CN105542005A - 一种抗人淀粉样β肽的纳米抗体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种新的抗人淀粉样β肽(Aβ)的纳米抗体及其应用。本发明利用噬菌体展示技术对羊驼噬菌体抗体库进行多轮筛选富集具有Aβ特异性的噬菌体，通过对噬菌体培养制备抗体，并且鉴定获得阳性克隆，通过测序获得其相应的编码序列，然后在大肠杆菌中表达获得可溶性的抗体片段。本发明的抗体具有如SEQ？ID？NO.8所示的氨基酸序列。本发明提供的抗体对Aβ具有特异的结合能力，可应用于以Aβ为靶标的疾病的治疗和诊断药物或试剂的制备。

Description

一种抗人淀粉样β肽的纳米抗体及其应用

技术领域

本发明属于生物化学与分子生物学领域，涉及一种抗人淀粉样β肽(amyloidβ,Aβ)的纳米抗体及其应用。

背景技术

阿尔茨海默病(Alzheimer’sdisease,AD)是进行性认知功能障碍和行为损害为特征的中枢神经系统变性疾病。2015年9月Alzheimer’sdiseaseinternational,(ADI)的报告数据显示：目前约每3.2秒就有一人罹患老年痴呆，在老年痴呆患者中60-70％为阿尔茨海默病性痴呆，随着老龄人口基数和比例的持续增加，AD带来患者个人的痛苦和社会、家庭的压力将越来越严重。

淀粉样β肽(amyloidβ,Aβ)是存在于人脑的天然产物，其在神经细胞发育(HeoC,etal.JNeurochem.2007；102(2):493-500.)、睡眠调节(KangJE,etal.2009；326(5955):1005-7)、抗菌(SosciaSJ,etal.PLoSOne2010；5:e9505.)等方面发挥积极的调节作用。但遗传学分析发现Aβ前体蛋白(amyloidprecursorprotein,APP)(GoateA,etal.Nature.1991；349(6311):704-6；JonssonT,etal.Nature.2012；488(7409):96-9)或与其代谢相关的基因如早老素发生突变与家族性AD的是否发生相关(KaminoK,etal.NeurosciLett.1996；208(3):195-8；SherringtonR,etal.Nature.1995；375(6534):754-60.)，因此人们认为Aβ肯定与AD的发生相关。在AD发生过程中自由Aβ经历先增加后减少的过程(MaiaLF,etal.EMBOMolMed.2015；7(7):895-903.)，可能正是由于Aβ的代谢失衡，Aβ在某种未知条件的诱导下逐渐聚集形成可溶的Aβ聚集体以及不溶的Aβ纤维沉积。

动物模型研究和临床实验均发现普通抗体都可以在一定程度上干扰Aβ的代谢，但在缓解AD病情发展方面没有获得理想的结果。仔细分析治疗过程发现，其治疗机理主要是通过药物与血液内Aβ的结合打破血液与脑脊液Aβ的平衡，促使脑脊液内Aβ跨越血脑屏障进入血液；或者是通过抗体跨越血脑屏障起到直接治疗效果，但实际所用药物主要是IgG类抗体，血液内极低的Aβ水平和抗体难于跨越血脑屏障的缺陷，大大限制了其治疗效果(BardF,etal.ExpNeurol.2012；238(1):38-43.)。

为了提高抗体跨越血脑屏障的能力，目前通常对抗体进行包埋修饰或将靶标抗体与具有跨血脑屏障能力的蛋白(脑血管内皮细胞相关抗原抗体或具有特殊转胞吞作用的蛋白)构建成嵌合体。无论哪一种策略，都进一步增加了抗体的制备成本。而分子量较小(12-15kD)等电点较高(pI>9.2)的来自驼科动物重链抗体可变区的纳米抗体在不进行任何修饰的条件下可以非常高效的跨越血脑屏障(LiT,etal.FASEBJ.2012；26(10):3969-79.)，因此纳米抗体在脑疾病治疗中具有很好的应用前景；另外，获得的纳米抗体和普通抗体一样可以用于以Aβ为靶标的诊断、检测与治疗。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种抗淀粉样β肽的纳米抗体。

一种抗淀粉样β肽的纳米抗体，所述纳米抗体氨基酸序列包括框架区FR和互补决定区CDR，其特征在于，所述的框架区FR由下组的FR的氨基酸序列组成：如SEQIDNO.1所示的FR1，如SEQIDNO.2所示的FR2，如SEQIDNO.3所示的FR3，如SEQIDNO.4所示的FR4；所述的互补决定区CDR由下组的CDR的氨基酸序列组成：如SEQIDNO.5所示的CDR1，如SEQIDNO.6所示的CDR2，如SEQIDNO.7所示的CDR3。

进一步地，所述的抗淀粉样β肽的纳米抗体，其具有SEQIDNO.8所示的氨基酸序列。

本发明目的之二是提供一种上述所述的纳米抗体在制备治疗淀粉样β肽代谢失衡引起的疾病的药物中的应用。优选地，所述的淀粉样β肽代谢失衡引起的疾病为阿尔茨海默病。

本发明目的之三是提供一种上述所述的纳米抗体在制备检测淀粉样β肽的检测试剂中的应用。

本发明还提供一种DNA分子，其编码本发明所述的抗淀粉样β肽的纳米抗体。

本发明的有益效果：

本发明提供了一种特异性的抗Aβ的纳米抗体，该纳米抗体对Aβ具有与已发表抗体不同的氨基酸序列，可以将其对应的基因转入到原核的或真核表达体系中进行表达，获得的抗体可以应用在各种以Aβ为靶标的疾病的治疗药物的制备以及Aβ的检测试剂的制备中。

附图说明

图1为本发明纳米抗体的框架区、互补决定区的位置以及氨基酸序列示意图。

图2为SDS-PAGE电泳检测纳米抗体在IPTG诱导条件下的表达情况。M为蛋白质分子量标准；泳道3为未加IPTG诱导的全菌蛋白；泳道1与2为IPTG诱导后的全菌蛋白。

图3为SDS-PAGE电泳检测金属螯合层析分离纯化纳米抗体情况。M为蛋白质分子量标准，泳道1为流穿液；泳道2-4为50mM咪唑洗脱；泳道5-11为150mM咪唑洗脱；泳道12-13为500mM咪唑洗脱。

图4为ELISA检测纳米抗体对不同序列(Aβ_12-35、Aβ₄₀、Aβ₄₂)与状态(单体、可溶聚集体和纤维)Aβ的结合能力。对照组与实验组的区别是前者包被抗原未加入纳米抗体，后者加入了纳米抗体。

图5为MTT检测纳米抗体对Aβ处理细胞SH-SY5Y的保护情况。

具体实施方式

下述非限制性实施例可以使本领域技术人员更全面理解本发明，本申请公开的DNA序列和氨基酸序列可以按照本领域常用的其他方法获得。而且可以将本申请获得的新的氨基酸序列对应的基因构建到任何合适的载体，用任何合适的表达体系进行表达。下述内容仅仅是对本申请要求保护的范围的示例性说明，一些根据所公开的内容做出的改变和修饰，也应当属于本申请要求保护的范围。本文实施例中所使用的药品及试剂若无特殊说明均按常规途径获得。

不同序列的Aβ(Aβ_12-35、Aβ₄₀、Aβ₄₂)的单体、可溶聚集体和纤维购自杭州中肽生化有限公司。

实施例1纳米抗体库的建立

本发明使用的噬菌体展示库是以T7噬菌体为载体的非免疫库，建立步骤如下：

(1)提取2岁雄性羊驼外周血淋巴细胞的总RNA(PuerLinkTMRNAMiniKit，LifeTechnologies：12183018A)；以UPprimer1为引物将提取的总RNA反转录为cDNA，并采用两轮巢式PCR扩增VHH基因；其中第一轮PCR为以转录的cDNA为模版，以UPprimer1和DOWNprimer1为引物，PCR扩增后回收大小为650～750bp的条带，再以此为模版，进行第二轮PCR扩增，上游和下游引物分别为UPprimer2和DOWNprimer2，回收得到450～500bp的PCR产物；

UPprimer1:5’-GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC-3’

DOWNprimer1:5’-CTTGGTGGTCCTGGCTGCTCT-3’

UPprimer2:5’-AAGCTTTTGTGGTTTTGGTGTCTTGGGTTC-3’

DOWNprimer2：5’-AAGCTTGGGGTCTTCGCTGTGGTGCG-3’

(2)用EcoRI和HindIII酶切上述PCR产物，即为VHH基因片段；

(3)用T4连接酶连接T7载体(10-3CloningKit,MerckMillipore70550-3)和VHH基因片段，将连接产物进行包装，然后进行扩增(方法见实施例2)，得噬菌体原始文库。

实施例2T7噬菌体的液体扩增

(1)活化宿主菌：在50mlLB培养基(含0.1mg/mL羧苄青霉素，简称Carb-LB)中接种大肠杆菌BLT5403，37℃170r/min过夜培养，得一代宿主菌；

(2)在Carb-LB液体培养基中接种1％的一代宿主菌，摇床培养，到OD₆₀₀为0.5-1.0，得二代宿主菌；

(3)用T7噬菌体感染二代宿主菌，37℃200r/min培养2-3h，观察溶菌情况，溶菌完全立即停止培养。将溶菌产物在8000g离心10min，并回收上清，上清即为扩增的噬菌体。测定滴度。

实施例3T7噬菌体滴度的测定

(1)在培养皿中倒入Carb-LB底层培养基，冷却、凝固；

(2)溶解顶层培养基，冷却，加入Carb后45℃保温；

(3)用无菌LB液体培养基梯度稀释扩增的噬菌体；

(4)300μL二代宿主菌与50μL不同梯度稀释的噬菌体混匀，加入4mL预热Carb-顶层培养基，迅速倒入有底层培养基的平皿中，晃动平皿使之分布均匀；

(5)37℃倒置培养3-4h，直到看到大小适中的噬菌斑；

(6)挑选噬菌斑数量为50-500间的平板进行噬菌斑计数，计算噬菌体滴度。

实施例4纳米抗体的筛选

(1)将Aβ用TBS稀释成10μg/mL，调pH至7.0，100μL/孔进行酶标板包被；

(2)室温摇床反应2h后用TBS洗板3次；

(3)用1％无蛋白封闭液(购自生工生物工程有限公司)进行封闭，室温摇床1.5h后用TBST洗板6次；

(4)加入扩增的噬菌体，100μL/孔，室温摇床孵育30min后用TBST洗板10次，充分去除未结合的噬菌体；

(5)加入T7洗脱缓冲液(1％SDS)洗脱噬菌体，室温摇床30min，并将洗脱液扩增，得下一轮筛选用噬菌体，进入下一轮筛选；

(6)经过四轮筛选之后，特异性的噬菌体得到富集。

实施例5单克隆噬菌体的序列分析

经第四轮筛选后，按照实施例3的方法得到单克隆噬菌斑。PCR法扩增后进行序列分析，方法如下：

(1)PCR扩增

①用灭菌牙签挑取噬菌斑，同一噬菌斑一部分放入EDTA溶胶缓冲液中用于PCR，另一部分进行扩增，用于后续ELISA；

②放入EDTA溶胶缓冲液中的部分65℃处理10min；

③冷却至室温，14000g离心5min，取上清98℃热击处理5min；

④取2μL作为模板进行PCR扩增；

反应条件为：94℃预变性5min后，98℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸60s，30个循环，最后72℃延伸7min；

(2)将PCR产物送交华大基因测序；

(3)将得到的核酸序列转化为氨基酸序列并进行比对，其氨基酸序列为SEQIDNO.8，由4个框架区(FR)、3个互补决定区(CDR)组成。所述纳米抗体的氨基酸序列以及其组成序列如下。

氨基酸序列如SEQIDNO.8所示，其中4个框架区FR1、FR2、FR3和FR4的氨基酸序列依次分别为SEQIDNO.1～4所示；3个互补决定区CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列依次分别为SEQIDNO.5～7所示；所述框架区、互补决定区在SEQIDNO.8中位置关系如图1所示。

实施例6Aβ纳米抗体的表达与分离纯化

(1)纳米抗体的表达：

①将纳米抗体的基因序列(如SEQIDNO.9)插入表达载体pET23a，并转化入大肠杆菌BL21(DE3)细胞；

②用LB培养基，在温度37℃的条件下培养，待菌体OD₆₀₀达到1-1.5时，加入终浓度为1mmol的IPTG进行诱导；

③继续培养3-4小时后弃上清，收集全菌；

④用裂解缓冲液重悬菌体后超声裂解细胞，在10000rpm离心5min，收集上清液以及沉淀。以15％SDS-PAGE电泳检测纳米抗体的表达情况，结果如图2所示。

图2中M为蛋白质分子量标准；泳道3为未加IPTG诱导的全菌蛋白；泳道1与2为IPTG诱导后的全菌蛋白，在16.5kDa处有明显的本发明纳米抗体的蛋白表达斑点。比较泳道3与泳道1或2发现，加入IPTG后纳米抗体表达量增加。

(2)纳米抗体的纯化：采用Ni-NTA亲和层析柱纯化融合蛋白：

①层析柱用上样缓冲液(15mmolPBS，50mmol咪唑，500mmolNaCl)清洗后，加入上述(1)中收集的上清液；

②先用清洗缓冲液(15mmolPBS，150mmol咪唑，500mmolNaCl)清洗去除杂蛋白，再用洗脱缓冲液(15mmolPBS，500mmol咪唑，500mmolNaCl)洗脱并收集洗脱液；

③纯化后纳米抗体以15％SDS-PAGE电泳检测融合蛋白的纯化情况，结果如图3所示。

图3中SDS-PAGE电泳检测金属螯合层析分离纯化纳米抗体情况。M为蛋白质分子量标准，泳道1为流穿液；泳道2-4为50mM咪唑洗脱；泳道5-11为150mM咪唑洗脱；泳道12-13为500mM咪唑洗脱。图3的结果显示，纳米抗体经镍柱亲和层析处理后，获得条带较为单一的纳米抗体，其分子量约为16.5kDa。

实施例7ELISA检测纳米抗体的结合特异性

(1)将100μl不同序列和类型的Aβ(0.5mg/L)加入到ELISA板上，37℃温育1h后，于4℃冰箱中放置过夜；

(2)倒尽板孔中液体，加满PBST洗涤液(NaCl8g、KH₂PO₄0.2g、Na₂HPO₄·12H₂O2.9g、Tween-200.5ml，用蒸馏水定容至1000ml)，静置3-5min，反复3次，最后将板倒置在吸水纸上，使孔中洗涤液流尽；

(3)加封闭液(0.5％牛血清白蛋白，pH7.4的PBS)200μl，37℃放置1h后洗涤，洗涤同步骤(2)；

(4)每孔加入纳米抗体200μl，1小时后洗涤，洗涤同步骤(2)；

(5)将anti-6×HisTagantibody(0.5mg/ml)按1:1000稀释，每孔加100μl，37℃放置1h后洗涤，洗涤同步骤(2)；

(6)将羊抗兔IgG-HRP(0.5mg/ml)按1:1000稀释，每孔加200μl，37℃放置1h；

(7)加TMB工作液200μl，于室温下在暗处放置10-15min，加终止液，每孔50μl；

(8)用酶标仪记录450nm处的读数，结果如图4所示；

图4中纳米抗体对不同聚集状态的Aβ(单体、可溶聚集体和纤维)和不同序列的Aβ(Aβ_12-35、Aβ₄₀、Aβ₄₂)都有结合能力。

实施例8MTT检测抗体对Aβ处理细胞的保护作用

(1)人神经母瘤细胞SH-SY5Y以10⁶个/ml接种于25cm²细胞培养瓶，培养液为含有10％胎牛血清(NQBB,Australia)和1％双抗(ThermoFisherScientific,USA)的DMEM高糖培养基(Gibco,USA)，培养条件为37℃，5％二氧化碳；

(2)细胞达到80％汇合度后用0.25％胰蛋白酶消化并传代，取对数生长期的细胞以5000个/孔进行铺板，继续于细胞培养箱中培养24h以使细胞贴壁；

(3)细胞贴壁后每孔经过PBS洗1次，更换为100μLDMEM高糖培养基/N2添加物(Gibco,USA)，继续培养1h；

(4)每孔加入终浓度为15μM的Aβ聚集体或Aβ聚集体和不同浓度的纳米抗体(nanobody)，继续培养48h；

(5)将培养液吸出，用PBS洗一次，每孔加入90μLDMEM高糖培养基和10μL5mg/mlMTT(Amresco,USA)溶液，放置于细胞培养箱中继续培养4h；

(6)小心吸出每孔中的培养液，加入150μLDMSO，水平震荡使DMSO充分溶解蓝紫色甲臢结晶，测定570nm吸光度，参比波长为630nm。结果如图5所示。

图5中纳米抗体不仅可以逆转Aβ聚集体引起的细胞损伤，并且对SH-SY5Y没有细胞毒性，且还能一定程度上促进SH-SY5Y的增值，且上述效应具有剂量依赖性。

Claims (5)

1.一种抗淀粉样β肽的纳米抗体，所述纳米抗体氨基酸序列包括框架区FR和互补决定区CDR，其特征在于，所述的框架区FR由下组的FR的氨基酸序列组成：如SEQIDNO.1所示的FR1，如SEQIDNO.2所示的FR2，如SEQIDNO.3所示的FR3，如SEQIDNO.4所示的FR4；所述的互补决定区CDR由下组的CDR的氨基酸序列组成：如SEQIDNO.5所示的CDR1，如SEQIDNO.6所示的CDR2，如SEQIDNO.7所示的CDR3。

2.根据权利要求1所述的抗淀粉样β肽的纳米抗体，其特征在于，其具有SEQIDNO.8所示的氨基酸序列。

3.权利要求1或2所述的纳米抗体在制备治疗淀粉样β肽代谢失衡引起的疾病的药物中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的淀粉样β肽代谢失衡引起的疾病为阿尔茨海默病。

5.权利要求1或2所述的纳米抗体在制备检测淀粉样β肽的检测试剂中的应用。