CN105616400A

CN105616400A - 一类牛蒡子苷元氨基甲酸酯衍生物在制备用于治疗阿尔茨海默病的药物中的用途

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Publication number: CN105616400A
Application number: CN201410619560.5A
Authority: CN
Inventors: 胡立宏; 沈旭; 雷敏; 朱志远; 刘军华; 陈静
Original assignee: Shanghai Institute of Materia Medica of CAS
Current assignee: Shanghai Institute of Materia Medica of CAS
Priority date: 2014-11-05
Filing date: 2014-11-05
Publication date: 2016-06-01

Abstract

本发明涉及如下通式I所示的一类牛蒡子苷元氨基甲酸酯衍生物在制备用于治疗阿尔茨海默病的药物中的用途。所述牛蒡子苷元氨基甲酸酯衍生物能降低β-淀粉样肽(Aβ)的含量，且在体内可代谢为牛蒡子苷元(Arctigenin,ATG)，因而可作为治疗阿尔茨海默病的药物。

Description

一类牛蒡子苷元氨基甲酸酯衍生物在制备用于治疗阿尔茨海默病的药物中的用途

技术领域

本发明涉及一类牛蒡子苷元氨基甲酸酯衍生物的医药用途。所述氨基甲酸牛蒡子苷元氨基甲酸酯衍生物可降低β-淀粉样肽(Aβ)的含量，且在体内可代谢为牛蒡子苷元(Arctigenin,ATG)，可作为治疗阿尔茨海默病的药物。

背景技术

阿尔茨海默病(Alzheimer’sdisease，AD)又称老年性痴呆，是一种进行性的神经退行性病变，主要是遭受不可逆性的神经元死亡以及随之而来的包括记忆和逻辑思维等的智力损伤。导致AD的因素很多，有基因的和非基因的因素。约有5％的AD是家族性的，其主要是由于淀粉样前体蛋白(APP)和早老素(PS)基因的突变而引起；而非家族性的潜在的AD的诱发因素包括年龄、载脂蛋白E4、血管病变、以及外伤性脑损伤等【HardyJ,SelkoeDJ.TheamyloidhypothesisofAlzheimer’sdisease:progressandproblemsontheroadtotherapeutics.Science,2002；297:353-356.】。AD的总病程为3～20年，确诊后平均存活时间为10年左右。该病要经历两种死亡，首先是精神死亡，然后是肉体死亡。据估计，目前全世界每年对AD患者照顾的费用达到了三千多亿美元(美国，阿尔茨海默病协会统计)。因而AD已成为社会和家庭的沉重负担。随着我国逐步进入老年型社会，我国的AD患者也逐年增加，因此寻找治疗AD的药物不仅成为一种医疗责任，更成为一种社会责任。

治疗AD的上市药物主要包括以下几种：乙酰胆碱酯酶(AChE)抑制剂多奈哌齐(Aricept，卫材制药)、卡巴拉汀(Exelon，诺华)、加兰他敏(Razadyne/Reminyl，强生)、他克林(Cognex，华纳-兰伯特)、石杉碱甲(Huperizine,上海复旦复华药业)以及NMDA(N-甲基-D-天冬氨酸)受体拮抗剂美金刚胺(Namenda/Axura，默克)。目前的AD疗法都是针对疾病症状进行的。它们只能在6至12个月内小幅度的稳定或改善认知水平和功能性症状，有些可以在这之后继续缓慢地发挥药效。但这些药物都没有能够停止或从实质上减缓疾病进程。

AD患者尸检显示其脑组织出现明显的萎缩，脑细胞出现广泛死亡，特别是基底神经节区的脑细胞，并可见老年斑、神经元纤维缠结等病变。AD的主要组织病理学特征为：大脑皮质、海马、某些皮层下核团如杏仁核、前脑基底神经核和丘脑中有大量的老年斑(senileplaque,SP)形成。老年斑是由大量纤维状、分子量为4kD的β-淀粉样蛋白(β-amyloidprotein；Aβ)聚集而成。

研究发现AD的神经化学和神经病理学改变均与Aβ有着密切的联系，目前AD病理机制的主要假说是Aβ假说。该假说认为：Aβ的聚集是导致淀粉状沉淀斑的形成、神经纤维的缠结、神经元炎症、神经元功能丧失及死亡、以及最后痴呆的形成等这一系列病理变化的起始因子；当Aβ产生过多或者它的清除减少的时候，Aβ蛋白能够聚集成为有着高度神经毒性的多聚体；这种多聚蛋白能够引起机体产生氧化应激、炎症、Tau蛋白的高度磷酸化等诱导神经元死亡的因素。所以Aβ的生成和聚集是AD的主要发病机制的中心环节。因此，基于Aβ在AD病理进程中所起的重要作用，靶向Aβ的抗AD药物一直被认为是最有希望能够起到延缓AD病理进程的药物【YaminG,OnoK,InayathullahM,TeplowDB.Amyloidbeta-proteinassemblyasatherapeutictargetofAlzheimer’sdisease.CurrentPharmaceuticalDesign,2008,14:3231-3246；KurzA,PerneczkyR.AmyloidclearanceasatreatmenttargetagainstAlzheimer’sdisease.JournalofAlzheimer'sdisease,2011,24[Suppl2]:61-73.】。

体内Aβ清除的调节因素非常多，其中一个重要的因素就是自噬。目前认为自噬能够增加细胞内的Aβ清除，在自噬被启动后能够将Aβ吞入自噬小泡内，然后和溶酶体进行融合而使Aβ被降解，从而达到清除细胞内Aβ的效果。因而增强自噬作用被认为是治疗这些神经退行性疾病的一种好策略【YangDS,StavridesP,MohanPS,etal.TherapeuticeffectsofremediatingautophagyfailureinamousemodelofAlzheimerdiseasebyenhancinglysosomalproteolysis.Autophagy,2011,7:788-789；BachmeierC,Beaulieu-AbdelahadD,MullanM,ParisD.Selectivedihydropyiridinecompoundsfacilitatetheclearanceofbeta-amyloidacrosstheblood-brainbarrier.EuropeanJournalofPharmacology,2011,659:124-129.】。

牛蒡ArctiumlappaL.为菊科牛蒡属两年生草本植物。牛蒡子为其干燥成熟果实，是我国传统的中药。ATG是牛蒡子最主要的活性成分。通过细胞水平上的筛选，发明人发现ATG既能抑制Aβ生成又能增加其清除。进一步分子机制研究发现，ATG能够通过减少BACE1表达而抑制Aβ生成，同时能够通过启动自噬而增强Aβ的清除；对AD转基因模型小鼠进行100天连续腹腔注射给药ATG(3mg/kg/d)，试验结果显示AD小鼠脑内蛋白沉淀斑明显减少，记忆力损伤得到明显恢复。发明人的前期研究结果已发表在JournalofNeuroscience上【ZhuY,YanJM,JiangW,YaoXG,ChenJ,ChenL；LiCJ,HuLH*,JiangHL*,ShenX*.ArctigenineffectivelyamelioratesmemoryimpairmentinAlzheimer'sdiseasemodelmicetargetingbothβ-amyloidproductionandclearance.JournalofNeuroscience,2013,33(32):13138-13149.】。之前的研究过程中，发明人已经合成了一系列的牛蒡苷元氨基甲酸酯类衍生物，并申请了相关专利【发明人：胡立宏、沈旭、朱志远、雷敏、陈静、颜建明；牛蒡子苷元碳酰胺衍生物及其制备方法、包含该衍生物的组合物、及其用途；申请号：201210186849.3】。但是之前专利报道的牛蒡苷元氨基甲酸酯类衍生物的脂溶性强、水溶性差、口服生物利用度较低，且不易结晶导致纯化困难。为了克服上述化合物的不足，发明人重新设计了一类新的含有氨基取代的牛蒡苷元氨基甲酸酯类衍生物，通过与酸成盐，可以提高其水溶性、口服生物利用度、化合物的稳定性，对盐通过重结晶纯化，可大大简化其纯化工艺。

发明内容

通过对牛蒡子苷元(ATG)的抑制Aβ生成作用的分子机制研究，发明人发现ATG能够通过减少BACE1表达而抑制Aβ生成，同时能够通过启动自噬而增强Aβ的清除。但是ATG口服生物利用度低(F约1％)，水溶性差(约为0.01mg/mL)。于是为了提高ATG的水溶性和口服生物利用度，发明人设计、合成了一类新的氨基甲酸牛蒡苷元酯类衍生物作为ATG的前药。该类化合物结构上特点是，氨基甲酸酯的氮上均有一个含氮的取代基团，该含氮的取代基能够与有机酸或无机酸成盐。这类化合物的水溶性比ATG提高了近50-500倍，生物活性得到保持或提高，并且该类化合物成盐后，容易形成固体，便于化合物的分离、提纯，也提高了化合物的稳定性。

本发明的一个方面提供了一类下面通式(I)所示的牛蒡子苷元氨基甲酸酯衍生物，或其药学上可接受的盐在制备用于治疗阿尔茨海默病的药物中的用途：

X为-(CH₂)_n-或亚芳基；优选为-(CH₂)_n-或亚苯基；

n为1、2或3；

R₁、R₂和R₃各自独立地为氢；C₁-C₆烷基；C₃-C₈环烷基；未取代或被C₁-C₄烷基、C₁-C₄烷氧基、卤素、硝基、氰基和羟基中的取代基取代的芳基；未取代或其中芳基被C₁-C₄烷基、C₁-C₄烷氧基、卤素、硝基、氰基和羟基中的取代基取代的芳基C₁-C₄烷基；未取代或其中杂芳基被C₁-C₄烷基、C₁-C₄烷氧基、卤素、硝基、氰基和羟基中的取代基取代的5-7元杂芳基C₁-C₄烷基；优选地，R₁、R₂和R₃各自独立地为氢、C₁-C₄烷基、或C₃-C₆环烷基；更优选地，R₂为氢或甲基；

进一步优选地，X为亚苯基，为与苯环邻位相连的N,N-二甲氨基。

或者，

X与R₃、以及与R₃相连的氮原子一起形成未取代或被选自C₁-C₄烷基、卤素、-NH₂和羟基中的取代基取代的4-8元含氮杂环，优选地，X与R₃、以及与R₃相连的氮原子一起形成未取代或被选自C₁-C₄烷基、卤素、-NH₂和羟基中的取代基取代的含有一个氮原子的4-8元含氮杂环，更优选地，X与R₃、以及与R₃相连的氮原子一起形成哌啶环；

或者

X与相邻的两个氮原子、R₃和R₁一起形成未取代或被选自C₁-C₄烷基、卤素、-NH₂和羟基中的取代基取代的4-8元含氮杂环，优选地，X与相邻的两个氮原子、R₃和R₁一起形成未取代或被选自C₁-C₄烷基、卤素、-NH₂和羟基中的取代基取代的含有两个氮原子的4-8元含氮杂环；更优选地，X与相邻的两个氮原子、R₃和R₁一起形成哌嗪环。

在本发明中，术语“芳基”是指芳香族环基，优选是碳原子数为6-14个的芳基，更优选为碳原子数为6-10个的芳基，如苯基、萘基、联苯基。

在本发明中，术语“亚芳基”是与优选是碳原子数为6-14个的亚芳基，更优选为碳原子数为6-10个的亚芳基，如亚苯基、亚萘基、亚联苯基。

在本发明中，术语“5-7元杂芳基”是指含有选自O、N和S中的至少一个杂原子的芳香族环基，优选为呋喃基、吡咯基、噻吩基、吡唑基、咪唑基、吡啶基、吡嗪基或噁唑基。

在本发明中，术语“C₁-C₆烷基”是指具有1至6个碳原子的直链或支链烷基，非限制性地包括甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、已基等；优选甲基、乙基、丙基、丁基。类似地，术语“C₁-C₄烷基”是指具有1至4个碳原子的直链或支链烷基，非限制性地包括甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基等；优选甲基、乙基、丙基、丁基。

在本发明中，术语“C₃-C₈环烷基”是指在环上具有3至8个碳原子的环状烷基，非限制性地包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基或环庚基；优选环己基。类似地，术语“C₃-C₆环烷基”是指在环上具有3至6个碳原子的环状烷基，非限制性地包括环丙基、环丁基、环戊基或环己基；优选环己基。

在本发明中，术语“4-8元含氮杂环”是指在环上具有至少一个N杂原子的4-8元饱和杂环，非限制性地包括：哌啶环或哌嗪环。

在本发明中，术语“药学上可接受的盐”是指与磷酸、硫酸、盐酸等无机酸，或醋酸、酒石酸、柠檬酸、苹果酸等有机酸，或天冬氨酸、谷氨酸等酸性氨基酸形成的盐，或与上述酸成酯或酰胺后再与无机碱形成的盐，如钠、钾、钙、铝盐和铵盐。

本发明中，所述通式(I)所示的牛蒡子苷元氨基甲酸酯衍生物优选选自下列化合物中：

本发明中通式(I)所示的牛蒡子苷元氨基甲酸酯衍生物可以采用本领域中已知的合成方法制备，或者采用如下合成方法制备：

其中，X，R₁，R₂和R₃定义与上述相同；

ATG与4-硝基氯甲酸苯酯发生酯化反应生成中间体A，然后A与相应的胺发生取代反应得到式I化合物。

具体而言，将ATG溶于溶剂(例如，四氢呋喃、二氯甲烷、乙腈等)中并加入N,N-二异丙基乙基胺(DIPEA)，再加入4-硝基氯甲酸苯酯，加热至回流6h，反应结束后，反应液用饱和碳酸钠洗，得到中间体A的溶液。向该溶液中加入N,N-二异丙基乙基胺(DIPEA)和相应的胺加热至回流至反应结束，反应液用饱和碳酸钠洗、干燥和浓缩后经柱层析得到式1化合物。

本发明中通式(I)所示的牛蒡子苷元氨基甲酸酯衍生物或其药学上可接受的盐可给药于人，可以口服、直肠、肠胃外(静脉内、肌肉内或皮下)、局部给药(粉剂、软膏剂或滴剂)。

用于口服给药的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂。在这些固体剂型中，活性化合物与至少一种常规惰性赋形剂(或载体)混合，如柠檬酸钠或磷酸二钙，或与下述成分混合：(a)填料或增容剂，例如，淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；(b)粘合剂，例如，羟甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶；(c)保湿剂，例如，甘油；(d)崩解剂，例如，琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、某些复合硅酸盐、和碳酸钠；(e)缓溶剂，例如石蜡；(f)吸收加速剂，例如，季胺化合物；(g)润湿剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；(h)吸附剂，例如，高岭土；和(i)润滑剂，例如，滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠，或其混合物。胶囊剂、片剂和丸剂中，剂型也可包含缓冲剂。

固体剂型如片剂、糖丸、胶囊剂、丸剂和颗粒剂可采用包衣和壳材制备，如肠衣和其它本领域公知的材料。它们可包含不透明剂，并且，这种组合物中活性化合物或化合物的释放可以延迟的方式在消化道内的某一部分中释放。可采用的包埋组分的实例是聚合物质和蜡类物质。必要时，活性化合物也可与上述赋形剂中的一种或多种形成微胶囊形式。

用于口服给药的液体剂型包括药学上可接受的乳液、溶液、悬浮液、糖浆或酊剂。除了活性化合物外，液体剂型可包含本领域中常规采用的惰性稀释剂，如水或其它溶剂，增溶剂和乳化剂，例知，乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺以及油，特别是棉籽油、花生油、玉米胚油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油或这些物质的混合物等。

除了这些惰性稀释剂外，上述组合物也可包含助剂，如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、矫味剂和香料。

除了活性化合物外，悬浮液可包含悬浮剂，例如，乙氧基化异十八烷醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、甲醇铝和琼脂或这些物质的混合物等。

用于肠胃外注射的组合物可包含生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液，和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜的含水和非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、多元醇及其适宜的混合物。

用于局部给药的本发明化合物的剂型包括软膏剂、散剂、喷射剂和吸入剂。活性成分在无菌条件下与生理上可接受的载体及任何防腐剂、缓冲剂，或必要时可能需要的推进剂一起混合。

本发明还提供了一种治疗阿尔茨海默病的方法，所述方法包括给具有该需要的患者给药治疗有效量的选自本发明中通式(I)所示的牛蒡子苷元氨基甲酸酯衍生物和其药学上可接受的盐中的一种或多种。

有益效果

本发明的通式(I)所示牛蒡子苷元氨基甲酸酯衍生物或其药学上可接受的盐具有抗AD的作用。整体动物试验表明，该类化合物具有能够明显逆转转基因小鼠出现的记忆力损伤表现，因此可作为治疗阿尔茨海默病的药物。

附图说明

图1为显示ATG-A02盐酸盐减轻转基因小鼠的记忆损伤的图表，其中T-ATG-A02HCl：10mg/kg/天ATG-A02-HCl处理的转基因小鼠，T-V：溶剂处理的转基因小鼠，N-V：溶剂处理的非转基因小鼠。

图2为显示ATG-A02盐酸盐减轻转基因小鼠的记忆损伤的图表，其中T-ATG-A02HCl：10mg/kg/天ATG-A02-HCl处理的转基因小鼠，T-V：溶剂处理的转基因小鼠，N-V：溶剂处理的非转基因小鼠。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但本发明不局限于此。

下述制备例中，¹H-NMR用VarianMercuryAMX300，400，500型仪器测定。MS用VGZAB-HS或VG-7070型以及Esquire3000plus-01005测定。所有溶剂在使用前均经过重新蒸馏，所使用的无水溶剂均是按标准方法干燥处理获得。除另有说明外，所有反应均是在氩气保护下进行并用TLC跟踪，后处理时均经饱和食盐水洗和无水硫酸镁干燥过程。产品的纯化除另有说明外均使用硅胶的柱色谱法，所使用的硅胶为200-300目，GF₂₅₄为青岛海洋化工厂或烟台缘博硅胶公司生产。

制备实施例

实施例1：化合物ATG-A01的合成

将氯甲酸对硝基苯酯(9.2mmol，1.85g)搅拌溶解于60mLTHF中，然后加入DIPEA(1.6mL)，反应液立刻出现白色固体。搅拌下加入ATG(4mmol，1.54g)，加热至回流反应6h，TLC检测反应直到原料ATG点消失。反应结束后，用饱和碳酸钠反复洗至水层至无色，得到结构式A的化合物的THF溶液。向该溶液中加入DIPEA(1.6mL)，N,N-二甲基-1,2-乙二胺(12mmol，1.0g)并加热至回流，TLC检测反应直到原料A点消失。反应结束后，反应液用水洗一次后，用饱和碳酸钠反复洗至水层无色，THF层再用饱和食盐水洗一次后，减压下除去溶剂得到黄色固体。黄色固体经柱层析分离(石油醚/丙酮＝3:1)得到化合物ATG-A01，收率为54％。

¹HNMR(400MHz,CDCl₃)δ6.97(dd,J＝8.1,1.8Hz,1H),6.75(d,J＝8.1Hz,1H),6.73(d,J＝1.9Hz,1H),6.65(dd,J＝7.9,2.0Hz,1H),6.53(d,J＝7.9Hz,1H),6.49(d,J＝2.0Hz,1H),4.13(dd,J＝6.3,5.7Hz,1H),3.88(t,J＝5.7Hz,1H),3.84(s,3H),3.82(s,3H),3.76(s,3H),3.64(brs,2H),3.51(brs,2H),2.95(d,J＝5.7Hz,2H),2.93–2.86(m,4H),2.78–2.31(m,4H).ESI-MS:m/z＝487([M+H]⁺)。

实施例2：化合物ATG-A02的合成

除了使用哌嗪代替N,N-二甲基-1,2-乙二胺之外，以与实施例1相同的方式制备化合物ATG-A02。硅胶柱层析洗脱液：石油醚/丙酮＝3:1，得到白色粉末状的化合物ATG-A02，收率为53％。

¹HNMR(400MHz,CDCl₃)δ8.61(s,1H),8.56(d,J＝4.9Hz,1H),7.71(d,J＝7.9Hz,1H),7.30(dd,J＝7.9,4.9Hz,1H),7.01(d,J＝8.0Hz,1H),6.77(d,J＝8.3Hz,1H),6.75(d,J＝2.0Hz,1H),6.65(dd,J＝8.0,1.9Hz,1H),6.54(dd,J＝8.1,2.0Hz,1H),6.50(d,J＝2.0Hz,1H),5.52(t,J＝6.2Hz,1H),4.47(d,J＝6.2Hz,2H),4.16(dd,J＝9.1,7.2Hz,1H),3.89(dd,J＝9.1,7.6Hz,1H),3.84(s,3H),3.81(s,3H),3.78(s,3H),2.96(d,J＝5.7Hz,2H),2.70–2.41(m,4H)；ESI-MS:m/z＝485([M+H]⁺)。

实施例3：化合物ATG-A03的合成

除了使用1-甲基哌嗪代替N,N-二甲基-1,2-乙二胺之外，以与实施例1相同的方式制备化合物ATG-A03。硅胶柱层析洗脱液：石油醚/丙酮＝3:1，得到白色粉末状的化合物ATG-A03，收率为52％。

¹HNMR(400MHz,CDCl₃)δ6.97(d,J＝8.0Hz,1H),6.76(d,J＝8.1Hz,1H),6.73(d,J＝1.9Hz,1H),6.65(dd,J＝8.1,1.9Hz,1H),6.53(dd,J＝8.1,2.0Hz,1H),6.49(d,J＝2.0Hz,1H),4.14(dd,J＝9.1,7.1Hz,1H),3.88(dd,J＝9.1,7.0Hz,1H),3.85(s,3H),3.82(s,3H),3.76(s,3H),3.70(brs,2H),3.56(brs,2H),2.96(d,J＝5.8Hz,2H),2.74–2.48(m,4H),2.44(t,J＝5.1Hz,4H),2.33(s,3H)；ESI-MS:m/z＝499([M+H]⁺)。

实施例4：化合物ATG-A04的合成

除了使用4-氨基哌啶代替N,N-二甲基-1,2-乙二胺之外，以与实施例1相同的方式制备化合物ATG-A04。硅胶柱层析洗脱液：石油醚/丙酮＝3:1，得到白色粉末状的化合物ATG-A04，收率为52％。

¹HNMR(400MHz,CDCl₃)δ6.97(d,J＝8.0Hz,1H),6.76(d,J＝8.1Hz,1H),6.73(d,J＝1.8Hz,1H),6.65(dd,J＝8.0,1.9Hz,1H),6.54(dd,J＝8.3,2.0Hz,1H),6.50(d,J＝2.0Hz,1H),4.31–4.20(m,1H),4.14(dd,J＝9.1,6.8Hz,2H),3.91–3.86(m,1H),3.85(s,3H),3.83(s,3H),3.77(s,3H),3.18–2.85(m,6H),2.75–2.40(m,4H),1.97–1.81(m,2H),1.46–1.28(m,2H)；ESI-MS:m/z＝499([M+H]⁺)。

实施例5：化合物ATG-A05的合成

除了使用2-(二甲氨基)-苯胺代替N,N-二甲基-1,2-乙二胺之外，以与实施例1相同的方式制备化合物ATG-A05。硅胶柱层析洗脱液：石油醚/丙酮＝3:1，得到白色粉末状的化合物ATG-A05，收率为34％。

¹HNMR(400MHz,CDCl₃)δ7.12–7.04(m,2H),6.97(dd,J＝7.8,1.7Hz,1H),6.82(d,J＝7.9Hz,1H),6.76–6.71(m,2H),6.62(d,J＝1.9Hz,1H),6.59(dd,J＝7.9,2.0Hz,1H),6.53(dd,J＝8.1,2.0Hz,1H),6.45(d,J＝2.1Hz,1H),5.79(s,1H),4.13(dd,J＝9.1,7.1Hz,1H),3.87(dd,J＝9.1,7.2Hz,1H),3.84(s,3H),3.80(s,6H),3.42(s,6H),2.91(d,J＝5.7Hz,2H),2.65–2.57(m,4H)；ESI-MS:m/z＝535([M+H]⁺)。

实施例6：化合物ATG-A01盐酸盐的合成

将化合物ATG-A01溶于乙醇中，滴加盐酸乙醇溶液至pH值为4-5，减压除去溶剂，再通过乙醇重结晶得到化合物ATG-A01盐酸盐。

所有其它化合物的盐酸盐，均可以用实施例6的方法将相应的化合物与盐酸乙醇溶液反应进行制备。

本发明所提及的化合物的有机酸和无机酸盐均可用与实施例6类似的方法将所述化合物与相应的有机酸或无机酸反应进行制备。

试验实施例

试验实施例1牛蒡子苷元衍生物的水溶性

对所合成的牛蒡子苷元衍生物盐酸盐用动态溶解度测定法进行了测定，即准确称量50mg化合物，并滴加去离子水，直至固体完全溶解，记下水的体积v，以50/v表示化合物的溶解度，单位为mg/mL。

本发明所设计合成的牛蒡子苷元衍生物的盐酸盐，其水溶性在0.5-5mg/mL，相比于ATG的水溶性(0.01mg/mL)和B-08(中国专利申请201210186849.3中活性最强的化合物，在此以引用的方式将中国专利申请201210186849.3的全部公开内容并入到本文中)的水溶性(<0.01mg/mL)，提高了近50-500倍。

表1、牛蒡子苷元衍生物盐酸盐的溶解度

试验实施例2细胞水平测试牛蒡子苷元衍生物对Aβ形成的抑制作用

本发明在高表达β-淀粉样蛋白前体蛋白(APP)和β-分泌酶(BACE1)的中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)上通过酶联免疫吸附实验(ELISA)测试了牛蒡子苷元衍生物对Aβ形成的抑制作用，得到的Aβ含量水平直接反映了其化合物活性水平。

1、实验原理

采用ELISA法检测细胞上清中Aβ含量，其原理是：细胞内形成的Aβ能够分泌至细胞培养液中，因此将培养液与偶联有Aβ抗体的白色透明96孔板孵育，然后加入Aβ的另一位点抗体同时进行孵育，通过抗原抗体特异性识别结合原理，将Aβ及其抗体同时特异性的吸附于96孔板上；然后用偶联了辣根过氧化物酶的二抗及其显色底物(Tetramethylbenzidine,TMB)孵育，生成的产物颜色深浅与Aβ含量成正比，分别测定标准管和样本管的吸光度值(OD450)，计算Aβ的含量。

2、实验材料与方法

1)Aβ测定试剂盒购于invitrogen公司，细胞培养试剂均购于Gibico公司。

2)CHO-APP&BACE1(于CHO细胞中转入pcDNA3.1a-APP质粒，然后通过G418抗生素进行稳定株筛选，得到CHO-APP的稳定株；继续在CHO-APP细胞中转入pSecTag2-BACE1质粒，然后通过zeocin和G418两种抗生素进行稳定株筛选，得到CHO-APP&BACE1的稳定株)细胞培养：CHO-APP&BACE1用F12培养液(10％FBS)培养于24孔板中，于70％细胞密度时分别加入各种牛蒡子苷元衍生物(20μM)(参见表1)孵育24小时，取出培养液10,000离心10分钟，取上清，加入蛋白酶抑制剂(cocktail),然后通过ELISA方法测定上清中Aβ含量。

3)将细胞上清用标准稀释液进行十倍稀释，然后按照试剂盒所提供方法进行检测。即在室温下将稀释后的上清、Aβ抗体和偶联Aβ另一种抗体的96孔板共同孵育3小时，然后用试剂盒中提供的漂洗液进行洗板4次，再加入偶联有辣根过氧化物酶的二抗室温下孵育30分钟，再用漂洗液洗板五次，然后加入显色液于室温孵育30分钟，最后加入反应中止液。以Bio-Rad酶标仪在450nm处读取OD值。

3、实验结果

结果如表2所示，牛蒡子苷元碳酰胺衍生物ATG-A01～ATG-A05均有抑制Aβ形成的作用，同时这些化合物的理化性质比ATG均有显著地改善。

表2、牛蒡子苷元及其衍生物对Aβ形成的抑制活性

化合物	抑制率(20μM)	化合物	抑制率(20μM)
				DMSO	0	ATG	34.84％
ATG-A01-HCl	35.02％	ATG-A02-HCl	36.71％
				ATG-A03-HCl	36.40％	ATG-A04-HCl	37.30％
ATG-A05-HCl	73.50％

试验实施例3ATG-A02盐酸盐和B-08的药代动力学研究

单次静脉(IV)及口服(PO)给予SpragueDawley大鼠受试物ATG-A02盐酸盐50mg/kg，于不同时间点采集血样，LC/MS/MS测定给予受试物后大鼠血浆中受试物的浓度并计算相关参数。口服后血浆中检测到的主要成分为ATG-A02和ATG。测试结果见表3。以ATG-A02计其口服生物利用度(F)为61.7％，以ATG计其口服生物利用度(F)为31.3％。

表3、大鼠单次口服给予ATG-A02盐酸盐后的ATG-A02和ATG主要药动学参数

AUC_(0-t)为药时曲线下面积，指血药浓度曲线从0到t与时间轴所包围的面积。

AUC_(0-∞)为药时曲线下面积，指血药浓度曲线对时间轴所包围的全部面积。

MRT_(0-∞)为平均驻留时间，指药物分子在体内停留时间的平均值。

t_1/2z为终末半衰期，指药物达到分布平衡后的血药浓度减少50％所需的时间。

T_max为达峰时间，指单次服药以后，血药浓度达到峰值的时间。

C_max为药峰浓度，指给药后出现的血药浓度最高值。

F为生物利用度，指药物经血管外途径给药后吸收进入全身血液循环药物的相对量。

同样地，单次静脉(IV)及口服(PO)给予SpragueDawley大鼠受试物B-0810mg/kg，于不同时间点采集血样，LC/MS/MS测定给予受试物后大鼠血浆中受试物的浓度并计算相关参数。口服后血浆中检测到的主要成分为B-08和ATG。以B-08计其口服生物利用度为1.7％，以ATG计其口服生物利用度为9.2％。

试验实施例4ATG-A02盐酸盐逆转老年性痴呆转基因模型小鼠记忆力损伤的作用

本发明通过APP/PS1双转基因老年性痴呆模型小鼠评价化合物ATG-A02盐酸盐对记忆力损伤改善作用。结果表明化合物ATG-A02盐酸盐能够明显逆转老年性痴呆模型小鼠的记忆力损伤。

1、实验原理

本实验采用的为APP/PS1双转基因老年性痴呆模型小鼠(B6C3转基因小鼠，APPswe，PS1dE9)。这类转基因小鼠能高表达嵌和鼠/人的瑞典突变APP(Mo/HuAPP695swe)和人源删除第9个外显子的早老素1蛋白(presenilin，PS1-dE9)。此类转基因小鼠会在6-7个月的时候出现Aβ沉积并且会在7个月的时候出现空间记忆力的损害。

我们采用经典的Morris水迷宫实验(MorrisWaterMaze,MWM)评价老年性痴呆模型小鼠的记忆力损伤情况。实验分为两部分：训练实验和平台寻找实验。以训练实验中小鼠寻找到平台时间长短和平台寻找实验中小鼠穿越平台次数为评价小鼠记忆力情况的指标。

2、实验材料与方法

1)APP/PS1双转基因老年性痴呆模型小鼠购买于美国的JacksonLaboratory公司，然后繁殖和鉴定。通过采用对小鼠剪尾，然后PCR鉴定小鼠的APP/PS1的基因序列以鉴定小鼠基因型。在实验中采用鉴定后没有转入这两个基因的小鼠作为实验中的阴性对照小鼠。小鼠在标准条件下饲养(SPF级环境，12/12小时明暗循环，足够水和食物，22℃的恒温，60％的湿度)。

2)老年性痴呆模型小鼠给药：在小鼠6月大小时，20只转基因小鼠被随机分为2组(转基因溶剂组，转基因ATG-A02盐酸盐-10mg/kg剂量组)，10只非转基因小鼠作为阴性对照组。化合物ATG-A02盐酸盐直接溶解于生理盐水中，采用灌胃给药100天，然后开始行为学实验检测(Morris水迷宫实验)。

3)小鼠训练实验：小鼠每天进行三次训练，持续六天。在三次训练中我们分别在三个除平台所在的象限点将小鼠面向池壁置于水中，然后给小鼠90秒钟时间去寻找平台位置，小鼠在平台上停留20秒钟时间以帮助它记忆平台位置。在此期间，记录小鼠找到平台的时间即潜伏期。在第六天，在三次训练之后，小鼠进行平台寻找实验。在这次实验中，潜于水面下的平台被撤除，然后让小鼠在水池中持续90秒钟去寻找平台，记录小鼠穿越平台次数作为其记忆力的评价指标，次数越多表明其记忆力越好。所有的动物实验操作都严格遵守《实验动物管理条例》。

3、实验结果

实验结果发现，转基因小鼠的潜伏期明显长于非转基因小鼠(图1)，而穿越平台次数明显少于非转基因小鼠(图2)，表明转基因小鼠的记忆力出现明显损伤，表明其老年性痴呆模型正确；给予化合物ATG-A02盐酸盐(10mg/kg/day，)的转基因小鼠潜伏期明显短于溶剂处理的转基因小鼠(图1)，而穿越平台次数明显多于溶剂处理的转基因小鼠(图2)，表明化合物ATG-A02盐酸盐能够明显逆转转基因小鼠出现的记忆力损伤表现；这些结果表明化合物ATG-A02盐酸盐能够起到很好治疗阿尔茨海默病效果。

Claims

1.一种如下通式(I)所示的牛蒡子苷元氨基甲酸酯衍生物，或其药学上可接受的盐在制备用于治疗阿尔茨海默病的药物中的用途，

X为-(CH₂)_n-，或亚芳基；

n为1、2或3；

R₁、R₂和R₃各自独立地为氢；C₁-C₆烷基；C₃-C₈环烷基；未取代或被C₁-C₄烷基、C₁-C₄烷氧基、卤素、硝基、氰基和羟基中的取代基取代的芳基；未取代或其中芳基被C₁-C₄烷基、C₁-C₄烷氧基、卤素、硝基、氰基和羟基中的取代基取代的芳基C₁-C₄烷基；未取代或其中杂芳基被C₁-C₄烷基、C₁-C₄烷氧基、卤素、硝基、氰基和羟基中的取代基取代的5-7元杂芳基C₁-C₄烷基；

或者

X与R₃、以及与R₃相连的氮原子一起形成未取代或被选自C₁-C₄烷基、卤素、-NH₂和羟基中的取代基取代的4-8元含氮杂环，或者

X与相邻的两个氮原子、R₃和R₁一起形成未取代或被选自C₁-C₄烷基、卤素、-NH₂和羟基中的取代基取代的4-8元含氮杂环。

2.根据权利要求1所述的用途，其中，X为-(CH₂)_n-，或亚苯基。

3.根据权利要求2所述的用途，其中，X为亚苯基，为与苯环邻位相连的N,N-二甲氨基。

4.根据权利要求1所述的用途，其中，R₁、R₂和R₃各自独立地为氢、C₁-C₄烷基、或C₃-C₆环烷基。

5.根据权利要求1所述的用途，其中，R₂为氢或甲基。

6.根据权利要求1所述的用途，其中，X与R₃、以及与R₃相连的氮原子一起形成未取代或被选自C₁-C₄烷基、卤素、-NH₂和羟基中的取代基取代的含有一个氮原子的4-8元含氮杂环，或者

X与相邻的两个氮原子、R₃和R₁一起形成未取代或被选自C₁-C₄烷基、卤素、-NH₂和羟基中的取代基取代的含有两个氮原子的4-8元含氮杂环。

7.根据权利要求1所述的用途，其中，X与R₃、以及与R₃相连的氮原子一起形成哌啶环，或者

X与相邻的两个氮原子、R₃和R₁一起形成哌嗪环。

8.根据权利要求1所述的用途，其中，所述牛蒡子苷元氨基甲酸酯衍生物选自下列化合物：