CN105259005A - 丹酰肼及其衍生物在糖蛋白特异性荧光预染检测法中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及糖蛋白特异性荧光预染检测法，具体地说是丹酰肼及其衍生物在糖蛋白特异性荧光预染检测法中的应用。本发明还提供了应用丹酰肼进行糖蛋白特异性荧光预染检测的方法，包括步骤：向蛋白质样品中加入高碘酸溶液进行氧化；加入抗坏血酸溶液中和过量高碘酸溶液；加入染料反应；加入上样缓冲液；电泳；观察。本预染发明具有灵敏度高、选择性好、操作简单迅速、重现性好、线性关系好、质谱兼容性好、使用安全、成本低廉等优点。此外相对于凝胶电泳后糖蛋白染色方法，预染检测法在电泳结束后即可观察，节省了凝胶电泳后染色步骤，可较好地适用于高通量蛋白质组学的研究。
Description
技术领域
本发明涉及糖蛋白特异性荧光预染检测技术，具体地说是丹酰肼及其衍生物在糖蛋白特异性荧光预染检测法中的应用。
背景技术
蛋白质糖基化修饰在生命科学研究领域具有至关重要的作用，作为最主要和普遍的蛋白质翻译后修饰之一，目前已知哺乳动物蛋白质中至少有二分之一发生了糖基化，这些糖蛋白广泛分布于组织、细胞、体液中，特别是在细胞膜表面、体液等中含量丰富，糖基化对于蛋白质的折叠、运输和定位等都起着重要作用，并参与受体激活、信号转导、细胞载附等诸多重要的生物过程。糖蛋白数量变化或糖链结构的改变，都可能导致疾病发生。不但目前已知的很多疾病的诊断标志物是糖蛋白，而且通过国际标准认证的药物中，糖蛋白也占到较高的比例。
分离纯化及鉴定是糖蛋白研究的重要步骤，是下一步结构分析得以实施的基础。目前凝胶上蛋白质染色主要分为预染及后染两类。前者在电泳前对样品进行处理，使染料特异性地与样品内糖蛋白相结合，经电泳分离之后即可在相应激发波长下进行观察，后染主要对电泳后的蛋白凝胶进行特异性染色。
目前糖蛋白检测领域试剂盒主要集中于后染，且多数产品均以高附加值的价格在市场销售，价格高昂，不利于生物技术基础研究的发展。尤其国内利用现有的生物试剂进行生物实验成本居高不下，无法实现经济效益与实验共同发展。糖蛋白特异性荧光预染检测技术鲜有报道。本发明开发的丹酰肼及其衍生物荧光预染检测方法灵敏度接近Pro-QEmerald488染色法，是一种灵敏、便捷、特异的糖蛋白荧光预染检测技术，有较好的基础与临床意义。
发明内容
本发明的目的在于提供丹酰肼及其衍生物在糖蛋白特异性荧光预染检测中的应用。
本发明所述的丹酰肼相关化合物是指以丹酰肼阴离子为母核的钠盐、钾盐和铵盐等。
丹酰肼母核为：
为了实现本发明的目的，本发明还提供了应用丹酰肼进行糖蛋白特异性荧光预染检测的方法包括如下步骤：
1)在1-20μL含0.5-10μg蛋白样品(不足1-20μL用重蒸水补足)中加入0.005-0.05M高碘酸水溶液1-20μL，置于避光处进行氧化反应5-30min；优选的样品体积为10μL，优选的高碘酸摩尔浓为0.03M，体积为10μL，优选的反应时间是10min；
2)在反应液中加入0.1-0.3M抗坏血酸1-10μL，摇匀反应0.5-5min；优选的抗坏血酸摩尔浓度是0.24M，体积为5μL，优选的反应时间是1min；
3)在反应液中加入丹酰肼或其衍生物按重量体积比1-5％二甲基亚砜溶液1-5μL，37℃环境下反应10-50min；优选的丹酰肼或其衍生物溶液为含重量体积是2％，体积为2.5μL，优选的反应时间是30min；
4)在反应液中加入10-50μL3X蛋白质上样缓冲液，摇匀；优选的体积为30μL；
5)电泳，观察。
前期研究表明该技术有如下优点：
1)灵敏度高：丹酰肼糖蛋白特异性荧光预染检测法灵敏度同Pro-QEmerald488灵敏度相当；
2)操作简单迅速：省去后染必需的固定等操作步骤，可在40min内完成；电泳结束后即可观察；
3)重现性好：受温度、摇床摆动频率等外部条件影响较小；
4)可逆性好：容易脱色；
5)质谱兼容性好：由于丹酰肼荧光预染检测法不影响蛋白质结构，所以可与MALDI-TOF等质谱仪高度兼容；
6)使用安全：采用毒性低的染料，提高实验操作的安全性，对环境污染小；
7)成本低。
附图说明
图1.丹酰肼的化学结构；
图2中(A-D)为在一向SDS-PAGE胶上，不同方法对Sigma公司的八种不同标准蛋白质样品选择性及灵敏度比较。(A)丹酰肼糖蛋白荧光预染检测法，(B)丹酰肼糖蛋白荧光预染检测法检测后用SYPRORuby全蛋白荧光染色法检测，(C)Pro-QEmerald糖蛋白荧光染色法，(D)Pro-QEmerald糖蛋白荧光染色法后用SYPRORuby全蛋白荧光染色法检测。带1，1000ng；带2，500ng；带3，250ng；带4，125ng；带5，64ng；带6，32ng；带7，16ng；带8，8ng；带9，4ng；带10，2ng。Pro-QEmerald糖蛋白荧光染色法、SYPRORuby全蛋白荧光染色法均按照文献记载操作；图中名称用斜体字表示为糖基化蛋白质。
(E-H)在一向SDS-PAGE胶上，不同方法对提取的人血清样品选择性及灵敏度比较。(E)丹酰肼糖蛋白荧光预染检测法，(F)丹酰肼糖蛋白荧光预染检测法检测后用SYPRORuby全蛋白荧光染色法检测，(G)Pro-QEmerald糖蛋白荧光染色法，(H)Pro-QEmerald糖蛋白荧光染色法后用SYPRORuby全蛋白荧光染色法检测。带1，5000ng；带2，2500ng；带3，1250ng；带4，625ng；带5，320ng；带6，160ng；带7，80ng；带8，40ng；带9，20ng；带10，10ng。Pro-QEmerald糖蛋白荧光染色法、SYPRORuby全蛋白荧光染色法均按照文献记载操作。
图3.二向SDS-PAGE胶上，(A)丹酰肼糖蛋白荧光预染检测法，(B)丹酰肼糖蛋白荧光预染检测法检测后用SYPRORuby全蛋白荧光染色法检测，(C)Pro-QEmerald糖蛋白荧光染色法，(D)Pro-QEmerald糖蛋白荧光染色法后用SYPRORuby全蛋白荧光染色法检测。分离样品为人血清总蛋白；IPG胶条长13厘米，pH4-7；分离胶的浓度为11.4％；样品上样量为25μg/胶条。
图4.比较在一向SDS-PAGE胶上，不同方法对去糖基化样品选择性，样品为用PNGaseF去除N-链糖后的人血清总蛋白。带TP，人血清总蛋白；带DP，去N-链糖后人血清总蛋白；Pre-S组为丹酰肼糖蛋白荧光预染检测法，Pre-S+SR组为丹酰肼糖蛋白荧光预染检测法检测后用SYPRORuby全蛋白荧光染色法检测，Pro-Q组为Pro-QEmerald糖蛋白荧光染色法，Pro-Q+SR组为Pro-QEmerald糖蛋白荧光染色法后用SYPRORuby全蛋白荧光染色法检测。
图5.在一向SDS-PAGE胶上，不同方法对富集后糖基化蛋白选择性比较，样品为使用糖基化富集试剂盒从人血清总蛋白中富集出的糖蛋白。带TP，未富集的人血清总蛋白；带ConAEnrichedGlycoproteins，使用糖基化富集试剂盒从人血清总蛋白中富集出的糖蛋白；SR组为SYPRORuby全蛋白荧光检测法，Pre-S组为丹酰肼糖蛋白荧光预染检测法，Pre-S+SR组为丹酰肼糖蛋白荧光预染检测法检测后用SYPRORuby全蛋白荧光染色法检测，Pro-Q组为Pro-QEmerald糖蛋白荧光染色法，Pro-Q+SR组为Pro-QEmerald糖蛋白荧光染色法后用SYPRORuby全蛋白荧光染色法检测。
具体实施方式
下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不能限制本发明的保护范围。
实施例1丹酰肼糖蛋白特异性荧光预染检测法
图1是丹酰肼的化学结构式。
图2-5是丹酰肼糖蛋白特异性荧光预染检测法数据图。
实验采用下述步骤进行：
1)在10μL含0.5-10μg蛋白样品(不足10μL用重蒸水补足)中加入0.03M高碘酸水溶液10μL，置于避光处进行氧化反应10min；
2)在反应液中加入0.24M抗坏血酸5μL，摇匀反应1min；
3)在反应液中加入2％丹酰肼或其衍生物2.5μL，37℃环境下反应30min；
4)在反应液中加入30μL3X上样缓冲液，摇匀；
5)电泳，观察。
按照上述方法分别用丹酰肼的钠盐、钾盐、铵盐进行糖蛋白预染，结果表明用这些衍生物均能够得到类似于丹酰肼的检测结果。
图2是说明丹酰肼糖蛋白特异性荧光预染检测法与其它染色法效果对比。
按照实施例1的方法，采用不同染色方法进行染色，
图2中(A-D)在一向SDS-PAGE胶上，不同方法对Sigma公司的八种不同标准蛋白质样品选择性及灵敏度比较。(A)丹酰肼糖蛋白荧光预染检测法，(B)丹酰肼糖蛋白荧光预染检测法检测后用SYPRORuby全蛋白荧光染色法检测，(C)Pro-QEmerald糖蛋白荧光染色法，(D)Pro-QEmerald糖蛋白荧光染色法后用SYPRORuby全蛋白荧光染色法检测。带1，1000ng；带2，500ng；带3，250ng；带4，125ng；带5，64ng；带6，32ng；带7，16ng；带8，8ng；带9，4ng；带10，2ng。Pro-QEmerald糖蛋白荧光染色法、SYPRORuby全蛋白荧光染色法均按照文献记载操作；图中名称用斜体字表示为糖基化蛋白质。
(E-H)为在一向SDS-PAGE胶上，不同方法对提取的人血清样品选择性及灵敏度比较。(E)丹酰肼糖蛋白荧光预染检测法，(F)丹酰肼糖蛋白荧光预染检测法检测后用SYPRORuby全蛋白荧光染色法检测，(G)Pro-QEmerald糖蛋白荧光染色法，(H)Pro-QEmerald糖蛋白荧光染色法后用SYPRORuby全蛋白荧光染色法检测。带1，5000ng；带2，2500ng；带3，1250ng；带4，625ng；带5，320ng；带6，160ng；带7，80ng；带8，40ng；带9，20ng；带10，10ng。Pro-QEmerald糖蛋白荧光染色法、SYPRORuby全蛋白荧光染色法均按照文献记载操作。
丹酰肼糖蛋白荧光预染检测法检测灵敏度接近Pro-QEmerald488糖蛋白荧光染色法。在选择性方面，仅糖基化蛋白(名称用斜体字表示)能被丹酰肼预染检测法及Pro-QEmerald488检测，SYPRORuby全蛋白荧光染色法则能检测凝胶上所有类型蛋白。
图3是说明丹酰肼糖蛋白荧光预染检测法结合二向电泳技术对糖基化蛋白进行特异性检测。
将人血清总蛋白经二向凝胶电泳分离后，分别采用实验例1的(A)丹酰肼糖蛋白荧光预染检测法，(B)丹酰肼糖蛋白荧光预染检测法检测后用SYPRORuby全蛋白荧光染色法检测，(C)Pro-QEmerald糖蛋白荧光染色法，(D)Pro-QEmerald糖蛋白荧光染色法后用SYPRORuby全蛋白荧光染色法检测进行染色，结果如图3所示。显示丹酰肼糖蛋白荧光预染检测法能在二向凝胶电泳技术基础上对糖基化蛋白进行特异性检测。
图4是说明在一向SDS-PAGE胶上，不同方法对去糖基化样品选择性，样品为用PNGaseF去除N-链糖后的人血清总蛋白。带TP，人血清总蛋白；带DP，去N-链糖后人血清总蛋白；Pre-S组为丹酰肼糖蛋白荧光预染检测法，Pre-S+SR组为丹酰肼糖蛋白荧光预染检测法检测后用SYPRORuby全蛋白荧光染色法检测，Pro-Q组为Pro-QEmerald糖蛋白荧光染色法，Pro-Q+SR组为Pro-QEmerald糖蛋白荧光染色法后用SYPRORuby全蛋白荧光染色法检测。结果如图4所示。去除N-链糖后的标准蛋白人血清总蛋白可被SYPRORuby全蛋白荧光染色法检测，但几乎不能被丹酰肼糖蛋白荧光染色法及Pro-QEmerald糖蛋白荧光染色法识别。进一步说明丹酰肼糖蛋白荧光染色法对糖蛋白检测具有高度特异性。
图5是在一向SDS-PAGE胶上，不同方法对富集后糖基化蛋白选择性比较，样品为使用糖基化富集试剂盒从人血清总蛋白中富集出的糖蛋白。带TP，未富集的人血清总蛋白；带ConAEnrichedGlycoproteins，使用糖基化富集试剂盒从人血清总蛋白中富集出的糖蛋白；SR组为SYPRORuby全蛋白荧光检测法，Pre-S组为丹酰肼糖蛋白荧光预染检测法，Pre-S+SR组为丹酰肼糖蛋白荧光预染检测法检测后用SYPRORuby全蛋白荧光染色法检测，Pro-Q组为Pro-QEmerald糖蛋白荧光染色法，Pro-Q+SR组为Pro-QEmerald糖蛋白荧光染色法后用SYPRORuby全蛋白荧光染色法检测。
图2-5中的参考染色方法及其相关文献
Pro-QEmerald488糖蛋白染色法操作方法参见文献：CourtenayHart.，BirteSchulenberg.，ThomasH.Steinberg.，Wai-YeeLeung.，WayneF.Patton，R.(2003)DetectionofglycoproteinsinpolyacrylamidegelsandonelectroblotsusingPro-QEmerald488dye，afluorescentperiodateSchiff-basestain.Electrophoresis24，588-598。
SYPRORuby荧光染色法操作方法参见文献：Malone，J.，Radabaugh，M.，Leimgruber，R.，Gerstenecker，G.(2001)Practicalaspectsoffluorescentstainingforproteomicapplication.Electrophoresis22，919-932.
Claims (9)
1.丹酰肼及其衍生物在糖蛋白特异性荧光预染检测法中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述的丹酰肼及其衍生物为丹酰肼的钠盐、钾盐或铵盐。
3.一种凝胶上糖蛋白特异性荧光预染检测法，其包括步骤：
1)在1-20μL含0.5-10μg蛋白样品(不足1-20μL用重蒸水补足)中加入0.005-0.05M高碘酸水溶液1-20μL，置于避光处进行氧化反应5-30min；
2)在反应液中加入0.1-0.3M抗坏血酸1-10μL，摇匀反应0.5-5min；
3)在反应液中加入丹酰肼或其衍生物按体积比1-5％二甲基亚砜溶液1-5μL，37℃环境下反应10-50min；
4)在反应液中加入10-50μL3X蛋白质上样缓冲液，摇匀；
5)电泳，观察。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤1)中蛋白样品体积为10μL；所加高碘酸水溶液体积为10μL，摩尔浓度为0.03M，避光反应。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤2)中所加抗坏血酸溶液体积为5μL，摩尔浓度为0.24M。
6.如权利要求3～5任一项所述的方法，其特征在于，步骤3)所加丹酰肼或其衍生物溶液为按体积比2％的二甲基亚砜溶液2.5μL，37℃环境下反应30min。
7.如权利要求3～5任一项所述的方法，其特征在于，步骤4)向反应液中加入30μL3X蛋白质上样缓冲液。
8.如权利要求3～5任一项所述的方法，其特征在于，步骤1)氧化时间为10min；步骤2)反应时间为1min；步骤3)反应时间为30min。
9.如权利要求3～5任一项所述的方法，其特征在于，步骤5)可在激光扫描仪下观察染色后的糖蛋白。
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| CN201410350554.4A CN105259005A (zh) | 2014-07-16 | 2014-07-16 | 丹酰肼及其衍生物在糖蛋白特异性荧光预染检测法中的应用 |
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Citations (2)
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| CN1902487A (zh) * | 2003-12-09 | 2007-01-24 | 株式会社资生堂 | 以头发中的氧化蛋白质为指标的头发损伤评价方法 |
| EP2518495A2 (en) * | 2006-08-09 | 2012-10-31 | Sumitomo Bakelite Company, Ltd. | Sugar chain-capturing substance and use thereof |
-
2014
- 2014-07-16 CN CN201410350554.4A patent/CN105259005A/zh active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1902487A (zh) * | 2003-12-09 | 2007-01-24 | 株式会社资生堂 | 以头发中的氧化蛋白质为指标的头发损伤评价方法 |
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