CN105311008B - 硬脂酰氨基酸或其药用盐的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种硬脂酰氨基酸或其可药用盐在制备减肥药物中的用途，所述硬脂酰氨基酸具有下述式(Ⅰ)所示的结构式，其中，R₁表示H或可以被一个或多个取代基取代的芳香基或C_1‑4的直链或带有支链的烷基，所述取代基为醇羟基或酚羟基；R₂表示C_11‑25的饱和或不饱和脂肪烃基。本发明还公开了包含硬脂酰氨基酸或其可药用盐的药物组合物。本发明的硬脂酰氨基酸或其药用盐，经临床前药动学实验证实，不仅能显著降低肥胖小鼠体重，而且安全性高，有望成为临床减肥药物，应用前景广阔。

Description

硬脂酰氨基酸或其药用盐的用途

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种硬脂酰氨基酸或其药用盐的新用途。

背景技术

肥胖是引起糖尿病，心脑血管疾病及非酒精性脂肪肝等疾病的首要原因。全球成人肥胖率显示逐年急剧升高的趋势，2013年达22％。尽管食欲抑制剂西布曲明、利莫那班等能有效降低体重，但抑郁等副作用最终导致这两种减肥药撤市。而FDA批准的减肥药Orlistat在四期临床监控中也发现罕见的肝损伤病例。由于肥胖症病因复杂，因此，理想的减肥药物应具有良好的安全性，并能够通过调节体内多条相关代谢通路，促进脂肪分解，抑制脂肪吸收及合成。目前，国内外对于肥胖治疗药物的研究主要集中于发现促进β-氧化(脂肪分解代谢的主要途径)的天然产物，但此类天然产物在肥胖动物模型上往往无法获得期望的疗效，同时，其安全性评估结果也限制了此类药物的发展。因此，发现作用机制新颖的减肥药物不仅有重大的社会需求，也具有重要的理论意义。

本实验室研发的N-硬脂酰氨基酸(如N-硬脂酰酪氨酸，NsTyr)或其可药用盐(如N-硬脂酰酪氨酸二钾盐，NST-2K)是内源性大麻素(anandamide，AEA)的新型类似物，它通过干预内源性大麻素系统(ECS)的代谢环节发挥神经保护作用。

以往对硬脂酰氨基酸及其盐的研究聚焦于该化合物的神经保护作用，至今尚无关于硬脂酰氨基酸或其药用盐用作减肥药物的公开报道。

发明内容

本发明要解决目前缺乏安全有效减肥药的技术问题，提供一种硬脂酰氨基酸或其药用盐在制备减肥药物中的用途。

为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现:

在本发明的一个方面，提供了一种硬脂酰氨基酸或其可药用盐在制备减肥药物中的用途，所述硬脂酰氨基酸具有下述式(Ⅰ)所示的结构式：

其中，R₁表示H或可以被一个或多个取代基取代的芳香基或C_1-4的直链或带有支链的烷基，所述取代基为醇羟基或酚羟基；R₂表示C_11-25的饱和或不饱和脂肪烃基。

上述C_1-4的烷基是指具有1～4个碳原子的直链或支链烷基，例如：甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基。优选具有1～2个碳原子的烷基。

上述C_11-25的脂肪烃基是指具有11～25个碳原子的饱和或不饱和脂肪烃基，其中，饱和脂肪烃基是指直链或带有支链的烷基、环烷基，如十二烷基、十八烷基、环十二烷基、环十八烷基等，而不饱和脂肪烃基是指链烯基、炔基或链二烯基，链烯基如1-十二烯基、2-十二烯基，炔基如1-十八炔基、2-十八炔基，链二烯基如1，3-十八烯基、7，9-十八烯基等。优选具有17～25个碳原子的直链或支链烷基，特别优选具有17个碳原子的直链烷基。

优选的，所述硬脂酰氨基酸为下述式(Ⅱ)结构式的N-硬脂酰酪氨酸：

优选的，所述硬脂酰氨基酸盐具有下述式(Ⅲ)或式(Ⅳ)的结构式：

其中，式(Ⅲ)中的M为一价金属阳离子或NH₄ ⁺，式(Ⅳ)中的M为二价金属阳离子。

优选的，所述式(Ⅲ)中的M选自K⁺、Na⁺、或NH₄ ⁺。

优选的，所述式(Ⅳ)中的M选自Ba²⁺、Ca²⁺、或Mg²⁺。

在本发明的另一方面，还提供了一种用于减肥的药物组合物，所述组合物包含安全有效量的硬脂酰氨基酸或其可药用盐、和药学上可接受的载体。

上述可接受的载体是无毒的、能辅助施用并且对硬脂酰氨基酸或其可药用盐的治疗效果无不利影响。此类载体可以是本领域的技术人员通常能得到的任何固体赋形剂、液体赋形剂、半固体赋形剂或者在气雾剂组合物中可以是气体赋形剂。固体药物赋形剂包括淀粉、纤维素、滑石、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、稻米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸镁、硬脂酸钠、甘油硬脂酰酯、氯化钠、无水脱脂乳等。液体和半固体赋形剂可以选自甘油、丙二醇、水、乙醇和各种油，包括那些源于石油、动物、植物或人工合成的油，例如，花生油、豆油、矿物油、芝麻油等、优选的液体载体，特别是用于可注射溶液的，包括水、盐水、葡萄糖水溶液和甘醇。另外还可以在组合物中加入其它辅剂如香味剂、甜味剂等。

本发明的硬脂酰氨基酸或其可药用盐以治疗上的有效量施用，其施用方式可以是口服、全身施用(例如，透过皮肤的、鼻吸入的或者用栓剂)或肠胃外施用(例如，肌肉内、静脉内或皮下)。优选的施用方式是口服，它可根据疾病程度调节。

本发明的硬脂酰氨基酸或其可药用盐的实际施用量(即活性组分)依赖于许多因素，如待治疗疾病的严重性、治疗对象的年龄和相对健康程度、所使用的化合物的效能、施用途径和形式，以及其他因素。

本发明药物组合物的各种剂型可以按照药学领域的常规方法制备。例如使该硬脂酰氨基酸盐(活性成分)与一种或者多种载体混合，然后将其制成所需的剂型，如片剂、药丸、胶囊、半固体、粉末、缓释剂型、溶液、混悬液、配剂、气雾剂等等。

在本发明的另一方面，还提供了硬脂酰氨基酸或其可药用盐在制备治疗脂肪肝药物中的用途。

本发明的硬脂酰氨基酸或其药用盐，当在临床前药动学实验中口服施用于KM小鼠，结果显示，该硬脂酰氨基酸或其药用盐不仅能显著降低肥胖小鼠体重，而且安全性高，有望成为临床减肥药物，应用前景非常广阔。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

图1是本发明实施例1的饮食干预11周期间各组小鼠体重变化图；

图2是本发明实施例1的饮食干预11周期间各组小鼠平均食物摄入量柱状图；

图3是本发明实施例2的给药处理4周期间各组小鼠体重变化图；

图4是本发明实施例2的给药处理4周期间各组小鼠平均食物摄入量柱状图；

图5是本发明实施例3的小鼠腹腔脂肪照片图；

图6是本发明实施例4的附睾脂肪组织切片H&E染色显微照片(比例尺＝100μm)图；

图7是本发明实施例4的附睾组织脂肪细胞大小柱状图；

图8是本发明实施例4的肝脏组织切片H&E染色显微照片(比例尺＝50μm)图；

图9是本发明实施例5的平衡溶解度曲线及表观脂水分配系数曲线图；

图10是本发明实施例5的大鼠经口服灌胃NST-2K、NsTyr后的血药浓度-时间曲线图。

图3～8中，ND,标准饲料空白对照组；HFDⅠ,高脂饲料空白对照组；HFDⅡ,低剂量NST-2K组(20mg/kg/day)；HFDⅢ,中剂量NST-2K组(60mg/kg/day)；HFDⅣ,高剂量NST-2K组(100mg/kg/day)；HFDⅤ,阳性对照组(Orlistat100mg/kg/day)。

具体实施方式

实施例1肥胖小鼠模型的建立

1.目的：建立用于测试硬脂酰氨基酸或其药用盐减肥活性的肥胖小鼠模型。

2.方法：60只C57BL/6小鼠(3周龄，雄性，～8.3g)以12％kcal标准饲料适应性喂养一周后，随机分为6组，各组10只。一组(ND)继续以标准饲料喂养，其余五组(HFDⅠ～Ⅴ)以45％kcal高脂饲料喂养。每周记录各组平均体重及食物摄入量直至两种饲料组之间体重具有显著性差异，同时五组高脂饲料组之间体重无显著性差异，并维持该稳定状态3周，可认为建模成功。

整个实验过程小鼠饲养于以下环境中：温度23±3℃，湿度50±5％，明暗交替周期12h/12h，整个过程小鼠自由进食饮水。

3.结果：

1)如图1所示，以不同饲料喂养至第9周(图1中横坐标为10的位置，因为横坐标0～1阶段为适应性喂养阶段，此阶段六个组均以标准饲料喂养，从横坐标1以后的阶段才使用不同饲料喂养)，五组高脂饲料组(HFDⅠ～Ⅴ)小鼠体重显著高于标准饲料组(ND)，且五组高脂饲料组(HFDⅠ～Ⅴ)之间，小鼠体重无显著性差异。上述体重差异状态持续3周后，肥胖模型建立成功(不同饲料喂养11周)，此时标准饲料组(ND)平均体重约为28.3g，五组高脂饲料组(HFDⅠ～Ⅴ)平均体重约为32.8g。在图1中，所有数值以均数±标准误的形式表示，n＝10，不同字母表示两者间具有显著性差异(P<0.05)。

2)如图2所示，饮食干预的11周期间(即不同饲料喂养期间)，标准饲料组(ND)小鼠日平均摄食量显著高于各高脂饲料组(HFDⅠ～Ⅴ)，但各高脂饲料组之间(HFDⅠ～Ⅴ)小鼠日平均摄食量无显著性差异。在图2中，所有数值以均数±标准误的形式表示，n＝10，***表示与ND比较具有显著性差异(P<0.001)。

4.结论：小鼠肥胖模型建立成功，且建模阶段，高脂饲料各组(HFDⅠ～Ⅴ)之间小鼠食欲类似。

实施例2给药实验

1.目的：观察N-硬脂酰氨基酸盐(本实施例以N-硬脂酰酪氨酸二钾盐，NST-2K为例)给药后对肥胖小鼠体重的影响，并与阳性药Orlistat对照比较。

2.方法：ND及HFDⅠ分别作为标准饲料及高脂饲料空白对照组，给予0.5％羧甲基纤维素钠水溶液(5ml/kg/day)；HFDⅡ～Ⅳ作为受试组，给予NST-2K(20、60、100mg/kg/day)；HFDⅤ作为阳性对照组，给予Orlistat(100mg/kg/day)。所有药物均溶于0.5％羧甲基纤维素钠水溶液后灌胃给药。给药持续4周，每周记录各组平均体重及食物摄入量直至给药阶段结束。

3.结果：

1)如图3所示，给药阶段，给药肥胖组HFDⅡ、HFDⅢ及HFDⅤ体重增加比空白肥胖HFDⅠ慢，但整个给药阶段结束时，这四组小鼠之间体重仍无显著性差异；给药肥胖组HFDⅣ随着给药时间延长，体重呈下降趋势，且整个给药阶段结束时，体重显著低于HFDⅠ。图3中，所有数值以均数±标准误的形式表示，n＝10，不同字母表示两者间具有显著性差异(P<0.05)。

2)如图4所示，给药处理4周期间，标准饲料组(ND)小鼠日平均摄食量显著高于各高脂饲料组(HFDⅠ～Ⅴ)，但各高脂饲料组之间(HFDⅠ～Ⅴ)小鼠日平均摄食量无显著性差异。图4中，所有数值以均数±标准误的形式表示，n＝10，^***表示与ND比较具有显著性差异(P<0.001)。

4.结论：

1)由图3可知，低、中剂量NST-2K(20、60mg/kg/day)及阳性药Orlistat(100mg/kg/day)能够抑制肥胖小鼠体重增加，高剂量NST-2K(100mg/kg/day)能够降低肥胖小鼠体重。在同等剂量下(100mg/kg/day)，NST-2K减肥活性显著优于Orlistat。

2)由图4可知，给药阶段，高脂饲料各组(HFDⅠ～Ⅴ)之间小鼠食欲类似，表明NST-2K及Orlistat均非通过抑制食欲发挥减肥作用。

实施例3实验动物脂肪及肝脏组织的收集与观察

1.目的：观察各组小鼠腹腔脂肪含量，并分离肝脏及脂肪组织，用于后续H&E染色观察。

2.方法：给药结束后，小鼠隔夜禁食，打开腹腔，观察各组小鼠腹腔脂肪含量，分离附睾脂肪，肾周脂肪及肝脏，并称重。

3.结果：

1)如图5所示，标准饲料组小鼠(ND)体型及腹腔脂肪垫明显小于各高脂饲料组(HFDⅠ～Ⅴ)，随着NST-2K给药剂量增加(HFDⅡ～Ⅳ)，腹腔脂肪垫与空白肥胖组(HFDⅠ)比较显示缩小的趋势，其中HFDⅣ(高剂量NST-2K组)效果最为明显，优于HFDⅤ(Orlistat组)。

2)如表1所示，各高脂饲料组间(HFDⅠ～Ⅴ)肝脏百分质量无显著性差异，但显著低于标准饲料组(ND)；HFDⅢ、HFDⅣ、HFDⅤ附睾及肾周脂肪百分质量显著低于空白肥胖组(HFDⅠ)；HFDⅡ(低剂量NST-2K组)与HFDⅠ比较，附睾及肾周脂肪百分质量无显著差异。

表1小鼠肝脏及脂肪组织百分质量^[a]

[a]所有数值以均数±标准误的形式表示，n＝10。^**、^***分别表示与ND比较具有显著性差异(P<0.01，P<0.001)。^#、^##、^###P<0.001分别表示与HFDⅠ比较具有显著性差异(P<0.05，P<0.01，P<0.001)。ND,标准饲料空白对照组；HFDⅠ,高脂饲料空白对照组；HFDⅡ,低剂量NST-2K组(20mg/kg/day)；HFDⅢ,中剂量NST-2K组(60mg/kg/day)；HFDⅣ,高剂量NST-2K组(100mg/kg/day)；HFDⅤ,阳性对照组(Orlistat100mg/kg/day)。

4.结论：NST-2K能够降低肥胖小鼠腹腔脂肪质量，对肝脏质量无显著性影响。同等剂量下(100mg/kg)，NST-2K降低腹腔脂肪质量效果优于Orlistat。

实施例4H&E染色观察脂肪及肝脏组织形态

1.目的：显微观察脂肪及肝脏组织形态。

2.方法：附睾脂肪及肝脏以10％中性福尔马林溶液固定48小时，石蜡包埋后作5μm切片，苏木精-伊红染色(H&E染色)，光镜观察脂肪细胞大小，肝脏细胞结构及脂肪堆积。

3.结果：

1)如图6，图7所示，HFDⅠ脂肪细胞显著大于ND，而给药组HFDⅢ、HFDⅣ及HFDⅤ脂肪细胞与HFDⅠ比较，显著减小；低剂量NST-2K(HFDⅡ)处理无法显著减小脂肪细胞。图7中，所有数值以均数±标准误的形式表示，n＝10，^***表示与ND比较具有显著性差异(P<0.001)，^###表示与HFDⅠ比较具有显著性差异(P<0.001)。

2)如图8所示，HFDⅠ肝脏组织具有严重的脂肪堆积现象，NST-2K或Orlistat给药处理后，随着给药剂量增加，肝脏脂肪堆积呈现缓解趋势。

4.结论：NST-2K能够缩小肥胖小鼠脂肪细胞大小，缓解肥胖小鼠肝脏脂肪性变化。

实施例5N-硬脂酰氨基酸盐理化常数与药动学参数的测试实验

1.平衡溶解度与表观脂水分配系数

采用摇瓶法测定37℃时NsTyr(N-硬脂酰酪氨酸)、NST-2K(N-硬脂酰酪氨酸二钾盐)、NST-2Na(N-硬脂酰酪氨酸二钠盐)水中平衡溶解度。NsTyr溶解度低于100μg/100ml水，NST-2K、NST-2Na溶解度分别为513.704μg/100ml水，926.551μg/100ml水；NST-2K、NST-2Na的表观脂水分配系数logp分别为1.512、1.477。不同pH下NST-2K、NST-2Na的平衡溶解度测试数据见表2、表观脂水分配系数见表3。平衡溶解度曲线及表观脂水分配系数曲线如图9所示。

表2NST-2K、NST-2Na在不同pH的缓冲液中的平衡溶解度

pH值	NST-2K(mg/L)	NST-2Na(mg/L)
			2.0	49.290	66.938
3.0	58.504	66.334
			4.0	188.155	195.371
5.0	220.693	232.102
			6.0	243.482	274.629
7.0	251.430	318.016
			7.4	270.414	374.484
8.0	285.935	463.902
			9.0	369.807	512.644

表3NST-2K、NST-2Na在不同pH缓冲液中的表观脂水分配系数

pH值	NST-2K Ko/w	LogP	NST-2Na Ko/w	LogP
					2.0	76.020	1.881	49.913	1.698
3.0	30.571	1.485	28.980	1.462
					4.0	16.020	1.205	15.224	1.183
5.0	21.934	1.341	18.710	1.272
					6.0	28.935	1.461	19.963	1.300

7.0	37.855	1.578	31.436	1.497
					7.4	16.674	1.222	29.286	1.467
8.0	13.797	1.140	28.704	1.458
					9.0	13.140	1.119	21.872	1.340

由以上表2、表3的平衡溶解度与表观脂水分配系数的数据，以及图9可知，胃内低pH使大量NST-2K、NST-2Na被还原成原型药NsTyr存在，透过生物膜吸收发挥药效；进入肠段后，其平衡溶解度急剧增大，表观脂水分配系数骤降，药物主要以离子形式存在，难以透过生物膜吸收入血。较原型药NsTyr，NST-2K，NST-2Na溶解度均有提高。

2.吸收动力学数据

10只150-180g的SD大鼠随机分为2组，每组5只，雌雄兼用。灌胃给予200mg/kg的NsTyr与NST-2K生理盐水溶液后，平均血药浓度-时间曲线分别见图10。SD大鼠口服200mg/kg的NsTyr与NST-2K后的代谢动力学参数见表4。

表4大鼠口服200mg/kg NsTyr与NST-2K后的代谢动力学参数

参数	NsTyr	NST-2K
			AUClast(h*μg/ml)	0.13	3.49
AUCinf(h*μg/ml)	0.14	3.69
			MRTlast(h)	1.38	2.19
T1/2(h)	1.49	2.90
			Tmax(h)	0.75	0.60
Cmax(μg/ml)	0.11	2.40

通过比较两者代谢动力学参数，NST-2K相比NsTyr曲线下面积AUC增大了30倍，相对生物利用度显著提高，半衰期明显延长(近两倍)；峰浓度Cmax的大幅提升(约20倍)和达峰时间Tmax的锐减，提示NST-2K在体内吸收速率大，可适当减少给药剂量，有利于降低毒副反应发生几率，增大治疗窗口和安全系数。制备剂型上，受溶解度限制NsTyr可制成混悬液形式；溶解度高的盐类NST-2K、NST-2Na可制备成均质溶液。

以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (5)

1.式(Ⅱ)所示N-硬脂酰酪氨酸或其可药用盐在制备减肥药物中的用途

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述N-硬脂酰酪氨酸的可药用盐具有下述式(Ⅲ)或式(Ⅳ)的结构式：

其中，式(Ⅲ)中的M为一价金属阳离子或NH₄ ⁺，式(Ⅳ)中的M为二价金属阳离子。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述式(Ⅲ)中的M选自K⁺、Na⁺或NH₄ ⁺。

4.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述式(Ⅳ)中的M选自Ba²⁺、Ca²⁺或Mg²⁺。

5.式(Ⅱ)所示N-硬脂酰酪氨酸或其可药用盐在制备治疗脂肪肝药物中的用途