CN105400810B - 采用敲除技术建立低磷性佝偻病模型的方法 - Google Patents
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Abstract
一种采用敲除技术建立低磷性佝偻病模型的方法，属于生物技术领域。本发明的目的是采用CRISPR‑CAS9基因敲除技术成功获得人类低磷性佝偻病模型的采用敲除技术建立低磷性佝偻病模型的方法。本发明的步骤是：sgRNA表达载体的构建，CAS9mRNA的合成，受精卵的获取和显微注射，受精卵的培养和发育。本发明成功获得低磷性佝偻病模型，该模型的获得能够有效地模拟人类疾病的病理过程，能更有效地预测新疫苗、新药和新诊断试剂等在临床应用中的效果，同时大大降低新药研发的风险，为临床研究提供基础模型。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域。
背景技术
低磷性佝偻病（Hypophosphatemic rickets, HR）是一组因肾脏磷丢失导致血磷降低，引起骨矿化异常的疾病。其分为四种亚型，临床上X 连锁显性低磷性佝偻病(XLH)最常见，其发病率约为 1/20000，可导致患者身材矮小，骨痛，牙齿发育异常，下肢畸形，以及儿童出现佝偻病等。XLH的病因是PHEX基因失活突变引起的。
人类疾病的病症模型是疾病机理研究和新药研发的重要基础。因此建立人类疾病模型，有效地模拟人类疾病的病理过程，能更有效地预测新疫苗、新药和新诊断试剂等在临床应用中的效果，同时大大降低新药研发的风险。
发明内容
本发明的目的是采用CRISPR-CAS9基因敲除技术成功获得人类低磷性佝偻病模型的采用敲除技术建立低磷性佝偻病模型的方法。
本发明的步骤是：
①sgRNA表达载体的构建：在PHEX基因第1个外显子处设计2个sgRNA序列作用靶点，合成两对寡聚核苷酸链制备sgRNA，其中两对寡聚核苷酸为：
sgRNA1:TAGGCAATTCGAGTGCCTCTGG和AAACCCAGAGGCACTCGAATTG；
sgRNA2:TAGGCTTGGCACGATCCTCTTTC和AAACGAAAGAGGATCGTGCCAAG；
合成的寡聚核苷酸经退火，退火条件是：95℃ 5min后自然降至室温，连入经 BbsⅠ酶切经回收PUC57-sgRNA表达载体，完成sgRNA载体构建；
其中：酶切体系：质粒PUC57 20μl
10×buffer 20μl
BbsⅠ 1μl
ddH2O 159μl
酶切37℃ 3h，电泳跑胶后，使用普通DNA琼脂糖胶回收试剂盒进行回收；
②CAS9mRNA的合成：CAS9表达质粒经酶切线性化，经酚氯仿抽提纯化后，溶于无核酸酶的水中；
酶切体系：NotⅠ 4μl
CAS9 50μl
BSA 30μl
Triton 30μl
10×H 30μl
ddH2O 156μl
酶切37℃ 3h，电泳跑胶后，使用普通DNA琼脂糖胶回收试剂盒进行回收；
③受精卵的获取和显微注射：注射卵泡刺激素，之后注射人绒毛膜促性腺激素，获取受精卵，通过显微注射仪器将预混好CAS9mRNA/sgRNA混合物注射到细胞质中，其中CAS9mRNA浓度为150ng/μl，sgRNA浓度为30ng/μl；
④受精卵的培养和发育：将显微注射的受精卵转移到培养液中，置于37℃恒温培养箱中培养，发育到桑椹胚时期时，用吸卵针将单个胚胎转移到离心管中。
本发明sgRNA的寡聚核苷酸链选取原则：选取分数最高并碱基序列开头为GG的寡聚核苷酸链。
本发明胚胎PHEX基因敲除情况鉴定方法：
①胚胎裂解：胚胎裂解试剂为NP40，裂解条件为：56℃ ，1h；95℃，10min；
②DNA测序鉴定胚胎基因型敲除情况：提取DNA，进行PCR，电泳鉴定，并进行DNA测序，得到基因型鉴定结果；
a、设计PCR引物如下：
上游引物：GTCAACGCTTAACAGACTC
下游引物：CACCTCCAACCACTTAATAC；
b、PCR反应体系如下：
模板DNA 1ul
上游引物 1ul
下游引物 1ul
2×Taq plus 12.5ul
ddH2O 9.5ul；
c、PCR反应条件：
95℃预变性7min；94 ℃变性30s，58℃退火30 s，72 ℃延伸40s；30个循环；72 ℃延伸5min；
③PCR产物进行测序，测序结果在PHEX基因引物设计的打靶位点附近出现双峰的情况，选择双峰的样品再次PCR，产物胶回收后进行连接PGM-T载体，转化后挑取阳性克隆再次进行测序，测序结果中在PHEX基因靶位点附近发生碱基插入或碱基缺失，导致阅读框移码突变,则为基因敲除。
本发明经过相关检测，成功获得低磷性佝偻病模型，该模型的获得能够有效地模拟人类疾病的病理过程，能更有效地预测新疫苗、新药和新诊断试剂等在临床应用中的效果，同时大大降低新药研发的风险，为临床研究提供基础模型。
附图说明
图1是本发明表达载体PUC57-sgRNA的结构示意图；
图2是本发明PCR产物鉴定胚胎PHEX基因敲除情况的电泳图；
其中M：Marker为DNA分子标准量；1-14：显微注射后14个胚胎DNA PCR结果。15：阳性对照（正常胚胎）；16：水对照；
设计的PHEX基因的鉴定引物为448bp
从DNA测序结果和PCR产物电泳结果可得到：1,2,3，4,5,6,7,8,9,10，11,12，13,14,15胚胎均发生不同的敲除情况；
图3是显微注射后得到的新生小兔经鉴定后，将对照组和敲除组分别记录并统计其在生长过程中体长的情况；
该图为正常组和敲除组兔生长曲线，从图上可以看出敲除组在生长发育过程中出现生长发育迟缓现象；
图4是显微注射后得到的新生小兔经鉴定后，将对照组和敲除组分别记录并统计其在生长过程中体重的情况；
该图为正常组和敲除组兔身高曲线，可以看出敲除组身高明显低于正常组，并且生长迟缓；
图5是显微注射后得到幼兔血清学鉴定结果：碱性磷酸酶含量对比；该图表现出：正常组和敲除组相比较，敲除组碱性磷酸酶的含量显著升高；
图6是显微注射后得到幼兔血清学鉴定结果：磷含量对比；该图表现出：正常组和敲除组相比较，敲除组磷含量显著减低。
具体实施方式
本发明建立PHEX基因敲除低磷性佝偻病模型：
步骤如下：
1）CRISPR-CAS9系统sgRNA设计和表达载体的构建。
根据Dr. Feng Zhang（http://crispr.mit.edu/）设计在PHEX基因第1个外显子处设计2个sgRNA序列作用靶点，合成两对
寡聚核苷酸链（sgRNA1:TAGGCAATTCGAGTGCCTCTGG和AAACCCAGAGGCACTCGAATTG;sgRNA2:TAGGCTTGGCACGATCCTCTTTC和AAACGAAAGAGGATCGTGCCAAG）用于制备sgRNA。该sgRNA的寡聚核苷酸链选取原则：选取分数最高并碱基序列开头为GG的寡聚核苷酸链。合成的寡聚核苷酸经退火( 95℃ 5min后自然降至室温) ，连入经 BbsⅠ酶切经回收PUC57-sgRNA表达载体，完成sgRNA载体构建，通过测序验证片段连接正确，进行克隆，扩大培养后提取质粒用于准备体外转录模板。
酶切体系：质粒PUC57 20μl
10×buffer 20μl
BbsⅠ 1μl
ddH2O 159μl
酶切37℃ 3h，电泳跑胶后，使用普通DNA琼脂糖胶回收试剂盒（购于天根公司，北京，中国）进行回收，具体操作按说明书进行。
CAS9表达质粒（Addgene，实验室购买），经酶切线性化，经酚氯仿抽提纯化后，溶于无核酸酶的水中作为模板，用于体外转录。CAS9mRNA的合成由试剂盒RNeasy Mini Kit(Qiagen,No.74104)在体外作用T7RNA聚合酶来完成，sgRNA的体外合成由试剂盒MiRNeasyMini Kit(Qiasgen,No.217004)在体外利用T7RNA聚合酶完成。
酶切体系：NotⅠ 4μl
CAS9 50μl
BSA 30μl
Triton 30μl
10×H 30μl
ddH2O 156μl
酶切37℃ 3h，电泳跑胶后，使用普通DNA琼脂糖胶回收试剂盒（购于天根公司，北京，中国）进行回收，具体操作按说明书进行。
2）受精卵的获取和显微注射。
注射卵泡刺激素（FSH），之后注射人绒毛膜促性腺激素(HCG)（购于宁波第二激素厂），获取受精卵，通过显微注射仪器将预混好CAS9mRNA/sgRNA混合物注射到细胞质中(CAS9mRNA终浓度为150ng/μl，sgRNA终浓度为30ng/μl）。
3）受精卵的体外培养和发育。
将显微注射的受精卵转移到培养液中，置于37℃恒温培养箱中培养，发育到桑椹胚时期时，用吸卵针将单个胚胎转移到离心管中，用于后面实验。
（2）胚胎PHEX基因敲除情况鉴定
1)胚胎裂解
胚胎裂解试剂为NP40，裂解条件为：56℃ 1h
95℃ 10min
2）DNA测序鉴定胚胎基因型敲除情况。
提取DNA，提取方法按照组织基因组提取试剂盒说明书进行操作（购于天根公司，北京，中国），进行PCR，电泳鉴定，并进行DNA测序，得到基因型鉴定结果。
设计PCR引物如下：
上游引物：GTCAACGCTTAACAGACTC
下游引物：CACCTCCAACCACTTAATAC
PCR反应体系如下：
模板DNA 1ul
上游引物 1ul
下游引物 1ul
2×Taq plus 12.5ul
ddH2O 9.5ul
PCR反应条件：
95℃预变性7min；94 ℃变性30s，58℃退火30 s，72 ℃延伸40s；30个循环；72 ℃延伸5min。
PCR产物进行测序，若测序结果在PHEX基因引物设计的打靶位点附近出现双峰的情况,则为打靶成功。选择双峰的样品再次PCR，产物胶回收后进行连接PGM-T载体，转化后挑取阳性克隆再次进行测序，测序结果中在PHEX基因靶位点附近发生碱基插入或碱基缺失，导致阅读框移码突变,则判断为基因敲除。
下面对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述：
（1）建立兔PHEX敲除低磷性佝偻病模型。
步骤如下：-
1）CRISPR-CAS9系统sgRNA设计和表达载体的构建。
在PHEX基因第1个外显子处设计2个sgRNA序列作用靶点，合成两对
寡聚核苷酸链（sgRNA1:TAGGCAATTCGAGTGCCTCTGG和AAACCCAGAGGCACTCGAATTG;sgRNA2:TAGGCTTGGCACGATCCTCTTTC和AAACGAAAGAGGATCGTGCCAAG）用于制备sgRNA。该sgRNA的寡聚核苷酸链选取原则：选取分数最高并碱基序列开头为G的寡聚核苷酸链。合成的寡聚核苷酸经退火( 95℃ 5min后自然降至室温) ，连入经 BbsⅠ酶切经回收PUC57-sgRNA表达载体，完成sgRNA载体构建，通过测序验证片段连接正确，进行克隆，扩大培养后提取质粒用于准备体外转录模板。
酶切体系：质粒PUC57 20μl
10×buffer 20μl
BbsⅠ 1μl
ddH2O 159μl
酶切37℃ 3h，电泳跑胶后，使用普通DNA琼脂糖胶回收试剂盒（购于天根公司，北京，中国）进行回收，具体操作按说明书进行。
CAS9表达质粒（Addgene，实验室购买），经酶切线性化，经酚氯仿抽提纯化后，溶于无核酸酶的水中作为模板，用于体外转录。CAS9mRNA的合成由试剂盒RNeasy Mini Kit(Qiagen,No.74104)在体外作用T7RNA聚合酶来完成，sgRNA的体外合成由试剂盒MiRNeasyMini Kit(Qiasgen,No.217004)在体外利用T7RNA聚合酶完成。
酶切体系：NotⅠ 4μl
CAS9 50μl
BSA 30μl
Triton 30μl
10×H 30μl
ddH2O 156μl
酶切37℃ 3h，电泳跑胶后，使用普通DNA琼脂糖胶回收试剂盒（购于天根公司，北京，中国）进行回收，具体操作按说明书进行。
2）受精卵的获取和显微注射。
注射卵泡刺激素（FSH），之后注射人绒毛膜促性腺激素(HCG)（购于宁波第二激素厂），获取受精卵，通过显微注射仪器将预混好CAS9mRNA/sgRNA混合物注射到细胞质中(CAS9mRNA终浓度为150ng/μl，sgRNA终浓度为30ng/μl）。
3）注射后的受精卵移植及动物培育。
显微注射后，将受精卵移植，进行胚胎发育，进行规范化饲养。
（2）兔低磷性佝偻病模型表型鉴定和基因型分析。
1）兔表型结果统计。
分别于出生后1周、2周、4周、6周、8周、10周、12周进行兔外观照片采集。
2）DNA测序鉴定兔低磷性佝偻病模型的基因型。
提取组织DNA，提取方法按照组织基因组提取试剂盒说明书进行操作（天根，北京，中国），进行PCR，电泳鉴定，并进行DNA测序，得到基因型鉴定结果。
设计PCR引物如下：
上游引物：GTCAACGCTTAACAGACTC
下游引物：CACCTCCAACCACTTAATAC
PCR反应体系如下：
模板DNA 1ul
上游引物 1ul
下游引物 1ul
2×Taq plus 12.5ul
ddH2O 9.5ul
PCR反应条件：
95℃预变性7min；94 ℃变性30s，58℃退火30 s，72 ℃延伸40s；30个循环；72 ℃延伸5min。
PCR产物进行测序，若测序结果在PHEX基因引物设计的打靶位点附近出现双峰的情况,则可能为打靶成功。选择双峰的样品再次PCR，产物胶回收后进行连接T载体，转化后挑取阳性克隆再次进行测序，若测序结果中在PHEX基因靶位点附近发生碱基插入或碱基缺失，导致阅读框移码突变,则可判断为基因敲除。
3）采用荧光定量PCR方法在mRNA水平上进行相关检测。
设计Q-PCR引物：
GAPDH：上游引物ATCCATTCATTGACCTCCACTAC
下游引物GTACTGGGCACCAGCATCAC
FGF23：上游引物CACACCTCATCAGACCATCTAC
下游引物TGTTGCCTCTGAAATCCATACA
SOST：上游引物CAGCCGTCCACATGGTAGAG
下游引物GCTGTACTCCGACACGTCTTT
PTH： 上游引物GTCTGCTCAAGACATGGCTAA
下游引物GAGGAACTCTGAGGCCAATAAA
兔肾脏RNA的提取：将冻存于-80℃兔的肾脏组织，使用液氮进行研磨，使用TRNzol-A+总RNA提取试剂盒进行提取，操作按照试剂盒说明书进行（购于天根公司，北京，中国）。
反转录：将上步提取的RNA进行反转录，采用FastQuant cDNA第一链合成试剂盒（天根，北京，中国），操作按照说明书进行。
采用BioEasySYBR Green I实时 PCR试剂盒进行定量分析，本发明选取FGF23、SOST、PTH等基因进行定量分析，内参基因为GAPDH。
4）采用蛋白质印迹法（Western Blot）方法进行PHEX基因蛋白水平分析。
Western Blot具体步骤如下：
样品准备，首先取10ug蛋白样品，加入上样缓冲液，沸水变性5分钟，立即放到冰上，12000rpm，4℃离心5分钟。
电泳：将蛋白样品上样到已配好的聚丙烯酸胺凝胶的样品孔内，进行电泳。
电转：按照海绵垫、滤纸、膜、凝胶、滤纸、海绵垫的顺序制作转移“三明治”，放入电转槽中，100V电压电转3小时。
洗膜：取出膜，放于TBST中洗15分钟，连续洗3次。
封闭：将膜放于5%脱脂乳的TBST溶液中封闭2小时。
一抗孵育：用含有5%脱脂乳的TBST进行一抗稀释，4℃孵育过夜。
洗膜：将膜用TBST洗15分钟，连续3次。
二抗：用含有5%脱脂乳的TBST进行二抗稀释，孵育2小时。
洗膜：将膜用TBST洗15分钟，连续3次。
显影：需要配显影液，使用显影仪进行显影。
（3）兔低磷性佝偻病模型表型鉴定和基因型分析。
1）兔体长和体重结果采集。
分别于出生后1周、2周、4周、6周、8周、10周、12周测定正常兔与敲除兔的体长和体重。
2）兔相关血清学结果测定。
分别于7周、14周进行血清学测定，分离血清，采用ELISA试剂盒测定血清中磷、碱性磷酸酶、钙等生化指标。
分离血清方法：取新鲜血液，放于1.5ml灭菌的离心管中，37℃静置30分钟，3000rpm离心10分钟，将淡黄色上清液吸到离心管中，放于-80℃保存，用于实验研究。
3）观察兔骨骼、心脏、肝脏、脾脏、肾脏、肺脏等重要器官或组织是否发生病变。
敲除兔在生长过程中，出现死亡的个体，解剖观察各脏器病变情况，固定组织，做组织病理切片。
4）兔骨骼影像学分析。
在第7周，取剔除干净的四肢骨骼，进行X-射线，获取四肢骨骼影像学照片，进行相应结果分析。
1、PHEX基因第一外显子的序列：
ATGGAAGCAGAAACAGGGAGCAATGCGGGAACTGGAAAGACGGCCACCAGAGGCAC
TCGAATTGCCCTGGTCGTATTCATCGGCGGCACTCTCGTGCTTGGCACGATCCTCTTTCT
GG
2、正常胚胎PCR产物进行DNA测序的结果（长度为448bp）：
GTCAACGCTTAACAGACTCTTGAGAGCAGCCACCAGACCACGAAAAGTGACTAAGATTCTTCTCGTGTGCTCTCTACGGC
CCTTCTGATGGAAGCAGAAACAGGGAGCAATGCGGGAACTGGAAAGACGGCCACCAGAGGCACTCGAATTGCCCTGGTCG
TATTCATCGGCGGCACTCTCGTGCTTGGCACGATCCTCTTTCTGGGTAAGTGGAGCCCTGGAGGCCGGGGGCACGGGGCA
TGTGCTGAGAAATCCCTTGTGCTTTATTCTAGCCTTGTCATAATGCAAGTGTGCGACTGTTTGCTTGTGTTAGAAGGTGA
TGCAGTCTTGGTTTCTATCAAATGGGCAAATGAAAAAGGCTTTGCTTTCAGAGGCTACATGCATAAATACAGTCAAGAAC
TGAATATGTACTGCAGAGGGCAAAGTGGGTATTAAGTGGTTGGAGGT
3、PUC57-sgRNA1序列（斜体下划线标注为sgRNA1一条寡聚核苷酸链）：
CAGTGATTGGAGATCGGTACTTCGCGAATGCGTCGAGATATTGGGTCTTTAAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAA
GTTGATAACGGACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTA AAACCCAGAGGCACTCGAATTG CCTATAGTGAGT
CGTATTAATTGGGTATCGGATGCCGGGACCGACGAGTGCAGAGGCGTGCAAGCGAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCT
GTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTG
CCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTG
CATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCT
GCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATA
ACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCAT
AGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATA
CCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTC
TCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTG
GGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAA
GACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTACAGGATTAGCAGAGCGAGTATGTAAGCGTTGCTACAGAGTTCTT
GAAGTGGTGCCTAACTACGGGCTTACCACTAAGGA
4、PUC57-sgRNA2序列（斜体下划线标注为sgRNA2一条寡聚核苷酸链）：
CGGCAGTGATTGGAGATCGGTACTTCGCGAATGCGTCGAGATATTGGGTCTTTAAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTT
CAAGTTGATAACGGACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTA AAACGAAAGAGGATCGTGCC AAG CCTATAGT
GAGTCGTATTAATTGGGTATCGGATGCCGGGACCGACGAGTGCAGAGGCGTGCAAGCGAGCTTGGCGTAATCATGGTCAT
AGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGG
GGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCA
GCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACT
CGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGG
GATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTT
CCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAA
GATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCC
TTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAA
GCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGG
TAAGACACGACTTATCGCACTGGCAGCAGCACTGTAACAGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGT
Claims (3)
1.一种采用敲除技术建立低磷性佝偻病模型的方法，其特征在于：
①sgRNA表达载体的构建：在PHEX基因第1个外显子处设计2个sgRNA序列作用靶点，合成两对寡聚核苷酸链制备sgRNA，其中两对寡聚核苷酸为：
sgRNA1:TAGGCAATTCGAGTGCCTCTGG和AAACCCAGAGGCACTCGAATTG；
sgRNA2:TAGGCTTGGCACGATCCTCTTTC和AAACGAAAGAGGATCGTGCCAAG；
合成的寡聚核苷酸分别经退火，退火条件是：95℃ 5min后自然降至室温，分别用BbsⅠ限制性核酸内切酶对PUC57载体线性化，随后将酶切产物进行回收，并将sgRNA1和sgRNA2分别连接到PUC57载体上，进而完成PUC57-sgRNA1和PUC57-sgRNA2载体的构建；
其中：酶切体系：质粒PUC57 20μl
10×buffer 20μl
BbsⅠ 1μl
ddH2O 159μl
酶切37℃ 3h，电泳跑胶后，使用普通DNA琼脂糖胶回收试剂盒进行回收；
②CAS9mRNA的合成：CAS9表达质粒经酶切线性化，经酚氯仿抽提纯化后，溶于无核酸酶的水中；
酶切体系：NotⅠ 4μl
CAS9 50μl
BSA 30μl
Triton 30μl
10×H 30μl
ddH2O 156μl
酶切37℃ 3h，电泳跑胶后，使用普通DNA琼脂糖胶回收试剂盒进行回收；
③受精卵的获取和显微注射：注射卵泡刺激素，之后注射人绒毛膜促性腺激素，获取受精卵，通过显微注射仪器将预混好CAS9mRNA/sgRNA混合物注射到细胞质中，其中CAS9mRNA浓度为150ng/μl，sgRNA浓度为30ng/μl；
④受精卵的培养和发育：将显微注射的受精卵转移到培养液中，置于37℃恒温培养箱中培养，发育到桑椹胚时期时，用吸卵针将单个胚胎转移到离心管中。
2.根据权利要求1所述的采用敲除技术建立低磷性佝偻病模型的方法，其特征在于：sgRNA的寡聚核苷酸链选取原则：选取分数最高并碱基序列开头为GG的寡聚核苷酸链。
3.权利要求1所述的采用敲除技术建立低磷性佝偻病模型的方法，其特征在于：还包括胚胎PHEX基因敲除情况鉴定方法：
①胚胎裂解：胚胎裂解试剂为NP40，裂解条件为：56℃ ，1h；95℃，10min；
②DNA测序鉴定胚胎基因型敲除情况：提取DNA，进行PCR，电泳鉴定，并进行DNA测序，得到基因型鉴定结果；
a、设计PCR引物如下：
上游引物：GTCAACGCTTAACAGACTC
下游引物：CACCTCCAACCACTTAATAC；
b、PCR反应体系如下：
模板DNA 1ul
上游引物 1ul
下游引物 1ul
2×Taq plus 12.5ul
ddH2O 9.5ul；
c、PCR反应条件：
95℃预变性7min；94 ℃变性30s，58℃退火30 s，72 ℃延伸40s；30个循环；72 ℃延伸5min；
③PCR产物进行测序，测序结果在PHEX基因引物设计的打靶位点附近出现双峰的情况，选择双峰的样品再次PCR，产物胶回收后进行连接PGM-T载体，转化后挑取阳性克隆再次进行测序，测序结果中在PHEX基因靶位点附近发生碱基插入或碱基缺失，导致阅读框移码突变,则为基因敲除。
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