CN105524839A - 一株高产耐高温真菌α-淀粉酶的里氏木霉 - Google Patents

Abstract

本发明公布了一株高产耐高温真菌α-淀粉酶的里氏木霉。本发明以里氏木霉为出发菌株，经紫外-氯化锂-硫酸二乙酯复合诱变，得到高耐高温真菌α-淀粉酶的里氏木霉突变菌株。所述里氏木霉901-18？Trichoderma？reesei？901-18于2013年11月24日保藏于中中国典型培养物保藏中心保藏号为CCTCC？NO:M？2013602。该菌株所产的耐高温真菌α-淀粉酶酶活力高达12000-15000u/ml，适用温度范围为50-75℃，pH4.5-7.0,特别适合反应温度高、液化工艺与糖化工艺并存的工业化需求。

Description

一株高产耐高温真菌α-淀粉酶的里氏木霉

技术领域：

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株高产耐高温真菌α-淀粉酶的里氏木霉。

背景技术：

α-淀粉酶全称为α-1，4-葡聚糖水解酶(EC3.2.1.1)，作用于淀粉时，可从分子内部切开α-1，4-糖苷键而生成糊精和还原糖，由于产物的末端葡萄糖残基C1碳原子为α-构型，故得名为α-淀粉酶。

常见的α-淀粉酶有三种：细菌α-淀粉酶、真菌α-淀粉酶和麦芽α-淀粉酶。细菌α-淀粉酶是由细菌如枯草杆菌、地衣芽孢杆菌等产生的，细菌α-淀粉酶的热稳定性较强。

真菌α-淀粉酶最早于1896年由日本的高峰让吉从米曲霉中提取，并作为消化剂使用。50年代以来，真菌α-淀粉酶的应用范围逐渐扩大，开始应用于淀粉制糖、酿造、面包、果蔬饮料、医药和饲料等领域。用于淀粉制糖可以生产出以麦芽三糖为主的新型糖浆；与葡萄糖苷转移酶合用，可以制备异麦芽低聚糖；在传统的饴糖、黄酒生产中使用此酶，可以简化生产工艺，提高原料利用率，节省粮食，降低生产成本；用于面包制作可以缩短发酵周期，制成的面包气孔分布均匀，体积大，保鲜期长，还可替代以往常用的面包添加剂溴酸钾；用于医药可作为消化剂，代替动物中提取的酶；用于果蔬饮料可以消除浑浊，提高收率；用于饲料可以提高饲料利用率。因此，真菌α-淀粉酶的应用具有广阔的市场前景。

但真菌α-淀粉酶的最适作用温度在55℃左右，当温度高于60℃便会逐渐失活，且热稳定相对较低，不适用于较高温度的反应过程，因此其应用与发展受到一定程度的限制。

发明内容：

为了解决上述技术问题，本发明提供了一株高产耐高温真菌α-淀粉酶的里氏木霉。

本发明提供的高产耐高温真菌α-淀粉酶的里氏木霉具体为里氏木霉901-18Trichodermareesei901-18。该菌株已于2013年11月24日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址为：中国.武汉.武汉大学)，保藏号CCTCCNO:M2013602。

所述菌株特点如下：

该菌株在PDA固体培养基上生长，形成的菌落特征为菌落呈棉絮状，菌落呈淡绿色，菌落扁平，高0.2-0.8mm，菌落边缘白色，整齐；生长速度快，48h菌落直径达1.5-8.5mm,72h达30-55mm；菌丝白色，有隔膜，菌丝壁光滑，直径在2-5μm。分生孢子梗从菌丝的短侧枝发生，侧枝上对生。

所述里氏木霉901-18Trichodermareesei901-18由一株分离自津市市河堤食用菌培植基地土壤样本的里氏木霉菌株经紫外线-氯化锂-硫酸二乙酯复合诱变筛选获得，具体筛选步骤如下：

(1)将出发菌株接种到马铃薯斜面培养基上，连续传代三次，活化菌种，加入无菌水振荡洗下成熟的孢子，搅拌分散孢子得孢子悬浮液，将搅拌好的孢子悬浮液置于紫外灯下，垂直距离30cm搅拌照射200s，上述紫外照射都必须在避光的条件下进行。

将经过照射的悬液经梯度稀释后涂布于氯化锂平板，并以未经紫外照射的菌液稀释涂平板做对照。将上述涂布均匀的平板，用黑色的布或报纸包好，置30℃培养48h，在长出的菌落中筛选出水解圈最大者挑至斜面保存，纯化后配制成菌悬液，经梯度稀释后与硫酸二乙酯原液充分混合，并于30℃震荡处理40min，将处理过的菌液经梯度稀释后涂布于氯化锂平板。

(2)高产菌种的初筛

将上述涂布均匀的平板，置30℃培养48h，筛出水解圈较大者挑至斜面保存，纯化后获得三株菌901-11，901-15,901-18。

(3)摇瓶发酵复筛

将获得的三株菌901-11，901-15,901-18在含有30mL马铃薯液体培养基的250mL摇瓶中进行摇瓶发酵，种子接种量10％(V/V)，30℃、150r/min培养72h，离心取发酵上清液制得粗酶液。

(4)酶活测定

酶活单位的定义：1mL粗酶液，于65℃、pH5.5条件下，1min液化1mg可溶性淀粉，即为1个酶活力单位，以U/mL表示。

经测定，菌株901-18,为稳定的最高产菌株。

培养特征：该菌株产真菌α-淀粉酶的最适pH3.0-6.5；最适温度为27～30℃。

将所得的901-18菌株经发酵条件优化后可得耐高温、热稳定性好且酶活高的真菌α-淀粉酶，具体如下：

采用变温调节的方法生产真菌α-淀粉酶，其发酵罐培养阶段包括如下步骤：

将种子液以6％接种量接入发酵罐，培养温度27～30℃，搅拌速度120-180r/m，通风量(V/V)1:1-3,培养时间10-15h；然后以1-2℃/h降温速率缓慢降温至10-15℃，恒温培养15-20h；继续以1-2℃/h降温速率缓慢降温至2-5℃，此时，将一级种子罐发酵液以4％接种量追加接入发酵罐，恒温培养20-30h；最后以1-2℃/h升温速率缓慢升温至10-15℃，恒温培养15-20h；继续以1-2℃/h升温速率缓慢升温至27～30℃，恒温培养15-20h；

补料控制：当发酵液中的还原糖含量降至3mg/ml-8mg/ml时，开始添加补料培养基，补料量以维持发酵液还原糖含量为2mg/ml-5mg/ml；

放罐标准：60-80％菌体衰老自溶，酶活力增长缓慢。

所述发酵培养基组成为：麦芽糊精50-150g，玉米粉50-60g，豆饼粉15-25g，海藻糖30-40g，酵母粉4-8g，玉米浆1-5g，硫酸铵1-3g，磷酸氢二钾1-2g，磷酸二氢钾1-2g，柠檬酸钠1-5g，消泡剂0.1-1g,纯净水l000mL，pH值5-6.5，121℃灭菌20min；

所述补料培养基重量组成为：麦芽糊精20-30％，玉米粉10-20％，豆粉15-25％，不足部分纯净水补足，pH值5-6.5，121-123℃灭菌30-40min。

发酵液经过滤、浓缩、调配、精滤、干燥得真菌α-淀粉酶，其酶学性质如下：

(1)该酶温度适用范围较宽，为50-75℃之间，最适作用温度在65℃，70℃下保存3h仍具有80％以上酶活。

(2)该酶最适反应pH值为5.5，在pH值4.5-7.0之间酶活保持在70％以上。

(3)酶活：由本发明所提供的突变株901-18制备的耐高温α-淀粉酶酶活力可达12000-15000U/ml，相较出发菌株酶活提高3.6倍。

有益效果：

1、本发明使用紫外线-氯化锂-硫酸二乙酯复合诱变的方法获得了一株高产真菌α-淀粉酶的里氏木霉菌株，该菌株变温发酵生产条件下所产酶具有耐高温、热稳定性好，活力高的特点。

2、有该菌株生产所得的耐高温真菌α-淀粉酶酶活力高达12000-15000U/ml,是原始菌株的3.6倍；该酶温度适应范围较宽，在50-75℃之间，耐温度高，特别适合反应温度高、液化工艺与糖化工艺并存的工业化需求。

具体实施方式：

下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。

实施例1：紫外线-氯化锂-硫酸二乙酯复合诱变筛选

(1)孢子悬液的制备

将活化后的出发菌株斜面中加入10mL无菌水，充分震荡制成孢子悬液。

(2)紫外线-氯化锂-硫酸二乙酯复合诱变

将3mL孢子悬液置于无菌平板中，在距离为30cm，功率15w的紫外灯下搅拌照射200s。将经过照射的孢子悬液经梯度稀释后(10^-1-10^-5)涂布于氯化锂平板，并以未经紫外照射的孢子悬液稀释涂平板做对照。将上述涂布均匀的平板，用黑色的布或报纸包好，置30℃培养48h，在长出菌落的平板上筛选出水解圈与菌落直径比值最大者挑至斜面保存，纯化后配制成菌悬液，经梯度稀释后(10^-1-10^-5)取20mL菌悬液与1mL硫酸二乙酯原液充分混合，并于30℃震荡处理40min，将处理过的菌液涂布于氯化锂平板。

(3)高产菌种的初筛

将上述涂布均匀的平板，置30℃培养48h，在长出菌落的平板上初筛出水解圈与菌落直径比值较大者挑至斜面保存，纯化后获得三株菌901-11，901-15,901-18；

(4)摇瓶发酵复筛

将获得的三株菌901-11，901-15,901-18在含有30mL马铃薯液体培养基的250mL摇瓶中进行摇瓶发酵，种子接种量10％(V/V)，30℃、100r/min培养72h，离心取发酵上清液制得粗酶液。

所述的氯化锂平板：淀粉1％，蛋白胨1％，(NH)₂SO₄0.4％，K₂HPO₄0.8％，CaCl₂0.2％，氯化锂0.9％，琼脂2％。

实施例2：酶活性的测定

(1)酶活单位的定义：1mL粗酶液，于65℃、pH5.5条件下，1min液化1mg可溶性淀粉，即为1个酶活力单位，以U/mL表示。

(2)采用DNS法测定901-11，901-15,901-18的淀粉酶活性，得知，901-18具有稳定最高酶活性。

实施例3：酶学性质的测定

(1)温度对酶活性的影响以及酶的热稳定性

相同反应体系，于40-80℃下分别测定该淀粉酶酶活力，结果表明该酶在50-75℃之间均表现较高酶活性，说明该酶的温度适应范围较宽。且热稳定实验表明，该酶在70℃保温3h后，于65℃，pH5.5条件下仍然具有80％以上酶活定，温度高于75℃，酶活损失严重。

(2)pH对酶活性的影响

相同反应体系，在pH3-8.5下分别测该酶酶活，结果表明该酶在pH4.5-7时均具有70％以上的酶活，且pH5.5时达到最大值。

实施例4：一种变温调节生产耐高温α-淀粉酶的方法，包括如下步骤：

(1)菌种活化

将保存完好的里氏木霉901-18的斜面菌种接种于马铃薯斜面培养基，30℃培养48h进行菌种活化，如此活化3次；

(2)液体种子扩大培养

①一级种子培养：将步骤(1)活化后的斜面菌种制成的孢子悬液接入500毫升摇瓶中，培养基装量100毫升，接种后孢子浓度达到10⁵个/mL，摇床120r/min，培养温度30℃，培养时间10h；

②二级种子培养：将一级种子按照10％的接种量接入500毫升二级种子摇瓶中，培养条件与一级种子相同；

③三级种子培养：将二级种子以10％接种量接入5000毫升三级种子摇瓶中，培养基装量1000毫升，旋转式摇床100r/min，培养温度30℃，培养时间10-15h；

④一级种子罐培养：将三级种子以10％接种量接入总容积为150L的一级种子罐，发酵培养基装量100L，培养温度30℃，搅拌速度150r/min，通风量(V/V)1:1.5,罐压0.05Mpa,培养时间15h；

所一级、二级、三级种子培养基重量组成为：

酵母粉0.4％，葡萄糖1.2％，蛋白胨0.4％，牛肉膏0.6％，磷酸氢二钾1.1％，海藻糖2％，硫酸钙1g,氯化镁2g,柠檬酸钠2g，不足部分纯净水补足，pH值5.5，123℃灭菌40min。

所述种子罐培养基重量组成为：

麦芽糊精10％，酵母粉0.6％，海藻糖2％，蛋白胨0.3％，玉米浆0.3％，磷酸氢二钾1.1％，硫酸镁0.08％，柠檬酸钠0.3％，不足部分纯净水补足，pH值5.5，123℃灭菌40min。

(3)发酵罐发酵

将步骤(2)中一级种子罐发酵液以6％接种量接入发酵罐，培养温度30℃，搅拌速度150r/min，通风量(V/V)1:2,培养时间12h；然后以2℃/h降温速率缓慢降温至12℃，恒温培养18h；继续以2℃/h降温速率缓慢降温至4℃，此时，将步骤(2)中一级种子罐发酵液以4％接种量追加接入发酵罐，恒温培养25h；最后以2℃/h升温速率缓慢升温至12℃，恒温培养18h；继续以2℃/h升温速率缓慢升温至30℃，恒温培养18h；

溶解氧控制：通过调整搅拌转速及通风量，控制溶解氧20％；

PH控制：通过补氨水或稀磷酸，控制发酵过程中pH值保持在5.5；

补料控制：当发酵液中的还原糖含量降至3mg/ml-8mg/ml时，开始添加补料培养基，补料量以维持发酵液还原糖含量为2mg/ml-5mg/ml；

放罐标准：70％菌体衰老自溶，酶活力增长缓慢。

所述发酵培养基组成为：麦芽糊精100g，玉米粉55g，豆饼粉20g，海藻糖35g，酵母粉6g，玉米浆3g，硫酸铵2g，磷酸氢二钾2g，磷酸二氢钾2g，柠檬酸钠3g，消泡剂0.5g,纯净水l000mL，pH值5.5，121℃灭菌20min；

所述补料培养基重量组成为：麦芽糊精25％，玉米粉15％，豆粉20％，不足部分纯净水补足，pH值5.5，123℃灭菌40min。

(4)发酵液经过滤、浓缩、调配、精滤、干燥得耐高温真菌α-淀粉酶。

经上述制备方法得到的真菌α-淀粉酶液体酶活力为15000u/ml。

Claims (3)

1.一株高产耐高温真菌α-淀粉酶的里氏木霉，其特征在于，所述里氏木霉具体为里氏木霉901-18Trichodermareesei901-18，保藏编号为CCTCCNO:M2013602。

2.如权利要求1所述的一株高产耐高温真菌α-淀粉酶的里氏木霉，其特征在于，所述里氏木霉能够生产耐高温真菌α-淀粉酶。

3.如权利要求1所述的一株高产耐高温真菌α-淀粉酶的里氏木霉，其特征在于，所述里氏木霉生产耐高温真菌α-淀粉酶的方法为：

将菌株901-18经过三级种子发酵和一级种子罐发酵后进入发酵罐发酵阶段；

将发酵菌种的一级种子罐发酵液以6％接种量接入发酵罐，培养温度27-30℃，搅拌速度120-180r/m，通风量(V/V)1:1-3,培养时间10-15h；然后以1-2℃/h降温速率缓慢降温至10-15℃，恒温培养15-20h；继续以1-2℃/h降温速率缓慢降温至2-5℃，此时，继续将一级种子罐发酵液以4％接种量追加接入发酵罐，恒温培养20-30h；最后以1-2℃/h升温速率缓慢升温至10-15℃，恒温培养15-20h；继续以1-2℃/h升温速率缓慢升温至27-30℃，恒温培养15-20h；

补料控制：当发酵液中的还原糖含量降至3mg/ml-8mg/ml时，开始添加补料培养基，补料量以维持发酵液还原糖含量为2mg/ml-5mg/ml；

放罐标准：60-80％菌体衰老自溶，酶活力增长缓慢；

发酵液经过滤、浓缩、调配、精滤、干燥得耐高温真菌α-淀粉酶。