CN105566468A

CN105566468A - 植物育性相关蛋白及其应用

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Publication number: CN105566468A
Application number: CN201610015709.8A
Authority: CN
Inventors: 孔秀英; 夏川; 张立超; 赵光耀; 贾继增
Original assignee: Institute of Crop Sciences of CAAS
Current assignee: Institute of Crop Sciences of CAAS
Priority date: 2016-01-11
Filing date: 2016-01-11
Publication date: 2016-05-11
Anticipated expiration: 2036-01-11
Also published as: CN105566468B

Abstract

本发明公开了植物育性相关蛋白TF1299及其应用。该TF1299蛋白为氨基酸序列如SEQ？ID？No.1所示的蛋白质。本发明首次鉴定了育性相关蛋白TF1299，育性相关蛋白TF1299的编码基因在过表达的情况下下会引起植物的花药败育，证明育性相关蛋白TF1299或其基因在控制花药发育的过程中发挥重要作用。本发明不仅为进一步阐明雄性不育的分子机理提供基础，而且为杂交制种提供新的基因资源和育种资源。

Description

植物育性相关蛋白及其应用

技术领域

本发明涉及植物分子生物学领域中的植物育性相关蛋白及其应用，特别地涉及植物雄性不育相关蛋白及其应用。

背景技术

作物的有性生殖过程与作物产量以及杂种优势的利用密切相关,其中雄性不育已经在在玉米、油菜、高粱、水稻等多种作物中被用于杂交制种，使作物的产量和品质得以提高。雄性不育的植物材料，在花药及雄配子体的分化发育过程中存在异常，不能完成有性生殖过程，即不能自花授粉及自交结实，因此雄性不育突变体在理论研究和农业生产实践中都具有重要价值。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何降低植物的育性。

为了解决上述技术问题，本发明提供了一个植物育性相关蛋白。

本发明所提供的育性相关蛋白名称为TF1299，为如下A1)或A2)：

A1)氨基酸序列如SEQIDNo.1所示的蛋白质；

A2)在A1)的蛋白质的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的与植物育性相关的由A1)衍生的蛋白质；

A3)在SEQIDNo.1所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质。

上述植物育性相关蛋白TF1299具体可为调控植物花药或花粉发育的相关蛋白。

其中，SEQIDNo.1由254个氨基酸残基组成。

为了使A1)中的蛋白质便于纯化，可在序列表中SEQIDNo.1所示的氨基酸序列的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1、标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述A2)中的TF1299蛋白，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

上述A2)中的TF1299蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述A2)中的TF1299蛋白的编码基因可通过将SEQIDNo.2的第89-853位所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变得到。

为解决上述技术问题，本发明还提供了与所述TF1299蛋白相关的生物材料。

本发明所提供的与所述TF1299蛋白相关的生物材料，为下述B1)至B7)中至少一种：

B1)编码TF1299的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)含有B1)所述核酸分子或B2)所述表达盒的重组载体；

B4)含有B1)所述核酸分子、B2)所述表达盒或B3)所述重组载体的重组微生物；

B5)含有B1)所述核酸分子、B2)所述表达盒或B3)所述重组载体的重组细胞系；

B6)含有B1)所述核酸分子、B2)所述表达盒或B3)所述重组载体的转基因植物组织；

B7)含有B1)所述核酸分子、B2)所述表达盒或B3)所述重组载体的转基因植物器官。

上述与所述TF1299蛋白相关的生物材料中，B1)所述核酸分子可为如下1)-5)中任一所示的基因：

1)其编码序列是SEQIDNo.2的第89-853位所示的DNA分子或cDNA分子；

2)序列是SEQIDNo.2所示的DNA分子或cDNA分子；

3)与1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述TF1299蛋白的DNA分子或cDNA分子；

4)与2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述TF1299蛋白的DNA分子或cDNA分子；

5)在严格条件下与1)-4)中任一所述限定的核苷酸序列杂交，且编码所述TF1299蛋白的DNA分子或cDNA分子。

上述用于编码所述TF1299蛋白的核酸分子，本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码所述TF1299蛋白的核酸分子的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，与本发明分离得到的编码所述TF1299蛋白的核酸分子的核苷酸序列具有75％或者更高同一性且编码所述TF1299蛋白，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指核酸序列间的序列相似性。“同一性”包括与本发明的SEQIDNo.2的第89-853位核苷酸所示的DNA分子或cDNA分子具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列；与本发明的SEQIDNo.2所示的DNA分子或cDNA分子具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列；同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min。

其中，SEQIDNo.2由1164个核苷酸组成，其编码序列是第89-853位，编码SEQIDNo.1所示的蛋白质。

上述与所述TF1299蛋白相关的生物材料中，所述表达盒是指能够在宿主细胞中表达相应蛋白质的DNA，该DNA不但可包括启动相关基因转录的启动子，还可包括终止相关基因转录的终止子，如B2)所述的含有编码TF1299蛋白的核酸分子的表达盒，是指能够在宿主细胞中表达TF1299蛋白的DNA。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：玉米Ubiquitin启动子、组成型启动子T7lac、花椰菜花叶病毒的组成型启动子CaMV35S、番茄核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶小亚基(Smallsubunitofribulose-1,5-bisphospatecarboxylase,rbcs)基因启动子；来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶("LAP",Chao等人(1999)PlantPhysiol.120:979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(PR1)(由水杨酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羟酸S-甲酯)诱导)；西红柿蛋白酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启动子(均可用茉莉酮酸曱酯诱导)；热休克启动子(美国专利5，187，267)；四环素诱导型启动子(美国专利5，057,422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pF128(CN101063139B(中国专利200710099169.7))，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆betaconglycin的启动子(Beachy等人(1985)EMBOJ.4:3047-3053))。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：根癌农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、T7终止子、花椰菜花叶病毒CaMV35S终止子、tml终止子、豌豆rbcSE9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如：Odell等(1985)，Nature，313:810；Rosenberg等(1987)，Gene,56:125；Guerineau等(1991)，Mol.Gen.Genet,262:141；Proudfoot(1991)，Cell,64:671；Sanfacon等，GenesDev.，5:141；Mogen等(1990)，PlantCell,2:1261；Munroe等(1990)，Gene，91:151；Ballad等(1989)，NucleicAcidsRes.17:7891；Joshi等(1987)，NucleicAcidRes.,15:9627)。

上述与所述TF1299蛋白相关的生物材料中，可用现有的植物表达载体构建含有所述TF1299基因的重组表达载体,所述植物表达载体包括Gateway系统载体、双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3’端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的TF1299基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对methatrexate抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。上述与所述TF1299蛋白相关的生物材料中，B3)所述重组载体可含有SEQIDNo.2的第89-853位所示的用于编码TF1299蛋白的DNA序列。

上述与所述TF1299蛋白相关的生物材料中，B4)所述重组微生物具体可为细菌,酵母,藻和真菌。其中，细菌可来自埃希氏菌属(Escherichia),欧文氏菌(Erwinia),根癌农杆菌属(Agrobacterium)、黄杆菌属(Flavobacterium),产碱菌属(Alcaligenes),假单胞菌属(Pseudomonas),芽胞杆菌属(Bacillus)等。B5)所述的转基因细胞系，B6)所述的转基因植物组织和B7)所述的转基因植物器官不包括植物的繁殖材料。

上述与所述TF1299蛋白相关的生物材料中，B5)所述的重组细胞系、B6)所述的转基因植物组织和B7)所述的转基因植物器官不包括繁殖材料。

为解决上述技术问题，本发明还提供了上述TF1299蛋白或上述B1)-B4)任一所述的生物材料在调控植物育性中的应用。其中，所述调控植物育性为降低植物育性。所述降低植物育性具体可体现在植物自交结实率降低上。

为解决上述技术问题，本发明还提供了所述TF1299蛋白或上述B1)-B4)任一所述的生物材料在调控植物自交结实率中的应用。其中，所述调控植物自交结实率为降低植物的自交结实率。

为解决上述技术问题，本发明还提供了所述TF1299蛋白或上述B1)-B4)任一所述的生物材料在调控植物花药或花粉发育中的应用。其中，所述调控植物花药或花粉发育具体体现为花药或花粉异形、数量减少。

为解决上述技术问题，本发明还提供了上述B1)-B4)中任一所述的相关的生物材料在培育雄性不育的植物中的应用；所述植物为转基因植物。

为解决上述技术问题，本发明还提供了一种培育雄性不育植物的方法；所述植物为转基因植物。

本发明所提供的一种培育雄性不育的转基因植物的方法，包括向受体植物中导入上述TF1299蛋白的编码基因得到雄性不育的转基因植物；所述受体植物为雄性可育植物。

上述方法中，所述TF1299蛋白的编码基因为如下1)-5)中任一所示的基因：

1)其编码序列是SEQIDNo.2的第89-853位所示的DNA分子或cDNA分子；

2)序列是SEQIDNo.2所示的DNA分子或cDNA分子；

其中，所述TF1299蛋白的编码基因可先进行如下修饰，再导入受体水稻中，以达到更好的表达效果：

1)根据实际需要进行修饰和优化，以使基因高效表达；例如，可根据受体植物所偏爱的密码子，在保持本发明所述TF1299蛋白编码基因的氨基酸序列的同时改变其密码子以符合植物偏爱性；优化过程中，最好能使优化后的编码序列中保持一定的GC含量，以最好地实现植物中导入基因的高水平表达，其中GC含量可为35％、多于45％、多于50％或多于约60％；

2)修饰邻近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻译有效起始；例如，利用在植物中已知的有效的序列进行修饰；

3)与各种植物表达的启动子连接，以利于其在植物中的表达；所述启动子可包括组成型、诱导型、时序调节、发育调节、化学调节、组织优选和组织特异性启动子；启动子的选择将随着表达时间和空间需要而变化，而且也取决于靶物种；例如组织或器官的特异性表达启动子，根据需要受体在发育的什么时期而定；

4)与适合的转录终止子连接，也可以提高本发明基因的表达效率；例如来源于CaMV的tml，来源于rbcS的E9；任何已知在植物中起作用的可得到的终止子都可以与本发明基因进行连接；

5)引入增强子序列，如内含子序列(例如来源于Adhl和bronzel)和病毒前导序列(例如来源于TMV,MCMV和AMV)。

所述TF1299基因表达载体可通过使用农杆菌介导、Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、基因枪等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。

所述方法还包括从导入SEQIDNo.2所示的TF1299蛋白的编码基因的植株中筛选表达所述编码基因的植株，得到所述转基因水稻的步骤。

上文中，所述转基因植物理解为不仅包含将所述基因转化受体植物得到的第一代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。

本发明所涉及的雄性不育体现为花药败育(花粉败育)或雄性育性降低。

本发明所涉及的植物可为单子叶植物或双子叶植物，所述单子叶植物具体可为禾本科植物，如水稻或小麦。

实验证明，将本发明的SEQIDNo.2的DNA分子(TF1299基因)导入水稻中，获得转TF1299基因的纯合株系花药不能产生正常花粉，自交结实率极低。本发明首次鉴定了育性相关蛋白TF1299，育性相关蛋白TF1299的编码基因在过表达的情况下会引起植物的花药败育，证明育性相关蛋白TF1299或其基因在控制花药发育的过程中发挥重要作用。本发明不仅为进一步阐明雄性不育的分子机理提供基础，而且为杂交制种提供新的基因资源和育种资源。

附图说明

图1为转TF1299基因的水稻与野生型水稻的表型。其中，A为野生型日本晴水稻及小花；B为TF1299纯合转基因水稻及小花；C为日本晴水稻花药及花粉；D为TF1299纯合转基因水稻花药及花粉。

图2为TF1299基因在野生型与转TF1299基因的水稻植株中的表达情况。

图3为转TF1299基因的水稻株系与野生型水稻株系的正常花粉与异形花粉数统计图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的2×PfuPCRMasterMix为天根生化科技(北京)有限公司的产品，产品目录号为KP201，该试剂含pfutaq酶；BPIIEnzymemix为LifeTechnologies的产品，产品目录号为11789-020；LRIIEnzymemix为LifeTechnologies的产品,产品目录号为11791-020；VectorConversionSystem为LifeTechnologies的产品,产品目录号为11828-019。

下述实施例中的入门载体pDONR^TM/ZeoVector为LifeTechnologies的产品，产品目录号为12535-035。

下述实施例中的大肠杆菌TOP10感受态细胞为北京全式金生物技术有限公司的产品。

下述实施例中的载体pCUbi1390(彭昊.利用T-DNA插入突变和RNA干扰技术研究水稻基因功能.中国农业科学院博士学位论文P43-44.2005)，公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的根癌农杆菌EHA105为北京华越洋生物科技有限公司的产品，产品目录号为GX0133-100。

下述实施例中的中国春小麦(TriticumaestivumL.)(P.Sourdille,T.Cadalen,H.Guyomarc'h,J.Snape,M.Perretant,G.Charmet,C.Boeuf,S.BernardandM.Bernard.AnupdateoftheCourtot×ChineseSpringintervarietalmolecularmarkerlinkagemapfortheQTLdetectionofagronomictraitsinwheat.TheoreticalandAppliedGenetics.2003,106(3):530-538)，公众可以从中国农业科学院作物科学研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的日本晴(O.SativaL.spp.japonica,varnippobare,AAgenome)(李磊，薛芗，左示敏，陈宗祥，潘存红，张亚芳，李亚超，朱俊凯，马玉银，潘学彪.扬州大学学报,2013年02期)，公众可以从中国农业科学院作物科学研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的培养基的配制方法如下：

一筛培养基:pH值为5.8，由NB基本培养基、2,4-D、潮霉素、噻孢霉素和Phytgel组成；各成分的浓度如下：2.0mg/L2,4-D，50mg/L潮霉素，0.5g/L噻孢霉素，2.5g/LPhytgel。

二筛培养基:pH值为5.8，由NB基本培养基、脱落酸(ABA)、6-苄氨基嘌呤(BA)、α-萘乙酸(NAA)、潮霉素、噻孢霉素和phytgel组成；各成分的浓度如下：5.0mg/L脱落酸(ABA)，2.0mg/L6-苄氨基嘌呤(BA)，l.0mg/Lα-萘乙酸(NAA)，50mg/L潮霉素，0.5g/L噻孢霉素，2.5g/Lphytgel。

三筛培养基：pH值为5.8，由MS培养基(含大量元素，微量元素和有机成分)、蔗糖和琼脂组成；各成分的浓度如下：30g/L蔗糖，15g/L琼脂。

SOC培养基：pH值为5.8，20gTryptone，5gYeastExtract，0.5gNaCl，2.5mMKCl，10mMMgCl₂，20mMglucose，去离子水1L。

AMM培养基：pH值为7，NH₄Cl1.0g，CaCl₂·H₂O0.001g，MgSO₄·7H₂O0.2g，FeSO₄·7H₂O0.001g，乙酸钠5g，酵母提取液0.5g，K₂HPO₄0.5g，去离子水1L。

分化培养基：MS大量+MS-Fe盐+B5微量+B5有机+NAA0.1mg/L+KT4mg/L+proline500mg/L+glutamine500mg/L+CH300mg/L+麦芽糖/蔗糖30g/L+Gelrite2.6mg/L+cef.250mg/L+Hyg50mg/L。

实施例1、TF1299基因过表达载体以及重组农杆菌的构建

一、利用Gateway技术构建TF1299基因过表达载体

1、attB引物设计

设计并合成如下引物，并在上游引物(F₁)和下游引物(R₁)的5'端分别加入attB1和attB2重组位点。

F₁：5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTAAAGCCTTACTACTCGCCTC-3’；

R₁：5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTTCTTCAACAAATTACAACA-3’。(下划线所示序列为attB重组位点)

2、提取小麦中国春(TriticumaestivumL.)小麦的总RNA，反转录为cDNA。

3、以步骤2得到的cDNA为模板，用F₁和R₁为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

PCR体系(25.0μL)：12.5μL2×PfuPCRMasterMix、3.0μL上游引物(F₁)(浓度为2μM)、3.0μL下游引物(R₁)(浓度为2μM)、2.0μLcDNA模板(质量为30ng)、DMSO1.5μL，加ddH₂O补足体系至25.0μL。

PCR反应程序：95℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1.5min，共35个循环；72℃延伸5min，4℃保存。

对PCR扩增产物进行测序，测序结果表明：PCR扩增产物中含有SEQIDNo.2所示的TF1299基因。该基因的编码序列为SEQIDNo.2的第89-853位核苷酸，编码SEQIDNo.1所示的蛋白质。

4、BP反应

BP反应体系：步骤3得到的PCR扩增产物25ng、入门载体pDONR^TM/Zeo40ng、BPIIEnzymemix0.3μL，加灭菌ddH₂O补足体系至2.5μL。

BP反应程序：25℃反应10h，得到BP反应产物。

5、将2.5μL步骤4得到的BP反应产物加入到30μL大肠杆菌TOP10感受态细胞液中，冰浴15min，42℃热激90s，然后迅速置于冰上2min；加入500μLSOC培养基，在37℃、225rpm条件下复苏50min，得到复苏液；将复苏液均匀涂布于LB固体培养基(含浓度为30μg/mL的Zeocin)表面，37℃倒置培养过夜。入门载体pDONR^TM/Zeo自身带有致死基因，不能在培养基上生存，通过BP反应目标基因片段会取代致死基因，所以在LB固体培养基(含浓度为30μg/mL的Zeocin)上生存的克隆即为含有目标基因片段的入门克隆(entryclone)。

6、将步骤5得到的入门克隆提取质粒进行双向测序验证，测序验证所用引物为入门载体pDONR^TM/Zeo通用引物，序列如下：

M13F：5’-GTAAAACGACGGCCAG-3’；

M13R：5’-CAGGAAACAGCTATGAC-3’。经测序验证正确的重组质粒命名为入门质粒。

7、LR反应

目标载体pGW-CUbi1390的构建：用平末端酶PmlI切开pCUbi1390，得到载体；利用VectorConversionSystem，将gatewaycasseteA(平端)连入载体，具体的方法为VectorConversionSystem标准流程，可从LifeTechnologies主页下载，所得到的目标载体即为pGW-CUbi1390。

LR反应体系：入门质粒25ng、目标载体pGW-CUbi139040ng、LRIIEnzymemix0.3μL，加灭菌ddH₂O补足体系至2.5μL。

LR反应程序：25℃反应10h，得到重组载体pGW-CUbi1390-TF1299，即为LR反应产物。

8、将2.5μL步骤7得到的LR反应产物加入30μL大肠杆菌TOP10感受态细胞液中，冰浴15min，42℃热激90s，然后迅速置于冰上2min；加入500μLSOC培养基，在37℃、225rpm条件下复苏50min，得到复苏液；将复苏液均匀涂布于LB固体培养基(含浓度为50μg/mL的卡那霉素)表面，37℃倒置培养过夜。目标载体pGW-CUbi1390自身带有致死基因，不能在LB固体培养基(含浓度为50μg/mL的卡那霉素)上生存，通过LR反应目标基因片段会取代致死基因，所以在培养基上生存的克隆即为含有目标基因片段的目标克隆(Destiantionclone)。

9、将步骤8得到的目标克隆提取质粒进行双向测序验证，测序验证所用引物为pGW-CUbi1390载体插入片段两端启动子区及终止区引物，序列如下：

Pubi：5’-TTTGTCGATGCTCACCCTG-3’；

Tnos：5’-TTGCCAAATGTTTGAACGA-3’。

测序验证结果表明重组载体pGW-CUbi1390-TF1299含有SEQIDNo.2所示的TF1299基因。

二、重组农杆菌的构建

将步骤一得到的重组载体pGW-CUbi1390-TF1299转化根癌农杆菌EHA105，得到重组根癌农杆菌；同时将目标载体pGW-CUbi1390转化根癌农杆菌EHA105，得到对照重组菌。将重组根癌农杆菌提取质粒，进行测序，测序结果表明重组载体pGW-CUbi1390-TF1299成功转入根癌农杆菌EHA105中，重组根癌农杆菌构建正确。

实施例2、转基因植物的获得

一、水稻愈伤组织的农杆菌侵染

1、取水稻日本晴的种子去壳灭菌，平铺到愈伤诱导培养基诱导两周，挑出愈伤继代培养两周至长出直径2mm左右的愈伤颗粒。

2、将实施例1得到的重组根癌农杆菌用LB液体培养基(含浓度为50mg/L的利福平和浓度为50mg/L的潮霉素)培养过夜，使OD₆₀₀值为0.6-0.8左右，得到重组根癌农杆菌菌液。

3、取3mL左右的重组根癌农杆菌菌液4000rmp离心3min，去上清，收集重组根癌农杆菌菌体，将重组根癌农杆菌菌体重悬于20mL左右的AMM(含浓度为100μmol/L的乙酰丁香酮)液体培养基中，在28℃，150rpm条件下摇两个小时，得到目的菌液。

4、浸染：将步骤1得到的愈伤颗粒在步骤3得到的目的菌液中浸泡20min，再放到有一层滤纸的共培养基上，得到共培养后的愈伤颗粒。三天以后将共培养后的愈伤颗粒用灭菌蒸馏水洗三次，每次20min左右，再用含浓度为500mg/L的羧苄的灭菌水洗两次，每次30min，可重复多次直到洗液很清亮，得到清洗后的愈伤颗粒。将清洗后的愈伤颗粒放在无菌滤纸上晾干，再将其放到一筛培养基上培养两周，得到一筛培养后的愈伤颗粒。将一筛培养后的愈伤颗粒转到二筛培养基上培养两周，得到二筛培养后的愈伤颗粒。将二筛培养后的愈伤颗粒再后转到三筛培养基上培养两周，得到抗性愈伤颗粒。

5、将抗性愈伤颗粒转到分化培养基上培养，得到分化小苗。

6、将步骤5得到的分化小苗栽到1/2MS培养基上培养生根，得到生根的小苗。然后将生根的小苗转到温室种植，得到T₀代植株，收获T₀代植株自交所结的种子，得到T₁代种子，将T₁代种子播种到大田中种植，得到实验组的T₁代植株。将实验组的T₁代植株自交，得到实验组的T₂代种子，以此方法直到获得实验组的T₂代植株。

除将上述步骤2中的重组根癌农杆菌替换为同实施例1得到的对照重组菌外，其它操作步骤不变，进行上述实验得到对照组的T₁代植株和T₂代植株。

二、对实验组和对照组的水稻植株进行分子鉴定

1、转TF1299基因纯合株系的获得提取实验组和对照组的T₁代植株和T₂代植株的叶片的基因组DNA，以F₂和R₂为引物进行PCR扩增，靶序列为约200bp的条带。引物序列如下：

F₂：5’-TCACCACCGATGTGGAGAAGTT-3’；

R₂：5’-TGTGCACCGCAACAAGTGACAA-3’。

能得到约200bp的条带的植株，PCR鉴定为阳性，即为转TF1299基因的植株。对于某一T₁代植株，如果由此植株自交得到的T₂代植株均经过PCR鉴定为阳性，则该植株为纯合的转TF1299基因的植株，该植株及其后代即为1个转TF1299基因纯化株系。

对照组的T₁代植株和T₂代植株进行上述PCR分子鉴定，均未得到约200bp的条带，结果均为阴性。

2、转基因水稻的实时定量PCR(QuantitativeReal-timePCR,QRT-PCR)

收获上述步骤中获得的T₂代转TF1299基因纯合株系植株所结的种子进行种植，得到T₃代转TF1299基因纯合株系。提取T₃代转TF1299基因纯合株系以及亲本日本晴花药的总RNA，反转录为cDNA，以F₂和R₂为引物，水稻18SrRNA为内参基因，进行实时定量PCR，利用ΔΔCt法计算转TF1299基因水稻与日本晴水稻植株中基因TF1299的转录水平。

结果表明：转TF1299基因纯化株系中TF1299基因表达，而野生型日本晴中没有TF1299表达(图2)。

实施例3、转基因植物表型鉴定

为了明确TF1299基因对水稻花药发育过程的影响，收获按照实施例2方法获得的T₂代转TF1299基因纯合株系植株所结的种子和T₂代纯合对照组株系植株所结的种子进行种植，收获T₃代转TF1299基因纯合株系水稻种子和T₃代纯合对照组株系水稻种子，将T₃代转TF1299基因纯合株系水稻种子和T₃代纯合对照组株系水稻种子在北京和廊坊两地种植，以野生型日本晴水稻作为对照，每种水稻各种植4个株系，每个株系20株，对植株表型进行调查，并在水稻抽穗前1-2天，花粉成熟时期取花药对花粉进行碘化钾染色，检测花粉活力，其中碘化钾染色后呈黑色圆形的花粉为正常花粉，呈黄褐色且干瘪缩小的花粉为异形花粉。结果表明：北京和廊坊两地的T₃代转TF1299基因纯合株系的水稻灌浆期穗部仍直立，花药内花粉数量少，花粉数仅为野生型花粉数的45.92％；且异形比例高，异形花粉率达到25.78％(异形花粉率(％)＝碘化钾染色阴性花粉粒数/碘化钾染色总粒数×100％)(见表1和图1、3)，比野生型花粉异形率高3倍多；结实率极低，仅为3.22％(结实率(％)＝实粒数/总粒数×100％)(见表2)；而T₃代纯合对照组株系水稻和野生型日本晴水稻灌浆后穗部下垂，花药形态正常，结实率高达96.46％(见图1和表2)。

表1、碘化钾染色转基因水稻株系与对照水稻株系异形花粉率

表2、转基因水稻株系与对照水稻株系结实率的调查结果

总之，基因TF1299与植物花粉发育有关，能够引起植物花药败育，降低植物自交结实率。

Claims

1.蛋白质，为如下A1)或A2)或A3)：

A1)氨基酸序列如SEQIDNo.1所示的蛋白质；

2.与权利要求1所述蛋白质相关的生物材料，为下述B1)-B7)中至少一种；

B1)编码权利要求1所述的蛋白质的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)含有B1)所述核酸分子或B2)所述表达盒的重组载体；

3.根据权利要求2所述的生物材料，其特征在于：B1)所述核酸分子为如下1)-5)中任一所示的基因：

1)其编码序列是SEQIDNo.2的第89-853位所示的DNA分子或cDNA分子；

2)序列是SEQIDNo.2所示的DNA分子或cDNA分子；

4.权利要求1所述的蛋白质或权利要求2或3的B1)-B4)任一所述的生物材料在调控植物育性中的应用。

5.权利要求4所述的应用，其特征在于：所述调控植物育性为降低植物育性。

6.权利要求1所述的蛋白质或权利要求2或3的B1)-B4)任一所述的生物材料在调控植物自交结实率中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述调控植物自交结实率为降低植物的自交结实率。

8.权利要求1所述的蛋白质或权利要求2或3的B1)-B4)任一所述的生物材料在调控植物花药或花粉发育中的应用。

9.权利要求1所述的蛋白质或权利要求2或3的B1)-B4)任一所述的生物材料在培育雄性不育的植物中的应用。

10.一种培育雄性不育植物的方法，包括向受体植物中导入权利要求2或3的B1)-B4)任一所述生物材料得到雄性不育的植物；所述受体植物为雄性可育植物。