CN105603537A - 一种启动子文库的构建方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种启动子文库的构建方法及其应用，构建方法包括如下步骤：1）根据原核生物启动子的保守区、半保守区、随机序列和转录起始位点，设计出具有启动子特征的寡核苷酸序列；2）、将步骤1）设计得到的寡核苷酸序列经退火、延伸形成双链，再连接到带有报告基因的载体上，得到启动子的突变库；3）、将步骤2）得到的启动子的突变库转入到宿主细胞中，涂布到相应抗性的平板中，得到启动子文库。本发明采用人工设计的具有启动子特征的寡核苷酸序列，通过分子聚合和延伸等技术，获得启动子强度跨度理想的启动子文库；该方法快速、高效、廉价、筛选工作量小。

Description

一种启动子文库的构建方法及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种启动子文库的构建方法及其应用。

背景技术

细胞代谢网络的优化和精细研究正在成为生物化工领域一个非常重要的前沿研究方向。但是，微生物细胞是一个复杂的动态网络，内由基因、蛋白、代谢物、各种信号分子及它们之间相互作用组成，代谢过程的分析和调控非常复杂和困难。为了能够从中解析出关键的节点进行精细调控，必须通过精细调控来研究各条路径的作用，从而实现对细胞表型和代谢流的人为改造。因此，精确的“开量”式基因微调是开展代谢工程研究非常重要的先进手段，对其开展研究具有重要的科学意义广泛的应用空间。启动子(Promoter)是基因表达调控最常用的元件，但目前的启动子都无法在一个较宽的范围内对基因表达强度进行连续的调控。例如诱导型启动子，因为要加入诱导物来达到“开关”的开和关，必然使得研究的费用增加，而且这种开关灵敏度很低，无法通过对诱导物的量控制来精确控制“开关”的开合程度。而组成型启动子，因其本身的一些特征，如启动强弱较低，不受外界环境影响等因素，不能达到目前研究理想的条件。

启动子文库就是对调控基因转录的启动子碱基序列进行突变，通过报告基因(ReporterGene，如绿色荧光蛋白gfp基因、半乳糖苷酶基因lacZ等)的表达水平，筛选得到的一系列不同强度的人工启动子集合体。由于启动子的碱基序列直接影响其调控基因转录的强度，故只要所构建的文库包含足够丰富的突变序列，筛选量足够大，就可以从中筛选出一系列具有不同调控强度的突变启动子，构成能对其下游基因实施“开量”式微调的文库。此种方法，能够筛选出一系列强度跨度较大的启动子序列，同时启动子强度易于表征，对代谢网络中实现精细控制非常理想。

因启动子文库独特的优势，出现后即被应用于代谢工程的研究。Solem等人利用启动子文库，在乳酸乳球菌(Lactococculslatis)中，不仅对糖酵解途径pfk基因，还对位于同一操纵子内的另外两个基因(pyk和Idh)实现了强度递增的表达调控。其次，Alper等在研究蕃茄红素的合成时，发现在野生菌中提高dxs基因(deoxy-xylulose-psynthase，脱氧-磷酸木酮糖合成酶)的表达，只能在一定程度上提高蕃茄红素的产量，而在过表达该合成途径下游两个酶的重组菌中，不断增强dxs基因表达能使蕃茄红素产量不断提高，说明脱氧-磷酸木酮糖合成酶活是重组菌合成途径的限制性因素。同时，Nevoigt等在分析3-磷酸甘油脱氢酶(GPDH)基因GPD1对酿酒酵母甘油产率的影响时发现，通过突变启动子控制GPDH的酶比活变化不超过其野生型的2倍时，菌体的生物量和甘油产率均与GPDH活性正相关，但多拷贝基因的过表达，非但不能使甘油产率相应增加，还对细胞生长产生抑制，因此在代谢改造中可通过突变启动子文库来精确微调基因表达水平以达到最优化控制。最后，可见，通过构建启动子文库，将“开量”式微调基因表达成为可能，在代谢分析和改造中，突破了原来只能通过基因敲除(Knockout)和过表达(Overexpression)两种非“开”即“关”的手段来实现对细胞基因型的扰动(Perturbation)。

目前，相关文献报道启动子文库的构建方法有如下方法：借助易错PCR方法，对原始的启动子进行随机突变，获得大量的突变体，然后采用高通量的筛选方法，获得不同强度的启动子。此种方法因为用了随机突变的方法，导致其突变库极大，无义突变也较高，大大加大了后期的筛选工作，本发明通过人工合成启动子序列，利用分子生物学手段，实现快速、高效、高效的构建方法。

发明内容

本发明提供一种启动子文库的构建方法及其应用，采用人工设计的具有启动子特征的寡核苷酸序列，通过分子聚合和延伸等技术，获得启动子强度跨度理想的启动子文库。

本发明采用的技术手段为：

一种启动子文库的构建方法，包括如下步骤：

1)、根据原核生物启动子的保守区：-10区、-35区，半保守区，随机序列，转录起始位点和方便连接构建，设计出具有启动子特征的寡核苷酸序列；

2)、将步骤1)设计得到的寡核苷酸序列经退火、延伸形成双链，再连接到带有报告基因的载体上，得到启动子的突变库；

3)、将步骤2)得到的启动子的突变库转入到宿主细胞中，涂布到相应抗性的平板中，得到启动子文库。

步骤1)中具有启动子特征的寡核苷酸序列能够在原核生物中具有生物学功能，包括基本特征区域：-10区、-35区、转录起始位点和随机区域，同时还包括一些关键酶切位点，总长为96bp，序列如下：CGGAATTCWTWNWN₄AWWWNNTTCTTGACAN₁₇TATAATDN4RTWWCCATGGGGGGCGGTCTAGAGC(见SEQIDNO:11)。

步骤2)中所述报告基因选自但不限于：绿色荧光蛋白(GFP)、增效的绿色荧光蛋白(EGFP)或半乳糖苷酶基因LacZ。

步骤2)中所述载体的报告基因前加入有一段RBS核糖体结合位点，例如可以为带有RBS和GFP基因的pMD19-T-RBS-GFP的载体。

所述的宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。代表性例子有：酵母，大肠杆菌，动物的组织细胞，植物细胞等。本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体和宿主细胞。作为本发明的优选方式，所述的宿主细胞是大肠杆菌细胞。

一种启动子强度的筛选方法，将含有突变库的菌株，分别涂布到相应抗性的平板中，挑选单菌落，培养，检测其OD₆₀₀和相对荧光强度RFU，利用RFU/OD₆₀₀作为衡量启动子强弱的标准，其值越大，启动子强度越强，反之。

一种启动子文库，包括SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9或SEQIDNO:10所示核苷酸序列的启动子。

所述的启动子文库中SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9或SEQIDNO:10所示核苷酸序列的启动子强度呈递增关系。

所述的启动子文库在调节目的基因的表达中的应用。各启动子启动目的基因表达的强度呈现梯度分布，可实现对目的基因表达的连续微调，用于在不同强度下指导目的基因表达。启动子文库的获得可保证对所调控的目的基因表达进行梯度调节，实施可控基因扰动和系统分析。

本发明的启动子可以被可操作地连接到目的基因上，所述的目的基因通常可以是任何核酸序列(如一种结构性核酸序列)，所述的目的基因优选编码具有特定功能的蛋白，例如某些具有重要特性或功能的蛋白。例如，当用于表达强度的研究时，所述的目的基因包括但不限于：绿色荧光蛋白、增效的绿色荧光蛋白、荧光素酶基因或半乳糖苷酶基因LacZ等。“绿色荧光蛋白”具有内源荧光基团，在受到紫外光或蓝光激发时可高效发射清晰可见的绿光，且见光不易淬灭。“增效的绿色荧光蛋白”为对绿色荧光蛋白进行改进后的蛋白。“荧光素酶”作为一种代表性的指示基因表达状况的工具，可良好地指示由启动子指导的基因表达情况。

作为本发明的优选方式，可以从本发明的启动子文库中选择不同强度的启动子，分别将它们与待研究的目的基因可操作地连接，或将目的基因与所述的启动子可操作的连接入合适的载体中，采取适当的方式导入到宿主细胞内，从而获得其中目的基因表达量不同的一系列细胞。可通过分析这些细胞的代谢情况、表型变化、蛋白表达情况或相互作用情况、各种信号分子的变化等，来得知该目的基因的功能或用途。

本发明中所述的“启动子”是指一种核酸序列，其通常存在于目的基因编码序列的上游(5’端)，能够引导核酸序列转录为mRNA。一般地，启动子提供RNA聚合酶和正确起始转录所必需的其它因子的识别位点。

“启动子文库”是指含有筛选得到的一系列启动子的核酸集合体。

“目的基因”是指可由本发明的启动子指导表达的基因。本发明对合适的目的基因没有特别的限制，例如包括但不限于：结构基因、编码具有特定功能的蛋白的基因、酶、报告基因(如绿色荧光蛋白、荧光素酶基因或半乳糖苷酶基因LacZ)。有益效果：

本发明提供的启动子文库的构建方法，采用人工设计的具有启动子特征的寡核苷酸序列，通过分子聚合和延伸等技术，获得启动子强度跨度理想的启动子文库；该方法快速、高效、廉价、筛选工作量小。

附图说明

图1.质粒pMD19-T-RBS-GFP经XbaI单酶切的鉴定结果；其中；M：5000bpMarker；1:pMD19-T-RBS-GFP经XbaI酶切结果3427bp；空载质粒pMD19-T经XbaI酶切结果2699bp。

图2.将具有生物学功能的寡核苷酸序列合成成双链的示意图。

图3.带有启动子文库载体的构建完整示意图。

图4.筛选出的启动子文库的RFU/OD₆₀₀强度分布图。

具体实施方法

以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非限定本发明的范围。

本发明人针对大肠杆菌中组成型启动子的一些保守区域、半保守区域和随机序列的深入研究，首先根据这些特征区域，人为合成一段具有启动子生物学功能的寡核苷酸序列，然后利用退火和聚合等分子手段，合成双链，结合分子克隆和连接技术，连接到带有绿色荧光蛋白的报告载体上，转化到E.coliDH5a感受态(诺唯赞公司)，挑选单菌落，接种到试管中，培养相同时间后，检测其相对荧光值(RFU)和OD₆₀₀，借用RFU/OD₆₀₀来衡量启动子原件的强弱，获得了10条不同强度梯度的启动子元件，各启动子启动目的基因表达的表达量呈现梯度分布。本发明的启动子文库可实现对目的基因表达的连续微调。在此基础上完成了本发明。

实施例1.重组菌pMD19-T-RBS-GFP的构建和鉴定

本发明利用绿色荧光蛋白(GFP)作为报告基因以描述和表征调控其表达的人工合成的启动子强度。为了构建报告基因表达载体，便于突变启动子插入，首先需要构建带有报告基因的表达载体。在本发明中，特殊的是，在构建报告基因的表达载体时，需在设计引物的时候人为加入一段RBS核糖体结合位点在GFP基因前面，目的是使得下游的报告基因能够顺利的翻译出蛋白(RBS即核糖体结合位点，在蛋白的翻译中起重要的功能)，从而构建出在报告基因GFP前面带有RBS序列的载体pMD19-T-RBS-GFP重组菌。

具体方法如下：参照图2，用引物：GFP-RBS-F(GCTCTAGAaaattcggagaaacaaagATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTCA)和引物GFP-RBS-R(TCTTATTTGTATAGTTCATCCATGC)扩增绿色荧光蛋白目的基因GFP，扩增条件为：94℃预变性10min，94℃变性45s，48℃退火45s，72℃延伸3min，30个循环，72℃延伸10min，将获得的PCR产物，利用T-A克隆连接试剂盒(TaKaRa公司)经加A和连接反应后，成功构建重组质粒pMD19-T-RBS-GFP(原始质粒：pMD19-TTaKaRa公司)，后经限制性内切酶酶切鉴定得到正确的阳性克隆转化子，酶切鉴定如图1所示。

实施例2.具有生物学启动子功能的寡核苷酸序列的设计以及重组质粒

pMD19-T-P_spl-RBS-GFP的构建和鉴定

该实施例中，针对大肠杆菌生物体中，组成型启动子的保守型(-35区：TTGACA；-10区：TATAAT)、半保守区(转录起始位点；上游调控区域)和随机区域(-35区和-10区的间隔区域)的特征，设计出具有生物学启动子功能的一条寡核苷酸序列。其次为了方便连接到报告基因表达载体上，上下游各引入两个限制性酶切位点，分别为：EcoRI和XbaI，便于后面酶切鉴定。最后在转录起始位点后面引入一个NcoI酶切位点,其作用是方便于重组质粒的酶切鉴定阳性转化子。具体的寡核苷酸序列为：

将设计好后的寡核苷酸序列当作引物P1合成，同时设计和合成一段与其反向互补的短链寡核苷酸序列引物P2(5’-gcTCTAGAccgccccCCATG-3’)。将合成好的两条引物P1和P2，分别加入ddH₂O稀释到浓度为100uM，先将两条引物按照相同的摩尔量加入到反应体系中，94℃反应2min,冰上冷却至室温，形成双链粘性末端，再利用LargeKlenowFramgentE.Coli.DNA聚合酶(TaKaRa公司)补平粘性末端。反应体系，反应体系如下：

37℃反应30min后，再75℃灭活5min，将粘性末端补平，形成双链平末端DNA。介于反应后的产物量非常少，故采用乙醇沉淀回收DNA法回收，将回收后的产物再利用酶切消化，用PCR纯化试剂盒(TaKaRa公司提供)纯化回收消化后的片段，最后再利用T4连接酶(TaKaRa公司提供)和经过相同酶处理的载体片段进行连接，获得重组质粒pMD19-T-P_spl-RBS-GFP，构建示意图如图3所示(spl:人工合成启动子文库简称)。

实施例3.带有人工启动子文库的突变菌的获得和筛选方法的确立和筛选结果

将获得的重组质粒pMD19-T-P_spl-RBS-GFP连接液转化到E.coliDH5a菌株中，涂布到含有氨苄青霉素的LB平板(氨苄青霉素：母液浓度为100mg/mL，称取3g阿拉丁的氨苄青霉素定容到30毫升无菌水中，用0.22um无菌滤膜过滤除菌，用量为1/1000(v/v)；LB培养基：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl5g/L，pH7.0，平板中需添加15-20g/L琼脂粉。以上试剂全购于南京晚晴公司)中，37℃隔夜培养后，获得转化单菌落。

筛选方法：将转化后获得的单菌落，接种到5mL含有氨苄青霉素的LB培养基中，37℃，200rpm/min培养12h后，将5mL菌液，8000rpm/min离心10min后，用pH7.0PBS磷酸盐缓冲溶液重悬和洗涤菌体两次。分别在波长为600nm的条件下测量OD值，获得第一个测量值OD₆₀₀，其次用荧光分光光度计，在光度计模式的荧光测量模式下，设置激发波长为：488nm，发射波长为：510nm条件下，测量相对荧光值即RFU值。如果测量的RFU值超出仪器的测量范围，需要用PBS溶液稀释一定倍数后再次测量。最后借用RFU/OD₆₀₀的比值来衡量启动子的强弱。RFU/OD₆₀₀越高，代表该菌中含有的启动子强度越强，反之，同理。

利用以上的筛选方法，本发明随机挑选了200株单菌落，分别测量其对应的OD₆₀₀和RFU值，具体的数据见图4。其RFU/OD₆₀₀比值跨度从最低的178.16到最高的29834.95，跨度适中，满足了对下游基因的不同强度的调控。按照其强度分别分为三个等级：弱启动子，其RFU/OD₆₀₀位于535-587，该系列的启动子共有41条；中等强度启动子，其RFU/OD₆₀₀位于986-9942，该系列的启动子共有31条；强启动子，其RFU/OD₆₀₀位于10000-28000之间，共有18条。总共挑选10条启动子，进行测序，序列如表1所示。

表1：10条不同强度的启动子相对应的RFU/OD₆₀₀和其碱基序列

实施例4.启动文库精细调控IrrE增强大肠杆菌对渗透压的耐受性

IrrE作为一种新颖的全局调控蛋白，被广泛研究，其中发现其能够大幅度地提升宿主菌对高渗透压的抵抗能力。目前的研究中，将IrrE在大肠杆菌中异源表达，都是利用其自己的启动子groE，为了能够进一步提高IrrE蛋白对渗透压的提升能力，本发明人从该启动子文库中，筛选了相对原始启动子groE三种不同强度的启动子，即：10倍、20倍、34倍，调控IrrE蛋白的表达水平，来提高大肠杆菌对渗透压的耐受性。

为了比较启动子文库中启动子强度和GroE启动子的强度，本发明人将GroE启动子通过PCR扩展下来后，连接到pMD19-T-GFP中，按照启动子文库的筛选法测量得出该启动子RFU/OD₆₀₀的比值，再选出其10倍、20倍、34倍的启动子，连接到还有irrE基因的载体pMD19-T-irrE,获得新的表达载体。

然后，为了表征启动子文库的作用，被构建的菌株分别在含有0.5MNa⁺AM1培养基中，30g/L葡萄糖，200rpm/min，37℃，纯厌氧发酵48h，分别测量最终的OD₆₀₀和有机酸的产量。其结果显示启动子的强度越强，大肠杆菌对渗透压的提升效果越好,具体结果如表2所示。

表2不同强度的启动子调控IrrE蛋白提高大肠杆菌对渗透压的耐受性

<110>南京工业大学

<120>一种启动子文库的构建方法及其应用

<130>

<160>14

<170>PatentInversion3.3

<210>1

<211>70

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

tttgtgggcatttgattcttgacattgcgtatgatgggaagtataatgtttctatatcca60

tggggggcgg70

<210>2

<211>70

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

tttcacttaattattttcttgacattttactattgagttattataattgctacattacca60

tggggggcgg70

<210>3

<211>70

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

tttcagcccaattgattcttgacatccgccagcatgctcaatataatttcggggttacca60

tggggggcgg70

<210>4

<211>70

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

attgtgcttattaacttcttgacacccggtacttttcgcgttataatggtcccgtttcca60

tggggggcgg70

<210>5

<211>70

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

ttattggggatttatttcttgacaactcacaagtttcggggtataatttacccgtatcca60

tggggggcgg70

<210>6

<211>70

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

attctctgtaataggttcttgacatccacgcgatttgcgtgtataatggcgatgtatcca60

tggggggcgg70

<210>7

<211>70

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

ttttgacactatttttttctgacagaagtcgtctagtctcgtataatactgcgataacca60

tggggggcgg70

<210>8

<211>70

<212>DNA

<213>人工序列

<400>8

ttaatgttcaaaagcttcttgacagcgggacaggacggttttataatgtctctgttacca60

tggggggcgg70

<210>9

<211>70

<212>DNA

<213>人工序列

<400>9

tttgtttagatttccttcttgacaatccgggtactaggtgttataatagtgtggtttcca60

tggggggcgg70

<210>10

<211>70

<212>DNA

<213>人工序列

<400>10

ttttaacgtaattggttcttgacattttaccatagataacttataatatccatgtaacca60

tggggggcgg70

<210>11

<211>86

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(12)..(12)

<223>nisa,c,g,ort

<220>

<221>misc_feature

<222>(14)..(17)

<223>nisa,c,g,ort

<220>

<221>misc_feature

<222>(22)..(23)

<223>nisa,c,g,ort

<220>

<221>misc_feature

<222>(33)..(49)

<223>nisa,c,g,ort

<220>

<221>misc_feature

<222>(57)..(61)

<223>nisa,c,g,ort

<400>11

cggaattcwtwnwnnnnawwwnnttcttgacannnnnnnnnnnnnnnnntataatdnnnn60

nrtwwccatggggggcggtctagagc86

<210>12

<211>51

<212>DNA

<213>人工序列

<400>12

gctctagaaaattcggagaaacaaagatgagtaaaggagaagaacttttca51

<210>13

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<400>13

tcttatttgtatagttcatccatgc25

<210>14

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>14

gctctagaccgccccccatg20

Claims (8)

1.一种启动子文库的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）、根据原核生物启动子的保守区、半保守区、随机序列和转录起始位点，设计出具有启动子特征的寡核苷酸序列；

2）、将步骤1）设计得到的寡核苷酸序列经退火、延伸形成双链，再连接到带有报告基因的载体上，得到启动子的突变库；

3）、将步骤2）得到的启动子的突变库转入到宿主细胞中，涂布到相应抗性的平板中，得到启动子文库。

2.根据权利要求1所述的启动子文库的构建方法，其特征在于，步骤1）中所述具有启动子特征的寡核苷酸序列为：CGGAATTCWTWNWN₄AWWWNNTTCTTGACAN₁₇TATAATDN4RTWWCCATGGGGGGCGGTCTAGAGC。

3.根据权利要求1所述的启动子文库的构建方法，其特征在于，步骤2）中所述报告基因为绿色荧光蛋白gfp基因或者半乳糖苷酶基因lacZ。

4.根据权利要求1所述的启动子文库的构建方法，其特征在于，步骤2）中所述载体的报告基因前加入有一段RBS核糖体结合位点。

5.一种启动子强度的筛选方法，其特征在于，将含有突变库的菌株，分别涂布到相应抗性的平板中，挑选单菌落，培养，检测其OD₆₀₀和相对荧光强度RFU，利用RFU/OD₆₀₀作为衡量启动子强弱的标准，其值越大，启动子强度越强，反之。

6.一种启动子文库，其特征在于，所述的启动子文库包括SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9或SEQIDNO:10所示核苷酸序列的启动子。

7.根据权利要求6所述的启动子文库，其特征在于，所述的SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9或SEQIDNO:10所示核苷酸序列的启动子强度呈递增关系。

8.权利要求6所述的启动子文库在调节目的基因的表达中的应用。