CN105603053A - 高血压易感基因SCN7A单核苷酸多态性位点rs7565062的检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及分子生物学和医学领域，具体涉及人Ⅶ型电压门控钠离子通道α亚基基因(sodium？channel,voltage-gated,typeⅦ,alpha？subunit,SCN7A)的单核苷酸多态性(single？nucleotide？polymorphism,SNP)位点rs7565062及其与原发性高血压相关性的检测。本发明还涉及检测这个SNP位点的方法和试剂盒及其在用于检测原发性高血压易感性的方法中的用途，本发明有助于判断某个体患原发性高血压的发病风险是否大于普通人群。

Description

高血压易感基因SCN7A单核苷酸多态性位点rs7565062的检测试剂盒

技术领域

本发明涉及分子生物学和医学领域。更具体地涉及人Ⅶ型电压门控钠离子通道α亚基基因(sodiumchannel,voltage-gated,typeⅦ,alphasubunit,SCN7A)的单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism,SNP)位点rs7565062及其与原发性高血压相关性的检测。本发明还涉及检测这个SNP位点的方法和试剂盒。

背景技术

现有技术公开了原发性高血压(essentialhypertension,EH)是一种多因素、多基因疾病，由环境与遗传因素共同致病的常见而多发的心血管病症，对人类健康造成极大的影响。随着分子医学的发展，目前已经发现的高血压相关基因已经有150余种，但是EH的发病机制仍然不完全清楚，高血压的早期诊断和预防问题仍然未能完全解决。研究显示，EH是遗传因子和环境共同作用的结果，血压的变化30％-60％归因于遗传，由于环境因素是可以控制和确认的，而对高血压遗传学因素却是固定不变的，因此，对可变因素的控制，如对高血压危险因素的预防，可以在一定程度上延缓和防止高血压的发病，但是对固定不变的遗传因素的认识不足却在一定程度上严重影响着对高血压发病、诊断和治疗。因此对高血压遗传学的研究十分必要(王佐广，温绍君，吴兆苏.高血压、易感基因与单核苷酸多态性[J].高血压杂志，2001，9：259-264)。

近二十余年来，有关高血压治疗的研究更多地集中在对血压的控制和对靶器官的保护，并已取得突飞猛进的发展。但是，业内研究人员认为，这些手段并不能从根本上控制血压，目前对人类内源性抗高血压基因的研究还很少，因此，研究内源性抗高血压机制是今后高血压防治研究的主要方向之一，具有重要的研究价值和应用前景，业内研究人员认为，通过调节内源性抗高血压机制治疗高血压病，将会促进我国生物医疗技术的发展，并为我国每年节省巨大的医疗费用。

已有研究证实钠盐的过多摄取在高血压的发生发展中发挥着重要作用。研究表明有一种以前认为是电压门控的钠离子通道，目前被发现为钠离子浓度依赖型钠离子通道，其能根据钠离子浓度的变化改变钠离子通道开放程度，在脑室周细胞中作为钠离子感受器，参与中枢对钠盐摄入行为的控制，因此可能参与了原发性高血压的发生发展；而Ⅶ型电压门控钠离子通道基因(sodiumchannel,voltage-gated,typeⅦ,alphasubunit；SCN7A)编码该钠离子通道的重要功能结构—α亚基，因此，有理由推断SCN7A基因作为血压调节环节中的重要部分，其蛋白功能及结构的改变均可能参与了原发性高血压的发生发展，基于以上研究基础，本申请在大样本人群的关联研究中证实该基因与原发性高血压密切相关，认为在该基因rs7565062位点上携带A等位基因的人群患高血压的风险更高。

综上所述，本申请的发明人拟提供新的原发性高血压易感基因，及其检测方法、试剂盒，以及相关的治疗药物。

发明内容

本发明的目的是为克服现有技术的不足，提供一种新的检测(包括早期诊断)高血压易感基因的方法及检测试剂盒。具体涉及高血压易感基因SCN7A单核苷酸多态性位点rs7565062的检测试剂盒

本发明提供了与高血压密切相关的SCN7A基因单核苷酸多态性位点rs7565062(位于SCN7A的5’引导序列中，片段重叠群contig：NT_005403.18位置71981560A/C)；

并经实验证实，SCN7A基因单核苷酸多态性位点rs7565062位于SCN7A，5’引导序列中(片段重叠群contig：NT_005403.18位置71981560A/C)基因型的改变将导致高血压的发病风险升高，其中关联研究结果显示，在SCN7A基因rs7565062A→C在病例和对照组中的分布存在显著性差异(p<0.05)，该SNP多态性可改变转录因子结合位点。

本发明涉及的SCN7A基因的详细序列可参见登录号为rs7565062的核苷酸序列(可参见网址http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。

本发明人对SCN7A基因中的5’引导序列中(片段重叠群contig：NT_005403.18位置71981560A/C)区域进行了测序。

本发明涉及的SC7A基因rs7565062位点的多态性可直接用于高血压的个性化治疗；在使用本发明SCN7A基因rs7565062位点的多态性时，还可同时使用其他治疗高血压的药剂。

本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效的本发明SCN7A蛋白以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。

本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备；诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。

本发明的药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊在无菌条件下制造；活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天0.1微克/千克体重-约10毫克/千克体重；此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。

使用药物组合物时，是将安全有效量的SCN7A蛋白或其拮抗剂、激动剂施用于普哺乳动物，其中该安全有效剂量通常至少约0.1微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约10毫克/千克体重，较佳地该剂量是约0.1微克/千克体重-约100毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内。

本发明中还涉及检测SCN7A基因的rs7565062的基因型可用于诊断高血压。检测可以针对基因组DNA，也可针对SCN7A基因的扩增片段。SCN7A基因的rs7565062的基因型可用已有的技术如Southern印迹法、DNA序列分析、PCR和原位杂交检测突变。

在本发明中，提供了SCN7A基因rs7565062位点的基因型在检测对高血压易感性制剂或方法中的用途，如提供了一种用于对个体的高血压易感性进行诊断的方法，它包括步骤：

检测该个体的SCN7A基因rs7565062位点的基因型，以此判断该个体患高血压的发病风险是否高于普通人群。

在另一优选例中，所述的差异是选自下列的单核苷酸多态性：

Rs7565062位于SCN7A，5’引导序列中(片段重叠群contig：NT_005403.18位置71981560A/C)

其中，脱氧核糖核酸(DNA)序列编号：rs7565062位置基于SEQIDNO：1/6。

在本发明的另一方面，提供了一种检测样品是否存在SCN7A基因的单核苷酸多态性的方法，包括步骤：

(a)用SCN7A基因5’引导序列特异性引物扩增样品的基因组DNA，得到扩增产物；和

(b)检测扩增产物中单核苷酸多态性位点rs7565062的基因型：

Rs7565062位于SCN7A，5’引导序列中(片段重叠群contig：NT_005403.18位置71981560A/C)

其中，脱氧核糖核酸(DNA)序列编号：引物1基于SEQIDNO：2/6；引物2基于SEQIDNO：3/6；探针1基于SEQIDNO：4/6；探针2基于SEQIDNO：5/6；扩增产物基于SEQIDNO：6/6。

在另一优选例中，所述的单核苷酸多态性是rs7565062位于SCN7A，5’引导序列中(片段重叠群contig：NT_005403.18位置71981560A/C)

其中，脱氧核糖核酸(DNA)序列编号：rs7565062位置基于SEQIDNO：1/6。

在另一优选例中，所述的试剂盒还含有选自下列的试剂：SCN7A的5’引导序列特异性引物、与单核苷酸多态性位点rs7565062结合的探针。

其中，脱氧核糖核酸(DNA)序列编号：引物1基于SEQIDNO：2/6；引物2基于SEQIDNO：3/6；探针1基于SEQIDNO：4/6；探针2基于SEQIDNO：5/6；扩增产物基于SEQIDNO：6/6。

在另一优选例中，所述的SCN7A的5’引导序列单核苷酸多态性位点：

Rs7565062位于SCN7A，5’引导序列中(片段重叠群contig：NT_005403.18位置71981560A/C)

其中，脱氧核糖核酸(DNA)序列编号：rs7565062位置基于SEQIDNO：1/6。

本发明公开了高血压易感基因SCN7A单核苷酸多态性位点rs7565062的检测试剂盒及其在用于检测原发性高血压易感性的方法中的用途，有助于判断某个体患原发性高血压的发病风险是否大于普通人群。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用做参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲述内容之后，本领域技术人员可以对本发明做各种改动或修改，这些形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

附图说明

图1显示了SCN7Ars7565062位于SCN7A，5’引导序列中(片段重叠群contig：NT_005403.18位置71981560A/C)的一种SNP基因型的测序结果。

图2是SCN7A基因rs7565062位点基因型的检测结果。

图3是实施例2的测序结果截图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆；实验室手册(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1荧光PCR检测

实验材料：

7900HT荧光定量PCR仪购自美国ABI公司，聚合酶链反应液(TaqManEXPressMasterMix)由美国应用生物系统公司(ABI)定制合成。

引物及探针设计与合成：

以SCN7A基因5’引导序列的部分序列为模板，使用PrimerExpressTM2.0软件分析TaqMan引物和探针位点，并由美国应用生物系统公司(ABI)定制合成。检测用引物：

SCN7A基因rs7565062上游引物序列：5＇-TGGAGAAGTTGAAAGGTAGAT-3＇

SCN7A基因rs7565062下游引物序列：5＇-ACTGCCTAACCAGGTAAGAT-3＇

荧光探针：

SCN7A基因rs7565062荧光探针1：5＇-VIC-aaagccaactcctgatttgga-TAMRA-3＇SCN7A基因rs7565062荧光探针2：5＇-FAM-aaagccaaatcctgatttgga-TAMRA-3＇样本检测：

实验共检613例高血压病例和616例正常对照人群，每例收集血样标本约2ml，用酚/氯仿抽屉基因组DNA，抽提结果用微量紫外/可见光分光光度计(INFINIGEN公司)检测。

按如下体系进行荧光PCR扩增，最后用SDS2.3扫描并聚类分析

基因组DNA抽提的检测结果显示：所有样本的基因组DNA符合检测要求(260/280>1.8，浓度>10ng/ul，如图2所示样本54号的检测结果)；

表1为SNP分型结果。

表1

实施例2

用测序法检测原发性高血压易感基因SCN7A基因的rs7565062位点。挑选上述高血压病例-对照组样本各10例进行测序判断rs75650629的基因型。

实验方法：PCR测序引物仍采用上述荧光PCR用引物，扩增的产物经纯化后直接测序。测序的仪器是ABI公司的3130xl遗传分析仪，用sequenceanalysis5.2分析软件进行分析，结果用chromas可以查看；

实验结果显示，20例的测序结果与7900荧光PCR的基因型分析结果完全一致。

SCN7A基因rs7565062基因型和高血压易感的关联分析结果显示，SCN7A基因rs7565062在高血压病人和对照中分布的比较采用RxCχ²检验.用SPSS软件进行统计分析，检测结果及SPSS软件分析结果如图2所示。

表2

SEQUENCELISTING

<110>首都医科大学附属北京安贞医院北京市心肺血管疾病研究所

<120>高血压易感基因SCN7A单核苷酸多态性位点rs7565062的检测试剂盒

<160>6

<170>PatentInversion3.3

<210>1

<211>52

<212>DNA

<213>homosapiens

<400>1

ccatgaagaagaagacttaaagccaactcctgatttggaagttggcaaaaag52

<210>2

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

tggagaagttgaaaggtagat21

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

actgcctaaccaggtaagat20

<210>4

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

aaagccaactcctgatttgga21

<210>5

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

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<210>6

<211>720

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

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tttgggaacacacatattggagatttttgtcaaaactgatatcttacctggttaggcagt720

Claims (6)

1.一种高血压易感基因rs7565062位点的检测方法，其特征在于，检测SCN7A基因rs7565062位点的基因型,其包括步骤：

(a)抽提样品的基因组DNA,扩增获得SCN7A基因包含rs7565062位点的区域，扩增产物基于SEQIDNO：6/6；

(b)检测步骤(a)产物中单核苷酸多态性位点rs7565062的基因型。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，检测的SCN7A基因rs7565062位点的基因型；其位点位于SCN7A基因5’引导序列中(片段重叠群contig：NT_005403.18位置71981560A/C)，rs7565062的位置基于SEQIDNO：1/6。

3.如权利要求2所述的检测方法，其特征在于，扩增SCN7A基因5’引导序列(片段重叠群contig：NT_005403.18位置71981560A/C)包含rs7565062位点的区域的引物序列如SEQIDNO：2/6和SEQIDNO：3/6所示。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，检测rs7565062位点基因型的探针序列如SEQIDNO：4/6和SEQIDNO：5/6所示。

5.一种检测高血压易感基因的试剂盒，其特征在于，它含有与位点rs7565062结合的探针，序列如SEQID。NO：4/6；和SEQIDNO：5/6所示。

6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，它还包括特异性扩增SCN7A基因5’引导序列中包含rs7565062位点的区域的引物，引物的序列如SEQIDNO：2/6和SEQIDNO：3/6所示。