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CN105343900A - 褐藻多糖为载体的淋巴靶向核磁造影剂及制备方法和应用 - Google Patents

褐藻多糖为载体的淋巴靶向核磁造影剂及制备方法和应用 Download PDF

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CN105343900A CN201510588832.4A CN201510588832A CN105343900A CN 105343900 A CN105343900 A CN 105343900A CN 201510588832 A CN201510588832 A CN 201510588832A CN 105343900 A CN105343900 A CN 105343900A
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Abstract

本发明涉及医药学造影剂，特别涉及褐藻多糖为载体的淋巴靶向性造影剂及其制备方法和应用，以褐藻多糖为载体、甘露糖或甘露糖衍生物作为甘露糖受体（MBP）识别基团、顺磁性金属离子螯合物作为核磁共振造影基团制备了水溶性良好的大分子造影剂，提高了淋巴组织结合力，所合成的造影剂分子中引入的甘露糖或者甘露糖衍生物基团达到了与淋巴组织中富集的甘露糖受体结合的目的。同时，本发明造影剂经皮下注射后，淋巴管和淋巴结在核磁共振仪器扫描下均清晰显影，注射该造影剂的动物体一侧淋巴结信号强化率和强化时间显著增强，实现了淋巴结和淋巴管的清晰绘图和精确定位，对淋巴系统疾病的检查、诊断有着巨大意义。

Description

褐藻多糖为载体的淋巴靶向核磁造影剂及制备方法和应用
技术领域
本发明涉及医药学造影剂，具体涉及一种以褐藻多糖为载体的淋巴靶向性造影剂及其制备方法和应用。
背景技术
淋巴系统是由淋巴结和淋巴管组成的网状结构，其分布与毛细血管和静脉血管大致并行，遍布人体全身各部位。作为人体免疫系统重要组成部分，淋巴系统在病菌的扩散和癌症的转移上起了关键作用。研究表明，乳腺癌细胞、黑色素瘤细胞转移时，前哨淋巴结(SLN)首先发现转移癌细胞的可能性最大。转移癌细胞将SLN作为蓄积地，沿淋巴管扩散侵入周围各级淋巴结，最终完成整个身体的癌细胞扩散。因此，淋巴系统造影作为一种医疗检测手段，对于癌转移的预防、诊断、各时期的评估界定和治疗有着重要意义。
磁共振成像(MagneticResonanceImaging，MRI)技术在医学显影诊断治疗中有着举足轻重的地位。磁共振造影剂(MRIcontrastagent)能够增强正常组织与病变组织的信号对比度，提高影像的清晰度及疾病检出率；随着近十年医学核磁共振技术研究的迅速崛起及发展，具有靶向性、溶解性、安全性及稳定性造影剂研发成为发展趋势。
近年来，淋巴核磁共振成像(MRI)作为一种分辨率高的非创伤性技术获得了广泛应用。由于淋巴系统的独特的开放式结构和淋巴液的单向流动，研制淋巴系统的靶向性高的造影剂从而获得高灵敏度和清晰度的淋巴系统MRI图一直是医学影像学的研究热点。目前临床使用的常用造影剂主要为小分子含钆造影剂(如马根维显)，它可以用于血管强化显影，但不能对前哨淋巴结和淋巴管特异显影；临床上使用另外一种组织特异性磁共振成像造影剂是超小型超顺磁性氧化铁纳米颗粒(USPIO)菲立磁(feridex)，主要用于肝脾磁共振造影；所以至今，临床上还没有一种药物特异性的用于淋巴系统和前哨淋巴结。一系列新型淋巴靶向性MR造影剂的研究可以提高淋巴系统绘图质量，为淋巴结的定位、转移瘤分期的评估、淋巴管道功能性诊断如淋巴水肿提供巨大帮助。
近10年来，肝、肿瘤、脑部等特殊部位的磁共振造影剂的研究取得了长足的发展，如CN101637612公开的一种脂质-钆复合物作为呼吸道磁共振喷雾造影剂，CN101433726公开的一种以碳纳米管为载体的钆磁共振造影剂，CN1943791A公开的以1，4，7，10-四氮杂环十二烷为核的树形大分子为载体连接顺磁性金属制备的用于肿瘤靶向性大分子造影剂。
在淋巴靶向造影的造影机理研究方面，申请号201010023087.6公开了以二氧化硅纳米微球包载的钆磁共振造影剂，由于其粒径范围在50-200nm之间，可以被动地被毛细淋巴管吸收而不透过毛细血管。另外，以多糖为载体的淋巴靶向造影剂的研究也是此类造影剂开发的重要方面，如以右旋糖酐(即葡聚糖)为载体共价连接含有钆的螯合物(鄢国平等，多糖类大分子顺磁性金属配合物及其合成方法，中国专利申请号，200910063629.X，江涛等，靶向淋巴系统造影剂的制备及其动物实验.中国科学:化学,2011(11):第1712-1718页)，大分子磁共振造影剂之所以没有用于临床，主要是因为二氧化硅纳米微球和右旋糖酐(葡聚糖)对淋巴细胞和巨噬细胞都没有特异性结合，它们是依据毛细淋巴管的上皮细胞裂隙大于毛细血管的上皮细胞裂隙，皮下注射后，通过淋巴管内外渗透压的不同，被动的将含有钆螯合物的大分子压到淋巴管中，不具有主动靶向性，从而导致该造影剂在淋巴系统内的弛豫时间、信号强度和造影的持续时间不尽如意。甘露糖结合蛋白(MBP)属于外源凝集素类受体蛋白的一种。这种高度存在于哺乳动物肺吞噬细胞、肝薄壁细胞和非薄壁细胞、血清和淋巴组织中的受体可以结合末端为甘露糖的糖蛋白，在淋巴靶向造影剂中引入甘露糖基团，可以使得造影剂具有主动靶向淋巴组织的功能，具有广阔的应用前景。
理想的淋巴靶向性造影剂需要满足三个条件，快的注射位点清除速率、长的淋巴驻留时间以及高的淋巴结造影剂积累浓度。主动靶向和被动靶向兼具的淋巴特异性造影剂才能够满足以上特性。2013年美国FDA批准用于临床的lymphoseek是一种以淋巴巨噬细胞的甘露糖受体为主动靶向的靶点蛋白，是在右旋糖酐的分子上接有甘露糖片段和含有放射性同位素锝Tc的淋巴靶向闪烁核素造影剂，实现了淋巴结和淋巴管的绘图与定位，该造影剂特异性结合于淋巴组织中，表明了造影剂中甘露糖基团与淋巴巨噬细胞中富含的甘露糖结合蛋白(MBP)受体结合策略的成功应用但是，该核素造影剂虽然已应用临床，但与核磁共振造影剂相比，仍然具有灵敏度低、放射性元素毒性大的缺点。虽然，CN101862461.B公开了一种以透明质酸为载体的含钆大分子造影剂，希望通过淋巴管具有的淋巴管透明质烷受体-1LYVE-1(Lymphaticvascularendothelialhyaluronanreceptor-1)，达到主动靶向淋巴系统的作用，但是，该专利仅仅公开的透明质酸为载体的含钆大分子造影剂的制备方法，并没有数据支持该造影剂可以主动靶向淋巴系统，也没有数据支持透明质酸与淋巴管透明质烷受体-1(LYVE-1)特异性结合。
虽然淋巴靶向核磁共振造影剂在临床医学上有重要需求，但近十年的研究，用右旋糖苷、聚酰胺高分子、聚乙二醇高分子或多肽为载体的制备的淋巴系统造影剂都没有进入新药审批阶段，主要原因是上述使用的载体只能依靠材料的粒径大小靶向进入淋巴系统，却不具备与淋巴细胞受体的结合作用，还不能从淋巴的特异性受体的角度获得主动靶向、快速进入、专一性强且停留时间长的造影剂。
发明内容
本发明针对现有技术中存在不能主动靶向、进入慢、转移性不强以及停留时间过长的问题，提供一种以褐藻多糖为载体的淋巴靶向性造影剂及其制备方法和应用。
淋巴细胞表面受体可以与多种酸性多糖结合，海洋多糖、寡糖是不可多得的免疫活性分子，海洋多糖来源的聚甘露糖醛酸和聚古罗糖醛酸具有强的提高免疫力和活性，而且，褐藻酸性多糖可以通过免疫活性增强淋巴巨噬细胞的吞噬能力(酸性磷酸酶ACP)。这些褐藻多糖能够增强甘露糖受体结合能力和巨噬细胞的吞噬能力，为本发明研究主动靶向淋巴系统的核磁共振造影剂提供了可能。
本发明的技术方案是：
一种褐藻多糖为载体的淋巴靶向性磁共振造影剂，其具有以下结构：造影剂大分子以褐藻多糖为载体，其6位羧基通过烷基、芳基或杂环基团为连接臂，分别与甘露糖受体MBP识别基团配体A以及顺磁性金属螯合物配体B结合，所述造影剂大分子具有以下通式：
其中：n1是整数、n2和n3为正整数；X为O、N或S；linker为烷基、芳香基或杂环基；配体A为甘露糖受体MBP识别基团；配体B为顺磁性金属螯合物。
优选的，所述的配体A的摩尔含量占褐藻多糖原有羧基的0-40％，配体B的摩尔含量占褐藻多糖原有羧基的1-60％，其中配体A的摩尔含量，配体B的摩尔含量以及褐藻多糖原有羧基中未反应羧基的摩尔含量总和为100％。
优选的，所述的褐藻多糖载体为聚甘露糖醛酸PM或聚古罗糖醛酸PG，并包括其相应的羧酸盐形式，分子量为100-108Da。
优选的，与多糖6位羧基通过酰胺键结合的Linker为原子数目1到20的烷基、芳香基或杂环基结构，再与甘露糖受体MBP识别基团配体A或者顺磁性金属螯合物配体B结合。
优选的，所述褐藻多糖的糖醛酸环羧基还以酰胺键连接有甘露糖受体MBP识别基团配体A，为α或β构型的甘露糖及其衍生物，具体结构如下：
其中R可以为多种官能团如烃基、羧基、氨基、羟基、卤素等。
优选的，所述顺磁性金属螯合物配体B由金属螯合剂与顺磁性金属离子螯合而成，金属螯合剂为含氨基的金属螯合剂，结构如下：
或金属螯合剂为不含氨基的金属螯合剂，结构如下：
所用顺磁性金属离子为Gd、Mn、Cr、Fe、Co、Ni、La、Tc、Dy或Cu的二价或三价离子。
本发明另一个目的在于公开制备褐藻多糖为载体的淋巴靶向性显影剂的方法，它包括以下步骤：
第一步：将褐藻多糖和酰化试剂溶解于溶剂中，随后加入甘露糖或甘露糖衍生物搅拌反应1-24h，反应完毕，淬灭反应，溶液经透析袋透析，除去小分子杂质，使用冷冻干燥法处理得到中间体，甘露糖或甘露糖衍生物、酰化试剂、褐藻多糖所有羧基三者的投料摩尔比值为0-0.999：0.001-100：1；
第二步：将上步所述中间体和酰化试剂溶解于去离子水中，加入带氨基基团的金属螯合剂搅拌反应1-24h，反应完毕淬灭反应，淬灭反应，向其加入金属离子的水溶液，经透析、冷冻干燥处理后得到最终产品，所述金属螯合剂、酰化试剂、金属离子与褐藻多糖所有羧基的投料摩尔比值为0.001-100：0.001-100：0.001-100：1。
优选的，两步酰化反应的溶剂为水或DMSO、DMF极性非质子溶剂，反应温度在0至150℃之间。
本发明第三个目的在于公开另一种制备褐藻多糖为载体的淋巴靶向性显影剂的方法，其特征在于，以采取以下步骤：
第一步：将褐藻多糖和酰化试剂溶解于溶剂中，随后依次加入烷基二胺类化合物、甘露糖或甘露糖衍生物搅拌反应1-24h，反应完毕，淬灭反应，溶液经透析后使用冷冻干燥法处理制得中间体，所述甘露糖或甘露糖衍生物、烷基二胺类化合物、酰化试剂与褐藻多糖所有羧基的投料摩尔比值为0-0.999：0.001-100：0.001-100：1；
第二步：将所述中间体和酰化试剂再次溶解于溶剂中，加入金属螯合剂搅拌反应1-24h；反应完毕，淬灭反应，向其加入金属离子的水溶液，经透析、冷冻干燥后得到最终产品，金属螯合剂、酰化试剂、金属离子与褐藻多糖所有羧基的投料摩尔比值为0.001-100：0.001-100：0.001-100：1。
优选的，两步酰化反应的溶剂为水或DMSO、DMF极性非质子溶剂，反应温度在0至150℃之间。
本发明的第四个目的在于公开以上所述的显影剂用于制备诊断淋巴系统疾病的试剂中的应用。
本发明旨在将顺磁性金属螯合物与大分子褐藻多糖共价连接，合成一种具有核磁共振检查功能的淋巴特异性造影剂。本发明通过制备方法合成的大分子造影剂的中间体使用核磁共振进行了表征；化合物中各个基团取代度使用元素分析法的C、N比例以及1HNMR谱峰面积积分计算；钆含量由ICP-MS测定；分子量由高效凝胶渗透色谱测定。结构表征完成后配成溶液分别于大鼠和新西兰兔后肢第一、二、三趾蹼处皮下注射，每隔15-60min进行一次核磁共振(MR)扫描以获取MR影像。
本发明的有益效果是：
1、以褐藻多糖为载体、甘露糖或甘露糖衍生物作为甘露糖受体(MBP)识别基团、顺磁性金属离子螯合物作为核磁共振造影基团制备了水溶性良好的大分子造影剂，提高了淋巴组织结合力，所合成的造影剂分子中引入的甘露糖或者甘露糖衍生物基团达到了与淋巴组织中富集的甘露糖受体结合的目的。
2、本发明合成的造影剂分子对大鼠和新西兰兔模型上进行了淋巴造影实验，结果显示该大分子核磁共振造影剂经皮下注射后，淋巴管和淋巴结在核磁共振仪器扫描下均清晰显影，与对照品透明质酸为载体的HA-DTPA-Gd相比，注射该造影剂的动物体一侧淋巴结信号强化率和强化时间显著增强，实现了淋巴结和淋巴管的清晰绘图和精确定位，对淋巴系统疾病的检查、诊断有着巨大意义。
附图说明
图1是本发明实施例1所合成化合物的红外光谱图；
图2是本发明实施例1所合成化合物1HNMR谱图；
图3是本发明实施例1所合成化合物13CNMR谱图；
图4是本发明实施例3所合成化合物1HNMR谱图；
图5是本发明实施例3所合成化合物13HNMR谱图；
图6是本发明实施例4所合成化合物1HNMR谱图；
图7是本发明实施例4所合成化合物13CNMR谱图；
图8是本发明实施例1中健康大鼠皮下注射大分子显影剂PM-GdDTPA后的双侧下肢淋巴结和淋巴管MR显影图；
A：注射造影剂前下肢MR平扫图像；B：注射造影剂10min后下肢MR图像；C：注射造影剂60min后下肢MR图像；R：右侧；L：左侧；
图9是本发明实施例2中PG-GdDTPA与HA-DTPA-Gd新西兰兔淋巴MR造影对比实验结果图；
A：注射造影剂HA-DTPA-Gd15min后下肢MR平扫图像；B：注射造影剂PG-GdDTPA15min后下肢MR图像；
图10是本发明实施例3中PM-GdNDTPA与HA-DTPA-Gd新西兰兔淋巴MR造影对比实验结果图；
A：注射造影剂前下肢MR平扫图像；B：注射造影剂15min后下肢MR图像；C：注射造影剂90min后下肢MR图像；D：注射造影剂15min后下肢矢状位MR图像；R：右侧；L：左侧；
图11是本发明实施例3中PM-GdNDTPA与HA-DTPA-Gd信号强化-时间曲线图；
图12是本发明实施例4中PM-M-GdNDTPA与HA-DTPA-Gd新西兰兔淋巴MR造影对比实验结果图；
图中A：注射造影剂前下肢MR平扫图像；B：注射造影剂15min后下肢MR图像；C：注射造影剂120min后下肢MR图像；D：注射造影剂4.5h后下肢MR图像；R：右侧；L：左侧；
图13是本发明实施例4PM-M-GdNDTPA与HA-DTPA-Gd信号强化-时间曲线图；
图14是本发明实施例4中PM-M-GdNDTPA与PM-GdNDTPA新西兰兔淋巴MR造影对比实验结果图；
A：注射造影剂前下肢MR平扫图像；B：注射造影剂120min后下肢MR图像；C：注射造影剂前下肢矢状位MR图像；D：注射造影剂120min后下肢矢状位MR图像；R：右侧；L：左侧；
图15是是本发明实施例4PM-M-GdNDTPA与PM-GdNDTPA信号强化-时间曲线图。
具体实施方式
本发明的具体实施方式如下：
以下结合附图和实施例对本发明的技术方案做进一步的说明。
当所述褐藻多糖为聚甘露糖醛酸时，具体分子式如下：
n1为整数、n2和n3为正整数，X为O、N或S；linker为烷基、芳香基或杂环基。配体A为甘露糖或甘露糖衍生物。配体B为顺磁金属螯合物片段。
当所述褐藻多糖为聚古罗糖醛酸时，具体分子式如下：
n1为整数、n2和n3为正整数，X为O、N或S；linker为烷基、芳香基或杂环基。配体A为甘露糖或甘露糖衍生物。配体B为顺磁金属螯合物片段。
实施例1：
褐藻多糖载体为聚甘露糖醛酸(PM)；n1＝6n2＝16n3＝78；X为氮原子(N)；linker1和linker2为二亚甲基氨基；甘露糖受体(MBP)识别基团(配体A)，摩尔含量为0；配体B为金属螯合剂DTPA，摩尔含量为16％；顺磁性金属为钆(Gd)；得到造影剂PM-GdDTPA。有以下反应流程和步骤：
将海洋褐藻多糖聚甘露糖醛酸(PM)1.78g与酰化试剂EDC(1.92g,10mmol)溶解于50mL去离子水中，室温搅拌下分批缓慢加入烷基二胺类化合物乙二胺(3.0g,50mmol)，室温反应12h。反应结束将溶液置于截留量为3500的透析袋中，在去离子水中透析48小时。透析结束后将溶液浓缩，冷冻干燥后得到白色固体化合物PM-N1.81g。烷基二胺类化合物、酰化试剂与褐藻多糖所有羧基的摩尔比值为：5：1：1。
将所述PM-N1.81g和EDC(1.92g,10mmol)溶解于100mL去离子水中，搅拌下向其加入金属螯合剂二乙烯三胺五乙酸(DTPA)(3.93g,10mmol)，室温反应12h。反应结束将溶液置于截留量为3500的透析袋中，在去离子水中透析48小时。透析结束后将溶液浓缩，冷冻干燥后得到白色固体化合物PM-DTPA2.2g。将所述PM-DTPA2.2g溶解于100mL去离子水中，搅拌下向其分批加入GdCl32.63g。室温搅拌1h后将溶液置于截留量为3500的透析袋中，在去离子水中透析48小时。透析结束后将溶液旋蒸浓缩，冻干后得到白色固体化合物PM-GdDTPA2.3g。金属螯合剂、酰化试剂、金属离子与褐藻多糖所有羧基的投料摩尔比值为1：1：3：1。
制得的所述白色固体化合物PM-GdDTPA的各基团取代度、钆含量及分子量信息如表1所示，
表1实施例1的PM-GdDTPA的各基团取代度、钆含量及分子量
其红外光谱如图1所示，从图1中可以看出：PM-N及PM-DTPA都具有和PM相似的多糖类吸收峰，即3455cm-1、3384cm-1、3426cm-1为三化合物羟基O-H的伸缩振动；2939cm-1、2964cm-1、2989cm-1为C-H的伸缩振动；1623cm-1、1606cm-1、1645cm-1为羧基-COOH的不对称伸缩振动峰；1400cm-1左右为羧基-COOH的对称伸缩振动峰；1047cm-1为C-O的伸缩振动；825cm-1、813cm-1、815cm-1则为甘露糖醛酸的特征吸收峰。2364cm-1为CO2峰。中间体PM-N红外图谱中的1600cm-1和1365cm-1峰分别为伯胺-NH2的对称弯曲振动峰和酰胺键C-N键伸缩振动峰，表明乙二胺与PM的羧基酰胺键连接。PM-DTPA红外图谱中1600cm-1峰的减弱和1645cm-1的大大增强表明DTPA连接到了PM-N的氨基上。
实施例1所合成化合物1HNMR和13CNMR谱图分别如图2和图3所示：
聚甘露糖醛酸的特征峰为糖环质子峰，其1、2、3、4和5位化学位移值分别为δ4.52、4.09、3.63、3.88、3.77ppm。中间体PM-N的1HNMR谱与PM相比出现了两组新峰δ2.90ppm和δ2.73ppm，分别为-CO-CH2-和-CH2-NH2亚甲基氢的特征峰。中间体PM-DTPA的1HNMR谱与PM-N相比出现了DTPA的特征峰δ3.22ppm和δ3.01ppm，分别为-CO-CH2-和-CH2-CH2-的特征峰。
中间体PM-N的13CNMR谱与PM相比出现了两组新峰δ44.18-43.39ppm和δ39.80-37.81ppm，分别为-CO-CH2-和-CH2-NH2亚甲基碳的特征峰。中间体PM-DTPA的13CNMR谱与PM-N相比，出现了DTPA的羰基碳特征峰δ177.73,171.43ppm和亚甲基碳特征峰57.09,56.14,52.51,49.40ppm。
健康的大鼠1只，体重为205g。用氯胺酮(80mg/kg)及地西泮(5mg/kg)肌肉注射麻醉后固定于手术台上，进行MRI平扫。相应参数：3DFastTOF-SPGRCE-MRA序列扫描,FlipAngle30°,TE1.6ms,TR4.5ms,视野280×280mm,矩阵360×224,层厚1.0mm,slah70,NEX2。然后于双脚第一、二、三趾蹼处皮下注射大分子造影剂PM-GdDTPA(30mg/L)，每次注射0.2ml，进行3D增强扫描。增强扫描序列的相关参数与平扫时一致，每隔15分钟扫描一次，总共扫描5次。实施例1中健康大鼠皮下注射大分子显影剂PM-GdDTPA后的双侧下肢淋巴结和淋巴管MR显影图片如图8所示，其中图中A：注射造影剂前下肢MR平扫图像；B：注射造影剂10min后下肢MR图像；C：注射造影剂60min后下肢MR图像；R：右侧；L：左侧。
结果显示，注射造影剂前的腘窝淋巴结无强化信号。而在注射PM-GdDTPA10min后双侧一级淋巴管和淋巴结信号迅速强化，淋巴结显影清晰，呈规则的椭圆形。注射造影剂60min后，双侧淋巴结仍然显影清晰。表明PM-GdDTPA可迅速增强淋巴结和淋巴管MR信号强度，实现淋巴系统的清晰显影；同时表现出了较长的淋巴结驻留能力，淋巴结显影时间可长达一小时。表明PM-GdDTPA具有淋巴系统显影迅速，显影时间较长的优点。
实施例2
褐藻多糖载体为聚古罗糖醛酸(PG)；n1＝13n2＝19n3＝46；X为氮原子(N)；linker1和linker2为二亚甲基氨基；甘露糖受体(MBP)识别基团(配体A)，摩尔含量为0；配体B为金属螯合剂DTPA，摩尔含量为19％；顺磁性金属为钆(Gd)；得到造影剂PG-GdDTPA。有以下反应流程和步骤:
将海洋褐藻多糖聚古罗糖醛酸(PG)2.3g与酰化试剂EDC(2.48g,12.9mmol)溶解于70mL去离子水中，室温搅拌下分批缓慢加入烷基二胺类化合物乙二胺(3.8g,63.3mmol)，室温反应12h。反应结束将溶液置于截留量为3500的透析袋中，在去离子水中透析48小时。透析结束后将溶液浓缩，冻干后得到白色固体化合物PG-N2.01g。烷基二胺类化合物、酰化试剂与褐藻多糖所有羧基的摩尔比值为：5：1：1
将所述PG-N2.01g和酰化试剂EDC(2.48g,12.9mmol)溶解于100mL去离子水中，搅拌下向其分批缓慢加入金属螯合剂二乙烯三胺五乙酸(DTPA)(4.38g,11mmol)，室温反应12h。反应结束将溶液置于截留量为3500的透析袋中，在去离子水中透析48小时。透析结束后将溶液浓缩，冷冻干燥后得到白色固体化合物PG-DTPA2.5g。将制得的PG-DTPA2.5g溶解于100mL去离子水中，搅拌下向其分批加入GdCl33.0g。室温搅拌1h后将溶液置于截留量为3500的透析袋中，在去离子水中透析48小时。透析结束后将溶液浓缩，冷冻干燥后得到白色固体化合物PG-GdDTPA2.8g。
表2实施例2的PG-GdDTPA的各基团取代度、钆含量及分子量
健康的新西兰大白兔1只，体重为3.16kg。用氯胺酮(80mg/kg、1.6ml)及地西泮(5mg/kg、1ml)肌肉注射麻醉新西兰大白兔。将其固定在兔手术台上，进行MRI平扫。相应参数：3DFastTOF-SPGRCE-MRA序列扫描,FlipAngle30°,TE1.6ms,TR4.5ms,视野280×280mm,矩阵360×224,层厚1.0mm,slah70,NEX2。然后使用实施例2中合成的PG-GdDTPA与HA-DTPA-Gd生理盐水溶液，分别于新西兰兔左、右后肢一、二、三趾蹼皮下注射，每次0.1ml，钆浓度为0.03mmol/ml。注射显影剂后，3.5h内每隔15-60min扫描一次，共扫描9次。
实施例2PG-GdDTPA与HA-DTPA-Gd(为ZL201010205001.1制备的大分子造影剂)新西兰兔淋巴MR造影对比实验结果如图9所示，图中A：注射造影剂HA-DTPA-Gd15min后下肢MR平扫图像；B：注射造影剂PG-GdDTPA15min后下肢MR图像；
注射造影剂PG-GdDTPA15min后双侧淋巴管和淋巴结信号迅速强化；三根一级淋巴管显影清晰，交汇于腘窝淋巴结；二级淋巴管同样显影清晰，延伸至腹腔。而注射造影剂HA-DTPA-Gd15min后双侧淋巴管和淋巴结信号较为模糊，二级淋巴管显影不清晰。
实施例3
褐藻多糖载体为聚甘露糖醛酸(PM)；n1＝0n2＝29n3＝71；X为氮原子(N)；linker2为苄基；甘露糖受体(MBP)识别基团(配体A)，摩尔含量为0；配体B为金属螯合剂1-(p-氨基苄基)-DTPA，摩尔含量为29％；顺磁性金属为钆(Gd)；得到造影剂PM-GdNDTPA。有以下反应流程和步骤:
将海洋褐藻多糖聚甘露糖醛酸聚甘露糖醛酸PM(2.6g,15mmol)和酰化试剂EDC(2.88g,15mmol)溶解于去离子水100mL中，搅拌下向其加入金属螯合剂1-(p-氨基苄基)-DTPA的盐酸盐(1.93g,3mmol)。室温搅拌反应12h后向溶液中加入K2CO3(8.3g,60mmol)，继续搅拌0.5h。反应完毕，将溶液置于截留量为3500的透析袋中，使用去离子水5L透析，每隔6h换一次水，总共换水5次。透析结束后将溶液浓缩，冻干后得到白色固体化合物PM-NDTPA2.8g。将反应制得的PM-NDTPA2.8g溶解于去离子水100mL中，搅拌下向其分批加入GdCl3·6H2O(0.93g,2.5mmol)，5％的NaOH溶液调pH为5～6，室温搅拌1h后将溶液置于截留量为3500的透析袋中，使用去离子水5L透析，每隔6h换一次水，总共换水5次。透析结束后将溶液浓缩，冻干后得到白色固体化合物PM-GdNDTPA2.7g。金属螯合剂、酰化试剂、金属离子与褐藻多糖所有羧基的摩尔比值为0.2：1：0.17：1；
所述制得的白色固体化合物PM-GdNDTPA的各基团取代度、钆含量及分子量信息如表3所示。
表3实施例3制得的PM-GdNDTPA的各基团取代度、钆含量及分子量
实施例3所合成化合物1HNMR和13CNMR谱如图4和图5所示：
中间体PM-NDTPA的1HNMR谱与PM相比出现了四组新峰：δ7.34ppm和δ7.17ppm的d峰为1-(p-氨基苄基)-DTPA苯环上的两组氢信号；δ3.37-3.17ppm和δ3.02-2.90ppm的两组峰为1-(p-氨基苄基)-DTPA上苄位和-CH2-NH2亚甲基氢信号；-CO-CH2-亚甲基氢信号与糖环氢信号重合。
中间体PM-NDTPA的13CNMR谱中，δ129.80,122.26,109.99,99.85ppm为1-(p-氨基苄基)-DTPA上苯环的4个碳信号峰；δ31.78ppm为1-(p-氨基苄基)-DTPA上苄位亚甲基碳信号；δ57.38-48.54ppm峰为1-(p-氨基苄基)-DTPA上-CO-CH2-和-CH2-NH2亚甲基碳的特征峰。
健康的新西兰大白兔1只，体重为3.12kg。用氯胺酮(80mg/kg、1.6ml)及地西泮(5mg/kg、1ml)肌肉注射麻醉新西兰大白兔。将其固定在兔手术台上，进行MRI平扫。相应参数：3DFastTOF-SPGRCE-MRA序列扫描,FlipAngle30°,TE1.6ms,TR4.5ms,视野280×280mm,矩阵360×224,层厚1.0mm,slah70,NEX2。然后使用实施例3中合成的PM-GdNDTPA与HA-DTPA-Gd生理盐水溶液，分别于新西兰兔左、右后肢一、二、三趾蹼皮下注射，每次0.1ml，钆浓度为0.03mmol/ml。注射显影剂后，3.5h内每隔15-60min扫描一次，共扫描9次。
实施例3PM-GdNDTPA与HA-DTPA-Gd(为ZL201010205001.1制备的大分子造影剂)新西兰兔淋巴MR造影对比实验结果如图10所示，图中A：注射造影剂前下肢MR平扫图像；B：注射造影剂15min后下肢MR图像；C：注射造影剂90min后下肢MR图像；D：注射造影剂15min后下肢矢状位MR图像；R：右侧；L：左侧。
注射造影剂15min后双侧淋巴管和淋巴结信号迅速强化；三根一级淋巴管显影清晰，交汇于腘窝淋巴结；二级淋巴管同样显影清晰，延伸至腹腔。注射造影剂90min后，注射HA-DTPA-Gd的右侧淋巴结和淋巴管信号强明显弱化，而注射PM-GdNDTPA的左侧淋巴结和一、二级淋巴管仍保持清晰显影。
信号强化-时间曲线(图11)显示注射PM-GdNDTPA的左侧淋巴结与注射HA-DTPA-Gd的右侧淋巴结均有两个MR信号强化峰，分别出现在15min和120min左右。处于15min的两侧淋巴结MR信号强化峰在峰形、峰值及峰出现时间具有显著的相似性，信号强化率的峰值高达9左右。而处于120min的淋巴结MR信号强化峰，左侧淋巴结的信号强化率明显高于右侧淋巴结，峰值是右侧的3倍左右。左侧淋巴结在3.5小时后仍有2.32的信号强化率，表明PM-GdNDTPA具有优异的淋巴结驻留能力。
实施例4：
载体为聚甘露糖醛酸(PM)；n1＝15n2＝17n3＝68；X为氮原子(N)；linker1为二亚甲基，linker2为苄基；配体A为甘露糖(M)，摩尔含量为15％；配体B为金属螯合剂1-(p-氨基苄基)-DTPA，摩尔含量为17％；顺磁性金属为钆(Gd)；得到造影剂PM-M-GdNDTPA。有以下反应流程和步骤:
将海洋褐藻多糖聚甘露糖醛酸(PM,3.52g,20mmol)与酰化试剂EDC(3.83g,20mmol)溶解于去离子水50ml中，室温搅拌下分批缓慢加入1-O-氨基乙基甘露糖(1.42g,5mmol)，室温搅拌反应12h。反应结束，向溶液中加入K2CO3(8.3g,60mmol)后搅拌0.5h；将溶液置于截留量为3500的透析袋中，使用去离子水5L透析，每隔6h换一次水，总共换水5次。透析结束后将溶液浓缩，冻干后得到白色固体化合物PM-M3.4g。甘露糖衍生物、酰化试剂、褐藻多糖所有羧基三者的摩尔比值为0.25：1：1。
将上一步反应制得的中间体PM-M3.5g以及EDC(1.92g,10mmol)溶解于去离子水100mL中，搅拌下向其加入1-(p-氨基苄基)-DTPA的盐酸盐(1.93g,3mmol)，室温搅拌反应12h。反应结束后向溶液中加入K2CO3(8.3g,60mmol)，搅拌0.5h。将溶液置于截留量为3500的透析袋中，使用去离子水5L透析，每隔6h换一次水，总共换水5次。透析结束后将溶液浓缩，冻干后得到白色固体化合物PM-M-NDTPA3.1g。将反应制得的PM-M-NDTPA3g溶解于去离子水100ml中，搅拌下向其分批加入GdCl3·6H2O(0.93g,2.5mmol)，5％的NaOH溶液调pH为5～6，室温搅拌1h后将溶液置于截留量为3500的透析袋中，使用去离子水5L透析，每隔6h换一次水，总共换水5次。透析结束后将溶液浓缩，冻干后得到白色固体化合物PM-M-GdNDTPA2.76g。金属螯合剂、酰化试剂、金属离子与褐藻多糖所有羧基的摩尔比值为0.15：0.5：0.125：1；
所述制得的白色固体化合物PM-M-GdNDTPA的各基团取代度、钆含量及分子量信息如表4所示。
表4实施例4制得的PM-M-GdNDTPA的各基团取代度、钆含量及分子量
实施例4所合成化合物1HNMR和13CNMR谱如图6和图7所示：
中间体PM-M的1HNMR谱中，1-O-氨基乙基甘露糖基团上的糖环质子信号以及亚甲基氢信号与PM的糖环氢信号重合；仅能找到端基氢信号δ4.73ppm。中间体PM-M-NDTPA的1HNMR谱中，δ7.32,7.17ppm为1-(p-氨基苄基)-DTPA上苯环氢信号；δ3.31-2.89ppm为1-(p-氨基苄基)-DTPA上苄位和-CH2-NH2亚甲基氢信号；-CO-CH2-亚甲基氢信号则与糖环氢信号重合。
中间体PM-M的13CNMR谱中，δ101.11ppm为1-O-氨基乙基甘露糖基团上的糖环端基碳信号；δ99.78、99.42ppm分别为与甘露糖基团相连甘露糖醛酸和其它甘露糖醛酸的端基碳信号；δ70.33、69.90、68.40、66.61、64.54ppm为甘露糖环其它碳信号；δ60.79、38.81ppm为连接臂-O-CH2-和-CH2-NH-亚甲基碳信号。这些新增信号表明甘露糖基团与MM连接。中间体PM-M-NDTPA的13CNMR谱与PM-M相比，δ130.00、122.17ppm为1-(p-氨基苄基)-DTPA上苯环的碳信号峰；δ57.45-54.32ppm峰为1-(p-氨基苄基)-DTPA上-CO-CH2-和-CH2-NH2亚甲基碳的特征峰。
健康的新西兰大白兔1只，体重为3.3kg。用氯胺酮(80mg/kg、1.6ml)及地西泮(5mg/kg、1ml)肌肉注射麻醉新西兰大白兔。将其固定在兔手术台上，进行MRI平扫。相应参数：3DFastTOF-SPGRCE-MRA序列扫描,FlipAngle30°,TE1.6ms,TR4.5ms,视野280×280mm,矩阵360×224,层厚1.0mm,slah70,NEX2。然后使用实施例4中合成的PM-M-GdNDTPA与HA-DTPA-Gd生理盐水溶液，分别于新西兰兔左、右后肢一、二、三趾蹼皮下注射，每次0.1ml，钆浓度为0.03mmol/ml。注射显影剂后，5.5h内每隔15-60min扫描一次，共扫描10次。
实施例4PM-M-GdNDTPA与HA-DTPA-Gd新西兰兔淋巴MR造影对比实验结果如图12所示，图中A：注射造影剂前下肢MR平扫图像；B：注射造影剂15min后下肢MR图像；C：注射造影剂120min后下肢MR图像；D：注射造影剂4.5h后下肢MR图像；R：右侧；L：左侧。
注射造影剂PM-M-GdNDTPA15min后双侧淋巴管和淋巴结信号迅速强化；三根一级淋巴管显影清晰，交汇于腘窝淋巴结；二级淋巴管同样显影清晰，由淋巴结向腹腔延伸。注射造影剂120min后，注射HA-DTPA-Gd的右侧淋巴结和淋巴管信号强明显弱化，而注射PM-M-GdNDTPA的左侧淋巴结和一、二级淋巴管仍保持清晰显影。扫描时间延长到4.5h后，左侧淋巴结MR图像仍清晰可辨，右侧淋巴结已经无显影。
信号强化-时间曲线(图13)中，注射PM-M-GdNDTPA的左侧淋巴结与注射HA-DTPA-Gd的右侧淋巴结同样出现了两个MR信号强化峰，分别出现在15min和120min左右。15min时两侧淋巴结MR信号强化峰值均为4左右，而处于120min的淋巴结MR信号强化峰，左侧淋巴结的信号强化率明显高于右侧淋巴结，峰值是右侧的3倍左右。在此后3.5小时内，左侧淋巴结信号强化率降低缓慢，到达5.5小时时仍有2.66的信号强化率；右侧淋巴结在4.5小时后已无强化。证明本发明造影剂PM-M-GdNDTPA优秀的显影能力和长的淋巴组织驻留时间
健康的新西兰大白兔1只，体重为3.34kg。用氯胺酮(80mg/kg、1.6ml)及地西泮(5mg/kg、1ml)肌肉注射麻醉新西兰大白兔。将其固定在兔手术台上，进行MRI平扫。相应参数：3DFastTOF-SPGRCE-MRA序列扫描,FlipAngle30°,TE1.6ms,TR4.5ms,视野280×280mm,矩阵360×224,层厚1.0mm,slah70,NEX2。然后使用实施例4中合成的PM-M-GdNDTPA与PM-GdNDTPA生理盐水溶液，分别于新西兰兔左、右后肢一、二、三趾蹼皮下注射，每次0.1ml，钆浓度为0.03mmol/ml。注射显影剂后，5.5h内每隔15-60min扫描一次，共扫描10次。
MR结果(图14)显示，在注射造影剂120min后双侧淋巴管和淋巴结显影清晰；三根一级淋巴管上行后交汇于腘窝淋巴结，二级淋巴管同样显影清晰，由淋巴结向腹腔延伸。T1加权序列的矢状位层面可观察到淋巴结和一二级淋巴管的清晰轮廓。PM-M-GdNDTPA显影效果和时长优于PM-GdNDTPA，证明造影剂中引入甘露糖片段可明显提高造影剂的淋巴驻留能力，是基于甘露糖受体结合策略的成功应用。
信号强化-时间曲线(图15)同样证明甘露糖片段提高了造影剂主动靶向淋巴组织的能力，两侧信号强化曲线均出现了两个MR信号强化峰，分别出现在30min和120min左右；注射PM-GdNDTPA的右侧淋巴结信号强化率低于注射PM-M-GdNDTPA的左侧。双侧淋巴结信号强化持续时间均超过了4h。
实施例1-4所合成的大分子造影剂经皮下注射后淋巴管和淋巴结均能清晰显影，达到了淋巴结和淋巴管的清晰绘图和精确定位。与对照品透明质酸为载体的HA-DTPA-Gd相比，注射该型造影剂的动物体一侧淋巴结信号强化率和强化时间均显著增强。而与此同时，PM-GdNDTPA和PM-M-GdNDTPA在淋巴结中的含量显著升高，维持淋巴结高信号强化(E>2)时间3h以上，表明二者比专利CN101862461.B公开的透明质酸为载体的造影剂HA-DTPA-Gd具有更好的淋巴结驻留能力。另外，PM-M-GdNDTPA的载药量在只有PM-GdNDTPA1/2-1/3水平下仍保持了同PM-GdNDTPA相近的淋巴结强化率及强化时间，表明甘露糖基修饰的聚甘露糖醛酸具有优异的淋巴靶向性。
本发明所述的以褐藻多糖为载体的大分子MR造影剂表现出显著的淋巴滞留水平差异，原因可能为淋巴组织中的甘露糖受体(MBP)对聚甘露糖醛酸(PM)和甘露糖配体的识别及结合力不同。这一结果符合本论文基于MBP结合策略合成主动靶向性造影剂的设计初衷。综上，本发明所制备核磁共振造影剂具有更强的淋巴组织驻留能力和更长时间、更清晰的淋巴组织显影，对淋巴系统疾病的检查、诊断方面有着巨大的临床应用潜力。

Claims (10)

1.一种褐藻多糖为载体的淋巴靶向性磁共振造影剂，其具有以下结构：以褐藻多糖为载体，其6位羧基通过烷基、芳基或杂环基团为连接臂，分别与甘露糖受体MBP识别基团配体A以及顺磁性金属螯合物配体B结合，具有以下通式：
其中：n1是整数、n2和n3是正整数；X为O、N或S；linker为烷基、芳香基或杂环基；配体A为甘露糖受体MBP识别基团；配体B为顺磁性金属螯合物。
2.根据权利要求1所述的褐藻多糖为载体的淋巴靶向性磁共振造影剂，其特征在于，所述的配体A的摩尔含量占所述的褐藻多糖原有羧基的0-40％，配体B的摩尔含量占所述的褐藻多糖原有羧基的1-60％，其中配体A的摩尔含量，配体B的摩尔含量以及褐藻多糖原有羧基中未反应羧基的摩尔含量总和为100％。
3.根据权利要求1所述的褐藻多糖为载体的淋巴靶向性磁共振造影剂，其特征在于，所述的褐藻多糖载体为聚甘露糖醛酸PM或聚古罗糖醛酸PG，并包括其相应的羧酸盐形式，分子量为100-108Da。
4.根据权利要求1所述的褐藻多糖为载体的淋巴靶向性磁共振造影剂，其特征在于，与多糖6位羧基通过酰胺键结合的Linker为原子数目1到20的烷基、芳香基或杂环基结构，再与甘露糖受体MBP识别基团配体A或者顺磁性金属螯合物配体B结合。
5.根据权利要求1所述的褐藻多糖为载体的淋巴靶向性磁共振造影剂，其特征在于，所述褐藻多糖的糖醛酸环羧基还以酰胺键连接有甘露糖受体MBP识别基团配体A，为α或β构型的甘露糖及其衍生物，具体结构如下：
其中R可以为烃基、羧基、氨基、羟基、卤素。
6.根据权利要求1所述的褐藻多糖为载体的淋巴靶向性磁共振造影剂，其特征在于，所述顺磁性金属螯合物配体B由金属螯合剂与顺磁性金属离子螯合而成，金属螯合剂为含氨基的金属螯合剂，结构如下：
或金属螯合剂为不含氨基的金属螯合剂，结构如下：
所用顺磁性金属离子为Gd、Mn、Cr、Fe、Co、Ni、La、Tc、Dy或Cu的二价或三价离子。
7.一种制备褐藻多糖为载体的淋巴靶向性显影剂的方法，其特征在于，它包括以下步骤：
第一步：将褐藻多糖和酰化试剂溶解于溶剂中，随后加入甘露糖或加入甘露糖衍生物搅拌反应1-24h，反应完毕，淬灭反应，溶液经透析袋透析，除去小分子杂质，使用冷冻干燥法处理得到中间体，甘露糖或甘露糖衍生物、酰化试剂、褐藻多糖所有羧基三者的投料摩尔比值为0-0.999：0.001-1：1；
第二步：将上步所述中间体和酰化试剂溶解于去离子水中，加入带氨基基团的金属螯合剂搅拌反应1-24h，反应完毕淬灭反应，淬灭反应，向其加入金属离子的水溶液，经透析、冷冻干燥处理后得到最终产品，所述金属螯合剂、酰化试剂、金属离子与褐藻多糖所有羧基的投料摩尔比值为0.001-100：0.001-100：0.001-100：1。
8.根据权利要求7所述的制备褐藻多糖为载体的淋巴靶向性显影剂的方法，其特征在于，两步酰化反应的溶剂为水或DMSO、DMF极性非质子溶剂，反应温度在0至150℃之间。
9.一种制备褐藻多糖为载体的淋巴靶向性显影剂的方法，其特征在于，以采取以下步骤：
第一步：将褐藻多糖和酰化试剂溶解于溶剂中，随后依次加入烷基二胺类化合物、甘露糖或甘露糖衍生物搅拌反应1-24h，反应完毕，淬灭反应，溶液经透析后使用冷冻干燥法处理制得中间体，所述甘露糖或甘露糖衍生物、烷基二胺类化合物、酰化试剂与褐藻多糖所有羧基的投料摩尔比值为0.001-0.999：0.001-100：0.001-100：1；
第二步：将所述中间体和酰化试剂再次溶解于溶剂中，加入金属螯合剂搅拌反应1-24h；反应完毕，淬灭反应，向其加入金属离子的水溶液，经透析、冷冻干燥后得到最终产品，金属螯合剂、酰化试剂、金属离子与褐藻多糖所有羧基的投料摩尔比值为0.001-100：0.001-100：0.001-100：1。
10.权利要求1中所述的造影剂用于制备诊断淋巴系统疾病的试剂中的应用。
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