚果/角果数、增加的荚果/角果重量、增加的棉铃大小、增加的棉纤维长度、增加的每植物棉铃数目、增加的圆锥花序和增加的产量。所述方法包括步骤：(a)将重组DNA构建体掺入植物中，所述重组DNA构建体，当在植物中表达时，产生干扰内源性HD-ZipII类蛋白抑制受内源性HD-ZipII类蛋白调控的基因的DNA转录的能力的蛋白质；和(b)从表达所述重组DNA构建体的植物中选择植物，其中所选择的植物具有相对于缺乏所述重组DNA构建体的对照植物的选自由以下组成的组的增强的性状：保绿、增加的穗生物质、增加的穗大小、增加的穗径、增加的穗长、增加的种子大小、增加的每植物种子数、增加的种子重量、增加的荚果/角果大小、增加的每植物荚果/角果数、增加的荚果/角果重量、增加的棉铃大小、增加的棉纤维长度、增加的每植物棉铃数目、增加的圆锥花序和增加的产量。在某些实施方案中，所述方法还包括确定所述DNA构建体是否被稳定地整合进植物的基因组中或由所述重组DNA构建体产生的蛋白质是否被表达。在其它实施方案中，所述植物为玉米植物。
在一个实施方案中，从所述重组DNA构建体在掺入了述重组DNA构建体的植物中的表达产生的蛋白质为在选自由以下组成的组的结构域中具有功能丧失型突变的HD-ZipII类转录因子：转录抑制结构域、同源结构域、亮氨酸拉链结构域和C末端中的CXXCX样基序。在另一个实施方案中，所产生的蛋白质通过与内源性HD-ZipII类蛋白的蛋白质间相互作用干扰内源性HD-ZipII类蛋白抑制DNA转录的能力。在其它实施方案中，所产生的蛋白质通过与内源性HD-ZipII类蛋白竞争DNA结合来干扰内源性HD-ZipII类蛋白抑制DNA转录的能力。在另一个实施方案中，利用其转化植物的重组DNA构建体包含编码蛋白质的编码蛋白质的DNA分子，所述蛋白质具有与具有由SEQIDNO：92至SEQIDNO：130中的一个所示的氨基酸序列的蛋白质具有至少60％同一性的氨基酸序列。如上所述待用于所述方法的蛋白质的实例，所述实例是如实施例15中的表11中所列的。
在另一个实施方案中，公开了产生具有增强的性状的植物的方法。所述方法包括步骤：a)将重组DNA构建体掺入植物中，所述重组DNA构建体，当在植物中表达时，产生干扰靶HD-ZipII类的表达的RNA分子；和(b)从表达所述重组DNA构建体的植物的亚群中选择植物，其中所选择的植物具有相对于不包含所述重组DNA构建体的对照植物的选自由以下组成的增强的性状的组的增强的性状：保绿、增加的穗生物质、增加的穗大小、增加的穗径、增加的穗长、增加的种子大小、增加的每植物种子数、增加的种子重量、增加的荚果/角果大小、增加的每植物荚果/角果数、增加的荚果/角果重量、增加的棉铃大小、增加的棉纤维长度、增加的每植物棉铃数目、增加的圆锥花序和增加的产量。在某些实施方案中，所述方法还包括确定所述DNA构建体是否被稳定地整合进植物的基因组中，或由所述重组DNA构建体产生的RNA是否被表达，或靶内源性HD-ZipII类蛋白的表达是否被减少或抑制。在其它实施方案中，所述植物为玉米植物。
在另一个实施方案中，公开了用于产生具有增强的性状的植物的方法。所述方法包括步骤：a)将重组DNA构建体掺入植物中，所述重组DNA构建体，当表达时，在编码内源性HD-ZipII类蛋白的基因中产生功能丧失型突变或改变内源性HD-ZipII类蛋白的表达；和b)从包含所述功能丧失型突变的植物的亚群中选择植物，其中所选择的植物具有相对于不包含所述重组DNA构建体的对照植物的选自由以下组成的增强的性状的组的增强的性状：保绿、增加的穗生物质、增加的穗大小、增加的穗径、增加的穗长、增加的种子大小、增加的每植物种子数、增加的种子重量、增加的荚果/角果大小、增加的每植物荚果/角果数、增加的荚果/角果重量、增加的棉铃大小、增加的棉纤维长度、增加的每植物棉铃数目、增加的圆锥花序和增加的产量。在某些实施方案中，所述方法还包括确定内源性HD-ZipII类蛋白的表达是否被改变。在其它实施方案中，所述植物为玉米植物。
在另一个实施方案中，具有功能丧失型突变的内源性蛋白质为在选自由以下组成的组的结构域中具有功能丧失型突变的HD-ZipII类转录因子：转录抑制结构域、同源结构域、亮氨酸拉链结构域和C末端中的CXXCX样基序。在另一个实施方案中，具有功能丧失型突变的内源性蛋白质通过与内源性HD-ZipII类蛋白的蛋白质间相互作用干扰内源性HD-ZipII类蛋白抑制DNA转录的能力。在其它实施方案中，所产生的功能丧失型蛋白质通过与内源性HD-ZipII类蛋白竞争DNA结合干扰内源性HD-ZipII类蛋白抑制DNA转录的能力。在另一个实施方案中，内源性HD-ZipII类基因中的功能丧失型突变存在于启动子中的II类DNA识别位点中，并且通过阻止内源性HD-ZipII类蛋白结合其启动子来干扰内源性HD-ZipII类蛋白抑制DNA转录的能力。
可通过植物或植物细胞的直接转化，或通过将具有与不具有如上所述的重组DNA构建体的植物杂交来掺入重组DNA构建体。所述重组DNA构建体在掺入了所述重组DNA构建体的植物中的表达可通过使用许多不同启动子(例如，组成型、诱导型、组织特性等)来发生。取决于所使用的启动子的类型，表达可能需要利用诱导剂的诱导，或可作为所述重组DNA构建体在植物或植物细胞中的存在的结果直接发生。可使用所述方法基于例如一个或多个性状的目测观察从表达所述重组DNA构建体的群体选择具有增强的性状的植物。
在另一个实施方案中，公开了用于培育具有增强的性状的植物的方法。所述方法包括步骤：(a)获得由具有如下性状的植物产生的种子：保绿、增加的穗生物质、增加的穗大小、增加的穗径、增加的穗长、增加的种子大小、增加的每植物种子数、增加的种子重量、增加的荚果/角果大小、增加的每植物荚果/角果数、增加的荚果/角果重量、增加的棉铃大小、增加的棉纤维长度、增加的每植物棉铃数目、增加的圆锥花序和增加的产量，其中所获得的种子包含重组DNA构建体，所述重组DNA构建体，当在植物或植物细胞中表达时，产生在转录抑制结构域、同源结构域、亮氨酸拉链结构域或C末端中的CXXCX样基序中具有功能丧失型突变的HD-ZipII类蛋白，和(b)种植所获得的种子，其中从种植的种子生长的植物为包含所述重组DNA构建体并具有以下增强的性状的植物的后代植物：保绿、增加的穗生物质、增加的穗大小、增加的穗径、增加的穗长、增加的种子大小、增加的每植物种子数、增加的种子重量、增加的荚果/角果大小、增加的每植物荚果/角果数、增加的荚果/角果重量、增加的棉铃大小、增加的棉纤维长度、增加的每植物棉铃数目、增加的圆锥花序和增加的产量。来自包含所述重组DNA构建体且具有增强的性状的植物的种子可获自许多来源。
在一个实施方案中，所述种子或植物包含重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包括编码如下蛋白质的编码蛋白质的DNA分子，所述蛋白质具有与具有由SEQIDNO：92至SEQIDNO：130中的一个所示的氨基酸序列的蛋白质具有至少60％同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述种子或植物为玉米种子或植物。
在另一个实施方案中，公开了培育具有增强的性状的植物的方法。所述方法包括步骤：(a)获得由具有如下性状的植物产生的种子：保绿、增加的穗生物质、增加的穗大小、增加的穗径、增加的穗长、增加的种子大小、增加的每植物种子数、增加的种子重量、增加的荚果/角果大小、增加的每植物荚果/角果数、增加的荚果/角果重量、增加的棉铃大小、增加的棉纤维长度、增加的每植物棉铃数目、增加的圆锥花序和增加的产量，其中所获得的种子包含重组DNA构建体，所述重组DNA构建体，当在植物或植物细胞中表达时，产生抑制靶内源性HD-ZipII类蛋白的表达的RNA分子；和(b)种植所获得的种子，其中从种植的种子生长的植物为包含所述重组DNA构建体并具有如下增强的性状的植物的后代植物：保绿、增加的穗生物质、增加的穗大小、增加的穗径、增加的穗长、增加的种子大小、增加的每植物种子数、增加的种子重量、增加的荚果/角果大小、增加的每植物荚果/角果数、增加的荚果/角果重量、增加的棉铃大小、增加的棉纤维长度、增加的每植物棉铃数目、增加的圆锥花序和增加的产量。来自包含所述重组DNA构建体并具有增强的性状的植物的种子可获自许多来源。在一个实施方案中，所述种子或植物为玉米种子或植物。
在另一个实施方案中，公开了用于培育具有增强的性状的植物的方法。所述方法包括步骤：(a)获得由具有如下性状的植物产生的种子：保绿、增加的穗生物质、增加的穗大小、增加的穗径、增加的穗长、增加的种子大小、增加的每植物种子数、增加的种子重量、增加的荚果/角果大小、增加的每植物荚果/角果数、增加的荚果/角果重量、增加的棉铃大小、增加的棉纤维长度、增加的每植物棉铃数目、增加的圆锥花序和增加的产量，其中所获得的种子包含改变的内源性HD-ZipII类基因；和(b)种植所获得的种子，其中从所述种植的种子生长的植物为包含改变的内源性HD-ZipII类基因并具有如下性状的增强的性状的植物的后代植物：保绿、增加的穗生物质、增加的穗大小、增加的穗径、增加的穗长、增加的种子大小、增加的每植物种子数、增加的种子重量、增加的荚果/角果大小、增加的每植物荚果/角果数、增加的荚果/角果重量、增加的棉铃大小、增加的棉纤维长度、增加的每植物棉铃数目、增加的圆锥花序和增加的产量。
在一个实施方案中，所述植物或种子是玉米植物或种子。来自包含改变的内源性HD-ZipII类基因和具有增强的性状的植物的种子可获自许多来源。
实施例
通过参考以下实施例将更容易地理解已被一般描述的本公开，所述实施例被包括来仅用于举例说明本发明的某些方面和实施例的目的，并且不旨在限制说明书或权利要求。本领域技术人应理解，类似的技术可被应用于可在任何商业植物或植物细胞中表达的干扰内源性HD-ZipII类转录因子的抑制活性的其它基因和/或蛋白质。
实施例1：ATHB17转基因玉米植物产生缺乏抑制结构域的截短的蛋白质
构建重组DNA构建体，其含有处于水稻肌动蛋白1启动子和35S增强子控制下的全长ATHB17编码序列、小麦叶绿素a/b结合蛋白的前导序列以及水稻肌动蛋白内含子和hsp173’多腺苷酸化序列。土壤杆菌介导的转化用于产生转基因玉米植物。
免疫印迹分析显示所表达的蛋白质(约20kDa)比对于全长蛋白质(约30kDa)所预期的大小小(图5)。ATHB17转录物序列分析确认截短的转录物因水稻肌动蛋白的内含子的选择性剪接而产生，从而导致相较于全长ATHB17缺乏前113个氨基酸的ATHB17蛋白。作为前113个氨基酸残基丢失的结果，玉米中表达的所述蛋白质缺少其独特的N末端，所述末端含有假定的跨膜结构域和抑制结构域(包括ERF相关脂质双嗜性抑制(EAR)样基序)的大部分，但保留其完整的HD和LZ结构域。基于ATHB17结构域的已知功能，所述截短的蛋白质可能将失去其转录抑制活性，但基于AtHB17结构域的已知功能，保留其二聚化和DNA结合性质。
实施例2：测试HD-ZipII类蛋白的DNA结合性质
HD-ZipI和II蛋白在体内条件下结合类似的顺式元件(CAAT(N)ATTG)(Sessa等人，EMBOJ12：3507-3517，1993)；Meijer等人，MolGenGenet263：12-21，2000)；Frank等人，PlantJCellMolecBiol15：413-421，1998)；Deng等人，PlantMolBiol49：601-610，2002)。HD-ZipII成员优先结合伪-回文序列CAAT(C/G)ATTG(SEQIDNO：55)(Sessa等人，EMBOJ12：3507-3517，1993)，然而HD-ZipI亚家族的成员优先结合在中央核苷酸上与HD-ZipII的伪-回文序列不同的伪-回文序列(CAAT(A/T)ATTG)(SEQIDNO：56)(Ariel等人，TrendsPlantSci12：419-426，2007)。对于I类和II类识别序列，使用表面等离子体共振(SPR)测定体外测试ATHB17Δ113的DNA结合性质。本测定中使用的寡核苷酸为CAGACAATCATTGCGGC(II类)、CAGACAATTATTGCGGC(I类)和CAGCTCAGTCTGACGGC(非共有序列)，其中在寡核苷酸的5’末端和3’末端上侧连4个核苷酸的伪-回文序列加以下划线。
结果显示ATHB17Δ113蛋白结合I类(KD＝37.7+14.0)和II类(KD＝20.4+3.3)DNA识别序列。结合的动力学分析表明I类序列具有较高的平衡解离常数，这表明ATHB17Δ113在体外具有较高的结合II类DNA识别序列的亲和力。
实施例3：鉴定ATHB17Δ113与内源性玉米HD-ZipII类蛋白之间的假定的相互作用
通过酵母双杂交测定来鉴定ATHB17Δ113与内源性玉米HD-ZipII类蛋白之间的假定的蛋白质间相互作用。将ATHB17全长和多个片段在通过HybrigenicsSA(Paris，France)进行的酵母双杂交筛选中用作诱饵。将编码ATHB17的全长cDNA克隆入pB27和pB29(LexA-C和N末端融合物)，将EAR基序区1-91克隆入pB29(LexAN-末端融合物)，将同源结构域区128-234克隆入pB27(LexAC-末端融合物)，将亮氨酸拉链结构域区域114-275克隆入pB27(LexAC末端融合物)。将这些诱饵构建体用于筛选从来自愈伤组织、黄化幼苗、V3幼苗、穗花序、正在发育的籽粒和穗叶的玉米RNA制备的随机引物引导的cDNA文库。筛选111,000,000-139,000,000个克隆(文库的11-14倍覆盖)。通过PCR扩增对应于330个阳性“猎物”克隆的cDNA片段，在它们的5′和3′连接处进行测序。针对适当的数据库搜索所得的序列，赋予其表示相互作用的置信度的质量分数。
几种玉米HD-ZipII类蛋白，但无其它种类的HD-Zip蛋白，被鉴定为假定的与ATHB17Δ113相互作用的蛋白质。使用基于已知的HD-ZipII类蛋白的结构域结构的生物信息学方法鉴定另外的玉米HD-ZipII类蛋白。
实施例4：确定ATHB17Δ113与内源性玉米HD-ZipII类蛋白的蛋白质间相互作用
使用基于珠粒的共免疫沉淀测定在玉米原生质体中测试18个鉴定的玉米HD-ZipII类蛋白中的13个蛋白的与ATHB17Δ113的蛋白质间相互作用。将ATHB17Δ113的C末端MYC-HA融合物与每一个玉米HD-ZipII类编码序列的C末端CFP融合物共转化入玉米叶的原生质体。从12日龄的植物分离玉米叶的原生质体(Sheen等人，PlantPhysiology79：1072-1076，1985)，并用PEG介导的转化法进行转化。将原生质体在22℃孵育18至24小时，随后将其以150xg沉淀，持续3分钟。重悬浮所述原生质体，将300μl转移至96-深孔板，以150xg离心3分钟。在重悬浮于20μl的孵育缓冲液后，裂解原生质体。将蛋白质裂解物以3000xg离心5分钟，保留可溶性级分以用于基于Luminex的共免疫沉淀(co-IP)测定。
将针对CFP、Myc和HA的捕获抗体共价偶联于羧化的荧光微球体(Luminex)。将CFP、Myc和HA的生物素化抗体用于在小型化夹心免疫测定中检测相互作用的猎物蛋白质。将NeutrAvidinR-藻红蛋白用作报道分子。使用小型化夹心免疫测定和co-IP法(如由Qi等(JBiolChem287：31482-31493，2012)描述的)检测ATHB17MYC：：HA双标记和CFP构建体的蛋白质表达。将模拟转化的原生质体的样品、单独的诱饵和单独的猎物用于测定Luminex测定的本底信号。
将缀合于生物素的抗CFP抗体用于确定所述复合物是否包括玉米HD-ZipII蛋白。如图5中所示，当单独转化ATHB17Δ113：：MYC-HA或HD-ZipII类：：CFP时未鉴定高于本底水平的信号。然而，当将ATHB17Δ113：：MYC-HA与含有HD-ZipII类：：CFP的构建体共转化时，观察到阳性信号。此外，在HD-ZipI类蛋白与ATHB17Δ113之间未检测到相互作用。这些结果表明当在玉米中表达时，ATHB17Δ113与HD-ZipII类蛋白形成异二聚体，从而具有影响与玉米HD-ZipII类蛋白相关的活性和途径的潜能。
实施例5：测定ATHB17Δ113的转录抑制
已显示ATHB17蛋白用作与几种其它HD-ZipII类蛋白(包括AtHB2和HAT2)类似的转录阻遏物(Ohgishi等人，PlantJ25：389-398，2001；Agalou等人，PlantMolBiol66：87-103，2007；Zhao等人，PLoSOne6：e28488，2011)。由于ATHB17Δ113缺乏大部分抑制结构域，因此，使用两个由GUS基因和位于35S(-45)最小启动子与e35S双重增强子之间的I类或II类DNA结合序列组成的报道分子构建体，在玉米叶的原生质体抑制/激活测定中测试其以确定其是否要用作转录激活物或阻遏物。对照报道分子构建体既不含有I类也不含有II类结合序列。如先前实施例中所述，转化原生质体。以每转化4个技术重复测试每一个处理。生物学重复由在于不同天分离的原生质体中测试的相同处理组成。
通过共转化递增量的ATHB17表达质粒与恒定量的报道分子质粒来测量转录。对于少至40ng的ATHB17表达质粒观察到II类启动子的抑制，并且所述抑制直至630ng的ATHB17表达质粒是剂量反应性的(图6)。在160ng的ATHB17表达质粒下观察到I类启动子的抑制，并且所述抑制在630ng时增加。未观察到缺乏DNA结合位点的对照启动子的抑制。因此，ATHB17可抑制从含有II类和，在较低的程度上，I类DNA结合位点的启动子的的转录。与通过全长ATHB17蛋白显示的GUS表达的抑制相反，当将ATHB17Δ113质粒与报道分子质粒共转化时，未观察到I类：：GUS或II类：：GUS表达的抑制或激活(图6)。该结果显示所述抑制活性因抑制结构域的截短而丧失。
实施例6：ATHB17Δ113用作HD-ZipII类蛋白的显性负性调节剂
虽然ATHB17Δ113不用作阻遏物，但所述蛋白保持其二聚化和DNA结合性质。因此，其可能的功能是通过显性负性机制减弱内源性HD-ZipII类蛋白的活性。所述显性负性机制可通过具有减小的DNA结合活性的非功能性同二聚体或异二聚体的形成或通过竞争DNA结合来发生。
为了评估ATHB17Δ113用作显性负性调节剂的能力，检查其解除全长ATHB17蛋白的抑制活性的能力。将先前实施例中描述的玉米原生质体系统用于共转化报道分子构建体与0.20μg全长ATHB17质粒和递增量的ATHB17Δ113质粒。随着递增量的ATHB17Δ113添加，由全长ATHB17引起的报道基因表达的抑制逐渐解除。只有当报道基因盒含有II类DNA结合序列时，才观察到该显性负性作用。当报道基因盒含有I类DNA结合序列或不含DNA结合序列时，未检测到表达水平的显著变化。基于如先前实施例中所述的体外测定中的较低的对I类序列的结合亲和力和当报道分子构建体含有I类序列时总体上较小的对表达的作用的观察，ATHB17更加活跃地抗在启动子区中具有II类DNA结合序列的基因。
为了进一步评估ATHB17Δ113是否还可用作内源性玉米HD-ZipII类转录因子的显性负性调节剂，克隆玉米HD-ZipII类家族的13个成员，并如先前实施例中所述，首先在玉米叶的原生质体中测试所述成员的活性。当GUS构建体含有I类或II类DNA结合序列时，所有13个HD-ZipII类蛋白以剂量依赖性方式显示针对GUS表达的抑制活性，这表明玉米HD-ZipII类蛋白在体内用作转录抑制剂。为了确定ATHB17Δ113是否具有用作玉米HD-ZipII类蛋白的显性负性调节剂的能力，将每一个玉米HD-ZipII类构建体(20ng)与报道分子构建体和递增量的ATHB17Δ113构建体共转化。当报道分子构建体在启动子区域中含有II类DNA结合序列时，对于所有测试的HD-ZipII类蛋白观察到递增量的ATHB17Δ113DNA对玉米HD-ZipII类的抑制活性的剂量依赖性解除(图2)。相反地，当报道分子构建体含有I类DNA结合序列或不含DNA结合序列(对照构建体)时，未观察到ATHB17Δ113对报道分子表达的恒定的剂量依赖性作用。这些结果确认了ATHB17Δ113蛋白可用作内源性玉米HD-ZipII类蛋白(其抑制从含有II类DNA结合位点的启动子的转录)的显性负性调节剂。该结果进一步表明由ATHB17Δ113施加的显性负性调控的机制应当包括对II类DNA结合位点的竞争。
实施例7：ATHB17功能丧失型突变及它们对DNA结合的作用
通过将ATHB17蛋白序列与哺乳动物HD和其它植物HD-Zip转录因子的那些序列相比较来产生ATHB17氨基酸取代和结构域缺失。如实施例2中所述，在Biacore2000上使用SPR评估这些变体的DNA结合性质。
关于DNA结合的同源结构域中的突变
同源结构域(HD)在结构上由负责DNA结合的保守α-螺旋组成。已显示来自拟南芥的AtHB-1(HD-ZipI)和AtHB-2(HD-ZipII)的α-螺旋-III内的氨基酸V47、Q50和N51在DNA结合中起着至关重要的作用(Sessa等人，JMolBiol274：303-309，1997)。已针对engrailedHD描述了类似的结构和功能性质(Gehring等人，Cell78：211-223，1994)。在ATHB17Δ113的DNA识别α-螺旋-III内的对应残基V182、Q185和N186中产生突变。ATHB17Δ113-V182A-Q185A-N186A变体被产生来使用Biacore2000测量与靶DNA序列的实时相互作用。结果表示ATHB17Δ113-V182A-Q185A-N186A丧失其与CAAT(G/C)ATTG(BS2)和CAAT(T/A)ATTG(BS1)(表3)相互作用的能力。对于ATHB17Δ113同源结构域缺失变体ATHB17Δ113-Δ138-195)观察到类似结果(表3)。
表3.与BS2DNA相互作用的ATHB17Δ113变体的结合等温线。
*指示在所使用的浓度范围内无变体的结合(NB)。随机DNA不与测试的任何蛋白质相互作用。
Sessa等(JMolBiol274：303-309，1997)观察到AtHB-2突变R55K消除了伪回文序列CAAT(G/C)ATTG内的中央核苷酸(G/C)的优先识别，所述伪回文序列赋予HD-ZipII类特异性。为了评估AtHB-2-R55K等效物在ATHB17Δ113中的作用，产生变体ATHB17Δ113-R190K以用于DNA结合分析。对于ATHB17Δ113-R190K对BS1和BS2的结合分别获得结合解离常数KD＝25.70±11.6nM和KD＝68.24±4.2nM。已显示野生型ATHB17Δ113分别以37.7±14.0nM和20±3.3nM的亲和力与BS1和BS2相互作用。结果表明氨基酸取代R190K显著减小ATHB17Δ113对BS2的亲和力。因此，未观察到ATHB17Δ113-R190K对BS1的亲和力的显著变化。
黑腹颗蝇的Bicoid同源结构域中的保守的色氨酸-48对苯丙氨酸的取代(W48F)表明W-48在稳定对于DNA识别是必需的HD的结构特性中的至关重要的作用(Subramaniam等人，JBiolChem276(24)：21506-21511，2001)。定位在螺旋1中的HAB-4(HD-ZipI)中的苯丙氨酸-20是维持大部分HD的构象所需的疏水核的部分。HAB-4中的F20L丧失了结合DNA的能力(Palena等人，BiochemJ341：81-87，1999)。进行利用对应的ATHB17Δ113中的对应的W183F和F155L的DNA结合分析。W183F和F155L对BS2DNA靶的亲和力分别为11μM和3.6μM(表3)。对于这两种变体，BS2DNA结合显著减少，但未被完全抑制。虽然未观察到结合的完全丧失，但结合亲和力的减少的量表明，与Bc-HD中的保守W48和HAB-4中的F20一样，ATHB17Δ113中的W183和F155似乎稳定DNA识别所需的HD的结构完整性。
关于DNA结合的亮氨酸拉链结构域中的突变
先前已证明DNA结合需要AtHB-1和HaHB-4的特定同二聚化(Sessa等人，EMBOJ12(9)9：3507-3517，1993；Palena等人，BiochemJ341：81-87，1999)。HD-Zip同二聚化由与HD相邻的特定亮氨酸拉链结构域介导。所述亮氨酸拉链结构域通常为由7个氨基酸(七肽)的重复abcdefg组成的α螺旋结构，其牵涉蛋白之间相互作用，诸如导致称为螺旋卷曲的环绕结构的同二聚化和异二聚化。蛋白质间相互作用由位置a和d(位置d总是亮氨酸)上的形成疏水核的疏水残基驱动。除疏水核以外，蛋白质间相互作用还经由位置e和g上的带电荷的残基发生。位置b、c和f上的其它氨基也是暴露于溶剂的(O′Shea等人，Science254：539-544，1991)。ATHB17Δ113的亮氨酸拉链由4个七肽重复组成。研究ATHB17Δ113的亮氨酸拉链和亮氨酸拉链内的至关重要的氨基酸残基对DNA结合的贡献。ATHB17Δ113-T196A-L203A-L210A-L217A-L224A变体中的亮氨酸拉链的二聚化界面中的至关重要的亮氨酸残基的去除完全消除DNA对BS2的结合(表3)，从而确认了DNA结合需要同二聚化。ATHB17Δ113变体中的亮氨酸拉链结构域的缺失(ATHB17Δ113-Δ194-224)导致相较于ATHB17Δ113(KD＝20.4±3.3nM)的DNA结合活性的显著丧失(KD＝4800±3113nM)(表3)。
关于DNA结合的C末端中的CXXCX样基序中的突变
为了评估C末端中的CXXCX样基序中的半胱氨酸残基对DNA结合的作用，产生ATHB17Δ113的变体。变体ATHB17Δ113-C243S-C246S表现出对BS2的结合亲和力的减小(表3)。
另外，还含有亮氨酸拉链的位置a1上的半胺氨酸的突变(C200A)的变体ATHB17Δ113-C200A-C243S-C246S完全丧失了结合DNA的能力(表3)。该观察表明半胱氨酸-200在稳定亮氨酸拉链的结构组织中是至关重要的，从而使得二聚体ATHB17Δ113能够高效地结合同源DNA靶。
实施例8：ATHB17中的功能丧失型突变对转基因水稻和玉米的作用
使用本领域中已知的方法产生包含ATHB17功能丧失型变体的转基因水稻植物，并在标准条件下在自动化温室中测试其种子总重量。在一个实验中，表4中的结果显示3个变体(ATHB17-C243S-C246S、ATHB17-R190K和ATHB17Δ73-C243S-C246S)具有相较于对照植物的种子总重量的显著增加。
表4.具有HD-ZipII类变体的转基因水稻的种子总重量。
*p≤0.1时是显著的
在第二实验中，在标准条件下测试表4中的3个性能最高的变体。对于每一个构建体播种18株转基因阴性植物，但每构建体只选择3株用于评估。表5中显示的结果表示基于所述3个选择的事件的总体作用的每植物种子的总重量。在构建体水平上，包含ATHB17-R190K或ATHB17-C243S-C246S的转基因植物具有中性的种子总重量，然而包含ATHB17Δ73-C243S-C246S的转基因植物显示显著的种子总重量的减少。
表5.具有HD-ZipII变体的转基因水稻的种子总重量
还使用本领域中已知的方法产生包含ATHB17功能丧失型变体的转基因玉米植物，并在田间测试其宽亩产量，每一种变体使用约4-5个位置。结果概述于表6中。变体的大部分事件显示中性产量。然而，来自新变体的几个事件具有统计上显著的减小的产量。
表6.具有ATHB17变体的转基因玉米植物的宽亩产量。
实施例9：鉴定表达ATHB17Δ113的玉米植物的表型变化
测定表达ATHB17Δ113的玉米植物以鉴定表型变化。在2011年和2012年于Illinois，USA进行田间研究。在2001年于利用10个重复和单独组块的两个测试者的随机化完全区组设计中和在2012年于利用18个重复的GUBD(两个在试验中随机组块的测试者)中建立这些研究。将用于每一个条目的组块在一起的3个2-行小地块(总共6行)当作用于本研究的实验单位。用于准备和维护每一个研究位置的农艺措施具有区域特征。根据需要施用维护农药，并且在给定的位置在整个生产面积上一致地进行所有维护操作。
在R1生长期收集生物质样品。在2011年，收获给定区域的10株植物，并测量面积，而在2012年对来自1-m行的所有样品进行取样，并计数植物数目。通过在土壤水平切割茎杆来移取植物，将其分开成叶片、具有叶鞘的茎杆和幼穗(具有壳和柄)，随后在70℃下干燥，直至获得恒定的重量。单个地报告组分，并针对秸杆(叶和茎)和总(秸杆和幼穗)生物质将其求合。2011年的数据表示为g/m2，而2012年的数据经由协方差分析被转化成经植物数目调整的g/m2。在R1计算穗重量对总重量的比率以测定至发育中的穗的早期分配。
如表2中所示，两个表达ATHB17Δ113的转基因玉米事件均具有显著增加的穗干重，和计算的穗分配系数。
实施例10：鉴定表达ATHB17Δ113的玉米植物中的保绿表型
测定表达ATHB17Δ113的玉米植物以鉴定表现出保绿(或可选择地称为延迟的衰老)表型的植物。始于R5，随后大致此后每周一次，可视地评估显示至少50％的其穗下(包括穗叶)面积是绿色的绿叶的数目，并计数每处理小区10株植物上的所述绿叶数目。
当测试该表型时，在两年的时期中对于不同的种植日期，在不同的测试仪中在表达ATHB17Δ113的玉米植物中始终观察到保绿表型，即使结果不总是统计上显著的。
实施例11：鉴定不同玉米组织间的HD-ZipII类转录水平
分析不同发育阶段的各种玉米组织的HD-ZipII类转录物的表达。在不同发育时间点从田间生长的植物收集组织样品。提取RNA，分析18个HD-ZipII类基因的转录物表达。为了进行标准化，计算所有样品(3个条目X3个重复)的管家基因的平均表达水平。随后通过将管家基因的平均值除以管家基因(天冬酰胺酶)的每一个个别中位荧光强度(MFI)来获得校正/标准化因数。将该校正/标准化因数与每一个扣除每一个“性状”的MFI的个别本底(该组织类型内的数据点)相乘，随后进行Log2转化以获得每一个性状的最终标准化值。
玉米内源性HD-ZipII基因的转录物水平的结果示于图7中。图7A中的热图表示所述基因相对于各自组织和发育阶段中的管家基因的表达。灰色梯度显示在经Log2标度标准化的MFI表示的表达值；较暗的阴影指示较高的表达水平。白色代表表达低于本底。在给定的组织(Zmhdz19、21、25、30、33和35)和其中每一个基因被最高表达(荧光)的组织中具有最高表达的6个基因加框表示。图7B显示Zmhdz19、21、25、30、33和35在两个杂种的另外的组织和另外的发育阶段中的表达水平。8个HD-ZipII基因(Zmhdz18、20、23、24、2629、32和34)主要在生殖组织中表达；图7C显示这些基因在两个杂种的另外的组织和另外的发育阶段中的表达水平。在图7B和7C中，一个杂种中的表达水平以黑色显示，另一个以灰色显示。
实施例12：玉米HD-ZipII类转基因植物的表型评估
如实施例1中所述，从两种玉米HD-ZipII类蛋白的功能丧失型变体产生转基因玉米植物，在田间测试其产量。这些变体含有N末端截短(Zmhdz25Δ59，SEQIDNO：113以及Zmhdz18Δ45，SEQIDNO：107)，所述截短导致抑制结构域的部分去除(图4)。在标准农艺措施下，在低功耗18-位置/2-重复的宽亩产量试验中测试Zmhdz25D59的8个事件和Zmhdz18D45的7个事件。大多数事件显示相较于对照的中性产量，然而Zmhdz25Δ59的一个事件显示统计学上显著的产量的增加(p＜0.2)(图8A和B)。
在另一个实验中，在田间测试来自两种玉米HD-ZipII蛋白的N末端截短变体的转基因玉米植物的产量：Zmhdz29Δ59，SEQIDNO：114以及Zmhdz18Δ45，SEQIDNO：107。在标准农艺措施下，在6-位置宽亩产量试验中测试6个事件。大多数事件显示相较于野生型对照的中性产量，然而2个Zmhdz18Δ45事件和3个Zmhdz25Δ59事件显示统计学上显著的产量的增加(p＜0.2)(表7)。
表7.具有玉米HD-ZipII变体的转基因玉米植物的宽亩产量。
还使用本领域中已知的方法产生包含玉米HD-ZipII类功能丧失型变体的转基因水稻植物，并在自动化温室中测试其种子总重量。在实验1中，在非胁迫条件下连同ATHB17Δ113一起测试3个在抑制结构域中具有部分截短的玉米HD-ZipII类变体。表8中的结果表明虽然对于Zmhdz33Δ94和Zmhdz31Δ64的种子总重量是中性的，但其对于ATHB17Δ113和Zmhdz35Δ76相较于对照植物倾向于阳性。
表8.具有玉米HD-ZipII类截短变体的转基因水稻的种子总重量。
*p＝0.05
在另一个实验中，在标准条件下测试Zmhdz35Δ76植物。播种18株转基因阳性和18株转基因阴性植物，但只选择3株用于评估。表8中显示的结果表示基于3个选择的事件的总体作用的每植物的种子总重量。在构建体水平上，在p-值为0.05时，转基因植物显示了种子总重量的显著增加。
实施例13：改变内源性HD-ZipII调控的TALEN介导的定点基因修饰
本实施例描述玉米内源性HD-ZipII类基因Zmhdz34(SEQIDNO：17)的启动子区域中的TALEN介导的定点基因组修饰的实例，以举例说明针对改变的基因表达的内源性基因的突变的产生。本领域技术人员可使用相同或类似的技术/方法来在该或其它内源性HD-ZipII类基因的启动子或编码区中引入突变以改变它们的表达。
TALEN为通过将TALEDNA结合结构域与DNA切割结构域融合产生的人工限制性内切酶。为了突变特定的位点，TALEN对被设计和工程化来靶向DNA并在特定位点切割DNA。选择TALEN靶位点，其由被含有待突变的靶位点的约22个碱基的间隔子相隔的两个适当地定向的各自约19至25个碱基的TALE结合位点组成。Zmhdz34基因在基因的～3kb上游启动子区域中含有两个II类DNA结合位点和两个I类DNA结合位点(图9)。II类或I类DNA结合位点中的突变将干扰内源性HD-ZipII类蛋白对这些位点的结合，包括Zmhdz34对其启动子的结合。这可导致由Zmhdz34和/或其它内源性HD-ZipII蛋白引起的转录抑制的解除。表9显示了可用于在每一个I类或II类DNA位点中引入突变的TALEN对和间隔子序列的DNA序列。基于表9中所列的序列，包含结合期望的位点的适当的重复可变双残基(RVD)的TALEN可通过商业来源例如LifeTechnologies合成。还可类似地设计启动子区域中的其它突变。
一旦合成TALEN，就可使用本领域中已知的方法将它们构建成植物转化载体。此类植物转化载体含有2个TALEN表达盒和选择性标记盒。每一个盒可从5’至3’包含启动子(其在植物细胞中具有功能且可操作地连接于前导序列)、前导序列(其可操作地连接于内含子(对于单子叶植物转化载体))、内含子(其可操作地连接于编码序列(对于TALEN蛋白或选择性标记))、编辑序列(其可操作地连接于3’UTR)、3’UTR。
通过例如土壤杆菌介导的转化，使用本领域中已知的方法将植物转化载体引入植物。所引入的DNA构建体产生内切核酸酶，其在靶位点上切割内源性HD-ZipII类基因的DNA，从而导致所述基因的表达的中断或下调。
在选择和再生后，可使用本领域中公知的方法，诸如通过DNA测序，通过用于片段长度的分析的利用荧光寡核苷酸的PCR，通过测量Zmhdz34的转录物水平，或通过TILLING，或通过使用突变检测试剂盒来筛选再生的事件，以鉴定具有特定突变的事件。
还可诱导其它玉米HD-ZipII类蛋白的启动子区域中的类似突变以改变它们的表达。可在这些基因的I类或II类DNA位点中产生所述突变。I类和II类DNA结合位点的序列以及用于鉴定基因的上游启动子区域中的这些位点的方法在本领域中是已知的。转化载体还可被设计和构建来靶向除II类和I类DNA结合位点中外的启动子中的突变，以及HD-ZipII类的编码区中的突变。可如上所述进行植物的转化、选择和再生以及植物的筛选。18个玉米HD-ZipII类基因的上游启动子区域的序列已被鉴定并且示于表10中。
表10.玉米HD-ZipII类基因的上游启动子序列。
多肽SEQ ID NO： 启动子_基因名称
37 启动子_Zmhdz18
38 启动子_Zmhdz19
39 启动子_Zmhdz20
40 启动子_Zmhdz21
41 启动子_Zmhdz22
42 启动子_Zmhdz23
43 启动子_Zmhdz24
44 启动子_Zmhdz25
45 启动子_Zmhdz26
46 启动子_Zmhdz27
47 启动子_Zmhdz28
48 启动子_Zmhdz29
49 启动子_Zmhdz30
50 启动子_Zmhdz31
51 启动子_Zmhdz32
52 启动子_Zmhdz33
53 启动子_Zmhdz34
54 启动子_Zmhdz35
实施例14：miRNA对内源性HD-ZipII类基因表达的抑制
在本领域中描述了用于基因表达的各种方法和技术。本实施例描述使用工程化microRNA(miRNA)抑制玉米内源性HD-Zip基因Zmhdx26的非限制性方法，只为举例说明本公开的一个实施方案。
从具有SEQIDNO：75的天然序列的玉米miR159a前体分子设计和衍生编码工程化“miRZmhdz26”miRNA前体的DNA分子(SEQIDNO：77)。玉米miR159a前体分子具有以下序列：GCATCTGCTGTTCTTTATTTCTATACATACATATATACTATCATCGGTTATTTGCTTCTCTATTCTGTCCGAGTACTTTACGGTGTTCCGCACATAGATCTCGTGGCCGGCTGTTTTGCGCTTTCGCTTGCGTTTCTTGGCCCTGCTGGTGTTGACCGGTCCGAACGGGGGCAGATCGATGCTTTGGGTTTGAAGGAAGGGTCGTTCCGAAGGGCTGGTTCCGCTGCTCGTTCATGGTTCCCACTATCCTATCTCATCATGTGTATATATGTAATCCATGGGGGAGGGTTTCTCTCGTCTTTGAGATAGGCTTGTGGTTTGCATGACCGAGGAGCTGCACCGCCCCCTTGCTGGCCGCTCCATCCTGATCCACCCCTCCATTTTTTTTGCTTGTTGTGTCCTTCCTGGGACCTGAGATCTGAGGCTCGTGGTGGCTCACTGTAG(SEQIDNO：75)，其中成熟miRNA(SEQIDNO：76)的核苷酸由SEQIDNO：75的核苷酸位置382至402上的加以下划线的粗体文本标示。
工程化“miRZmhdz26”miRNA前体具有以下序列：
GCATCTGCTGTTCTTTATTTCTATACATACATATATACTATCATCGGTTATTTGCTTCTCTATTCTGTCCGAGTACTTTACGGTGTTCCGCACATAGATCTCGTGGCCGGCTGTTTTGCGCTTTCGCTTGCGTTTCTTGGCCCTGCTGGTGTTGACCGGTCCGAACGGGGGCAGATCGATGCTTTGGGTTTGAAGACTGGAGGAGCGCTGCAAGGCGAAGGGTCGTTCCGAAGGGCTGGTTCCGCTGCTCGTTCATGGTTCCCACTATCCTATCTCATCATGTGTATATATGTAATCCATGGGGGAGGGTTTCTCTCGTCTTTGAGATAGGCTTGTGGTTTGCATGACCGAGGAGCTGCACCGCCCCCTTGCTGGCCGCTC CATCCTGATCCACCCCTCCATTTTTTTTGCTTGTTGTGTCCTTCCTGGGACCTGAGATCTGAGGCTCGTGGTGGCTCACTGTAG，其中成熟miRNA(“miRZmhdz26”)的核苷酸由SEQIDNO：77的核苷酸位置382-402上的加以下划线的粗体文标示，并且称为miRNA*(“miRZmhdz26*”)的对应相对链的核苷酸由SEQIDNO：77的核苷酸位置196至216上的加以下划线的斜体文本指示。该miRZmhdz26前体在植物中被加工成人工“miRZmhdz26”成熟miRNA，其具有序列(以5’至3’方向)TCCTTGAAGCTCTCCTCCAGT(SEQIDNO：78，或者以3’至5’方向书写为TGACCTCCTCTCGAAGTTCCT)，并且其抑制玉米内源性基因Zmhdz26(SEQIDNO：9)。Zmhdz26具有以下序列：
ATGGAGCTGGGGCTGAGCCTGGGCGACGCGGCAGTGCCGGACGCCGGCAGGGCGGCTCCGGAGCTGGGCCTGGGGCTTGGGGTCGGGATTGGATCCAACGCCGCCGGAACCGGCAGGGGAAGCAAGGCGGCGGGGACGACGGGAACTACTGGGTGGTGGGCGGCGCCGGCCACACCGGAGTCGGCAGTGCGGCTCAGCCTCGTGTCCAGCCTCGGCCTTCAGTGGCCACCTCCGGACGGCGGCATCTGTCATGTAGGGCGCGACGAGGCGCCGGCGCGCGGCTTCGACGTGAACCGGGCGCCGTCGGTGGCGGGGAGCGCCCTGGCGCTGGAGGATGACGAGGAGGAGCCGGGCGCCGCGGCACTGTCGTCGTCGCCCAACGACAGCGCGGGCTCCTTCCCGCTGGACCTGGGAGGCCCACGCGCCCACGCCGAGGGCGCCGCGGCGCGGGCCGGCGGCGAGCGGTCCTCGTCTCGCGCCAGCGATGAGGACGAGGGCGCGTCCGCGCGCAAGAAGCTGCGCCTCTCCAAGGAGCAGTCTGCGTT GCACAGCACCCTCAACCCTAAGCAGAAGGCGGCGCTGGCGAAGCAGCTCAACCTCCGGCCGCGACAGGTAGAAGTCTGGTTCCAGAACCGCCGAGCCAGGACGAAGCTGAAGCAGACGGAGGTGGACTGCGAGTACCTGAAGCGCTGCTGCGAGACGCTGACGGAGGAGAACCGGCGGCTGCACAAGGAGCTCGCGGAGCTGCGCGCGCTCAAGACGGCGCCGCCCTTCTTCATGCGCCTCCCGGCCACCACCCTCTCCATGTGCCCCTCCTGCGAGCGCGTCGCCTCCGGCCCCAGCCCTGCCTCCACCTCGGCACCTGCGTCGTCCACGCCGCCTGCCACAGCCGCCACCACCGCCATCTCGTACGCTGCAGCAGCCGCCGCACCCGTGCGAGCCGACCACCGGCCCTCGTCGTTCGCCGCGCTGTTCGCGGCGACCCGCAGCTTCCCGCTGGCGTCCCAGCCGCGGCCGCCCGCGCCGGCGAGCAACTGCCTGTAG(SEQIDNO：9)，其包括具有序列 (SEQIDNO：79)的miRNA识别位点并且在SEQIDNO：9的核苷酸位置546-566上也由加以下划线的粗体文本指示。
使用本领域公知的方法制备包含上述DNA分子的重组DNA构建体。所述重组DNA构建体可包含编码工程化miRNA前体(其处于可操作地连接的启动子的控制之下)、前导序列和内含子(对于玉米转化载体)和3’UTR的表达盒。其还可包含选择性标记盒。通过例如土壤杆菌介导的转化或微粒轰击将所述重组DNA构建体引入植物或植物细胞。
在选择和再生转化植物后，通过本领域中公知的方法，诸如通过northerm印迹和PCR(对于转录物)，或通过免疫印迹(对于蛋白质水平)分析转基因植物。或者，筛选转基因植物的改变的表型。
实施例15：玉米HD-ZipII类的功能丧失型变体
通过与如先前部分中所述的鉴定的ATHB17蛋白变体的序列，和/或与哺乳动物HD和其它植物HD-Zip转录因子的已知变体的序列的比较，单独地或组合地产生玉米HD-ZipII类蛋白的每一个结构域或基序中的功能丧失型变体。所述突变包括，但不限于，N末端、抑制结构域中的EAR或EAR样基序或其它结构域、HD结构域、亮氨酸拉链结构域和含CXXCX样基序的C末端中的氨基酸取代或缺失。示例性变体示于表11中。可单独地产生这些变体或以不同的组合产生这些变体以产生另外的变体。
可以例如通过体外DNA合成或基于PCR的定点诱变将突变体外引入HD-ZipII类蛋白的编码序列。通常地，随后通过标准技术将工程化编码序列克隆入植物表达载体，随后通过例如土壤杆菌介导的转化引入植物，随后使用本领域中已知的各种方法筛选和再生转基因植物。可筛选转基因植物的本公开中公开的表型。
还可使用各种基因编辑技术诸如实施例13中所述的TALEN和本领域中已知的其它方法，将相同或相似的突变引入玉米内源性HD-ZipII类蛋白。
*由“；”分隔的N末端截短变体代表独立的变体。例如，列出了Zmhdz34的两个不同的变体：具有N末端28个氨基酸截短的变体，和具有N末端40个氨基酸截短的变体。
**由“/”连接的氨基酸取代是指同时发生的取代。例如，Zmhdz18变体L8A/L10A/L12A意指位置8、10和12上的3个亮氨酸残基均被突变成丙氨酸。“＞”分隔两个独立的变体，即“＞”之前的变体是“＞”之后的变体的独立变体。例如，在表中列出了Zmhdz35的3个独立变体：变体L13A/L15A/L17A/L19A、变体L55A/L57A/L59A和变体L156A/L158A。可使用3个变体的不同组合产生另外的变体。
N/A＝不适用的。

Claims (38)

1.一种包含可操作地连接于异源启动子的编码蛋白质的DNA的重组DNA构建体，所述构建体，当在植物或植物细胞中表达时，产生干扰内源性HD-ZipII类蛋白抑制至少一个受所述内源性HD-ZipII类蛋白调控的基因的DNA转录的能力的蛋白质。
2.根据权利要求1所述的重组DNA构建体，其中所述产生的蛋白质为HD-ZipII类转录因子。
3.根据权利要求2所述的重组DNA构建体，其中所述产生的蛋白质为在选自由以下组成的组的结构域中具有功能丧失型突变的HD-ZipII类转录因子：转录抑制结构域、同源结构域、亮氨酸拉链结构域和C末端中的CXXCX样基序。
4.根据权利要求3所述的重组DNA构建体，其中所述DNA分子编码蛋白质，所述蛋白质具有与具有SEQIDNO:92至SEQIDNO:130的氨基酸序列的蛋白质具有至少60％同一性的氨基酸序列。
5.根据权利要求1所述的重组DNA构建体，其中所述至少一个受所述内源性HD-ZipII类蛋白调控的基因为编码HD-ZipII类蛋白的基因。
6.根据权利要求5所述的重组DNA构建体，其中所述至少一个受所述内源性HD-ZipII类蛋白调控的基因为编码玉米HD-ZipII类蛋白的基因。
7.根据权利要求6所述的重组DNA构建体，其中所述玉米HD-ZipII类蛋白为SEQIDNO:19至SEQIDNO:36中的一个。
8.一种包含可操作地连接于异源启动子的编码RNA的DNA分子的重组DNA构建体，所述重组构建体，当在植物或植物细胞中表达时，产生抑制靶HD-ZipII类蛋白的表达的RNA分子。
9.根据权利要求8所述的重组DNA构建体，其中所述产生的RNA分子为选自由反义RNA、siRNA、miRNA和长的非编码RNA组成的组的RNA分子。
10.根据权利要求8所述的重组DNA构建体，其中所述植物或植物细胞为玉米植物或植物细胞并且所述靶HD-ZipII类蛋白为玉米HD-ZipII类蛋白。
11.根据权利要求10所述的重组DNA构建体，其中所述玉米HD-ZipII类蛋白为SEQIDNO:19至SEQIDNO:36中的一个。
12.一种包含可操作地连接于异源启动子的DNA分子的重组DNA构建体，所述重组DNA构建体，当在植物或植物细胞中表达时，在内源性HD-ZipII类基因中产生功能丧失型突变。
13.根据权利要求12所述的重组DNA构建体，其中所述功能丧失型突变存在于选自由以下组成的组的结构域中的基因的编码区中：转录抑制结构域、同源结构域、亮氨酸拉链结构域和C末端中的CXXCX样基序。
14.根据权利要求12所述的重组DNA构建体，其中所述功能丧失型突变存在于基因的调控区中。
15.根据权利要求12所述的重组DNA构建体，其中所述内源性HD-ZipII类基因中的功能丧失型突变为敲除突变。
16.根据权利要求12所述的重组DNA构建体，其中所述植物或植物细胞为玉米植物或植物细胞并且所述内源性HD-ZipII类蛋白为玉米HD-ZipII类蛋白。
17.根据权利要求16所述的重组DNA构建体，其中所述玉米HD-ZipII类蛋白为SEQIDNO:19至SEQIDNO:36中的一个。
18.一种植物或植物细胞，所述植物或植物细胞包含权利要求1、8或12的重组DNA构建体。
19.根据权利要求18所述的植物或植物细胞，其中所述植物或从所述植物细胞生长的植物具有相对于缺乏权利要求1、8或12的重组DNA构建体的对照植物的增强的性状，并且其中所述增强的性状选自由以下组成的组：保绿、增加的穗生物质、增加的穗大小、增加的穗径、增加的穗长、增加的种子大小、增加的每植物种子数、增加的种子重量、增加的荚果/角果大小、增加的每植物荚果/角果数、增加的荚果/角果重量、增加的棉铃大小、增加的棉纤维长度、增加的每植物棉铃数目、增加的圆锥花序和增加的产量。
20.根据权利要求19所述的植物，其中所述植物为玉米植物。
21.一种用于产生具有增强的性状的植物的方法，所述方法包括步骤：
(a)将重组DNA构建体掺入植物的群体中，所述重组DNA构建体，当在所述植物中表达时，产生干扰内源性HD-ZipII类蛋白抑制受所述内源性HD-ZipII类蛋白调控的基因的DNA转录的能力的蛋白质，和
(b)从包含所述重组DNA构建体的植物的亚群选择具有相对于不包含所述重组DNA构建体的对照植物的增强的性状的植物，所述增强的性状选自由以下组成的组：保绿、增加的穗生物质、增加的穗大小、增加的穗径、增加的穗长、增加的种子大小、增加的每植物种子数、增加的种子重量、增加的荚果/角果大小、增加的每植物荚果/角果数、增加的荚果/角果重量、增加的棉铃大小、增加的棉纤维长度、增加的每植物棉铃数目、增加的圆锥花序和增加的产量。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述重组DNA构建体为权利要求2的重组DNA构建体。
23.根据权利要求21所述的方法，其中所述重组DNA构建体为权利要求3的重组DNA构建体。
24.根据权利要求21所述的方法，其中所述重组DNA构建体为权利要求4的重组DNA构建体。
25.根据权利要求21所述的方法，其中所述植物为玉米植物。
26.一种用于产生具有增强的性状的植物的方法，所述方法包括步骤：
(a)将重组DNA构建体掺入植物的群体中，所述重组DNA构建体，当在所述植物中表达时，产生抑制靶HD-ZipII类蛋白表达的RNA分子；和
(b)从包含所述重组DNA构建体的植物的亚群选择具有相对于不包含所述重组DNA构建体的对照植物的增强的性状的植物，所述增强的性状选自由以下组成的组：保绿、增加的穗生物质、增加的穗大小、增加的穗径、增加的穗长、增加的种子大小、增加的每植物种子数、增加的种子重量、增加的荚果/角果大小、增加的每植物荚果/角果数、增加的荚果/角果重量、增加的棉铃大小、增加的棉纤维长度、增加的每植物棉铃数目、增加的圆锥花序和增加的产量。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述重组DNA构建体为权利要求9的重组DNA构建体。
28.根据权利要求26所述的方法，其中所述植物为玉米植物并且所述靶HD-ZipII类蛋白为玉米HD-ZipII类蛋白。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述玉米HD-ZipII类蛋白为SEQIDNO:19至SEQIDNO:36中的一个。
30.一种用于产生具有增强的性状的植物的方法，所述方法包括步骤：
(a)将重组DNA构建体掺入植物的群体中，所述重组DNA构建体构建体，当表达时，在内源性HD-ZipII类基因中产生功能丧失型突变；和
(b)从包含所述功能丧失型突变的植物的亚群选择具有相对于不包含所述功能丧失型突变的对照植物的增强的性状的植物，所述增强的性状选自由以下组成的组：保绿、增加的穗生物质、增加的穗大小、增加的穗径、增加的穗长、增加的种子大小、增加的每植物种子数、增加的种子重量、增加的荚果/角果大小、增加的每植物荚果/角果数、增加的荚果/角果重量、增加的棉铃大小、增加的棉纤维长度、增加的每植物棉铃数目、增加的圆锥花序和增加的产量。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述重组DNA构建体为权利要求13的重组DNA构建体。
32.根据权利要求30所述的方法，其中所述重组DNA构建体为权利要求14的重组DNA构建体。
33.根据权利要求30所述的方法，其中所述重组DNA构建体为权利要求15的重组DNA构建体。
34.根据权利要求30所述的方法，其中所述植物为玉米植物并且所述内源性HD-ZipII类蛋白为玉米HD-ZipII类蛋白。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述玉米HD-ZipII类蛋白为SEQIDNO:19至SEQIDNO:36中的一个。
36.一种用于产生具有增强的性状的植物的方法，所述方法包括获得和种植由权利要求19的植物产生的种子，其中由所述种植的种子生长的植物为具有增强的性状的后代植物，所述增强的性状选自由以下组成的组：保绿、增加的穗生物质、增加的穗大小、增加的穗径、增加的穗长、增加的种子大小、增加的每植物种子数、增加的种子重量、增加的荚果/角果大小、增加的每植物荚果/角果数、增加的荚果/角果重量、增加的棉铃大小、增加的棉纤维长度、增加的每植物棉铃数目、增加的圆锥花序和增加的产量。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述种子包含权利要求1、8或12的重组DNA构建体。
38.根据权利要求36所述的方法，其中所述植物为玉米植物。
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