CN105229160B

CN105229160B - 工程化的抗-TGF-β抗体及抗原结合片段

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Publication number: CN105229160B
Application number: CN201480026283.5A
Authority: CN
Inventors: R·魏; A·莫林; M·马蒂厄; C·潘; S·帕克; H·邱
Original assignee: Genzyme Corp
Current assignee: Genzyme Corp
Priority date: 2013-03-11
Filing date: 2014-03-11
Publication date: 2020-06-23
Anticipated expiration: 2034-03-11
Also published as: US20170342144A1; BR112015021595A2; TR201901415T4; RU2681502C2; WO2014164709A2; US20160017026A1; EP2971048B1; TW201803592A; PL2971048T3; CY1121412T1; ES2845215T3; KR102258457B1; ES2713505T3; SG10201707021RA; RU2015143156A; JP6495884B2; EP3415633A1; EP3415633B1; EP2971048A2; AU2014249051B2

Abstract

将抗体或其抗原结合片段进行工程化，以结合转化生长因子‑β(TGFβ)。相比于人TGFβ2以及人TGFβ3，TGFβ同种型选择性抗体或其抗原结合片段可选择性地结合人TGFβ1，或相比于人TGFβ1以及人TGFβ2，该TGFβ同种型选择性抗体或其抗原结合片段可以选择性地结合人TGFβ3。通过与TGFβ2结合的GC1008的重组Fab片段的共结晶结构以及通过与TGFβ1结合的GC1008的scFv形式的另一共结晶结构有助于设计该抗体或其抗原结合片段。

Description

工程化的抗-TGF-β抗体及抗原结合片段

序列表

本申请包含序列表，其已通过ASCII格式电子提交，并在此通过提述以其整体并入。所述ASCII副本创建于2014年3月7日，标题为209262-0001-00-WO-(509735)_SL.txt，并且其大小为10,335字节。

技术领域

将抗体或其抗原结合片段进行工程化，以结合转化生长因子-β(TGFβ)。本发明提供了包含抗体或其片段的组合物和将其用于TGFβ活性相关的疾病治疗的方法。

背景技术

许多严重的疾病与TGFβ引起的信号传导途径功能异常有关。据信，TGFβ组织水平的增加是例如特发性肺纤维化和心肌纤维化形成的一个因素。此外，TGFβ局部组织水平高可使得一些类型的癌细胞得以维持与进展。因此，下调TGFβ信号传导可以降低此类肿瘤细胞的存活率。

TGFβ同种型是具有类似结构框架的～25kDa同型二聚体分子，其中两个单体经二硫桥而共价连结。哺乳动物同种型共有70-82％的序列同一性，但在血管发育以及调节免疫细胞功能方面具有不重叠的活性。人体内存在有三种TGFβ同种型：TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3(Swiss Prot登录号分别为P01137、P08112、和P10600)。TGFβ1与TGFβ3在结合至两个跨膜受体(已知为I型与II型TGFβ受体)的胞外结构域时引起细胞信号传导级联。TGFβ2结合也被认为涉及I型与II型TGFβ受体，以及III型TGFβ受体。

已生产出可结合人TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3的抗体分子(例如Genzyme的美国专利No.7,723,486)。例如，Grütter等(2008)Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 105(51):20251-56公开了GC1008，这是一种在临床发展中用于治疗恶性疾病和纤维化疾病的人IgG4单克隆抗体(Mab)。因为GC1008能中和所有三种人TGFβ同种型，故其为一种“泛-特异性(pan-specific)”的TGFβ中和抗体。GC1008以相似的亲和力结合至人TGFβ1、TGFβ2以及TGFβ3。GC1008所识别的TGFβ表位与I型和II型TGFβ受体的TGFβ结合位点相重叠，这被认为是GC1008中和能力的基础。Grütter等公开了在

的分辨率下GC1008Fab片段与TGFβ3复合的三维结构。由TGFβ3同型二聚体组成的复合体两侧为两个GC1008Fab片段。亦参见互联网上proteopedia.org/wiki/index.php/3eo0处的Proteopedia条目3eo0，“Structure oftheTransforming Growth Factor-Beta Neutralizing Antibody GC-1008(2012年10月20日最后修改)”；以及在互联网上proteopedia.org/wiki/index.php/3eo1处的Proteopedia条目3eo1，“Structure of the Fab Fragment of GC-1008in Complexwith TransformingGrowth Factor-Beta 3(2012年10月20B最后修改)”。

发明概述

本发明公开了TGFβ结合抗体或其抗原结合片段。TGFβ结合抗体或其抗原结合片段可以对所有TGFβ同种型(TGFβ1、TGFβ2与TGFβ3)都具有泛-特异性。此类抗体或其抗原结合片段可中和所有TGFβ同种型。或者或另外，相比于人TGFβ2和TGFβ3，TGFβ结合抗体或其抗原结合片段可选择性地结合人TGFβ1，或相比于人TGFβ1和TGFβ2其选择性地结合人TGFβ3。TGFβ同种型特异性拮抗剂可能展现出较低的潜在副怍用。通过与TGFβ2结合的GC1008单克隆抗体的重组Fab片段(在本文为GC1008(Fab))的共结晶结构，以及通过与TGFβ1结合的GC1008的scFv形式(在此处已知为GC1009或GC1009(scFv))的另一个共结晶结构有助于设计所述抗体或其抗原结合片段。

分离抗体或其抗原结合片段可包含具有TGFβ互补位与非互补位残基的PET1073G12可变重链(VH)域(SEQ ID NO:1)，以及具有TGFβ1互补位与非互补位残基的PET1073G12可变轻链(VL)域(SEQ IDNO:2)的变体，

其中所述VH域包含多至20个互补位残基取代以及多至20个非互补位残基取代；

其中所述VL域包含多至20个互补位残基取代以及多至20个非互补位残基取代；以及

其中所述抗体或其抗原结合片段能够结合人TGFβ(TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3)。

所述抗体或其抗原结合片段能够结合人TGFβ的所有三种同种型，包括人TGFβ1、人TGFβ2和人TGFβ3。所述抗体或其抗原结合片段以比GC1008(Fab)或GC1009(scFv)高2倍、2.4倍、3倍、5倍、10倍或更高的亲和力结合人TGFβ的所有三种同种型。所述抗体或其抗原结合片段可包含Y27、S30、S31、N32、I52、I54、V55、D56、N59、E74和/或G101残基的取代。Y27可用Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Trp取代。S30可用Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、Tyr或Trp取代。S31可用Ala、Glu、Gly、His、Lys、Leu、Pro、Gln、Arg、Thr、Val或Trp取代。N32可用Ala、Asp、Glu、Gly、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代。I52可用Val取代。I54可用Ala、Phe、His、Leu、Met、Pro、Thr、Val或Trp取代。V55可用Phe或Gly取代。D56可用Cys、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Gln、Arg、Ser、Tyr或Val取代。N59可用Arg或Tyr取代。E74可用Ala、Cys、Asp、Phe、Gly、His、Leu、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Trp或Tyr取代。G101可用Tyr取代。VH域和/或VL域可包含多至19个互补位残基取代。优选地，VH域和/或VL域可包含多至互补位残基取代。互补位取代可选自表5中所示取代。VH域和/或VL域可包含多至18个非互补位残基取代。优选地，VH域和/或VL域可包含多至12个非互补位残基取代。

或者，相比于人TGFβ2和人TGFβ3，所述抗体或其抗原结合片段能够选择性地结合人TGFβ1。所述抗体或其抗原结合片段可选择性地以比GC1008(Fab)或GC1009(scFv)高2倍、2.4倍、3倍、5倍、10倍或更高的亲和力结合TGFβ1。VH域和/或VL域可包含多至20个互补位残基取代，优选为多至19个互补位残基取代，以及更优选为多至12个互补位残基取代。互补位取代可选自表5中所示取代。VH域和/或VL域可包含多至20个非互补位残基取代，优选为多至18个非互补位残基取代，以及更优选为多至12个非互补位残基取代。

或者，相比于人TGFβ1和人TGFβ2，所述抗体或其抗原结合片段能够选择性地结合人TGFβ3。所述抗体或其抗原结合片段可选择性地以比GC1008(Fab)或GC1009(scFv)高2倍、2.4倍、3倍、5倍、10倍或更高的亲和力结合TGFβ3。VH域和/或VL域可包含多至20个互补位残基取代，优选为多至19个互补位残基取代，以及更优选为多至12个互补位残基取代。互补位取代可选自表5中所示取代。VH域和/或VL域可包含多至20个非互补位残基取代，优选为多至18个非互补位残基取代，以及更优选为多至12个非互补位残基取代。

在上述任一情况中，所述抗体可以是IgG1、IgG2，或IgG4抗体，例如GC1008单克隆抗体的变体。其抗原结合片段可以是scFv，例如GC1009(scFv)的变体，或例如双-scFv。或者，所述VH域可进一步包含人重链恒定域(例如IgG1、IgG2，或IgG4恒定域)，而所述VL域可进一步包含人轻链恒定域(例如κ轻链恒定域)。重链恒定域可具有SEQ ID NO:3中所示序列，而轻链恒定域可具有SEQ ID NO:4中所示序列。此实施方案中的抗原结合片段可以是Fab、Fab′或F(ab′)2，例如GC1008(Fab)的变体。

分离核酸可包含编码抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列。所述分离核酸可以是cDNA。宿主细胞可以包含所述分离核酸。制造所述抗体或其抗原结合片段的方法可包括在适于生产该抗体或其抗原结合片段的条件下培养所述宿主细胞。可以对通过此方法所生产的抗体或其抗原结合片段进行纯化。

组合物可包含上述抗体或其抗原结合片段之一。组合物可以是药物组合物。所述药物组合物可包含治疗有效量的抗体或其抗原结合片段。组合物还可以包含一或多种生物活性化合物。

在人体内治疗直接或间接由TGFβ活性所致疾病或病况的方法，其可包括施用包含治疗有效量的抗体或其抗原结合片段的药物组合物。所述疾病或病况可选自纤维化疾病、癌症或免疫介导的疾病。抗体或其抗原结合片段可用于制造用于治疗选自纤维化疾病、癌症或免疫介导疾病的疾病或病况的药物。对所述疾病或病况的治疗可包括中和TGFβ1、TGFβ2和/或TGFβ3。对所述疾病或病况的治疗可包括抑制TGFβ1、TGFβ2和/或TGFβ3信号传导。对所述疾病或病况的治疗可包括抑制TGFβ1介导的、TGFβ2介导的和/或TGFβ3介导的纤维连接蛋白生成、血管内皮生长因子(VEGF)生成、上皮细胞增殖、内皮细胞增殖、平滑肌细胞增殖或免疫抑制。对所述疾病或病况的治疗可包括增加天然杀伤细胞活性。

附图简述

图1描述GC1008(Fab)与人TGFβ2(SEQ ID NO:6)的共结晶结构。

图2描述GC1009(scFv)与人TGFβ1(SEQ ID NO:5)的共结晶结构。

图3描述GC1009(scFv)VH域(SEQ ID NO:1)与人TGFβ1(SEQ ID NO:5)的一部分共结晶结构。

图4描述GC1008(Fab)VH域(SEQ ID NO:1)与人TGFβ3(SEQ ID NO:7)的一部分共结晶结构。

图5描述GC1008(Fab)与人TGFβ的一部分共结晶结构。显示出表7关于重链(SEQ IDNO:1)的残基Y27、S30、S31、N32、I52、P53、I54、V55、D56、N59、E74、G101、V103与L104以及轻链(SEQ ID NO:2)的残基A93的热图分析。

发明详述

本发明的TGFβ结合抗体或其抗原结合片段是包含GC1008抗体的经修饰VH域的变体，其中所述变体包含VH和/或VL域(分别为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2)的氨基酸取代。例如，TGFβ抗体或其抗原结合片段可包含具有氨基酸取代的VH域，所述氨基酸取代赋予了对人TGFβ(TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3)的结合，所述结合与GC1008抗体所观察到的是相当的或提高的。TGFβ同种型选择性抗体或其抗原结合片段相比于人TGFβ2和TGFβ3可选择性地结合TGFβ1，或它们相比于人TGFβ1和人TGFβ2可选择性地结合人TGFβ3。选择性结合可以通过将包含VH域(SEQ ID NO:1)的抗体或其抗原结合片段的一或多个氨基酸进行取代而实现。

“选择性结合”意为抗体或其抗原结合片段(i)可以比包含GC1008抗体的未经修饰VH域的抗体或其抗原结合片段更高的亲和力结合人TGFβ的特定同种型，和/或(ii)可以比包含GC1008抗体的未经修饰VH域的抗体或其抗原结合片段更低的亲和力结合其他TGFβ同种型。例如，选择性结合TGFβ1同种型的抗体或其抗原结合片段可以比GC1008(Fab)或GC1009(scFv)更高(例如2倍、3倍、5倍、10倍高或更高)的亲和力结合TGFβ1。或者或另外，所述抗体或其抗原结合片段可以比GC1008(Fab)或GC1009(scFv)更低(例如2倍、3倍、5倍、10倍低或更低)的亲和力结合TGFβ2与TGFβ3。

如本文所用，第一要素“和/或”第二要素表示分别对第一或第二要素的具体公开，或是对第一要素与第二要素的组合的具体公开。除非上下文另有明确指明，否则单数形式“一”、”一种”与“所述”包括复数指代对象。

抗体或其抗原结合片段

包含GC1008抗体的经修饰VH域的抗体或其抗原结合片段包括但不限于完整抗体(例如IgG，如IgG1、IgG2或IgG4)，或其抗原结合片段(例如F(ab′)₂、scFv、Fab或dAb多肽)。单价抗原结合片段可以包括Fab、Fv、scFv、和di-scFv，其是两个scFv分子通过肽接头连接而成。抗原结合片段可以是多价的，例如针对TGFβ和其他抗原。多价片段包括F(ab′)₂和di-scFv，其中两个scFv组分由针对各自的抗原的不同的可变域组成。例如，本发明的抗体或其抗原结合片段可以是经修饰的GC1008(完整人IgG4抗体)、GC1008(Fab)(GC1008的Fab片段)或GC1009(scFv)(GC1008的scFv形式)。GC1009(scFv)是重组产生的抗原结合片段，其包含通过肽接头连接的人重链PET1073G12VH域(SEQ ID NO:1)和人轻链PET1073G12VL域(SEQID NO:2)，所述肽接头允许两个域相连至抗原结合位点中。GC1008和GC1009的进一步详细内容在美国专利No.7,723,486和Grütter(2008)中公开。GC1009(scFv)的氨基酸序列在下文中示出，其中(Gly₄/Ser)_n模块(SEQ ID NO:10)的肽接头用粗体和斜体显示，而信号肽则用灰色高亮显示。

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSSNVISWVRQAPGQGLEWMGGVIPIVDIANYAQRFKGRVTITADESTSTTYMELSSLRSEDTAVYYCASTLGLVLDAMDYWGQGTLVTVS

SALETVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSLGSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRAPGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYADSPITFGQGTRLEIKRHHHHHH(SEQ ID NO:9)。

“经修饰的”或“变体”可变域包含与参考序列相比的氨基酸取代。例如，“GC1008抗体的变体VH域”可以包含与PET1073G12VH域(其氨基酸序列如SEQ ID NO:1中所示)相比的氨基酸取代。

VH域和/或VL域可以包含多至20个互补位残基取代，优选为19个互补位残基取代，更优选为12个互补位残基取代。例如两个结构域的一个可包含互补位残基取代，而另一个结构域是未经修饰的，或者两个结构域可以都包含互补位残基取代。互补位取代可以选自表5中所示的取代。互补位取代可以引起经修饰的抗体或抗原结合片段选择性地结合TGFβ同种型，或所述取代可以保留抗体或抗原结合片段对TGFβ同种型的泛-特异性结合。两种类型的互补位取代都可以进行。例如，互补位取代可引起抗体或抗原结合片段选择性地结合TGFβ同种型，同时进行另一个保留泛-特异性结合的互补位取代以使该抗体或抗原结合片段去免疫化。去免疫化可根据例如Harding等(2010)mAbs 2:256-265的方法来进行。

或者或另外的，VH域和/或VL域可含有多至20个非互补位残基取代，优选为多至18个非互补位取代，以及更优选为多至12个非互补位取代。取代非互补位残基可以出于不同理由，例如增加抗原结合片段的热稳定性、去除对氧化或脱酰胺基化敏感的氨基酸残基、添加可易于缀合至药物或PEG分子的氨基酸，例如，或去除潜在的羧化位点。

修饰还可以包括氨基酸删除。例如，可以将一个或两个非互补位氨基酸从变体VH和/或VL域删除。删除的氨基酸可以来自VH和/或VL域的羧基端或氨基端。

本发明抗体或其抗原结合片段的可变域包含三个互补决定区(CDR)，其每一个的两侧为框架区(FW)。例如，VH域可包含一组三个重链CDR(HCDR1、HCDR2和HCDR3)。VL域可包含一组三个轻链CDR(LCDR1、LCDR2和LCDR3)。本文公开的一组HCDR可以提供于VH域中，所述VH域与VL域组合使用。VH域可随本文所公开的一组HCDR一起提供，并且如果此VH域与VL域配对，则VL域可随本文所公开的一组LCDR一起提供。免疫球蛋白可变域CDR和FW区的结构与位置在本文中可以通过参考Kabat等(1987)Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,4^th ed.,U.S.Department of Health and Human Services来确定。

本发明的抗体或其抗原结合片段含有“互补位”和“非互补位”氨基酸残基。本发明抗体或其抗原结合片段的“互补位”氨基酸具有在人TGFβ同种型的原子核的

内的原子核。因为每个人TGFβ同种型与本发明的抗体或其抗原结合片段形成的复合体结构各异，各个同种型的互补位残基可能不同。“TGFβ1互补位残基”例如具有在人TGFβ1的原子核的

内的原子核。表3显示本发明的抗体或其抗原结合片段对于人TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3同种型各自的互补位残基。“TGFβ互补位”残基具有在所有三种人TGFβ同种型的原子核的

内的原子核。

如Kabat命名法所定义的，将一个残基认定为互补位残基，与其在CDR或FW区内的位置无关。许多互补位残基位于CDR区内，例如表4中所示。但是，一些互补位残基位于FW区内。“非互补位”氨基酸是非“互补位”氨基酸的、抗体或其抗原结合片段的任意氨基酸，其与所述残基是否位于CDR或FW区内无关。

抗体或其抗原结合片段可包含选自不同人生殖系的重链与轻链氨基酸取代。例如，可以使用重组DNA技术将一组HCDR引入缺少CDR的可变域目本(repertoire)中。生殖系框架包括来自V_H-1家族的人DP-10(V_H 1-69)生殖系或人DP-88(V_H 1-e)的重链序列。轻链序列可以来自人Vκ3家族，例如人DPK-22(A27)。人生殖系可变域氨基酸序列通过例如VBASE2于vbase2.org/vbstat.php在互联网上公开。例如，一组HCDR和一组LCDR可以一起配对用于PET1073G12、PET1074B9或PET1287A10抗体。因此，该抗体可以是例如包含经修饰的PET1073G12VH域和/或PET1073G12VL域的IgG4抗体分子。包括了HCDR和LCDR组的PET1073G12、PET1074B9或PET1287A10域的氨基酸序列公开于美国专利No.7,723,486。

抗原结合片段还可以包含抗体恒定区或其部分。例如，VL域可以在其C端处附接至包含人C_κ或C_λ链的抗体轻链恒定域。同样地，包含VH域的抗体或其抗原结合片段还可以包含附接在其C端处的衍生自任意抗体同型(例如IgG、IgA、IgE、以及IgM)或任一同型亚类(尤其是IgGl、IgG2，或IgG4)的整个或部分免疫球蛋白重链(例如CH1域)。对于一些应用而言优选为IgG4，因为其不结合补体且不产生效应子功能。若需要效应子功能，则优选为IgG1。在所有情况下，抗体恒定区或其部分可以是人序列。

可以对抗体恒定区进行修饰以增进抗体或其抗原结合片段的各种特性。例如，可用重组氨基酸修饰来降低所表达的多肽的结构同质性。代表性的实例为Peters等(2012)J.Biol.Chem.287(29):24525-33，其公开了IgG4铰链区中的Cys取代为Ser，这降低了二硫键的异质性并提高了Fab结构域的热稳定性。类似地，Zhang等(2010)Anal.Chem.82:1090-99公开了在治疗应用中对IgG2铰链区进行工程化，以限制二硫键的乱序化(scrambling)和结构异构体的形成。对CH3结构域的氨基酸修饰还能用于删除羧基末端Lys残基，以减少电荷变体(charge variant)的数量。氨基酸修饰还可以用于改进重组抗体或其抗原结合片段的药理学功能。例如，当抗体或其抗原结合片段包含Fc区时，氨基酸修饰可以用于增加补体活化，通过增加FcγRIIIA结合或减少FcγRIIIB结合来增强抗体依赖性的细胞的细胞毒性作用(ADCC)，和/或通过增加FcRn结合来增加血清半衰期。此类氨基酸修饰在例如Beck等(2010)Nature 10:345-52中有评述。

如下的表1显示了未经修饰的PET1073G12VH域(SEQ ID NO:1)；CH1域(SEQ ID NO:3)；PET1073G12VL域(SEQ ID NO:2)；和Cκ域(SEQ ID NO:4)的氨基酸序列，其存在于GC1008(Fab)中。多种CDR和框架(FW)区是带标志的；CDR残基也是高亮显示的。

表1

抗体或其抗原结合片段可以是针对人TGFβ的单一特异性的，或者它们可以是双特异性的。双特异性抗体或其抗原结合片段可以通过多种方式来制造，例如Holliger等(1993)Current Opinion Biotechnol.4,446-449中所公开的。双特异性抗体的实例包括双重可变域IgG(DvD-IgG)技术或BiTE^TM技术的那些，其中可以使用具有不同特异性的两种抗体的结合结构域，并通过柔性短肽直接连接。

经重组修饰的VH和/或VL域

本发明抗体或其抗原结合片段的重链和/或轻链可变域可以经重组修饰，以从其生殖系序列改变氨基酸序列。例如，可以修饰重链CDR组中的一个或多个CDR，可以修饰轻链CDR组中的一个或多个CDR，和/或可以修饰VH和/或VL域中的框架区中的一个。可以对互补位氨基酸进行取代，例如增强或减弱对TGFβ同型体的结合亲和力的取代，或者它们可以使亲和力相对保持不变。还可以对非互补位氨基酸残基进行其他取代以赋予抗体或其抗原结合片段多种特性，例如提高稳定性或引入可共价修饰的结构域表面反应基团。因此，对于本发明抗体或其抗原结合片段的VH和/或VL域的如下四类氨基酸取代是本文预期内的：(1)赋予对人TGFβ同种型的选择性结合的取代；(2)维持对三种人TGFβ同种型的泛-特异性结合的取代；(3)对非互补位氨基酸的取代；和(4)多氨基酸取代。这几类氨基酸取代并不互斥。

1.赋予选择性结合的取代

TGFβ同种型选择性抗体或其抗原结合片段可以包含VH域(SEQ ID NO:1)内的氨基酸取代。例如，相比于人TGFβ2和人TGFβ3，所述抗体或其抗原结合片段可以选择性地结合人TGFβ1；或是相比于人TGFβ1和人TGFβ2，所述抗体或其抗原结合片段可以选择性地结合人TGFβ3。选择性结合可以通过取代一个或多个互补位氨基酸来实现。

通过与每个TGFβ同种型的共结晶结构，有助于预测氨基酸取代如何影响抗体或其抗原结合片段与TGFβ同种型相互作用的能力。GC1008(Fab)和TGFβ3的共结晶结构在Grütter(2008)中公开。GC1008(Fab)和TGFβ2的共结晶结构在图1中描述。GC1009(scFv)和TGFβ1的共结晶结构在图2中描述。

表2显示人TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3同种型的氨基酸序列。共结晶结构的比较显示出三个同种型之间的互补位差异。各个同种型中与GC1008相互作用的TGFβ残基在表2中用粗体表示。

表2

下文表3列出了VH域(SEQ ID NO:1)和VL域(SEQ ID NO:2)的互补位残基，如通过与各个人TGFβ同种型的共结晶结构所确定的。粗体显示的GC1008互补位残基在所有三种TGFβ同种型均共有。TGFβ表位的三个区域被命名为“顶部”、“疏水性碎片(hydrophobicpatch)”以及“螺旋三(helix three)”。具有在TGFβ的“疏水性碎片”内的原子核的

内的原子核的VH以及VL域残基在所有三个同种型是保守的，其具有序列L₂₈GWKW₃₂(SEQ ID NO:8)。然而，与“顶部”和“螺旋三”区相互作用的GC1008残基显示出更高的变异性。通过比较所有三种共结晶结构，很明显GC1008转换位向并调整CDR环位置与侧链构象以相似的亲和力容纳所有三个TGFβ同种型。参见图1与图2。例如，Grütter(2008)公开了GC1008在水貂肺上皮细胞(MLEC)增殖测定中对三种同种型展现出相似的亲和力：对TGFβ1、TGFβ2以及TGFβ3的IC₅₀值分别为1±2nM、14±5nM、和7±2nM。而三个TGFβ同种型的残基67和68在其与VH互补位残基Y27的相互作用方面是不同的。VH残基Y27与TGFβ1残基Q67和H68产生氢键相互作用。相比之下，VH残基Y27与TGFβ2和TGFβ3的T67和Y50形成疏水相互作用。这导致了与TGFβ2和TGFβ3复合体相比，TGFβ1复合体中HCDR1环发生重排。

表3

表3的信息在表4中重新转换格式，以表示VH和VL域的残基，其在共结晶中在TGFβ3的原子核的

内。互补位残基以粗体显示。大多数(但并非全部)互补位残基位于HCDR之内。

表4

共结晶结构的比较能指导对VH和/或VL域残基的取代，以改变GC1008对TGFβ同种型的亲和力。具体而言，氨基酸取代可以基于三个晶体结构中每个VH和/或VL残基的定位，并考虑到残基是否与抗原相互作用或是否涉及与其他CDR的相互作用或与稳定CDR环的结构元件的相互作用。例如，LCDR3上的I97在三种结构的任一种中不直接与TGFβ相互作用；然而，I97朝向抗体的内部，并且在同样由HCDR3的V103和L104组成的疏水口袋中。因为V103和L104是对于TGFβ结合重要的互补位，用中度或轻度疏水性的或弱极性的残基取代I97是可以接受的，并且不会显著改变针对TGFβ的亲和力(例如超过10倍)。

在表位序列中螺旋3区显示出最高的变异性。TGFβ1和TGFβ2的位置60处的赖氨酸和精氨酸引起GC1008轮流(rotation)结合至TGFβ1和TGFβ2(相比于TGFβ3)。TGFβ1在残基67和68处分别具有谷氨酰胺和组氨酸，而不是如TGFβ2和TGFβ3中的苏氨酸和异亮氨酸/亮氨酸(图3)。当S30突变为疏水性残基如A、W时，与保守的TGFβL64的额外的疏水相互作用是更为偏好的，并因此增加针对所有三种TGFβ的亲和力。这种亲和力增加对于TGFβ2和3而言更加显著，这是由于TGFβ2和TGFβ3中残基67和68处的上述苏氨酸和异亮氨酸/亮氨酸，其相对于TGFβ1的Q和H更为偏好疏水残基。在TGFβ1和TGFβ2中，位置60处的带正电荷的侧链与重链中的E74产生离子相互作用。用带正电的残基取代E74，这对于GC1008与TGFβ1的结合而言是偏好程度较低的，而对于TGFβ3(其在位置60处具有苏氨酸)而言则是更为偏好的(图4)。由于TGFβ3的T60侧链的尺寸较小，在重链上E74处的大多数突变都是可以接受的。由于T60的局部疏水特性，在E74处的疏水性取代也能大幅增加对TGFβ3的结合亲和力，这往往导致k_d ^var:k_d ^wt比率大于两倍的提高。

为了快速地筛选对特定TGFβ同种型具有较高亲和力或对某种同种型的选择性高于其他同种型的TGFβ抗体或其抗原结合片段，将表3中所列位置随机化成其他19种氨基酸。这可以用本领域已知技术(Bradbury等(2011)Nature Biotechnol.29(3):245–254)通过体外展示GC1009(scFv)、GC1008Fab片段或GC1008文库而实现。在没有分别复合至GC1009和GC1008Fab的TGFβ1与TGFβ2的结晶结构的情况下，仅对TGFβ3具有较高亲和力的抗体或抗原结合片段可以用这种体外展示技术来鉴定，所述体外展示技术是基于衍生自Grütter(2008)中公开的TGFβ3复合体结构的接触TGFβ3的氨基酸。随着我们确定了复合至GC1009和GC1008Fab结构的新的TGFβ1及TGFβ2，对TGFβ1和TGFβ2具有更高亲和力的抗体或其抗原结合片段也可以通过展示技术而快速地鉴定出来。此外，掌握了所有三种结构的信息，使人们生产能够更加专门的文库来鉴定同种型选择性变体。例如，针对TGFβ1的专门文库仅需要随机化VH域(SEQ ID NO:1)的位置27和30。通过噬菌体文库可以覆盖32²(1024)个可能的突变体，文库大小仅为～10⁵个种。(20种氨基酸可以由32个具有序列NNG/C的密码子所表示，其中在前两个位置是四种核酸任一种而在第三个位置为G或C)。在没有复合至GC1009/GC1008的TGFβ1和TGFβ2的结晶结构的情况下，人们必须将衍生自Grütter(2008)中公开TGFβ3复合体结构的全部14个接触TGFβ3的氨基酸进行随机化。具有32¹⁴(10²¹)的多样性的噬菌体文库即便在任何已知文库的最佳文库中(其呈现不超过约～10¹¹个种)中也无法完全展现。因此，本文提供的结构数据将允许快速筛选和鉴定TGFβ选择性拮抗剂。

2.维持泛-特异性结合的取代

可以进行那些不显著改变针对TGFβ同种型的结合亲和力的取代。不“显著改变”针对TGFβ同种型的结合亲和力的取代不会增加变体的解离速率(k_d ^var)相对野生型的解离速率(k_d ^wt)的比率超过2.4(即k_d ^var/k_d ^wt少于或等于2.4)。展现“泛-特异性结合”的抗体或其抗原结合片段就此目的来说可具有对TGFβ(TGFβ1、TGFβ2及TGFβ3)至少为10nM、30nM或100nM的表观结合常数。对TGFβ同种型的亲和力可以使用本领域任何适当技术来测量，例如Grütter(2008)中所公开的MLEC增殖测定或

3000(GE Healthcare)结合测定。展现出“泛-特异性结合”的抗体或其抗原结合片段就此目的来说可具有对TGFβ(TGFβ1、TGFβ2与TGFβ3)相对野生型少于或等于2.4倍、少于或等于3倍、少于或等于5倍或少于或等于10倍的表观结合亲和力(k_d ^var:k_d ^wt)，优选为相对野生型少于或等于2.4倍(k_d ^var:k_d ^wt)。可以通过GC1008/GC1009与三个TGFβ同种型之间的三种共结晶结构来指导这些取代。参见Oberlin等(2012)J.Chem.Inf.Model.52:2204-2214。

维持对TGFβ的泛-特异性结合的取代预期不会对TGFβ氨基酸残基产生空间位阻或对抗体或其抗原结合片段的稳定性具有显著的不利影响。对稳定性具有显著不利影响的取代能通过致使局部展开或错误折叠来促使抗体或其抗原结合片段聚集和失活。去稳定的、聚集的抗体或其抗原结合片段可能引起免疫原性，因为患者的免疫系统可能会将这些聚集物识别为外来分子。

维持泛-特异性结合的取代的一个实例是LCDR1上的R24。R24被定向远离TGFβ结合位点且暴露于VL域表面上。这个位置可容纳用最具极性的残基取代，除了Pro与Cys之外，它们一般来说是要避免的。另一方面，HCDR2上的I52与TGFβ上的“疏水性碎片”(L₂₈GWKW₃₂(SEQID NO:8))产生密切的疏水相互作用，所以将I52取代限制至中等尺寸的疏水性残基(具有Val取代的可行性)，而使用较大的疏水性残基取代可能会在结合复合体中产生空间位阻。

表5提供了SEQ ID NO:2的VL域(表5A)和SEQ ID NO:l的VH域(表5B)的氨基酸取代的非限制性实例。在一些情况下，可以在互补位内对框架残基进行氨基酸取代，例如FW2区中的VL残基Y50。带有一个或多个如下取代的抗体或抗原结合片段预计对TGFβ具有与GC1008/GC1009相似的泛-特异性和提高的亲和力，即结合所有这样的TGFβ同种型，所述同种型具有相对于野生型少于或等于2.4倍、少于或等于3倍、少于或等于5倍或少于或等于10倍的结合亲和力(k_d ^var:k_d ^wt)。

表5A

表5B

3.非互补位氨基酸残基的取代

可以非互补位氨基酸进行重组取代，以产生具有与生殖系可变域相比相似的或改变的特性的可变轻或重域。“经修饰的”可变域还包括氨基酸删除，以及取代。例如，可以从经修饰的可变域中删除N末端或C末端氨基酸残基。

例如，可以进行非互补位氨基酸的取代，以增加稳定性和/或减少聚集的趋势。例如，低稳定性能影响抗原结合片段在重组表达时适当折叠的能力，导致一部分被表达的片段变成无功能的。低稳定性抗体或其抗原结合片段也可以趋于形成潜在免疫原性的聚集物或是可具有受损的亲合力(avidity)或储存寿命。scFv多肽尤其可证明关于在细菌和哺乳动物表达系统中的稳定性、溶解性、表达、聚集、分解产物和总体可制造性的问题。例如，预期增加VH和/或VL域稳定性和/或减少VH和/或VL域聚集的趋势的框架氨基酸取代(例如在scFv多肽中)在WO 2007/109254中公开。预期本发明VH和VL域中相应的残基中的取代类似地增加稳定性和/或减少聚集的趋势。

可以允许的取代预计包括会用另一个人VH或VL域生殖系序列中出现的相应氨基酸来取代SEQ ID NO:1或2的非互补位氨基酸的那些。目前，本领域已知有约40个可变重生殖系序列，如约40个可变κ生殖系序列和约30个可变λ生殖系序列。用这些生殖系序列的任一个中出现的氨基酸来取代非互补位氨基酸，预期是可以接受的。例如，SEQ ID NO:1的VH域的残基能用任意VH生殖系序列中相应位置中出现的氨基酸来取代，所述VH生殖系序列例如来自DP-10(V_H1-69)或DP-88(V_H1-e)的生殖系序列。通过各种生殖系序列之间的序列比对来确定在这种情况下的相应位置，所述序列比对使用的是本领域所熟知的比对技术，例如ClustalW。

预期可接受的其他取代是那些对大部分侧链暴露于溶剂的氨基酸所进行的取代，如通过分析三种共结晶结构所决定的。残基的溶剂可接触表面积可以使用本领域已知的技术来估算。此外，若氨基酸的侧链不对邻近的残基产生空间位阻，则预期包埋在可变域内的氨基酸取代将会是更可以接受的。因此，通常将包埋的氨基酸取代为具有相似的或较小尺寸的侧链的氨基酸。例如，将包埋的Ile残基取代为Leu、Val、Ala或Gly预期是可按受的。可以通过分析三个共结晶结构来加以预测由于取代而产生的可能空间位阻。更多预期可接受的取代是在可变域内维持现有静电相互作用的那些，例如偶极-偶极交互作用、诱导偶极相互作用、氢键或离子键。

可变域的其他氨基酸取代包括预期赋予抗体或其抗原结合片段新的可用特性的那些。例如，可能移除VH和/或VL域中推定的N-糖基化位点以防止或降低N糖型(N-glycoform)的形成。氨基端残基可以用Gln残基来取代以产生焦谷氨酰化(pyroglutamylation)，其能降低电荷变体的数量。可以用氨基酸取代来降低等电点，这可以降低例如IgG多肽抗体的消除速率。

可变域的表面残基可使用Cys或Lys残基来取代，例如，Cys或Lys残基可以经共价修饰并偶联至赋予抗体或其抗原结合片段可用特性的分子(例如可检测标志物、毒素、标靶部分或蛋白质)。例如，Cys残基可以偶联至细胞毒性药物以形成药物缀合物。Cys残基也可以偶联至增加血清半衰期的分子，例如聚乙二醇(PEG)或血清白蛋白。例如，此类氨基酸修饰在Beck等(2010)Nature 10:345-52中有评述。

可检测标志物包括放射性标志物，如¹³¹I或⁹⁹Tc，可使用本领域已知方法将其附接至抗体或其抗原结合片段。标志物也包括酶标志物，如辣根过氧化物酶。标志物进一步包括化学部分，如生物素，其可以通过结合至特定的同源可检测部分(例如带标志物的亲和素)而被检测到。可以将有助于纯化的其他部分进行附接。例如，可以用已知的重组修饰和表达方法对抗体或其抗原结合片段进行His标记。

4.对可变域的多氨基酸取代

可以对抗体或其抗原结合片段进行多氨基酸取代。作为一般性法则，抗体或其抗原结合片段在至少数个随机选择的氨基酸取代之后预期会维持其稳定性及功能性。参见例如Wells,Biochemistry 29:8509-17(1990)。但是，随着更多取代被随机地引入可变域中，例如，该域的整体稳定性可能降低，其聚集趋势可能增加，其对TGFβ的亲和力可能降低，并且其可能的免疫原性可能会增加。因此，当进行多氨基酸取代时，优选的取代选自上文所述的那些，其预期能维持稳定性和功能性。经修饰可变域的功能性可以使用本领域已知的惯常方法来进行测试，包括但不限于Grütter(2008)中公开的MLEC增殖测定。

制造抗体与抗原结合片段的核酸和方法

本发明进一步的方面提供了编码本文所述抗体或其抗原结合片段的核酸。例如，分离核酸可以是合成的DNA、非天然存在的mRNA或cDNA。可以将核酸插入质粒、载体或转录或表达盒中。重组宿主细胞可包含一或多个上述构建体。“分离”核酸(或抗体或其抗原结合片段)移取自其天然环境，并且还基本是纯的，例如至少90％纯，或呈均质形式。

制备抗体或其抗原结合片段的方法包括在生产所述抗体或其抗原结合片段的条件下于宿主细胞中表达所述编码核酸，以及回收所述抗体或其抗原结合片段。回收抗体或其抗原结合片段的方法可包括分离和/或纯化抗体或其抗原结合片段。生产方法可包括将抗体或其抗原结合片段配制成包含至少一种额外组分(如药学上可接受的赋形剂)的组合物。

包含编码抗体或其抗原结合片段的核酸的合适载体可以是选中的或是构建的，其含有适当调控序列，所述调控序列包括启动子序列、终止子序列、聚腺苷酸化序列、增强子序列、标记基因以及视情况而定的其他序列。载体可以是例如质粒、噬菌体、噬菌粒、腺病毒、AAV、慢病毒。操作核酸的技术与实验方案(例如在制备核酸构建体、诱变、测序、将DNA引入细胞、以及基因表达中)是本领域已知的。

将此类核酸引入宿主细胞可以用本领域已知技术来完成。对于真核细胞而言，合适的技术可包括例如磷酸钙转染、DEAE-Dextran、电穿孔、脂质体介导的转染和使用逆转录病毒或其他病毒的转导。对于原核细胞而言，合适的技术可包括氯化钙转化、电穿孔和使用噬菌体的转染。引入之后可引起或允许核酸表达，例如通过在用于表达所述基因的条件下培养宿主细胞。在一个实施方案中，将本发明的核酸整合至宿主细胞的基因组(例如染色体)中。可以依据标准技术、通过包含促使与基因组重组的序列来促进整合。

用于在各种不同宿主细胞中克隆和表达多肽的系统是已知的。合适的宿主细胞包括细菌、哺乳动物细胞、植物细胞、昆虫细胞、真菌、酵母以及转基因植物和动物。本领域中可用于表达异源性多肽的哺乳动物细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾细胞、小鼠黑色素瘤细胞、大鼠骨髓瘤细胞、人胚肾细胞、人胚视网膜细胞，以及许多其他细胞。在原核细胞(如大肠杆菌)中对抗体及抗体片段的表达在本领域中已充分建立。综述参见例如Plückthun Bio/Technology 9:545-551(1991)。在培养的真核细胞中进行表达对于本领域技术人员来说也是可行的，例如在Andersen等(2002)Curr.Opin.Biotechnol.13:117-23中所评述的。

抗体或其抗原结合片段可以是糖基化的，不论其是天然糖基化的或者是表达宿主的选择，所述表达宿主例如CHO或NSO(ECACC 85110503)细胞；或者它们可以是未糖基化的，例如当其是通过在原核细胞中表达而生产的时。也可以有目的性地对糖基化进行改变，例如通过抑制岩藻糖基化从而增加所得抗体的ADCC活性。

使用抗体或其抗原结合片段的方法

本发明抗体或其抗原结合片段可用于治疗或诊断人或动物身体的方法中，如在人患者中治疗(其可包括预防性治疗)疾病或病症的方法，该方法包括向所述患者施用有效量。可治疗的病况包括任何其中TGFβ发挥作用的病况，例如纤维化疾病、癌症、免疫介导的疾病以及伤口愈合。

本发明抗体或其抗原结合片段可用于治疗直接或间接由TGFβ活性所致的疾病与病况。本发明抗体或其抗原结合片段可以在体外或体内选择性地抑制人TGFβ同种型的活性。TGFβ同种型的活性包括但不限于TGFβ介导的信号传导、细胞外基质(ECM)沉积、抑制上皮与内皮细胞增殖、促进平滑肌增殖、诱导III型胶原蛋白表达、诱导TGFβ、纤维连接蛋白、VEGF以及IL-11表达、结合隐性相关肽(Latency Associated Peptide)、肿瘤诱导的免疫抑制、促进血管生成、活化肌成纤维细胞、促进转移，和抑制NK细胞活性。例如，本发明抗体或其抗原结合片段可用于治疗局灶性节段性肾小球硬化(FSGS)、肝纤维化(HF)、急性心肌梗死(AMI)、特发性肺纤维化(IPF)、硬皮病(SSc)以及马方综合征。

所述抗体或其抗原结合片段可用于治疗疾病及病况，包括但不限于纤维化疾病(诸如血管球性肾炎、神经瘢痕、皮肤瘢痕、肺纤维化(pulmonary fibrosis)、肺部纤维化(lung fibrosis)、辐射诱导的纤维化、肝纤维化、骨髓纤维化)、烧伤、免疫介导的疾病、炎性疾病(包括类风湿性关节炎)、移植排斥、癌症、杜普伊特伦氏挛缩(Dupuytren’scontracture)，以及胃溃疡。它们可用于治疗、预防肾功能不全并降低其发生的风险，肾功能不全包括但不限于：(I型和II型)糖尿病肾病、辐射诱导的肾病、阻塞性肾病、弥漫性全身性硬化、肺纤维化、同种异体移植物排斥、遗传性肾病(例如多囊性肾病、髓质海绵肾、马蹄形肾)、肾小球性肾炎、肾硬化、肾钙沉着症、系统性红斑性狼疮、斯耶格伦氏综合征(Sjogren’s syndrome)、贝格尔氏病(Berger’s disease)、全身性或肾小球性高血压、肾小管间质性肾病、肾小管性酸中毒、肾结核以及肾梗死。具体而言，当与肾素-血管紧张素-醛固酮系统组合时，它们是有用的，所述肾素-血管紧张素-醛固酮系统包括但不限于：肾素抑制剂、血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂、Ang II受体拮抗剂(也称为“Ang II受体阻断剂”)，以及醛固酮拮抗剂。将抗体或其抗原结合片段与此类拮抗剂组合使用的方法如例如WO2004/098637中所示。

所述抗体或其抗原结合片段也可以用于治疗与ECM沉积有关的疾病和病况，包括全身性硬化、术后粘连、瘢痕瘤与肥厚性瘢痕、增生性玻璃体视网膜病变、青光眼引流手术、角膜损伤、白内障、佩罗尼氏病(Peyronie’s disease)、成人呼吸窘迫综合征、肝硬化、心肌梗死后瘢痕、血管成形术后再狭窄、蛛网膜下出血后瘢痕、多发性硬化、椎板切除术后纤维化、肌腱及其他修复后纤维化、因去除纹身所致的瘢痕、胆汁性肝硬化(包括硬化性胆管炎)、心包炎、胸膜炎、气管造口术、穿透性中枢神经系统损伤、嗜酸性粒细胞性肌痛综合征(eosinophilic myalgic syndrome)、血管再狭窄、静脉阻塞性疾病、胰脏炎和牛皮癣性关节病。

所述抗体或其抗原结合片段还可用于促进疾病和病况的上皮再形成，所述疾病和病况如静脉性溃疡、缺血性溃疡(褥疮)、糖尿病溃疡、移植部位、移植提供部位、擦伤与烧伤、支气管上皮疾病(如哮喘)、ARDS、小肠上皮疾病(如与细胞毒性治疗有关的黏膜炎)、食道溃疡(回流性疾病)、胃溃疡、小肠与大肠病损(炎症性肠病)。

所述抗体或其抗原结合片段还可用于促进内皮细胞增殖，例如稳定动脉粥样硬化斑、促进血管愈合，或抑制平滑肌细胞增殖，如在动脉疾病、再狭窄以及哮喘中。

所述抗体或其抗原结合片段可用于增强针对巨噬细胞介导的感染的免疫响应。它们还可用于降低例如由肿瘤、AIDS或肉芽肿性疾病所引起的免疫抑制。所述抗体或其抗原结合片段可用于治疗过度增生性疾病，如癌症包括但不限于乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、胃癌、肾癌、胰腺癌、结肠直肠癌、皮肤癌、肺癌、宫颈癌与膀胱癌、胶质瘤、间皮瘤，以及各种白血病与肉瘤(诸如卡波西氏肉瘤)，且可用于治疗或预防此类肿瘤的复发或转移。所述抗体或其抗原结合片段还可用于抑制环孢菌素介导的转移。

在癌症疗法的情况中，“治疗”包括任何这样的医学干涉，所述医学干涉导致肿瘤生长减缓或肿瘤转移降低以及癌症的部分缓解以延长患者的生存期。

治疗方法包括施用所述抗体或其抗原结合片段或含有所述抗体或其抗原结合片段的药物组合物。所述抗体或其抗原结合片段可用于制造用于施用的药物。例如，制造药物或药物组合物的方法包括将抗体或其抗原结合片段与药学上可的接受赋形剂配制在一起。组合物可以单独施用或与其他治疗组合施用(同时或是序贯施用，取决于要治疗的病况而定)。

优选的施用是以足够对患者显示出益处的“治疗有效量”施用。该益处可以是至少改善具体疾病或病况的至少一个症状。确切的施用量和施用速率和时间表将取决于要治疗的疾病或病况的性质和严重程度。治疗处方(例如决定的剂量等)可根据临床前和临床研究来决定，而临床前和临床研究的设计是在本领域技术人员能力范畴内的。

精确剂量将取决于一些因素，包括所述抗体或其抗原结合片段是用于诊断还是用于治疗、要治疗区域的大小和位置、抗体或其抗原结合片段的确切性质(例如完整抗体、Fab或scFv片段)，以及任何可检测标志物或附接至抗体或其抗原结合片段的其他分子的性质。例如，完整抗体的典型剂量可以在100μg至1gm的范围内供全身性施用，而1μg至1mg供局部施用。用于成年患者单次治疗的剂量可以按比例调整以供用于儿童与婴孩，并且还可针对其他抗体形式根据分子量和活性按比例来调整。按照临床医师的判断，可以每天、每周两次、每周、每月或按其他间隔来重复治疗。治疗可以是周期性的，并且施用之间的时段可以是约两周或更长，优选为约三周或更长，更优选为约四周或更长，或约每月一次。

每kg患者体重约0.1、0.3、1、3、10或15mg的剂量水平预期是有用且安全的。例如，大鼠和小鼠中对于急性情况来说0.5-5mg/kg是有效剂量。因此，就长期给药而言，基于预期21天的半衰期，可向人施用0.3-10mg/kg。剂量可以是足以产生效力的，而同时低至足够有助于最佳施用。例如，少于50mg的剂量有助于皮下施用。静脉内施用可用作为重病的递送途径，其中可能需要高剂量和长给药间隔。皮下注射可增加对产品的潜在免疫响应。针对局部性疾病的局部施用可能降低施用的产品的量并增加其在作用部位的浓度，这可以提高安全性。

抗体或其抗原结合片段可通过注射来施用，所述注射例如皮下、静脉内、腔内(例如在肿瘤切除后)、病灶内、腹膜内或肌内的。抗体或其抗原结合片段也可以通过吸入或局部(例如眼内、鼻内、直肠、至伤口内、皮肤上)或经口来递送。

抗体或其抗原结合片段通常会以药物组合物的形式施用，其除了抗体或其抗原结合片段以外还可包含至少一种组分。因此，药物组合物可包含药学上可接受的赋形剂、载剂、缓冲剂、稳定剂或其他本领域技术人员已知的材料。此类材料应该是无毒的且不应干扰活性成分的效力。此类材料可以包括，例如任意和所有的溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等张剂和吸收延迟剂。药学上可接受的载剂的一些实例是水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、右旋糖、甘油、乙醇等等，及其组合。在许多情况下，优选为组合物中包含等张剂，例如糖、多元醇(如甘露醇、山梨糖醇)或氯化钠。药学上可接受的物质的其他实例为润湿剂或辅助物质，如乳化剂、防腐剂或缓冲剂，其增加储存期限或有效性。

载剂或其他材料的确切性质取决于施用途径。对于静脉内注射或在罹病部位处的注射，活性成分会呈肠道外可接受的水溶液形式，其是无热原的且具有合适的pK、等张性和溶解性。本领域相关技术人员能够使用例如等张介质(如氯化钠注射剂、林格氏注射剂(Ringer’s injection)和乳酸林格氏注射剂(lactated Ringer’s injection))来制备合适的溶液。可以包含防腐剂、稳定剂、缓冲剂、抗氧化剂和/或其他添加剂。

抗体或其抗原结合片段可以配制为液体、半固体或固体形式，如液体溶液(例如可注射与可输注溶液)、分散液或悬浮液、粉剂、脂质体以及栓剂。优选的形式取决于所要的施用模式、治疗应用、分子的物理化学特性，以及递送路径。制剂可包含赋形剂或赋形剂的组合，例如：糖、氨基酸和表面活性剂。液体制剂可包括广泛范围的抗体浓度和pH。固体制剂可以通过冻干、喷雾干燥或通过例如超临界流体技术来干燥来制成。

治疗组合物可以配制成溶液、微乳液、分散液、脂质体，或其他适于高药物浓度的有序结构。可以通过将抗体或其抗原结合片段与上述列举成分之一或组合一起并入适当溶剂中，然后无菌过滤来制备无菌注射溶液。一般来说，分散液是通过将活性化合物并入含有基本分散介质和来自上文所列成分的其他成分的无菌介质中来制备的。对于用于制备无菌注射溶液的无菌粉剂而言，其优选的制备方法是真空干燥与冷冻干燥，其由预先经无菌过滤的溶液产生活性成分加其他所需成分的粉剂。例如，通过使用包衣(如卵磷脂)、通过维持分散液的颗粒尺寸，或通过使用表面活性剂可维持合适的溶液流动性。可以通过将延迟吸收的药剂(例如单硬脂酸盐与明胶)纳入组合物而带来注射组合物的延长吸收。

在一些实施方案中，活性化合物可以与保护抗体或其抗原结合片段对抗快速释放的载剂一起制备，如控释制剂，包括植入物、透皮贴片和微囊化投递系统。可使用生物可分解、生物相容的聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐类、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。用以制备此类制剂的许多方法已申请专利或为本领域技术人员所公知。

使用抗体或其抗原结合片段的方法可包括引起或允许其结合至TGFβ。这种结合可在体内发生(例如在对患者施用抗体或其抗原结合片段之后)，或是可在体外发生(例如在ELISA、Western印迹、免疫细胞化学、免疫沉淀、亲和力色谱或以基于细胞的测定中)，或在基于离体的治疗方法中(例如细胞或体液与抗体或其抗原结合片段离体接触并随后施用于患者的方法)。

提供了包含抗体或其抗原结合片段的试剂盒。所述抗体或其抗原结合片段可以是带标志物的，以允许在样品中确定其反应性。可在例如诊断分析中采用试剂盒。试剂盒可以含有使用所述组分的说明。可以将有助于或能够实行这种方法的辅助材料包含在所述试剂盒内。

样品中抗体或其抗原结合片段的反应性可以通过任何适当方法(例如放射性免疫测定法(RIA))来确定。放射性标记的抗原可以与未经标记的抗原(测试样品)混合并可以结合至抗体或其抗原结合片段。以物理方式将已结合的抗原与未结合的抗原分离并且测定结合至抗体或其抗原结合片段的放射性抗原的量。也可以使用竞争性结合分析，其采用非放射性抗原，使用连接至报告分子的抗原或类似物。报告分子可以是荧光染料、磷或染料。合适的荧光染料包括荧光素、罗丹明、藻红素和德克萨斯红。合适的发色染料包括二氨基联苯胺。

其他报告子包括大分子胶粒或颗粒物质，如乳胶珠粒，其为有色、磁性或偏磁性，并且是可直接或间接产生可检测信号的生物或化学活性剂，所述可检测信号能够视觉观察到、电子侦测到或以其他方式记录。例如，这些分子可以是催化显色或变色反应或引起电子特性改变的酶。它们可以是分子可激发的，从而使能态间的电子跃迁产生独特光谱吸收或发射。它们可包括用于与生物感应器连结的化学实体。可采用生物素/亲和素或生物素/链霉亲和素以及碱性磷酸酶检测系统。由抗体-报告子缀合物产生的信号可用来在样品中导出相关抗体结合的可量化的绝对或相对数据。

本发明还提供抗体或其抗原结合片段用于在竞争测定中测量抗原水平的用途。将报告分子连接至抗体或其抗原结合片段从而在结合时产生物理或光学变化是一个可行办法。报告分子可直接或间接产生可检测、且优选为可测量的信号。报告分子的连接可以是直接或间接地、共价地(例如经由肽键)或非共价地连接。抗体或其抗原结合分子与蛋白质报告子可以通过肽键连接和作为融合蛋白而重组表达。

对于本领域技术人员而言，本发明的更多方面和实施方案将因为包括下列实验范例的本公开内容而变得清楚。

实施例1

抗TGFβ单链Fv(scFv)可依据下列公开于美国专利No.7,723,486的实施例1中的非限制性实例来制备。可以使用诱变和/或组合的技术来增加对于TGFβ1、TGFβ2和/或TGFβ3的中和效力。具有对于TGFβ1、TGFβ2和/或TGFβ3的提高的效力的scFv可如美国专利No.7,723,486的实施例1中所述的选择和筛选噬菌体抗体库而生成。在MLEC增殖测定中，将那个实施例中所产生的scFv与美国专利No.7,723,486中公开的1D11.16来进行比对。

在美国专利No.7,723,486的实施例1中，在高效力TGFβ中和性的scFv群体中，发现特定生殖系具有高度代表性。这些是重链的DP-10/1-69和DP-88/1-e(均为VH1生殖系家族的成员)，以及轻链的DPK22/A27(V_κ3家族)。这些生殖系似乎提供特别适合高效力TGFβ泛-中和抗体的结构框架。PET1073G12、PET1074B9，和PET1287A10scFv在MLEC增殖测定中对所有三种TGFβ同种型都显示出接近或超过1D11.16的效力。

将PET1073G12、PET1074B9和PET1287A10VH与VL基因段的衍生氨基酸序列与VBASE数据库(Tomlinson,V-BASE sequence directory,MRC Centre for ProteinEngineering,Cambridge,UK,于超文本传送协议vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk(1997))中的已知人生殖系序列进行比对，并通过序列相似性来鉴定最为接近的人生殖系。对于PET1073G12与PET1074B9的VH基因段，最接近的人生殖系基因鉴定为DP-10/1-69(VH1生殖系家族)，而对于PET1287A10的VH基因段，最接近的人生殖系序列鉴定为DP-88/1-e(VH1生殖系家族)。对PET1073G12、PET1074B9和PET1287A10的VL基因段来说，最接近的人生殖系基因鉴别为DPK22/A27(V_κ3生殖系家族)。用定点诱变来将与生殖系有所不同的框架残基取代为生殖系残基，前提是此类改变在MLEC增殖测定中不使所得抗体对任何TGFβ同种型的效力损失超过三倍。若观察到这种效力损失，则在最终抗体内保留非生殖系框架氨基酸。

在生殖系化的(germlined)PET1073G12与生殖系化的PET1074B9中，除了VH中的两个残基以及VL中的一个残基以外，所有框架残基是生殖系。在美国专利No.7,723,486中，对于生殖系化的PET1073G12的氨基酸序列而言，其VH在SEQ ID NO:2中描述，其VL在SEQ IDNO:7中描述。在美国专利No.7,723,486中，对于生殖系化的PET1074B9的氨基酸序列而言，其VH在SEQ ID NO:12中描述，其VL在SEQ ID NO:17中描述。在生殖系化的PET1287A10中，所有VH和VL框架残基是生殖系。在美国专利No.7,723,486中，对于生殖化系的PET1287A10的氨基酸序列而言，其VH在SEQ ID NO:22中描述，其VL在SEQ ID NO:27中描述。

实施例2A

抗TGFβ抗体或其抗原结合片段的中和效力可以用美国专利No.7,723,486的实施例4中公开的TGFβ依赖性MLCE增殖测定法来进行测定。MLEC增殖测定法是基于Danielpour等,J.Cell.Physiol.,138:79-86(1989)所述测定的。这个测定是按照添加至水貂肺上皮细胞的TGFβ1、TGFβ2或TGFβ3抑制血清诱发的细胞增殖的原理来运作的。测试抗体对引起细胞增殖恢复的TGFβ1、TGFβ2或TGFβ3的中和。通过摄取[³H]-胸苷来对增殖进行测量。抗体效力定义为中和单一浓度的TGFβ1、TGFβ2或TGFβ3达到50％水平(IC₅₀)的抗体浓度(以nM计)。

MLEC增殖测定实验方案：由美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection)获得MLCE细胞系(Cat.#CCL-64)。细胞生长在含有10％胎牛血清(FBS)(Gibco)、1％盘尼西林/链霉素(Gibco)和1％MEM非必需氨基酸溶液(Gibco)的最低必需培养基(MEM,Gibco)中。使来自T-175烧瓶的汇聚细胞从烧瓶脱离、旋转下沉、洗涤并再悬浮于MLEC测定培养基中，所述MLEC测定培养基是由含有1％FBS、1％盘尼西林/链霉素和1％MEM非必需氨基酸溶液的MEM制成的。接着将小份试样的细胞用台盼蓝标记、在血球计数器上计数，并用测定培养基将细胞原液稀释至1.75×10⁵细胞/ml。将100μL的该悬浮液添加至组织培养平底96孔板的各个孔中，并温育3至5小时。

制备TGFβ/抗体溶液：在MLEC测定培养基中制备6ng/ml的TGFβ1、TGFβ2或TGFβ3的工作溶液(最终测定浓度的六倍)和最大测定终浓度的3倍的抗体(包括如1D11.16的对照)的工作溶液。这个测定中TGFβ的终浓度(1ng/ml或40pM)对应于诱发与无TGFβ对照相比细胞增殖的约80％抑制的浓度(即EC₈₀值)。

稀释平板设置：以3倍稀释步骤在MLEC测定培养基中对测试与对照抗体样品进行滴定，并在TGβ1、TGFβ2或TGFβ3存在或不存在的情况下进行温育。在每个实验中纳入所有相关对照：测试1D11.16和/或参考抗体(视情况而定)并进行TGFβ1、TGFβ2或TGFβ3滴定。将完成的平板留在经湿润的组织培养箱中1小时±15分钟。

向平板中的细胞添加TGFβ/抗体溶液：在适当温育时间之后，从稀释平板各孔将100μL被转移至平板中的MLEC并将平板放回培养箱历时44±2小时。将25μL的稀释于磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的10μCi/ml[³H]-胸苷添加至每个孔(0.25μCi/孔)。然后将平板放回培养箱中历时4小时±30分钟。

细胞收获：将100μL的胰蛋白酶-EDTA(0.25％，Gibco)添加至各孔，在培养箱中温育平板10分钟，并用Tomtec或Packard 96孔细胞收获器来收获细胞。

数据累积和分析：使用β-平板读取仪(TopCount，Packard)从收获的细胞读取数据。分析数据以获得IC₅₀和标准差值。使用Prism 2.0(GraphPad)软件来获得IC₅₀值。

结果：在MLEC增殖测定中与1D11.16一起测试了纯化的PET1073G12、PET1074B9和PET1287A10生殖系化的IgG4。如美国专利No.7,723,486的实施例3中所述制造IgG4。PET1073G12和PET1287A10IgG4的平均IC₅₀数据显示，这些抗体具有类似或接近于1D11.16对TGFβ1、TGFβ2与TGFβ3的效力。

平均IC₅₀数据提示，PET107489IgG4对TGFβ1作用更强，尽管在MLEC测定中并没有获得完整的剂量响应曲线。通过比较，1D11.16显示在91pM的浓度处对TGFβ1有12％中和，而PET1074B9在92pM的相似浓度处有78％中和。

实施例2B

此外，使用

3000(GE Healthcare)仪器测量GC1008抗体的TGFβ同种型结合亲和力。内部制造的TGFβ1和TGFβ2在10mM乙酸，pH 4.5中稀释成至～1μg/mL，而TGFβ3(R&D Systems)在10mM乙酸，pH 4.0中稀释至～2μg/mL。使用来自GE Healthcare的标准胺偶联试剂盒，将CM5传感器芯片的流动槽(Flowcell)2、3和4分别与50至100RU的TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3共价固定。流动槽1用作为对照表面。为了进行动力学结合分析，在HBS-EP缓冲液中将GC1008按1:3从33.3nM系列地稀释至1.2nM，并且以一式三重复的方式将其注射至所有四个流动槽中5min，然后在缓冲液中以30μL/min的流速解离5min。以75μL/min用两次30sec注射40mM HCI使表面再生。在用BIA评估软件套组(GE Healthcare)扣除缓冲液与对照流动槽折射率变化之后，使用1:1结合模型来拟合传感图(sensorgrams)。显示于表6中的K_D为多于25个独立分析的平均值。

表6

同种型	K<sub>D</sub>(nM)
		TGFβ1	1.7±0.6
TGFβ2	3.0±1.2
		TGFβ3	2.0±1.2

实施例3

抗体或其抗原结合片段用于治疗慢性肾病和其他临床适应症的生物学效力可以用美国专利No.7,723,486的实施例7中所示的大鼠单侧输尿管结扎(UUO)模型来确定。将重量为250-280克(约6周大)的成年Sparague Dawley大鼠(Taconic Farms,Germantown,N.Y.)养于空气、温度与光线受控的环境中。经历UUO的大鼠接受小腹中线的腹部切口术以露出左肾和上输尿管。在肾脏下极位置处将输尿管用丝缝合线结扎并在第一个下方约0.2cm处结扎第二次。假手术的大鼠接受相同的手术程序但没有进行输尿管结扎。

如美国专利No.7,723,486中所述，用PBS、鼠泛-中和单克隆抗体(1D11)、同型匹配对照抗体(13C4)或人泛-中和TGFβ单克隆抗体处理经阻塞的大鼠。在输尿管结扎当天起，对大鼠腹膜内施用抗体3周的时长。以5mg/kg(3次/周)施用13C4和1D11，并以5mg/kg(每5天)施用人泛-中和抗体。在3周结束时处死大鼠，用PBS灌注肾脏3分钟，并收获灌注过的肾脏用于mRNA分析、胶原蛋白含量确定和组织学检验。

为了评估组织纤维化的程度，根据Kivirikko等，通过对水解产物提取物中的羟脯氨酸的生化分析来确定总组织胶原蛋白含量。针对总胶原蛋白含量，还进行了Sircol胶原蛋白测定。基于Sirius红色染料与组织胶原蛋白侧链的特异性结合，Sircol胶原蛋白测定测量了总酸/胃蛋白酶可溶性胶原蛋白的量。

当与经PBS处理的组(3.5±0.3μg/mg干燥组织，p<0.05)相比时，用人泛-中和单克隆抗体处理的UUO大鼠显示出羟脯氨酸含量降低43.4％(1.98±0.26μg/mg干燥组织)。罹病肾脏中的总溶解胶原蛋白的降低，进一步支持了肾脏纤维化的减轻，如通过基于Sirius红色染料的测定所确定的那样(假：18.5±2.6，PBS：69.3±3.8，以及人泛-中和单克隆抗体：35.6±5.2μg/100mg组织，与PBS对比p<0.05)。

还通过免疫组化来评估了人泛-中和抗-TGF-β单克隆抗体降低组织纤维化的能力。在对照动物中，三周的输尿管阻塞使得肾小管结构被广泛破坏，有明显膨胀、细胞萎缩和坏死/细胞凋亡、组织发炎和有明显纤维化的肾小管间质膨胀。肾小球损伤的证据极少。另一方面，经1D11或人泛-中和单克隆抗体治疗的大鼠显示出维持肾脏结构，如同由肾小管扩张和瓦解的衰减、炎性浸润(细胞性)的减少以及肾小管间质膨胀与纤维化的减少而判断的那样。

还测量了使用人泛-中和抗-TGF-β单克隆抗体治疗对于TGF-β调控的基因表达的影响。与经PBS处理或经13C4对照抗体治疗的动物相比，经人泛-中和单克隆抗体治疗的UUO动物中的TGF-β1mRNA降低了。与经PBS或13C4处理的那些相比，在经人和鼠抗-TGF-β抗体治疗的阻塞肾脏中也观察到了III型胶原蛋白的mRNA水平明显降低，说明胶原蛋白合成降低。

通过测量总肾TGF-β1蛋白来进一步确认人泛-中和抗-TGF-β单克隆抗体降低自身诱发的TGF-β合成的效力。与进行假手术的动物相比，阻塞肾脏在总组织TGF-β1方面表现出明显的增加。但是，给予了人泛-中和单克隆抗体的阻塞大鼠显示出组织TGF-β1水平下降75％，低于对照组所记录到的水平。通过比较，相比于对照组，鼠1D11抗体将组织TGF-β1水平降低了45％。上述结果证明，使用人泛-中和抗-TGF-β单克隆抗体的TGF-β中和阻断了TGF-β自分泌调节循环，并防止TGF-β1产生和胶原蛋白III mRNA表达。

进一步将人泛-中和抗-TGF-β单克隆抗体对平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达的影响确定为TGF-β抑制的间接指示物。平滑肌肌动蛋白表达是活化的肌成纤维细胞的一个指示物，其与组织纤维化相关并产生纤维性结缔组织。TGF-β是基质成纤维细胞和定殖上皮细胞(resident epithelial cells)至肌成纤维细胞的活化与表型转化的诱导物。通过标准Western印迹分析来检测α-SMA蛋白。

当与假手术的动物相比时，带有阻塞肾脏的大鼠显示出α-SMA蛋白的大幅上调，如通过组织匀浆的Western印迹所测量的。给与人泛-中和抗-TGF-β单克隆抗体的阻塞大鼠显示出可测量的α-SMA表达显著降低(相比于PBS对照为75％)。

这些结果证实，人泛-中和抗-TGF-β单克隆抗体在纤维化肾脏中降低胶原蛋白沉积的效力，清楚地表明了该抗体在这个严重肾损伤进而肾小管间质纤维化的模型中是肾胶原蛋白生产与沉积的强力抑制剂。因为多种器官(诸如肺脏、肝脏或肾脏)中组织纤维化的过程具有共同的机制或途径，技术人员会理解该抗体可用于治疗慢性肾病，以及特征为病理性纤维化的其他临床适应症。

实施例4

如下所述确定GC1008(Fab)-TGFβ2复合体的结构。使带有C-端His6标签(SEQ IDNO:11)的重组GC1008(Fab)在HEK293FS细胞中瞬时表达，并且经Nickel-NTA亲和力树脂纯化，然后进行尺寸排阻色谱。将纯化的GC1008(Fab)和TGFβ2同型二聚体混合并用尺寸排阻色谱来分离复合体。GC1008(Fab)-TGFβ2复合体在35％PEG400、100mM 2-(N-吗啉代)乙磺酸(pH6.0)中于20℃下结晶并进一步通过晶种种植及pH优化来进行优化。在空间群P2₁2₁2中收集最终数据组至

并且使用分子取代来解析结构，所述取代用Grütter(2008)中公开的GC1008(Fab)-TGFβ3结构进行。GC1008(Fab)-TGFβ2复合体的结构于图1中描述。

实施例5

如下所述来确定GC1009(scFv)-TGFβ1复合体的结构。带有C-端His6标签(SEQ IDNO:11)的重组GC1009(scFv)在大肠杆菌中过表达，并且经Nickel-NTA亲和力树脂纯化，然后进行尺寸排阻色谱将纯化的GC1009(scFv)与TGFβ1同型二聚体混合并用尺寸排阻色谱来分离复合体。GC1009(scFv)-TGFβ1复合体在16％PEG 4K、0.1M柠檬酸(pH 5.0)、4％2-丙醇中于21℃结晶。在空间群C2中将结构确定至

并且使用分子取代来解析结构，所述分子取代用实施例4中确定的GC1008(Fab)-TGFβ2结构来进行。GC1009(scFv)-TGFβ1复合体的结构在图2中描述。

实施例6

在基于PCR的诱变反应中用编码GC1008重链或轻链的质粒作为模板。对编码DNA进行突变以产生编码的重链氨基酸序列的155个单氨基酸取代以及编码的轻链氨基酸序列约一个单氨基酸取代。根据制造商说明书使用

Lightning Site-DirectedMutagenesis试剂盒(Agilent Technologies,Santa Clara CA)，从而利用一组正向和反向引物来产生DNA突变，所述正向和反向引物或是针对特定氨基酸或是针对所有20种氨基酸以简并密码子(NNK)来设计的。在测序确认之后，将经鉴定的突变DNA与野生型轻链或重链DNA配对以供转染至Expi293F^TM宿主细胞悬浮液(Life Techonologies Corp.，GrandIsland，NY)中。在转染后4天时，收获条件培养基(1mL)并用l mL Protein A

柱(PhyNexus,Inc.,San Jose,CA)和PureSpeed^TM12-通道移液管(Rainin Instrument LLC,Oakland,CA)来纯化。使用100RU水平的TGFβ1、2和3固定的表面，以一式二重复的方式在

3000(GE Healthcare)上以50nM浓度分析纯化的变体抗体样品。变体的解离速率(k_d)除以野生型对照的(k_d)以获得k_d的变化倍数。若(k_d ^var/k_d ^wt)小于1，则表示亲和力增加，若该值大于1，则表示降低。生成了热图来显示所述结果。完全失去对TGFβ的亲和力的变体以无数字的黑色显示。结果在表7A、7B和7C中显示。

表7A

表7C

选择了17个突变体并按比例放大至产生足够量的纯化蛋白用于通过Biacore的KD(平衡常数＝kd/ka)分析。在固定了150RU水平TGFβ1、2和3的表面上一式二重复地使用了多种浓度(90、30、10和3.33nM)。用1对1的Langmuir结合模型的总体曲线拟合分析(globalcurve fitting analysis)来计算KD。来自所有4种浓度的实验数据用于计算，除了I54N和I54R突变(其中仅使用了前两位高的浓度)外。将表7B中显示的KD的倍数变化与kd(解离速率)的倍数变化进行比较，并生成热图用于显示。从两组数据中观察到了相似的倍数变化，证实了用kd作为155个单一突变体的筛选参数的有效性，如表7B中所示。

表7的热图分析显示于图5中，图5显示了结合至TGFβ的GC1008的3D结构。灰链代表GC1008，而黑链代表TGFβ2。依据显示在图7A底部用于热图分析的颜色图解，残基I52、I54和V55标示为黑色字母；残基Y27、S31、N32和D56标示为灰色；而残基S30和E74标示为白色。以较小字体标示的其他六个残基P53、N59、G101、V103、L104，和A93(轻链)依据热图分析有相似的着色。基于诱变分析，最为敏感的位置(黑色字母显示的I52、I54、V55)是与完全保守的TGFβ疏水性碎片区的核心相互作用的互补位残基，而最可接受的位置(白色字母显示的S30、E74)更为远离且与TGFβ螺旋三区相互作用。