CN105542006A - 抗epor融合蛋白抗体的制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗EPOR融合蛋白抗体的制备方法和用途，涉及基因工程领域。本发明提供的抗EPOR融合蛋白抗体可以抑制或阻断EPO-EPOR通路，从而抑制肿瘤细胞的增殖和转移，将本发明提供的抗EPOR融合蛋白多克隆抗体用于制备肿瘤防治或治疗的药物中。

Description

抗EPOR融合蛋白抗体的制备方法和用途

技术领域

本发明涉及基因工程领域，尤其涉及抗EPOR融合蛋白抗体的制备方法和用途。

背景技术

促红细胞生成素(erythropoietin，EPO)是一种糖蛋白激素，属于细胞因子超家族成员们作为一种造血生长因子，他与促红细胞生成素受体(erythropoietinreceptor，EPOR)结合，在红细胞的生产中发挥重要的作用。

促红细胞生成素(erythropoietin，EPO)的生物学效应是通过其特殊的细胞表面受体-促红细胞生成素受体(erythropoietinreceptor，EPOR)来调节的。促红细胞生成素受体(erythropoietinreceptor，EPOR)是一种含有508个氨基酸残疾的额狂魔蛋白，分子量为66kDa，由胞外配体结合域、跨膜域及胞内域三个部分组成，近年研究表明EPO及其受体同样存在于许多非红系的肿瘤细胞系中，EPO及EPOR的表达在多种人类肿瘤中被发现，包括乳腺癌、肾细胞癌、前列腺癌、结肠癌、头颈部鳞状上皮细胞癌等等。

发明内容

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的问题，提供一种促红细胞生成素受体抗体，可以抑制促红细胞生成素-促红细胞生成素受体通路活性的影响，从而阻断促红细胞生成素-促红细胞生成素受体表达的肿瘤。

为实现本发明的目的，本发明第一方面提供一种抗EPOR融合蛋白的抗体，其可抑制或阻断EPO-EPOR通路，是由具有如SEQIDNO.3所示的氨基酸序列的融合蛋白免疫动物获得。

其中，所述融合蛋白是由组氨酸信号肽及位于人体EPOR蛋白的第25位到254位氨基酸残基组成。

特别是，所述EPOR融合蛋白通过真核表达获得。

尤其是，所述EPOR融合蛋白是通过转染到人体肾上皮细胞表达得到。

优选地，所述人体肾上皮细胞为HEK-293细胞。

为实现本发明的目的，本发明第二方面提供一种抗EPOR融合蛋白的基因，其编码第一方面所述的融合蛋白，包括如SEQIDNO.3所示的氨基酸序列。

为实现本发明的目的，本发明第三方面提供一种重组载体，在其进行有效连接过程中，具有第二方面所述的基因。

其中，所述重组载体是利用真核表达载体pcDNA3.1(+)-myc-His-Cmammalianexpressionvector得到。

为实现本发明的目的，本发明第四方面提供一种宿主细胞，其含有第三方面所述的重组载体。

为实现本发明的目的，本发明第五方面提供一种化合物，包括第一方面所述的抗EPOR融合蛋白的抗体，应用于抑制或阻断EPO-EPOR通路药物的制备。

为实现本发明的目的，本发明第六方面提供一种将第一方面所述的抗EPOR的抗体作为制备治疗肿瘤药物的应用。

为实现本发明的目的，本发明第七方面提供一种制备抗EPOR融合蛋白的抗体，由以下步骤制备获得：

将信号肽及EPOR外段肽通过PCR的方法依次连接到真核表达载体中并转染至宿主细胞进行表达，获得EPOR融合蛋白；

纯化所述EPOR融合蛋白，并进行质谱鉴定；

将鉴定正确的EPOR融合蛋白免疫动物，获得具有抗EPOR融合蛋白的抗血清；

纯化所述抗血清，得到抗EPOR融合蛋白的抗体。

其中，所述真核表达载体为pcDNA3.1(+)-myc-His-Cmammalianexpressionvector。

其中，所述宿主细胞为人体肾上皮细胞HEK293细胞。

本发明的有益效果体现在：

1、本发明提供的抗EPOR融合蛋白的抗体可以有效抑制EPO-EPOR通路，从而阻断EPO-EPOR通路活性引起的肿瘤表达，在依赖EPO生长的UT-7细胞及经典的肾肿瘤细胞系中可以明显看出本申请提供的多克隆抗体不同程度的抑制的细胞的发生，因此本申请提供的多克隆抗体及具有表达所述多克隆抗体的基因可以用于制备治疗肿瘤药物的应用。

2、本发明利用人体肾上皮细胞作为宿主细胞，制备得到的抗EPOR融合蛋白的多克隆抗体纯度高，与抗原的结合能力强，效价高，稀释倍数达到256000时，依然可以检测得到有效抗体。

附图说明

当结合附图考虑时，通过参照下面的详细描述，能够更完整、更好地理解本发明以及容易得知其中许多伴随的优点。此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定，如图，其中：

图1是实施例3所述的纯化后的重组EPOR融合蛋白的质谱测序鉴定结果图，图中表示蛋白大小为35-36kDa；

图2是实施例4中所述的血清效价检测结果的显色图，图A表示三免后抗血清效价检测显色图；图B表示四免后抗血清效价检测显色图；图C表示终放血后抗血清效价检测显色图；图D是终放后抗血清纯化抗体效价检测显色图，图中Ⅰ、Ⅱ表示两次重复；

图3是实施例5所述的抗EPOR融合蛋白抗体的鉴定结果图；

图4是实施例6所述的抗EPOR融合蛋白抗体抑制EPO-EPOR通路活性的结果图；其中图E是抗EPOR融合蛋白抗体对不同细胞系的通路活性抑制效果图、图F是不同作用时间下通路活性抑制效果图、图G是不同抗体浓度下通路活性抑制效果图；

图5是实施例7所述的抗EPOR抗体对肿瘤细胞生长的影响的结果图；其中，图H是抗EPOR抗体对UT-7细胞增殖的影响结果图、图I是抗EPOR抗体对caki-1肾癌细胞增长的影响结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1：重组EPOR表达质粒的构建

1、表达信号肽Osteonectin及组氨酸6-His标签准备

采用正常人基因组DNA为模板，通过常规PCR扩增表达信号肽Osteonectin序列，其中，所用上游引物带有HindIII酶切位点，碱基序列为agctAagcttgcctgccgcctgcctgcct，如SEQIDNO.4所示，下游引物带有BamHI酶切位点及6个His(组氨酸)序列，碱基序列为agctggatccgtgatggtgatggtgatgcagctgaggggctgccaagg，如SEQIDNO.5所示。

其中，所述表达信号肽的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。

根据HUMANEPOR的氨基酸序列扩增EPOR基因片段，并经过1％浓度的琼脂糖凝胶电泳后回收，得到扩增后的EPOR基因片段。将EPOR基因片段和真核表达载体pcDNA3.1(+)-myc-His-Cmammalianexpressionvector采用HindIII与BamHI内切酶酶切后连接，得到重组质粒pcDNA3.1(+)-myc-His-Cmammalianexpressionvector-Osteonectin-6His，并将重组质粒转化大肠杆菌DH5α，获得重组菌DH5α/Osteonectin-6His。经PCR筛选阳性克隆并进行DNA测序，验证后，得到构建正确的重组质粒DH5α/Osteonectin-6His。

2、表达人EPOR外段肽重组质粒制备

采用正常人基因组DNA为模板，通过常规PCR扩增人EPOR外段肽序列，所用上游引物带有BamHI酶切位点，序列为agctggatccgcgcccccgcctaacctc，如SEQIDNO.6所示。下游引物带有EcoRI酶切位点，序列为agctgaattctcacgtcaggatgagggg，如SEQIDNO.7所示，得到人EPOR外段肽序列。

将扩增得到的人EPOR外段肽序列经过1％浓度的琼脂糖凝胶电泳后进行回收，得到表达人EPOR外段肽的基因片段。将获得的基因片段和重组质粒pcDNA3.1(+)-myc-His-Cmammalianexpressionvector-Osteonectin-6His，采用BamHI与EcoRI内切酶酶切后连接，得到重组质粒pcDNA3.1(+)-myc-His-Cmammalianexpressionvector-Osteonectin-6His-EPOR，将其转化大肠杆菌DH5α，获得重组菌DH5α/Osteonectin-6His-EPOR，经PCR筛选阳性克隆并进行DNA测序，验证得到构建正确的重组质粒DH5α/Osteonectin-6His-EPOR。

将阳性DH5α/Osteonectin-6His-EPOR接种至1LLB/Amp由1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl配制的液体培养基，于37℃、180rpm条件下振荡培养过夜。第二天使用去内毒素质粒大提试剂盒提取质粒，得到重组EPOR表达质粒。

实施例2：重组EPOR融合蛋白的表达

1、HEK293细胞的准备

将生长状态良好的、汇合度95％以上的HEK-293细胞以1*10^5个的接种量接种于6孔板中，用含10％胎牛血清的DMEM培养基培养，反复颠倒混匀后置于37℃、5％CO2培养箱内培养24小时，得到可用于瞬时转染的，细胞贴壁完全、密度达到80％的HEK293细胞。

其中，HEK293细胞来自于ATCC-美国标准生物品收藏中心。

2、HEK-293细胞的瞬时转染与表达

将实施例1得到的重组EPOR表达质粒转染到培养有HEK293细胞的6孔板中，充分混匀后缓慢加入细胞工厂内。将细胞工厂置于37℃、5％CO₂培养箱内培养。4小时后，加入266mlCellBoost5，混匀后继续培养3-4天，之后，7000rpm条件下离心20min分钟收集上清液用于目的蛋白的纯化。

实施例3：重组EPOR融合蛋白的纯化与鉴定

将收获的细胞培养上清液3000rpm离心20min去除沉淀。用等量的BindingBuffer稀释，采用Beaver公司提供的组氨酸标签蛋白纯化试剂盒进行目的蛋白的纯化，得到纯化后的重组EPOR融合蛋白，如图1所示。

由图1可以看出，纯化后的重组EPOR融合蛋白分子量为35-36KDa左右。

将得到的重组EPOR融合蛋白采用生工生物工程(上海)股份有限公司提供的Maldi-TOF-TOF进行质谱测序，验证后重组EPOR融合蛋白与正常人体表达EPOR外段肽序列一致。

实施例4：抗EPOR融合蛋白抗体的获得与纯化

1、免疫处理

称取实施例3得到的EPOR蛋白3mg，对4月龄，2.1kg的健康雌性新西兰大白兔进行免疫，初免剂量为0.3mg/只，二免、三免、四免剂量为0.15mg/只。初免抗原为蛋白抗原与等体积弗氏完全佐剂混匀乳化，二免、三免、四免抗原为蛋白抗原与等体积弗氏不完全佐剂混匀乳化，处理设置为2个重复，记为A兔和B兔，其中，免疫过程为：

一免：第1天，免疫用抗原为弗氏完全佐剂+蛋白抗原；

二免：第21天，免疫用抗原为弗氏不完全佐剂+蛋白抗原；

三免：第35天，免疫用抗原为弗氏不完全佐剂+蛋白抗原；

三免后采血：第42天，耳静脉采血1ml，ELISA检测抗血清效价；

四免：第49天，免疫用抗原为弗氏不完全佐剂+蛋白抗原；

四免后采血：第56天，耳静脉采血1ml，ELISA检测抗血清效价；

终放血：第57天，ELISA检测抗血清效价达到要求，颈动脉采全血。

弗氏完全佐剂与弗氏不完全佐剂均购自Sigma，。

2、血清效价检测

2.1.间接ELISA检测

将三免、四免、终放血及终放血纯化后的抗血清利用ELISA方法检测血清效价，具体方法为：

将抗原用0.05mol/l碳酸盐(PH＝9.6)按0.2ug/孔包板，100ul/孔，4℃孵育过夜，取出后用0.05％Tween-20(PBST)洗涤三次，3分钟/次，然后向每孔加入5％脱脂奶粉100ul封闭液，37℃封闭60分钟，再次取出用0.05％Tween-20(PBST)洗涤三次，3分钟/次。将兔子的血清分别按照1:1000稀释，然后倍比稀释，37℃孵育1小时，取出用0.05％Tween-20(PBST)洗涤三次，3分钟/次。用辣根酶标记山羊抗兔IgG(H+L)，1:8000稀释，37℃孵育45min。取出用0.05％Tween-20(PBST)洗涤五次，3分钟/次。加入底物溶液(TMB)100ul/孔，反应15min，最后加入100ul2mol/L硫酸终止反应。用酶标仪(科华ST-360)在450nm波长下测定OD值。

2.2检测结果与分析

测得三免后抗血清效价检测结果见图2A和表1，测得四免后抗血清效价检测结果见图2B和表2，测得终放血后抗血清效价检测结果见图2C和表3，测得终放后抗血清纯化抗体效价检测结果见图2D和表4。

表1

注：根据检验标准，血清效价值≥2.0×阴性值则表示有意义的稀释倍数；

K表示1000倍数。

根据检测结果所示的图2A可以看出，显色部分的抗体与抗原可以良好的结合，并且结合表1可知，当稀释倍数达到128K时，A兔与B兔依然可以检测到有效抗体。

表2

注：根据检验标准，血清效价值≥2.0×阴性值则表示有意义的稀释倍数；

K表示1000倍数。

根据检测结果所示的图2B可以看出，显色部分的抗体与抗原可以良好的结合，并且结合表2可知，当稀释倍数达到256K时，A兔与B兔依然可以检测到有效抗体。

表3

注：根据检验标准，血清效价值≥2.0×阴性值则表示有意义的稀释倍数；

K表示1000倍数。

根据检测结果所示的图2C可以看出，显色部分的抗体与抗原可以良好的结合，并且结合表3可知，当稀释倍数达到512K时，A兔与B兔依然可以检测到有效抗体。

表4

注：根据检验标准，血清效价值≥2.0×阴性值则表示有意义的稀释倍数；

K表示1000倍数。

根据检测结果所示的图2D可以看出，显色部分的抗体与抗原可以良好的结合，并且结合表4可知，当稀释倍数达到512K时，A兔与B兔依然可以检测到有效抗体。

3、免疫亲和纯化

将血清(含总抗体)结合到蛋白A微珠上。将抗体和蛋白A珠混合制成稀薄的匀浆，在总量为10ml的溶液中加入大约lml微珠，室温孵育1h，轻轻摇动混匀，用10倍体积的0.2mol/L硼酸钠(pH9.0)洗涤微珠2次，每次以3000g离心2rain或10000g离心30s，用10倍体积的0.2mol/L硼酸钠(pH9.0)重悬微珠，加入足量的二甲基庚二酸酯(固体)至微珠匀浆中，使终浓度为20mmol/L，室温孵育30min，并轻轻混匀，用0.2mo/L乙醇胺(pH8.0)洗涤微珠1次以终止反应。然后重悬于0.2mol/L乙醇胺，室温孵育2h，轻轻混匀。微珠用PBS洗涤后，重悬于PBS，加入硫柳汞保存，将偶联前和偶联后的微珠样品加入Laemmli样品缓冲液中煮沸后，检查偶联效果，分别取相当于1ul和9ul2份样品在10％SDS—聚丙烯酰胺凝胶中电泳，并用考马斯亮蓝染色，偶联效果良好时，在偶联前的微珠样品中显示一条55kDa的重链带，而偶联后的样品无此区带，将抗体包被的微珠转入层析柱中，用PBS冲洗容器，收集残留的微珠。如果可能，仅使用结合制品中全部抗原所需的抗体微珠基质，用20倍柱床体积与制备抗原相同的缓冲液洗柱，将EPOR抗原液加到柱上，按每毫升柱体积大约lml/h的速度使抗原溶液流过层析柱，用20倍柱床体积的结合缓冲液(PBS)洗柱，用20倍柱床体积的预洗脱缓冲液洗柱。使用预洗脱缓冲液，采用分段洗脱法，连续以0.5倍柱床体积的洗脱缓冲液通过层析柱，分管收集每一组分，检测每管的抗原含量，将浓度高的各管合并。对获得的蛋白洗脱液透析以改变缓冲液，最终获得浓度为2.0mg/ml的抗体，约5ml。

实施例5：抗EPOR融合蛋白抗体的鉴定

设置阴性PBS对照和兔IgG对照及阳性EpoR检测抗体(购自santacruzsc-5624)对照，采用常规的westernblot方法利用EPOR抗体和EPOR蛋白的结合性对抗EPOR融合蛋白抗体进行鉴定，鉴定结果如图3所示，由图中可以明显看出本申请制备的抗体与EPOR蛋白具有良好的结合性。

实施例6：抗EPOR融合蛋白抗体抑制EPO-EPOR通路活性

1、抗EPOR融合蛋白抗体对EPO-EPOR通路活性的影响

将依赖EPO生长的UT-7细胞、肾肿瘤细胞786-0、caki-1铺6孔板，当细胞长至汇合度80％后换无血清培养基饥饿过夜，在每组细胞每孔分别加入PBS20uL、兔IgG对照100ug、EPOR抗体100ug，培养2小时，再向每孔加入牛血清FBS10uL,培养30分钟，最后提取各个细胞的总蛋白，采用western检测各组EPO-EPOR通路活性，检测结果如图4E所示。

由图4E可以明显看出，应用抗EPOR抗体后，UT-7、786-0、caki-1细胞系中EPO-EPOR通路活性均有不同程度下降。

2、不同作用时间下抗EPOR融合蛋白抗体对EPO-EPOR通路活性的影响

将依赖EPO生长的UT-7细胞铺6孔板，当细胞长至汇合度80％后换无血清培养基饥饿过夜，每孔加入牛血清FBS10ul，培养30min，再向每组细胞每孔分别在第0min,120min,180min,210min,220min,225min,230,235,240min加入EPOR抗体250ug/mL(最终对应反应时间0、5、10、20、30、60、120、240min)，最后提取各个细胞的总蛋白，采用western检测各组EPO-EPOR通路活性，检测结果如图4F所示。

抗体作用30min后就可稳定抑制EPOR通路效果。

由图4F可以明显看出，抗体作用30min后可有稳定抑制EPOR通路效果。

3、不同药物浓度下抗EPOR融合蛋白抗体对EPO-EPOR通路活性的影响

将依赖EPO生长的UT-7细胞铺6孔板，当细胞长至10^5个/mL后换无血清培养基饥饿过夜，再向每组细胞每孔分别加入EPOR抗体500ug/mL,250ug/mL,125ug/mL,兔IgG对照(生工公司)500ug/mL,250ug/mL,125ug/mL,培养2小时，再向每孔加入牛血清FBS10uL,培养30分钟，最后提取各个细胞的总蛋白，采用western检测各组EPO-EPOR通路活性，检测结果如图4G所示。

由图中可以明显看出，EPOR抗体抑制EPO-EPOR通路活性与浓度呈正相关。

实施例7：抗EPOR抗体对肿瘤细胞生长的影响

将抗EPOR抗体、兔IgG及PBS溶液分别加入到人原巨核细胞型白血病细胞UT-7细胞及肾癌细胞caki-1，观察比较其对细胞增长的影响，具体操作步骤如下所示：

1.细胞培养

将UT-7及caki-1细胞铺6孔板(每个细胞系3板，每板5孔，每孔5*10^4个细胞)，在无血清培养基饥饿过夜，使细胞周期同步化，次日更换5％FBS培养基培养，并按下列条件加入不同药物培养细胞(每24h加药一次)：

板1(UT-7cell)：每孔加入抗EPOR抗体250ug/mL

板2(UT-7cell)：每孔加入兔IgG对照250ug/mL

板3(UT-7cell)：每孔加入PBS对照20uL

板1(caki-1cell)：每孔加入抗EPOR抗体250ug/mL

板2(caki-1cell)：每孔加入兔IgG对照250ug/mL

板3(caki-1cell)：每孔加入PBS对照20uL。

2、结果观察

分别在24h、48h、72h、96h、120h后进行细胞计数(UT-7细胞为悬浮细胞，离心收集重悬后接计数板计数；caki-1为贴壁细胞，消化后收集细胞重悬计数)，重复3次，取增殖率平均数绘制细胞增殖生长曲线。得到如图5所示的UT-7细胞增殖率及caki-1细胞的增殖率。

由图5H可以看出，向人原巨核细胞型白血病细胞加入抗EPOR抗体的细胞增殖率显著低于加入兔IgG及加入PBS的细胞增殖率。由图5I可以看出，向肾癌细胞中加入抗EPOR抗体的细胞增殖率显著低于加入兔IgG及加入PBS的细胞增殖率。说明本申请制得的抗EPOR融合蛋白可以显著抑制或阻断EPO-EPOR通路，从而抑制肿瘤细胞的增殖和转移。

尽管上述对本发明做了详细说明，但不限于此，本技术领域的技术人员可以根据本发明的原理进行修改，因此，凡按照本发明的原理进行的各种修改都应当理解为落入本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种抗EPOR融合蛋白抗体，其特征在于，用于抑制或阻断EPO-EPOR通路，是由具有如SEQIDNO.3所示的氨基酸序列的融合蛋白免疫动物获得。

2.一种如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述EPOR融合蛋白通过真核表达获得。

3.一种表达EPOR融合蛋白的基因，其特征在于，包括如SEQIDNO.3所示的氨基酸序列，用于编码所述融合蛋白。

4.一种重组载体，其特征在于，在其进行有效连接过程中，具有如权利要求3所述的基因。

5.一种宿主细胞，其特征在于，含有权利要求5所述的重组载体。

6.一种化合物，包括权利要求1所述的抗EPOR融合蛋白的抗体，用于抑制或阻断EPO-EPOR通路药物的制备。

7.一种如权利要求1所述的抗体作为制备治疗肿瘤药物的应用。

8.一种制备如权利要求1所述抗体的方法，其特征在于，包括：

将信号肽及EPOR外段肽通过PCR的方法依次连接到真核表达载体中并转染至宿主细胞进行表达，获得EPOR融合蛋白；

纯化所述EPOR融合蛋白，并进行质谱鉴定；

将鉴定正确的EPOR融合蛋白免疫动物，获得具有抗EPOR融合蛋白的抗血清；

纯化所述抗血清，得到抗EPOR融合蛋白抗体。

9.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞为人体肾上皮细胞HEK-293细胞。