CN105229158A - 来自糖化生物质分离的纤维素酶再循环 - Google Patents

Abstract

本公开提供了用于从纤维素生物质生产糖的方法。该方法联合了使用高剪切磨碎设备对生物质进行的处理以及生物质的糖化以将生物质部分水解。可在高剪切磨碎处理之后或同时对生物质进行糖化。随后将部分水解的生物质分离成具有糖化酶的固体流和具有糖的液体流。在糖化条件下对固体流和关联酶进行进一步孵育，以生产额外的糖；或者，将固体流和关联酶再循环并添加至新鲜生物质，使该新鲜生物质在高剪切磨碎条件下糖化。该方法导致纤维素生物质向葡萄糖的转化提高。

Description

来自糖化生物质分离的纤维素酶再循环

相关专利申请的交叉引用

本申请要求于2013年3月15日提交的美国临时专利申请No.61/798,070的优先权，以引用的方式将其整体并入本文。

背景技术

酶水解是基于生物质生产生物燃料的重要步骤。酶水解省去了对大量酸和中和此酸的需求，但目前商业化纤维素酶的成本较高，并且酶对纤维素和半纤维素聚合物的作用可能较慢。另一方面，虽然水解机制以及各种纤维素酶的结构和功能之间的关系已被广泛研究，酶活性的许多细节仍然知之甚少。

木质纤维素底物的酶水解强烈受到终产物抑制和酶特性的影响。因此，生物质水解与以下因素直接或间接相关：底物可用性、终产物积累和/或在生物质预处理期间或之后产生的酶抑制剂(这阻碍纤维素酶对其各自底物的特异性活性)。对底物的低特异性催化剂活性限制了水解效力。

发明内容

本方法涉及改进纤维素生物质的糖化来生产可转化为有用的下游产物(如生物燃料)的糖。在该方法中，在适于将生物质组分水解成糖的条件下，使生物质与催化剂接触。在一些实施方式中，所述条件包括在高剪切搅拌(high-shearagitation)条件下，使生物质与催化剂接触。在一些实施方式中，在使生物质与催化剂接触以将生物质组分水解成糖之前，使用高剪切磨碎设备(highshearmillingdevice)对生物质进行处理，以产生相对均一的粒径。将得到的水解生物质混合物分离成包含糖的液体流和包含固体的固体流，其中，两相都构成残留酶(residualenzymes)，在本文的实施方式中对其进行说明。在一些实施方式中，在生物质部分水解之后进行分离步骤。在适于将固体组分水解成糖的条件下，将固体进一步孵育，从而生产额外的糖。在一些实施方式中，在约6小时至约24小时内，该方法将生物质中至少80％的葡聚糖转化成葡萄糖。

因此，在一方面，描述了用于从生物质生产糖的方法，所述方法包含：

(a)在适于将生物质组分水解成糖的高剪切搅拌条件下，使所述生物质与催化剂接触，从而产生包含糖的固液混合物；

(b)将所述混合物分离成包含糖的液体流和包含固体的固体流；

(c)在适于将固体组分水解成糖的条件下孵育所述固体，从而生产额外的糖。

在另一方面，描述了用于从生物质生产糖的方法，所述方法包含：

(a)使用包含转子和定子的高剪切/磨碎混合设备对所述生物质进行预处理，其中，所述高剪切/磨碎混合设备在所述转子和所述定子之间具有约0.1毫米至2.2毫米的间隙设置(gapsetting)，从而减小所述生物质中生物质颗粒的粒径；

(b)使所述生物质与催化剂接触以将生物质组分水解成糖，从而产生包含糖的固液混合物；

(c)将所述混合物分离成包含糖的液体流和包含固体的固体流；

(d)在适于将固体组分水解成糖的条件下孵育所述固体流，从而生产额外的糖。

在上述方面的一些实施方式中，生物质包含葡聚糖，且生物质中至少80％的葡聚糖在约6小时至约24小时内被水解成葡萄糖。在一些实施方式中，生物质是木质纤维素生物质。在使生物质与催化剂接触之前，生物质可包含至少约10w/w％的固体。在使生物质与催化剂接触之前，也可对生物质进行预处理。催化剂可包括酶(如水解酶)，或可为非酶催化剂。

在一些实施方式中，高剪切搅拌条件产生如下生物质粒径：其中，至少约80％的颗粒具有约1微米至约800微米、约2微米至约600微米、约2微米至约400微米或约2微米至约200微米的粒径。

在一些实施方式中，使用机械设备、过滤器、膜或切向流过滤设备将混合物分离。机械设备可为离心机、压力机(press)或筛(screen)。

在一些实施方式中，在将混合物分离成液体流和固体流之前，使生物质混合物部分水解不同时间长度。例如，在一些实施方式中，在使生物质与催化剂接触约2小时至约4小时、或约4小时至约6小时后，进行分离步骤。在一个实施方式中，当存在于生物质中的约30％至约60％的葡聚糖转化成葡萄糖时，将生物质混合物分离成液体流和固体流。相较于不包含将混合物分离成液体流和固体流、并在适于将固体组分水解成糖的条件下孵育固体流的步骤的方法，本文所述的方法提高了葡聚糖向葡萄糖的转化量。在一些实施方式中，相较于不包含额外的分离和孵育步骤的方法的葡聚糖转化量，该方法的葡聚糖转化量至少提高10％。

在一些实施方式中，使固体流在适于将固体组分水解成糖的条件下孵育约8小时至约20小时。还可在高剪切搅拌条件下对固体流进行孵育。

在一些实施方式中，在间歇(batch)、半间歇(semi-batch)或连续(continuous)工艺中使固体流与额外的生物质接触。额外的生物质也可包含将生物质组分水解成糖的催化剂。

在一些实施方式中，该方法生产的糖被加工成乙醇、生物燃料、生化制品或其它化学产品。在一些实施方式中，相较于未依据本方法进行处理的生物质，从所述生物质混合物中分离出的液体流包含增加量的化合物，例如糠醛、低聚糖和酚类。在一些实施方式中，相较于未在高剪切条件下处理的生物质，所述生物质的水解组分包含降低浓度的污染物。

在一些实施方式中，在使用高剪切设备对生物质进行处理之后，使生物质与适于将生物质组分水解成糖的催化剂接触。

在一些实施方式中，高剪切搅拌条件包含使用高剪切/磨碎混合设备对生物质进行处理，所述高剪切/磨碎混合设备包含转子和定子。依据所用的生物质类型，所述转子和所述定子之间的间隙设置可在约0.1毫米至约2.2毫米之间。

在一个实施方式中，所述方法进一步包含将液体流分离成包含糖的第二液体流和包含固体的第二固体流；以及在适于将固体组分水解成糖的条件下孵育第二固体，从而生产额外的糖。

在一些实施方式中，在预处理步骤之前或在使生物质与高剪切磨碎设备接触之前，将生物质与水混合以提供生物质/水混合物。

在此对本发明进一步的实施方式进行说明。

定义

除非另有定义，本文所使用的所有技术术语和科学术语具有与本发明所属领域的技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管基本上与本文所述的方法和材料类似的任何方法和材料都可以用于本发明的实践或测试中，但是仅对示例性方法和材料进行了描述。为了本发明的目的，下面对以下术语进行定义。

除非上下文清楚地另外指明，术语“一种/一个”和“该/所述”包括复数所指物。

术语“催化剂”指的是提高化学反应(如纤维素水解)的速率、或允许反应在较低温度下以基本相同的速率进行的化合物或物质。该术语包括将木质纤维素生物质转化成多糖、低聚糖和/或简单的可发酵糖的水解和糖化酶。该术语还包括由基因工程化植物或转基因植物生产的糖化酶，例如，如Rabb等人在美国专利公开2012/0258503中所描述的，以引用的方式将其整体并入本文。该术语还包括聚合物酸催化剂，例如，如在美国专利公开2012/0220740、2012/0252957和2013/0042859中所描述的，以引用的方式将它们各自整体并入本文。

术语“生物质”指的是包含木质纤维素材料的任意材料。木质纤维素材料由三种主要组分组成：纤维素、半纤维素和木质素。纤维素和半纤维素包含包括多糖和低聚糖在内的碳水化合物，并且可以与诸如蛋白质和/或脂质等其它组分组合。生物质的实例包括农产品，例如谷物，如玉米、小麦和大麦；甘蔗；玉米秸秆、玉米棒、甘蔗渣、高粱和食用植物的其它不可食用的废物部分；食物废物；草类，如柳枝稷；以及林业生物质，如木材、纸、木板(board)和废木材产品。

术语“木质纤维素”指的是同时包含木质素和纤维素的材料，并且也可以包含半纤维素。

关于材料或组合物的术语“纤维素”指的是包含纤维素的材料。

术语“葡聚糖”指的是所有的α-连接和β-连接的1,4葡萄糖单元均聚物。

术语“适于将生物质组分水解成糖的条件”指的是使固相生物质与一种或多种催化剂(包括但不限于纤维素酶、半纤维素酶和辅助酶或蛋白质)接触，以由生物质中的多糖生产可发酵糖和链较短的低聚糖。该条件可进一步包括最适合糖化酶活性的pH，例如，约4.0至约7.0的pH范围。该条件可进一步包括最适合催化剂(包括糖化酶)活性的温度，例如，约20℃～100℃、约35℃～75℃或约40℃～60℃的温度范围。

术语“高剪切搅拌”、“高剪切混合”和“高剪切磨碎”或“高剪切磨碎/糖化”指的是将生物质置于高剪切条件下，以降低生物质粒径和/或增强包含催化剂的生物质混合物的混合。在一些实施方式中，所述条件产生约1微米至约800微米的生物质粒径分布。在一些实施方式中，生物质粒径分布如下：至少约70％、75％、80％、85％、90％或95％的颗粒具有约1微米至约800微米、约2微米至约600微米、约2微米至约400微米或约2微米至约200微米的粒径。可以由本领域熟知的设备提供高剪切条件，例如，由ICS型孔口反应器(orificereactor)(Buchen-IndustrialCatalystService)、旋转胶体型磨机、Silverson混合器、气蚀磨碎(cavitationmilling)设备、螺旋钻(auger)、磨碎螺旋钻或蒸汽辅助水力喷射式(hydro-jet)磨机提供。在一些实施方式中，高剪切设备包括具有静止定子和旋转转子定位的任何设备，以在运行期间保持转子和定子之间的物理间隙，使得在该间隙内或沿着该间隙产生高剪切区。在一些实施方式中，高剪切设备包含螺旋钻磨碎设备，所述螺旋钻磨碎设备的磨碎杆或磨碎棒插在螺旋钻叶片之间并包含在螺旋钻叶片插槽内，这允许磨碎杆在螺旋钻直径的中心和壁区域之间行进。当螺旋钻旋转时，磨碎杆行进至螺旋钻组件中心(处于被定义为零度位置的旋转顶部)。随着旋转进展超过90度并向180度旋转位置行进，磨碎杆落向螺旋钻组件的外径或壁，从而，由于螺旋钻叶片的旋转，当磨碎杆沿螺旋钻的较低区域行进时，上述运动产生由磨碎杆质量击打生物质而导致的磨碎作用。螺旋钻杆可以配备有多种表面特征，以支持生物质的有效磨碎，并且可以配置在沿着螺旋钻叶片的各种位置，以保持旋转中的平衡和生物质转化的最佳条件。可以在预处理和糖化工艺步骤之前和/或期间，以任意组合使用这些高剪切磨碎设备，以提高生物质向糖的转化。

术语“糖化”也称为“水解”，指的是从生物质或生物质原料或包含非纤维素类生物质的原料生产糖和短链低聚糖。糖化可由催化剂实现，所述催化剂包括水解酶、纤维素酶、α-淀粉酶、葡萄糖-淀粉酶、β-葡糖苷酶和/或辅助蛋白质，所述辅助蛋白质包括但不限于过氧化物酶、虫漆酶、扩张素(expansins)和膨胀素(swollenins)。“水解”指的是打破多糖中的糖苷键并引入水以产生简单的单体糖和/或低聚糖。例如，纤维素的水解产生6碳(C6)糖(例如葡萄糖)和低聚葡萄糖，而半纤维素的水解产生5碳(C5)糖(例如木糖和阿拉伯糖)和6碳(C6)糖(例如半乳糖和甘露糖)和各种低聚糖。可通过各种技术、工艺和/或方法来实现从聚合的纤维素纤维和生物质生产短链纤维素类的糖。例如，可以用水来水解纤维素以产生纤维素类的糖。可通过使用水解酶、化学品、机械剪切、热和压力环境或上述技术的任意组合来辅助和/或加速水解。水解酶的实例包括β-葡糖苷酶、木聚糖酶、纤维素酶和半纤维素酶。纤维素酶是多种酶的混合物(包括外切纤维二糖水解酶、内切葡聚糖酶和β-葡糖苷酶)的通用术语，这些酶联合作用以将纤维素水解成纤维二糖和葡萄糖。化学品的实例包括强酸、弱酸、弱碱、强碱、氨或其它化学品。机械剪切包括高剪切孔口(highshearorifice)、气蚀、胶体磨机和螺旋钻磨机。

术语“可发酵糖”指的是在发酵过程中(例如，在由酵母进行的发酵过程中)可以转化成乙醇或其它产物(例如但不限于甲醇、丁醇、丙醇、琥珀酸和异戊二烯)的糖。例如，葡萄糖是从纤维素的水解衍生而来的可发酵糖，而木糖、阿拉伯糖、甘露糖和半乳糖是从半纤维素的水解衍生而来的可发酵糖。

术语“同步糖化和发酵(SSF)”指的是如下工艺：通过生物质的酶水解生成可发酵糖，这些糖几乎马上就在发酵过程中被消耗，从而产生有价值的产物(如生物燃料)。这与术语“分步水解和发酵(SHF)”相反，在SHF中，生物质的酶水解在糖的发酵转化之前发生。

术语“预处理”指的是使用物理、热、化学或生物手段或上述手段的任意组合对生物质进行处理，从而使生物质更易于水解、糖化或转化成糖和短链低聚糖(例如，通过糖化酶进行)。预处理可以包含在升高的压力和/或升高的温度下处理生物质。预处理可以进一步包含将生物质物理混合和/或磨碎，从而降低生物质颗粒的粒径及产生均一的粒径。可用于生物质的物理预处理的设备包括例如锤磨机、剪切磨机、气蚀磨机、胶体磨机或其它高剪切磨机、或螺旋钻磨机。示例性的胶体磨机为Cellunator^TM(Edeniq，Inc.，Visalia，CA)。例如，WO2010/025171中描述了使用高剪切胶体磨机来降低粒径并且产生均一的粒径，从而提高乙醇的产率，以引用的方式将其整体并入本文。

在预处理步骤的情况下，术语“升高的压力”指的是高于基于海拔的大气压力(例如，在海平面上为1atm或14.695psi)的压力，例如，在海平面上为至少20psi、30psi、40psi、50psi、60psi、70psi、80psi、90psi、100psi、110psi、120psi、130psi、140psi、150psi、200psi、220psi或更高。在一些实施方式中，例如但不限于高剪切孔口磨机的情况，“升高的压力”可以是非常高的压力，例如为67atm、133atm、200atm、400atm、700atm(985psi-10,300psi)或更高。

在预处理步骤的情况下，术语“升高的温度”指的是高于环境温度的温度，例如，至少为100℃、110℃、120℃、130℃、140℃、150℃、160℃、170℃、180℃、190℃、200℃、210℃、250℃或更高。当用于水热预处理中时，该术语包括足以大幅提高封闭系统中的压力的温度。例如，封闭系统中的温度可以提高到170℃及更高，使得压力为至少100psi或更高，例如为131psi、167psi、211psi、262psi、570psi或更高。

术语“预处理的生物质”指的是已经进行了预处理的生物质，从而使所述生物质更易于水解。

附图说明

图1示出了本文所述方法的一个说明性实施方式。

图2示出了本文所述方法的另一说明性实施方式。

图3示出了本文所述方法的第三说明性实施方式。

图4示出了本文所述方法的第四说明性实施方式。

图5示出了使用经热预处理、但未磨碎的生物质进行的摇瓶规模糖化测试的结果。在30加仑反应器中，使生物质与酶接触，并混合以确保均质性。立即(T＝0)将生物质等分试样取出，并离心以产生固体沉淀(pellet)和液体上清液(Sup)。将SolkaFloc(SF)(纤维素和半纤维素的已校准来源)加入到沉淀和上清液中，将沉淀稀释，并允许继续糖化24小时。

图6示出了使用经热预处理、但未磨碎的生物质进行的摇瓶规模糖化测试的结果。在30加仑反应器中，使生物质与酶接触，并混合以确保均质性。在12小时后(T＝12)将生物质等分试样取出，并离心以产生固体沉淀和液体上清液(Sup)。将SolkaFloc(SF)(纤维素和半纤维素的已校准来源)加入到沉淀和上清液中，将沉淀稀释，并允许继续糖化另外的24小时。

图7示出了使用经热预处理、但未磨碎的生物质进行的摇瓶规模糖化测试的结果。在30加仑反应器中，使生物质与酶接触，并混合以确保均质性。在24小时后(T＝24)将生物质等分试样取出，并离心以产生固体沉淀和液体上清液(Sup)。将SolkaFloc(SF)(纤维素和半纤维素的已校准来源)加入到沉淀和上清液中，将沉淀稀释，并允许继续糖化另外的24小时。

图8示出了使用经热预处理、但未磨碎的生物质进行的摇瓶规模糖化测试的结果。在30加仑反应器中，使生物质与酶接触，并混合以确保均质性。在48小时后(T＝48)将生物质等分试样取出，并离心以产生固体沉淀和液体上清液(Sup)。将SolkaFloc(SF)(纤维素和半纤维素的已校准来源)加入到沉淀和上清液中，将沉淀稀释，并允许继续糖化另外的24小时。来自30加仑糖化的48小时糖化材料(来自于T＝48材料)的固液分离(SLS)和继续糖化。

图9示出从摇瓶测试中得到的葡萄糖和木糖浓度，在所述摇瓶测试中，将经热预处理、但未磨碎的生物质与酶接触、混合、并使其反应4小时。然后将生物质离心，使用等体积的水将沉淀重悬，使稀释的沉淀和上清液继续与残留酶反应另外的20小时。分别在T＝4小时和T＝24小时测定糖的浓度。将未经离心的对照样品标记为标准Sacc(NormalSacc)。

图10示出了使用工程化酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)酵母菌株对糖化后的固/液部分进行发酵的结果。用水标准化的(normalized)糖化生物质的固体残留物显示出葡萄糖向乙醇的高转化。箭头指出来自于标准糖化生物质和用水标准化的固体残留物的乙醇生产的直接比较。

图11(A)和图11(B)示出了一式两份的实验(duplicateexperiments)的结果，在该实验中，使用磨碎螺旋钻在高剪切搅拌条件下使热预处理的生物质糖化。糖化4个小时后，取出生物质的等分试样并离心。将所得沉淀用水稀释至生物质的初始浓度。将稀释的生物质沉淀和上清液原样在摇瓶中糖化另外的20小时，不施加额外的酶。在此图中，对照是允许其糖化完整的24个小时的未受干扰的生物质。

图12：(A)示出了用于检测结合至生物质的纤维素酶的方法的示意图。(B)示出了β-葡糖苷酶(BG)和内切葡聚糖酶(EGII)对预处理的生物质的结合性质。右侧图显示了实验的工作计划。BGI、BGII和BgIII表示：I上清液(Sup)、IISup(缓冲液洗涤)和IIISup(缓冲液+0.1％SDS)(见该图右上方)；对于EGII也是如此。T0和T4表示采样时间点(小时)。

图13示出了在生物质糖化后的离心后，固相和液相中的β-葡糖苷酶(BG)活性，表明了酶再循环(recycle)的概念。

图14示出了作为磨碎-糖化和固液分离时间的函数的生物质粒径分布。

图15示出了作为磨碎-糖化和固液分离时间的函数的葡聚糖转化。

图16示出了作为磨碎-糖化和固液分离时间的函数的葡聚糖转化速率(％/小时)。

图17示出了对于在实验室规模磨碎设备中水解的生物质而言，纤维素转化为葡萄糖的百分数(％)以及转化速率。在水解3小时后进行SLS，用水将固体部分(fraction)稀释至初始生物质浓度，并允许在无额外的酶的情况下继续水解总共18个小时。

图18示出了在T＝0小时至T＝24小时中的磨碎糖化固液分离动力学和粒径分布分析。

图19示出了本文所述方法的第五说明性实施方式。连续工艺包含混合螺旋钻和糖化螺旋钻、用于固液分离的振动筛、用于将液体流进一步分离成第二固体流和第二液体流的切向流过滤器(TFF)，并存在再循环回路。

具体实施方式

已惊讶地发现，本文所述的方法通过将高剪切磨碎与糖化联合，并在糖化完成之前将部分水解的生物质固体从液体中分离出，提高了纤维素生物质向糖的转化速率。本公开描述了可用于从生物质生产糖的方法。在一方面，所述方法包含使用高剪切磨碎设备处理生物质，以产生相对均一的粒径；随后在适于将生物质组分水解成糖的条件下，使处理的生物质与催化剂接触。在另一方面，所述方法包含在高剪切搅拌(例如高剪切混合或高剪切磨碎)条件下，使生物质与催化剂接触。所述条件适于将生物质组分水解成糖。因此，该条件产生包含糖的固液混合物。允许高剪切搅拌条件进行规定的时间段，从而使得至少一部分生物质水解成糖。例如，在一些实施方式中，允许该条件进行足以产生如下生物质粒径分布的时间段：至少约80％(例如，至少80％、85％、90％、95％或更多)的生物质颗粒为约2微米至约200微米。在一些实施方式中，该时间段为约2-4小时。在一些实施方式中，该时间段为约4-6小时。在一些实施方式中，该时间段为约6-8小时。在一些实施方式中，该时间段为约8-10小时。在一些实施方式中，该时间段为不超过10小时。在一些实施方式中，该时间段为约1、2、4、6、8或10小时。

在生物质被水解成混合物之后，将水解的混合物分离成包含糖的液体流和包含固体的流(即，“固体流”)。本领域技术人员应明了的是，固体流通常包含其它组分，例如液体(例如，含水液体或水)、溶解固体、残留糖和/或水解酶。可以使用本领域中已知的任何合适的方法进行分离步骤。例如，在一些实施方式中，使用机械设备、过滤器、膜或切向流过滤设备进行分离步骤。在一些实施方式中，机械设备是离心机、压力机或筛。本文中对分离方法和设备的实例作了进一步说明。

可在如本文所述的合适的时间段之后进行分离步骤。例如，可在生物质与催化剂接触并经受高剪切搅拌之后约1小时至约2小时进行分离步骤。在一些实施方式中，可在生物质与催化剂接触并经受高剪切搅拌之后约2小时至约4小时进行分离步骤。在一些实施方式中，可在生物质与催化剂接触并经受高剪切搅拌之后约4小时至约6小时进行分离步骤。在一些实施方式中，可在生物质与催化剂接触并经受高剪切搅拌之后约6小时至约8小时进行分离步骤。在一些实施方式中，可在生物质与催化剂接触并经受高剪切搅拌之后约8小时至约10小时进行分离步骤。在一些实施方式中，在不晚于生物质首次与催化剂接触并经受高剪切搅拌之后10小时进行分离步骤。在一些实施方式中，在生物质与催化剂接触并经受高剪切搅拌之后约1、2、4、6、8或10小时进行分离步骤。在一些实施方式中，在足以使生物质中约30w/v％至约60w/v％的葡聚糖转化成葡萄糖的时间段之后进行分离步骤。因此，在一些实施方式中，当约30％、35％、40％、45％、50％、55％或60％的葡聚糖转化成葡萄糖时，进行分离步骤。

在分离步骤之后，在适于将固体组分水解成糖的条件下对固体进行孵育。此进一步的水解产生额外的糖。在一些实施方式中，在约6小时至约24小时、或约6小时至约18小时、或约6小时至约12小时、或约6小时至约10小时、或约6小时至约8小时内，生物质中至少约80％的葡聚糖转化成葡萄糖。在一些实施方式中，孵育步骤不超过约6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24小时。在一些实施方式中，相较于不包含本文所述的分离步骤的方法的葡聚糖转化量，本文所述方法的葡聚糖转化量至少提高10％、15％、20％、25％、30％、40％或50％。

应该理解的是，葡聚糖向葡萄糖的转化可以发生在第一水解步骤期间(在高剪切搅拌条件下或施用高剪切搅拌后)和分离步骤之后。因此，葡聚糖转化成葡萄糖的总量可以包括在第一水解步骤期间产生的葡萄糖和分离步骤之后产生的葡萄糖。在一些实施方式中，足以将80％的葡聚糖转化成葡萄糖的总水解时间(即，第一水解步骤和分离步骤之后的联合)不超过约6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24小时。

在一些实施方式中，适于将固体组分水解成糖的条件包括在高剪切搅拌或高剪切混合条件下或在施用高剪切搅拌之后对固体进行孵育。例如，在一个实施方式中，在第二高剪切搅拌设备中对固体进行孵育。在一些实施方式中，将固体加入到并孵育于包含生物质的相同高剪切搅拌设备中。

在一些实施方式中，所述生物质是木质纤维素生物质。可用于本文所述方法的生物质的实例包括但不限于农作物、森林作物以及包含木质纤维素和/或纤维素的不同类型的废物和副产物。生物质包括但不限于农业生物质(例如玉米秸秆、玉米棒、玉米壳、麦秆、稻草、稻壳、大麦秆、燕麦秆、燕麦壳、油菜秆和大豆秸秆)；草类(如柳枝稷、芒草、大米草(cordgrass)、黑麦草和草芦(reedcanarygrass))；甘蔗和糖加工副产品(如甘蔗渣和甜菜浆)；高粱、木材产品、树及其部分、锯屑、再循环的纸浆纤维、木屑、新闻纸和纸板；以及动物粪便(animalwaste)。生物质还可以包含加工的木质纤维素原料。

在一些实施方式中，在与催化剂接触之前，所述生物质包含至少约10％、15％、20％、25％或30％的固体(w/w)。在一些实施方式中，所述生物质为预处理的生物质。本文描述了适合的预处理条件。

在一些实施方式中，使从混合物中分离出的固体与额外的生物质接触。在与生物质接触之前，固体可以在水解条件下孵育一段时间，或者可以立即与生物质接触。在一些实施方式中，固体包含再循环回来与生物质接触的水解酶。酶的再循环具有降低需要添加到新鲜生物质中来水解纤维素的酶量的优点。与固体接触的生物质可以是新鲜生物质(例如，尚未与催化剂接触的生物质；或已经与催化剂接触以产生包含糖的固液混合物、但尚未将该混合物分离成液体流和固体流的生物质)，或者可以是产生固体的原始生物质的一部分。可在间歇、半间歇或连续工艺中使固体和关联酶(associatedenzymes)与额外的生物质接触。在一些实施方式中，额外的生物质进一步包含能够将生物质组分水解成糖的催化剂。在一些实施方式中，在高剪切搅拌条件下(例如，在高剪切反应器中)使固体与额外的生物质接触。

在连续工艺的实施方式中，在高剪切搅拌设备中将固体添加到新的或新鲜的生物质，并在适于产生糖的条件下对新的生物质和固体进行孵育。为了测定生物质的葡聚糖向葡萄糖的转化量，测量向高剪切磨碎设备中添加生物质的速率，并确定产生葡萄糖的平均净速率(averagenetrate)。因此，在连续工艺的一些实施方式中，葡聚糖向葡萄糖的转化是稳态水平或速率。在一个实施方式中，通过计算单位时间内产生的葡萄糖的量与进料到连续工艺的生物质中的葡聚糖的葡萄糖当量的百分比，来确定葡聚糖的转化速率。

在一些实施方式中，从混合物中分离出的液体流中的糖和/或在固体孵育步骤中产生的额外的糖被加工成乙醇、生物燃料、生化制品或其它化学产品。

在一些实施方式中，相较于未在高剪切搅拌条件下用催化剂处理的生物质，从混合物中分离出的液体流包含增加量的化合物，例如但不限于糠醛、低聚糖和短链酚类。这些化合物可为乙醇工厂提供额外的收益来源。因此，在一些实施方式中，相较于从未在高剪切搅拌条件下用催化剂处理的生物质混合物中分离出的液体流，本发明的从混合物中分离出的液体流包含的化合物多至少5％、10％、15％、20％或更多。

在一些实施方式中，将水解的固体组分分离成包含额外的糖的第二液体流和第二固体流。在一些实施方式中，相较于未在高剪切搅拌条件下用催化剂处理的生物质，本发明的第二液体流包含降低浓度的污染物。所述污染物可以包含糖化抑制剂和/或发酵抑制剂。因此，在一些实施方式中，相较于从水解的固体组分中分离出的液体流(其中，从未在高剪切搅拌条件下用催化剂处理的水解混合物中分离出该固体)，本发明的第二液体流包含的污染物的浓度低至少5％、10％、15％、20％或更低。

预处理

在本文所述的水解步骤之前，可以对生物质进行预处理以使木质纤维素和纤维素更易于水解。预处理包括利用物理、化学或生物手段或者上述手段的任意组合对生物质进行处理，从而使生物质更易于水解，例如，通过本文所述的糖化酶或催化剂来进行。化学预处理的实例在本领域是已知的，并包括酸预处理和碱预处理。

物理预处理的一个实例包括升高的温度和升高的压力。因而，在一些实施方式中，预处理包括使生物质经历升高的温度和升高的压力，以使木质纤维素和纤维素易于发生酶水解。在一些实施方式中，温度和压力提高的量以及维持的时间足以使纤维素易于水解。在一些实施方式中，预处理条件可以包括在约150℃～约210℃范围内的温度。预处理温度可以基于预处理步骤的持续时间而变化。例如，对于约60分钟的预处理持续时间，温度为约160℃；对于30分钟的持续时间，温度为约170℃；对于5分钟的持续时间，温度为约210℃。

预处理条件也可以包括提高的压力。例如，在一些实施方式中，压力可以为至少100psi或更高，例如110psi、120psi、130psi、140psi、150psi、200psi、265psi或更高。在一些实施方式中，在封闭系统中对生物质进行预处理，并且温度提高的量足以提供所需的压力。在一个实施方式中，在封闭系统中提高温度，直到压力提高到约125psi、约145psi或约265psi。本领域技术人员将理解的是，将压力提高到所需水平所需的温度提高将取决于各种因素，例如封闭系统的尺寸和饱和蒸汽的平衡。在一些实施方式中，预处理包括使木质纤维素和纤维素更易于水解的本领域已知的任意其它方法，例如，酸处理、碱处理和蒸汽处理或它们的组合。

在一些实施方式中，预处理步骤不导致产生相当大量的糖。例如，在一些实施方式中，一般来说，预处理致使产生按重量计低于约10％、5％、1％、0.1％、0.01％或0.001％的葡萄糖；按重量计低于约10％、5％、1％、0.1％、0.01％或0.001％的木糖；和/或按重量计低于约10％、5％、1％、0.1％、0.01％或0.001％的糖。在一些实施方式中，进入预处理阶段的工艺流中的糖的量与离开预处理阶段的工艺流中的糖的量基本相同。例如，在一些实施方式中，进入预处理阶段的工艺流中的糖的量和离开预处理阶段的糖的量之间的差异按重量计低于约10％、5％、1％、0.1％、0.01％或0.001％。

在一些实施方式中，预处理可以进一步包括对生物质进行物理混合和/或磨碎以减小生物质颗粒的粒径。生物燃料(例如，乙醇)或可发酵糖的产率可以通过使用具有较小粒径的生物质颗粒来提高。例如，适用于生物质的物理预处理的设备包括锤磨机、剪切磨机、气蚀磨机或胶体磨机或任意其它类型或构造的高剪切磨机。因而，在一些实施方式中，预处理步骤包括利用胶体磨机对生物质进行物理处理。示例性胶体磨机是Cellunator^TM(Edeniq，Visalia，CA)。在一些实施方式中，对生物质进行物理预处理，以产生具有低于约1600μm的相对均一的粒径的颗粒。例如，至少约50％、60％、70％、80％、85％、90％或95％的预处理的生物质颗粒可以具有约100μm～约800μm的粒径。在一些实施方式中，至少约50％、60％、70％、80％、85％、90％或95％的预处理的生物质颗粒具有约100μm～约500μm的粒径。在一些实施方式中，使用胶体磨机对生物质进行物理预处理，以产生具有相对均一的粒径的颗粒。如美国专利申请公开No.2010/0055741(Galvez等)中所描述的(以引用的方式将其整体并入本文)，使用胶体磨机来产生具有相对均一的粒径(例如，约10μm～约800μm)的生物质颗粒可以提高糖的产率。

胶体磨机具有各种尺寸和各种结构材料。本领域技术人员将能够针对各种生物质来优化尺寸和冶金材料(metallurgy)。例如，两台IKA的MK2000/50型号可在双相不锈钢中用于50MMGPY(百万加仑每年)玉米发酵工艺，而一台IKA的MK2000/50型号(由304个不锈钢部件组成)完全可以满足30MMGPY甘蔗纤维素工艺的需要。在各种情况下，为各种原料物质输入和各种流量条件优化间隙尺寸(gapsize)。

胶体磨机可用来对生物质(如玉米生物质)进行预处理。在一些实施方式中，与单独使用锤磨机进行预处理相比，用胶体磨机进行预处理可提高乙醇生产的产率。胶体磨机可被改装，例如在目前的玉米乙醇生产工厂中通过将胶体磨机内嵌(in-line)插在混合罐和液化罐之间。胶体磨机还可用于设计和建设新的生物燃料生产工厂。

通过使用间隙旋转控制器(gaprotationalcontrols)，可使用胶体磨机来选择所形成的粒径分布。与备选的预处理技术(如用锤磨机粉碎)相反，使用胶体磨机可从大得多的生物质材料得到相对精细的粒径分布。胶体磨机上合适的间隙尺寸可产生高度均一的生物质悬浮液，与仅使用粉碎设备相比，其中的生物质的最大粒径被大大减小且明显更均一。用在玉米乙醇工厂中的胶体磨机的间隙尺寸范围可为0.104mm-0.728mm，如0.104mm-0.520mm，如0.208mm-0.520mm，从而所得到的粒径范围为10μm-800μm。例如，在一些实施方式中，0.1mm-0.15mm的间隙设置用于玉米秸秆或其它纤维素类生物质，而0.2mm-0.3mm的间隙设置用于谷物(包括但不限于玉米粒)。在其它实施方式中，例如采用甘蔗渣的实施方式中，间隙设置的范围可以为1.1mm-2.2mm，如1.1mm-1.9mm，如1.4mm-1.9mm。与锤磨机相比，胶体磨机可用于生产具有高表面积的相对精细的均一粒径，使得有更高百分比的淀粉、纤维素和糖可被利用进行酶转化，从而使产率得到提高。

通常，如前所讨论的，生物质越细，得到的就每吨生物质的生物燃料加仑数而言的产率也就越高。然而，整个工艺中的关键主导因素是移除生物燃料后残留固体的回收。如上所解释的，这个因素使得用于玉米乙醇的最佳生物质尺寸为100-500μm。对于使用稻草、甘蔗、能源甘蔗(energycane)和其它材料(如本文所述的材料)的纤维素类工艺(其中可安装最新的过滤装置)，生物质尺寸可为50-350μm，通常为75-150μm。

在大部分生物燃料工厂中，玉米醪中固体的重量范围为25-35wt％(db)。内嵌置于混合罐和液化罐间的胶体磨机可接受通常遇见的固体的整个范围，并且，由于实现了粒径的高度均一和较低的流体粘度，还使得生物质的负载比不使用胶体磨机的类似工艺更高(如，40wt％范围内)。

在某些情况下，可将生物质直接引入胶体磨机中。然而，在其它情况下，在将生物质引入胶体磨机之前，使其经历一个或多个预处理步骤。例如，可首先用粉碎设备(如锤磨机、切碎机(macerator))对生物质进行预处理，这通常使生物质破碎并导致大且无规则的粒径分布，随后使用胶体磨机进行更精细的研磨、或使用切碎机后再使用胶体磨机进行更精细的研磨，由此形成具有期望尺寸的相对均一的颗粒。例如，来自不同材料(例如但不限于玉米和稻草)的生物质可通过具有固定设置的筛孔尺寸(如#7或#8)的锤磨机给料。然后可将该锤磨机连接到胶体磨机，该胶体磨机具有可调节的间隙设置，用于动态调节生物质的期望粒径。

在一些实施方式中，预处理步骤不涉及可以将糖降解成发酵抑制剂的酸的使用。

在一些实施方式中，将预处理的生物质的pH调节到约3.0～约6.5的pH。在一些实施方式中，在预处理步骤期间或之后将生物质的pH调节到最适合糖化酶活性的范围内，例如，约4.0～6.0的范围内。在一些实施方式中，使用Mg(OH)₂、NH₄OH、NH₃或者Mg(OH)₂和NH₄OH或NH₃的组合来调节生物质的pH。

在预处理之后，使用本文所述的方法和催化剂将预处理的生物质水解以产生糖。

催化剂的实例

本文所述的方法使用的催化剂包括糖化酶及它们的各种组合。糖化酶的实例包括糖苷酶、纤维素酶、半纤维素酶、淀粉水解糖苷酶、木聚糖酶、木质素酶和阿魏酸酯酶以及它们的组合。糖苷酶将二糖、低聚糖和多糖的醚键水解。术语纤维素酶是将纤维素水解成葡萄糖、纤维二糖和其它纤维寡糖的糖苷酶族群的通称。纤维素酶可以包括包含外切纤维二糖水解酶(CBH)、内切葡聚糖酶(EG)和β-葡糖苷酶(BG)的混合物。半纤维素酶是将半纤维素水解成木糖和其它低聚糖的糖苷酶族群的通称。半纤维素酶可包括木聚糖酶、内切木聚糖酶、外切木聚糖酶、β-木糖苷酶、阿拉伯木聚糖酶、甘露聚糖酶、半乳糖酶、果胶酶和葡萄糖醛酸酶。糖化酶也包括淀粉水解糖苷酶，例如但不限于淀粉酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、α-葡糖苷酶和异淀粉酶。糖化酶的具体实例包括羧甲基纤维素酶、木聚糖酶、β-葡糖苷酶、β-木糖苷酶和α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶以及淀粉酶。糖化酶是市售的，例如，CTec2和HTec2或CTecIII(Novozymes，Denmark)、和Accellerase(DuPontIndustrialBiosciences，Rochester，N.Y.)、4(Codexis)和木聚糖酶(DuPontIndustrialBiosciences)。糖化酶也可以由宿主生物体(包括重组微生物)表达。在某些实施实施方式中，通过基因工程化植物或转基因植物生产糖化酶，例如，如Rabb等人在美国专利公开2012/0258503中所描述的，以引用的方式将其整体并入本文。

在一些实施方式中，催化剂是包含酸性单体和离子单体的聚合物，其中，各酸性单体具有至少一种Bronsted-Lowry酸，并且各离子单体独立地具有至少一种含氮阳离子基团或含磷阳离子基团。在一些实施方式中，Bronsted-Lowry酸选自于由磺酸、磷酸、乙酸、间苯二甲酸、硼酸和全氟酸组成的组。美国专利公开2012/0220740、2012/0252957和2013/0042859描述了合适的聚合物酸催化剂的实例，以引用的方式将它们整体并入本文。固液分离和酶再循环方法

本文所述的方法利用各种类型的分离器和分离方法。分离器分离的固体流将包含包埋(embedded)有水解酶的部分水解的生物质，所述水解酶在糖化工艺过程中以连续的方式再循环。使液体流进一步通过膜分离单元，以从包含一部分水解酶的液体中分离小的固体。在一些实施方式中，分离器是机械设备，包括但不限于离心机、沉降式离心机、碟片式离心机或压力机。在一些实施方式中，分离器是过滤器，例如压滤机、Vincent型压力机、滚筒压力机(cylinderpress)或砂型过滤器。在一些实施方式中，分离器是筛型分离器。筛型分离器的非限制性实例包括筛、振动筛、往复式筛(耙筛(rakescreens))、回转筛/筛粉机(sifters)和压力筛。

在一些实施方式中，分离器是膜型分离器。膜用于进一步从酶流中分离较小的生物质固体以及多糖和/或二糖和/或单糖和/或木质素和/或半纤维素和/或木糖和/或阿拉伯糖和/或甘露糖和/或半乳糖等，同时将酶(包括外切葡聚糖酶、内切葡聚糖酶、β-葡糖苷酶、内切木聚糖酶、木糖苷酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、果胶酶等)浓缩以再循环回系统中。膜型分离器的实例包括超滤(UF)膜、微滤(MF)膜以及设计用于实施MF或UF过滤的中空纤维过滤系统和切向流过滤(TFF)系统。

MF膜通常具有0.1μm～10μm的孔径(poresize)。微滤膜的实例包括诸如WhatmanGF/A膜的玻璃微纤膜。UF膜的孔径比MF膜小，通常在0.001～0.1μm的范围内。UF膜通常通过截留分子量(MWCO)来分类。超滤膜的实例包括具有低截留分子量(例如，约10kDa)的聚醚砜(PES)膜。UF膜是市售的，例如来自SynderFiltration(Vacaville，CA)。

使用MF或UF膜进行的过滤可用于直接流过滤(DFF)或切向流过滤(TFF)中。也被称为死端过滤的DFF将进料流垂直施加至膜面，从而大多数或所有流体通过膜。也被称作交叉流过滤的TFF将进料流平行施加至膜面，从而一部分作为滤液或渗出液(permeate)通过膜，而剩余部分(保留物(retentate))再循环回去跨膜或转用于其它用途。TFF过滤器包括微滤系统、超滤系统、纳米过滤系统和反向渗透过滤器系统。交叉流过滤器可以包含堆叠布置的多个滤板(过滤膜)，例如，其中滤板与渗出液和保留物板交替。待过滤的液体流过滤板，直径大于滤板孔径的固体或高分子量物类被保留并进入保留物流，而液体连同任何渗出液物类经由滤板扩散并进入渗出液流。包含保留物和渗出液板的TFF滤板可以由任何合适的结构材料形成，包括例如聚合物，如聚丙烯、聚乙烯、聚砜、聚醚砜、聚醚酰亚胺、聚酰亚胺、聚氯乙烯和聚酯等；尼龙、硅树脂(silicone)、氨基甲酸酯、再生纤维素、聚碳酸酯、醋酸纤维素、三乙酸纤维素、硝酸纤维素和纤维素混合酯等；陶瓷，如硅、锆和/或铝的氧化物；金属，如不锈钢；聚碳氟化合物，如聚四氟乙烯；以及兼容合金(compatiblealloys)，此类材料的混合物和复合物。适用于此类过滤的交叉流过滤器模块和交叉流过滤器盒可由SmartFlowTechnologies，Inc.(Apex，N.C.)商购。合适的此类交叉流过滤器模块和交叉流过滤器盒在以下美国专利中进行了不同描述：美国专利No.4,867,876、美国专利No.4,882,050、美国专利No.5,034,124、美国专利No.5,034,124、美国专利No.5,049,268、美国专利No.5,232,589、美国专利No.5,342,517、美国专利No.5,593,580和美国专利No.5,868,930；以引用的方式将所有这些专利的公开内容各自整体并入本文。

在一些实施方式中，分离器是反向渗透(RO)型分离器。RO型分离器的实例包括可以从KochMembraneSystems(Wilmington，MA)或SynderFiltration(Vacaville，CA)得到的RO螺旋膜。

糖化和发酵条件

糖化反应可以在最适合所用催化剂的温度和pH下或该温度和pH附近进行。在本方法的一些实施方式中，最适合糖化的温度范围为约15℃～约100℃。在其它实施方式中，该温度范围为约20℃～80℃、约35℃～65℃、约40℃～60℃、约45℃～55℃、或约45℃～50℃。取决于酶，最适合糖化酶的pH范围可以为约2.0～11.0、约4.0～6.0、约4.0～5.5、约4.5～5.5、或约5.0～5.5。

可以基于生物质的纤维素含量和/或存在于包含生物质的组合物中的固体的量以及还可以基于期望的纤维素转化速率来调节添加到反应中的催化剂的量。例如，在一些实施方式中，如酶提供者所指定的，添加的酶的量基于存在于生物质中的纤维素的重量百分数。在此基础上，这种实施方式中添加的酶占纤维素的重量百分数范围可为约0.1％～约20％。

现在将对非限制性实施方式进行描述。

实施方式的描述

现参照图1，对一个说明性实施方式进行描述。如图1所示，将生物质(BM)和糖化酶(E)以及水加入到高剪切磨碎/糖化单元中。对BM处理4-6小时，并使部分糖化的生物质混合物通过固-液分离(SLS)单元。SLS将混合物分离成包含糖的液体流，该液体流被送到糖储存器。在本文所述的该实施方式和其它实施方式中，可以根据需要将所述糖转化成生物燃料、生化制品、化学产品或其它下游产品。

将具有关联酶的固体流(SE)送回高剪切磨碎/糖化单元，并孵育另外的6-8小时。然后，可使水解的生物质通过SLS以回收具有额外的糖的液体流。

在此实施方式的变型中，将BM+E加入到高剪切磨碎/糖化单元中。对BM处理4-6小时，并使部分糖化的生物质混合物通过固-液分离(SLS)单元。用如上所述的方法处理液体流，并将固体流添加回高剪切磨碎/糖化单元，而不加入额外的生物质。使固体进一步糖化另外的12小时，然后使其通过SLS设备，以产生包含糖的第二液体流和第二固体流(第二固体流被清除(purged)或用于下游产物)。

现参照图2，对另一个说明性实施方式进行描述。如图2所示，将生物质(BM)和糖化酶(E)以及水加入到初级高剪切磨碎/糖化单元中。对BM处理4-6小时，并使部分糖化的生物质混合物通过固-液分离(SLS)单元以产生第一固体流和第一液体流。在此实施方式中，将第一固体流加入到次级高剪切磨碎/糖化单元中。在适于产生额外的糖的条件下，将第一固体孵育另外的6-8小时。然后，使这些水解的固体通过SLS以产生第二固体流和第二液体流，如上所述，将具有额外的糖的第二液体流加入到糖储存器中。第二固体流被清除或用于下游产物。

在此实施方式的变型中，使用第一SLS将部分糖化的生物质分离，以产生包含糖的第一液体流和具有关联酶的第一固体流(SE)。将第一固体加入到次级单元中，其在一个实施方式中为高剪切磨碎/糖化单元(需要时加入水将固体稀释成浆液)，并孵育另外的12小时以产生水解的固体。使用第二SLS将水解的固体混合物分离，以产生具有糖的第二液体流(L)和第二固体流(S)。如本文所述，可对来自第一液体流和第二液体流的糖进行加工，例如，根据需要转化成生物燃料、生化制品、化学产品或其它下游产品。第二固体流可被清除或用于下游产物。

现参照图3，对另一个说明性实施方式进行描述。如图3所示，将生物质(BM)和糖化酶(E)以及水加入到初级高剪切磨碎/糖化单元(A)中。对BM处理4-6小时，并使部分糖化的生物质混合物通过固-液分离(SLS)单元以产生包含糖的第一液体流(L)和具有关联酶的第一固体流(S)(具有酶的固体)。在此实施方式中，可将固体流加入到第二罐(B)中，其在一些实施方式中为高剪切磨碎/糖化单元。在适于产生额外的糖和水解固体流的条件下，将加入到单元(B)中的固体孵育另外的6-8小时。然后，使水解的固体流通过SLS，以产生第二液体流和第二固体流，并如上所述，将具有额外的糖的第二液体流加入到糖储存器中。可将具有酶的第二固体流加入到第三罐(C)中，必要时用水将固体稀释以形成浆液。在一些实施方式中，第三罐(C)是高剪切磨碎/糖化单元。在适于产生额外的糖的条件下，在第三单元(C)中将第二固体孵育另外的8-12小时。然后使第二水解固体通过SLS，以产生第三固体流和第三液体流，并将具有额外的糖的第三液体流加入到糖储存器中，而剩余的固体可被清除或用于下游产物或再循环回到单元A、B或C中。应该理解的是，虽然只示出了一个SLS单元，可使用多于一个SLS单元，例如，SLS设备可位于各个糖化单元之间，以将水解的固体混合物分离成固体流和液体流。在一些实施方式中，各个SLS设备是同一类型的设备(例如，膜过滤器设备)；而在其它实施方式中，SLS设备是彼此不同的(例如，离心机和TFF设备)。

现参照图4，对用于处理生物质的连续批量工艺的说明性实施方式进行描述。如图4所示，将生物质(BM)和糖化酶(E)以及水(必要时)加入到高剪切磨碎/糖化单元中。在适于将生物质组分水解成糖的条件下对BM处理4小时，并使部分糖化的生物质混合物通过固-液分离(SLS)单元以产生包含糖的液体流(L)和具有关联酶的固体流(具有酶的固体)。将液体流加入到糖储存器中。将具有酶的固体加回糖化单元中，并与新鲜生物质和额外的酶(必要时)合并，以确保有效水解。在适于将生物质组分水解成糖的条件下，再对该固体/生物质/酶混合物处理4小时。重复该工艺，使得在每个分离步骤之后，在适于将生物质组分水解成糖的条件下，在糖化单元中将具有酶的固体与新鲜生物质合并。然而，因为固体流中的酶被再循环并与新鲜生物质接触，每一轮需要添加较少的额外的酶。因此，上述工艺降低了水解新鲜生物质所需的酶量，这降低了生物燃料设施的运行成本。

在另一方面，本发明提供了用于处理生物质的系统。在一个实施方式中，该系统包含：第一螺旋钻，所述第一螺旋钻包含固体入口、位于所述螺旋钻内并用于将所述螺旋钻中的固体物质从第一端引导到第二端的螺杆(screw)、所述第一端处的液体出口、以及所述第二端处的固体出口；分离器，所述分离器适于将所述生物质分离成液相和固相，并且所述分离器位于(i)所述液体出口与(ii)所述螺杆和所述固体出口之间；以及第二螺旋钻，所述第二螺旋钻包含用于接收来自所述第一螺旋钻的固体物质的与所述固体出口流体连通的入口、以及固体出口。

在一些实施方式中，所述系统进一步包含第二分离器，所述第二分离器适于将所述生物质分离成液相和固相，并且所述第二分离器位于(i)所述第一螺旋钻的固体出口与(ii)所述第二螺旋钻的入口之间，其中，所述第二分离器与所述第一螺旋钻的固体出口和所述第二螺旋钻的入口流体连通。

在一些实施方式中，第一分离器和/或第二分离器是筛、振动筛、离心机或压力机或串联运行的这些单元的组合。在一些实施方式中，第一分离器和/或第二分离器与适于将液相分离成滤液和保留物的过滤器流体连通。在一些实施方式中，过滤器与第一螺旋钻的液体出口以及第一螺旋钻和/或第二螺旋钻的入口流体连通。在一些实施方式中，过滤器单元所具有的孔径使得与滤液或渗出液相比，保留物包含浓缩的酶和/或聚合物添加剂，如聚乙二醇(PEG)。

在一些实施方式中，所述螺杆以与所述螺旋钻内的液体流动的方向相反的方向输送所述固体物质。在一些实施方式中，所述螺旋钻倾斜，使得所述液体出口低于所述固体出口。

在一些实施方式中，第一螺旋钻和/或第二螺旋钻进一步包含用于添加生物质、固体、酶和/或再循环流的额外入口。

在一些实施方式中，第一螺旋钻不具有液体出口，通过螺杆将所有材料运送至第二螺旋钻。

在一些实施方式中，所述系统进一步包含至少一个额外的螺旋钻，该螺旋钻包含：入口，所述入口与第一螺旋钻和/或第二螺旋钻的固体出口流体连通；以及固体出口，其中，所述至少一个额外的螺旋钻与第一螺旋钻和第二螺旋钻串联成行(alignedinseries)，从而将固体物质引导通过串联的螺旋钻。在一些实施方式中，所述螺旋钻中的至少一个的固体出口与适于从处理的生物质中去除液体的第三分离器流体连通。

在一些实施方式中，在第一螺旋钻内的停留时间(residencetime)可足以水解约10％至20％至30％至40％的生物质。在第一螺旋钻内的停留时间可以为0.5小时至36小时，优选1小时至4小时。在第二螺旋钻和随后的螺旋钻内的停留时间可以为0.25小时至4小时。

实施例

实施例1

此实施例显示了在固液相分离后，预处理的生物质的糖化效率提高。

在以下条件下对热预处理的生物质(30加仑规模)进行糖化：将纤维素酶(AccelleraseTrio)加入到预处理的生物质中，随后混合，并在酶加入后的T＝0、12、24和48小时处对样品进行采样。

对在酶加入后的T＝0、12、24和48小时处采集的生物质样品进行离心，使固体残留物与液体分离。将固体残留物用新鲜水重悬、并通过浆液孵育进一步糖化处理24小时。然后使用本领域熟知的方法通过高效液相色谱(HPLC)对样品中的葡萄糖和木糖含量进行分析。糖的产量以％(w/v)计，糖的转化以生物质中纤维素和半纤维素的总量为基础计算。

在某些情况下，对液体部分和固体部分均补充solkafloc(SF)生物质，以观察在两个部分中SF的进一步水解。向液体部分和固体部分添加SF的原因是为了(i)了解在固体残留物或在液体中的活性纤维素酶的定位和功能属性；以及(ii)提供证据表明向固体残留物和/或液体中加入的新生物质可在不加入任何额外的酶混合物的情况下水解。因此，solkafloc在这里代表还包含木聚糖的新鲜纤维素生物质。Solkafloc是用于测试纤维素酶活性的标准的含纤维素生物质。与木质纤维素生物质相比，它是更简单的生物质；与微晶纤维素(Avicel)相比，它是均质性更低的纤维素制品。Solkafloc水解通过追踪糖化过程中葡萄糖和木糖的释放提供了测量葡聚糖和木聚糖转化的优势。

在T＝0、T＝24小时进行采样。糖化在标准条件下于50℃进行。在500mL烧瓶中以100克材料完成实验室规模的糖化。本文提及的贯穿全文的一般糖化工艺如下：用氢氧化铵水溶液将热预处理的生物质的pH调节至5。然后将该材料与AcceleraseTrio接触。通过以反应中葡聚糖的含量、生物质的量和生物质的固体％为基础计算所需的AcceleraseTrio的浓度来确定酶的加入。将充分混合的生物质一式三份地转移到500mL烧瓶中(各100gm)用于进行糖化。

从30加仑罐收集的糖化时间T＝0的生物质在24小时中具有3.4w/v％的葡萄糖释放(“原样(AsIs)”，无solkafloc且无固液分离)。包含作为纤维素酶活性测试底物的solkafloc的平行样品在同样的糖化时间内将葡萄糖释放提高到4.9w/v％(图5)。此为葡萄糖释放增加了44.1％。

在相同生物质的固/液分离之后，在分离的糖化上清液(Sup)和重悬于新鲜水中的固体部分(沉淀)中观察葡萄糖释放。在Sup相24小时的糖化中，葡萄糖和木糖水平没有变化，表明Sup不包含任何可用于进一步糖化的多糖。24小时后，无solkafloc的Sup具有1.05w/v％的葡萄糖，包含solkafloc的样品则增加至1.87％。加入solkafloc之后葡萄糖的变化表明Sup包含可以将solkafloc水解成葡萄糖单体的纤维素酶。

与T＝0时的0.38％比较，未添加solkafloc的固体残留物“沉淀”在T＝24的糖化时产生高得多的3.09w/v％的葡萄糖。这证明固体残留物包含高水平的活性纤维素酶，其即使在将Sup与固体残留物分离之后仍继续糖化生物质。包含solkafloc的固体部分显示出葡萄糖的进一步释放，从T＝0时的0.41％至24小时时的4.76％(图5)，表明固体关联的纤维素酶对外源性solka-floc底物的活性。

这些结果证明，活性纤维素酶与显示出比未分离的“原样”样品更高活性的固体部分关联(以图5中的数据计算，葡萄糖释放增加1.7倍)。

在糖化T＝12小时采集的“原样”生物质具有3.32w/v％的葡萄糖，其在24小时糖化后达到3.6％，几乎未增长。这表明与T＝0样品相比，纤维素酶生产率在“原样”样品中损失。这一点通过在包含solka-floc的样品中较低的C6转化得到确证：从缺少solkafloc的样品中3.6w/v％的葡萄糖的基数，在包含solkafloc的样品中糖化24小时时达到4.6w/v％的葡萄糖。因此，酶对外源添加的底物的活性比在T＝0采样点时低，这可能是由于C6纤维素酶的葡萄糖终产物抑制、不可用的底物或其它因素。

与来自于图5中T＝0的样品的观察结果一致，取自T＝12时间点的Sup(图6)通过加入solkafloc具有增加的葡萄糖，从3.32％增加至3.99％(图6)，表明Sup包含活性纤维素酶。固体部分显示出更高的相对葡萄糖增加，其中，在24小时的糖化后，无solkafloc的样品从0.61w/v％增至1.0w/v％，具有solkafloc的样品从0.6％增至2.5％(图6)。

图7示出了从30加仑罐的24小时糖化材料得到的酶再循环测试结果。在对照糖化中，当孵育另外的24小时时，无solkafloc的“原样”生物质的葡萄糖释放几乎没有增长。当加入solkafloc时，葡萄糖从3.6％增加至4.7％(图7)，表明酶仍极具活性且与图6中的观察结果类似。

在此时间点，发现葡萄糖释放接近饱和，Sup具有增加的糖浓度(30加仑样品中的24小时糖化材料)。与solkafloc孵育的固体部分仍显示出葡萄糖释放的增加，但是小于12小时的样品。这表明固体残留物具有活性纤维素酶，然而24小时糖化的生物质中的可用多糖较少(图7)。

48小时糖化材料的结果类似(图8)，在24小时糖化之前和之后以及在solkafloc存在和不存在时，显示出类似的葡萄糖水平。

这些结果表明，功能性纤维素酶在固体部分中，且直至48小时仍保持活性以用于再循环。

实施例2

早期阶段固液分离对糖化和发酵的影响。

在早期时间点将Sup从糖化生物质中移除，在此之后，对连续糖化和发酵的效率和可重复性进行了测定(在T＝4小时进行SLS)。图9显示了在T＝20小时(总糖化)内，相较于离心的固体残留物和Sup而言，葡萄糖和木糖从生物质的释放。这些结果表明，相较于未分离的材料(得到3w/v％的葡萄糖)，当总固体和Sup的葡聚糖转化百分比加在一起时，糖释放更高(2.34％+1.63％＝3.97w/v％的葡萄糖)。

在糖化早期进行固/液分离，随后对各部分继续糖化，产生了比未分离的材料更高的总糖产率。

实施例3

由磨碎糖化和固液分离释放的糖的发酵。

通过对糖化生物质(T＝4小时糖化)进行离心将糖化4小时后的生物质分离成固体部分和液体部分。将具有葡萄糖和其它糖的液体流冷却至4℃，而对固体残留物补充等体积的新鲜水并糖化另外的12小时(总糖化时间为16小时)。生物质中初始糠醛浓度为900ppm，接近本实验使用的酵母菌株的可接受发酵的上限。

将取自a)16小时糖化的生物质、b)12小时糖化的固体残留物(总糖化时间为16小时)和c)糖化T＝4小时分离的Sup的样品以40×10⁶酵母细胞/gm材料的比例进行接种并发酵(图10)。

发酵对于16小时糖化的生物质和Sup而言是不成功的，但对于12小时糖化的固体残留物而言是成功的，这可能是由于从液体流中除去抑制剂将大部分活性纤维素酶混合物留在固体部分中。

使用具有高糠醛浓度的预处理的生物质的这些结果证明，早期糖化材料的分离使得来自固体部分的糖能够被更有效地发酵。

实施例4

使用磨碎糖化和固液分离对>30％的水热预处理的生物质进行的连续糖化。

对具有>30％的固体％的生物质进行磨碎和糖化，4小时后通过离心将其分离成固体部分和液体部分(T＝4)。将具有葡萄糖和其它糖的液体流冷却至4℃，而对固体残留物补充等体积的新鲜水并糖化另外的16小时。

图11证明，对高固体含量的生物质的磨碎糖化和固液分离与在较低固体百分比的生物质条件中的情况一样有效。

与对照相比，固相(水补足的)样品显示相同的糖化效率，表明在高固体浓度中，同步磨碎和糖化联合固相再循环系统是有效的。

实施例5

β-1,4-糖苷键(β-1,4-内切葡聚糖酶由此得名)将纤维素的β-D-吡喃葡萄糖单元连接在一起。β-1,4-内切葡聚糖酶(EG)特异性切割纤维素链的内键。需要外切葡聚糖酶或纤维二糖水解酶(CBH)、EG和β-葡糖苷酶(BG)来将纤维素完全分解成葡萄糖单体。在水热预处理的玉米秸秆中对内切葡聚糖酶和β-葡糖苷酶的结合行为进行了测定，以测试它们对葡聚糖转化的作用。

使用内切葡聚糖酶(EG)和β-葡糖苷酶(BG)(由酿酒酵母菌株表达和分泌)来测试这些纤维素酶的结合性质。EGII具有纤维素结合结构域，而BG没有。

将1克水热预处理的玉米秸秆与500μL(30μg/μl)各自浓缩的纤维素酶催化剂混合并在50℃下对样品进行孵育。在不同时间点收集上清液，除0.1％SDS洗涤外，进行或不进行缓冲液洗涤。在使用针对各个酶催化剂的多克隆抗肽抗体进行蛋白质印迹之前，将上清液用三氯乙酸(TCA)沉淀并用丙酮洗涤。图12A示出了示意图，图12B示出了实验结果。

与在糖化材料的可溶性液体部分中可见的β-葡糖苷酶(BG)不同，内切葡聚糖酶(EG)强烈地与固相结合。

实施例6

β-葡糖苷酶是作用于连接两个葡萄糖或葡萄糖取代分子(即二糖、纤维二糖)的β-1,4键的糖苷酶。它是对各种β-D-糖苷底物具有特异性的外切纤维素酶。它催化β-D-葡糖苷中的末端非还原性残基的水解，释放葡萄糖。在预处理的玉米秸秆中对β-葡糖苷酶(BG)的行为进行测试，以评估早期糖化分离生物质中的β-葡糖苷酶的定位和活性。

使用纤维素酶混合物(AccelleraseTrio)对生物质进行糖化，并将其孵育4小时。将糖化的生物质离心，并加入等量的新鲜水使生物质固体部分标准化。继续糖化4小时。向各烧瓶中加入纤维二糖(2w/v％)作为外源性底物并孵育4小时。通过HPLC测定葡萄糖和木糖。

在4小时后收集糖化生物质，并离心以分离固体部分和液体部分。液体(上清液)和固体残留物均用水标准化，补充以2％的纤维二糖，并于50℃在振荡孵育箱中过夜孵育。

如下为简要图解：

图13示出了上清液和固体部分(用纤维二糖补充)中的葡萄糖生成。BG活性在上清液和固体残留物中几乎同等分布。另外，来自固体残留物的液体的两次随后替换仍表现出BG活性。上清液中的BG活性在4小时内达到饱和。

这个实施例表明生物质固体部分保留了用于纤维二糖转化的足够的BG活性。

实施例7

这个实施例表明本文所述的工艺可以在18小时内将玉米秸秆中80％的葡聚糖转化成葡萄糖。

使用葡聚糖含量为19-40％的玉米秸秆。在140-190℃进行水热预处理，停留时间为30-90分钟，保持生物质固体％(w/w)的范围为10％-40％。使用新鲜预处理的生物质进行各实验。在糖化开始之前，调节pH为4-6.5之间。糖化反应在磨碎反应器中进行。糖化温度为30-60℃，旋转速度为120-200rpm。台式球和/或杆磨碎反应器填装有20-80％的生物质(体积比)并加入纤维素酶混合物。使用商业化纤维素酶混合物(Ctec2和Htec2；Novozymes，Denmark)进行糖化；10％(w/w)的Ctec2加样是基于生物质的葡聚糖含量，而基于生物质的固体％加入0.5％(w/w)的Htec2。

生物质组成分析：对生物质中的提取物(extractives)进行如ASTM方法1107所述的组成分析。在真空下将液体蒸发并通过重量分析测定提取物含量。制备0.1g样品并通过标准生物质分析方法(NREL)[TAPPI测试方法(T22-om88)]中描述的两阶段酸水解法进行表征。第一水解步骤使用72％的硫酸在30℃进行1小时。立即将样品稀释至4％并高压灭菌1小时。所得固体残留物记为酸不溶性木质素。水相中的糖通过高效液相色谱(HPLC)定量。通过为每个糖物类建立标准曲线并相对于标准糖样品进行验证，对葡聚糖、木聚糖和阿拉伯聚糖含量进行定量。使用110L/gcm的消光系数，通过205nm处的UV吸收测定酸可溶性木质素。通过在烘箱中于575℃燃烧材料并每4小时检查恒重来测定灰分含量。

在pH调节后，向预处理的玉米秸秆中加入纤维素酶。在酶和生物质充分混合后，对混合物进行磨碎-糖化工艺。在磨碎的T＝2和T＝4小时进行SLS。在这两种情况下，总糖化时间为18小时。在SLS(T＝2小时和T＝4小时)之前以及在18小时时记录葡聚糖转化％。进行粒径分析并与T＝0的生物质(在开始磨碎-糖化工艺之前刚加入酶的样品)相比较(见表1)。计算了所有测试样品的葡聚糖转化速率。

表1：磨碎之前和之后材料的粒径分布

图14示出了磨碎过程中不同时间点材料的粒径分布。图15示出了用高剪切磨碎-糖化联合SLS处理的玉米秸秆的葡聚糖向葡萄糖(C6)的转化。在高剪切磨碎条件下糖化处理仅2小时、结合对固体进行另外16小时的分离后糖化处理(总共18小时糖化)，导致80.6％的葡聚糖转化成葡萄糖。图16示出了依照处理和时间给出的葡聚糖转化速率(％/小时)。

此实施例表明，在高剪切磨碎条件下糖化仅2小时、继以额外糖化16小时，导致生物质中80％的葡聚糖转化成葡萄糖。

实施例8

这个实施例证明了在少于18小时内有80％的葡聚糖转化。验证了增加的葡聚糖转化与降低的粒径的直接关联。

在此实验中，在糖化3小时后进行SLS，并每隔三小时进行粒径分布分析，直到18小时。

如图17所示，该工艺在糖化时间为15小时时给出了>80％的C6转化。18小时则给出了>90％的C6转化。图18示出了糖化材料(T＝3至T＝24)和未糖化材料(T＝0)的粒径分布。观察到粒径和葡聚糖转化之间的线性负相关性：由较小的粒径观察到最高的转化。在T＝24小时糖化时，粒径从T＝0时的初始30-800μm降至1.8-40μm的范围。

实施例9

这个实施例对用于从生物质生产糖的系统进行了阐释，其中，使用螺旋钻，在适于将生物质水解成糖的条件下使酶与生物质接触。使用振动筛和切向流过滤系统(TFF)将酶再循环。

在本实施例中，使用位于螺旋钻底部的筛将螺旋钻液相与螺旋钻固相分离开。使用振动筛将此螺旋钻液相进一步分离，以产生第一液相和第一固相。将第一液相储存在适于生产糖的条件下。在第二步骤中，使用TFF膜将第一液相分离成包含糖和一些溶解固体的第二液相或渗出液以及包含酶、糖和任何残留颗粒固体的第二固相或保留物。然后，通过使用逆流洗涤将保留物与各螺旋钻中的螺旋钻固体再合并。本实施例中使用的生物质是甘蔗渣，并且系统连续运行超过10天。

图19中绘出了用于从生物质生产糖的系统的整体示意图。在179℃将甘蔗渣生物质预处理40分钟。将甘蔗渣浆料(12％固体)转移到5个螺旋钻中的第一个，即混合螺旋钻。没有液体再循环发生到该螺旋钻中。以相对于甘蔗渣中的葡聚糖而言酶为20wt％的剂量，将Accellerase添加至混合螺旋钻中的甘蔗渣。另外，以相对于溶液中的固体质量而言聚乙二醇(PEG)质量为2％的剂量，将PEG添加至混合螺旋钻中的生物质。螺旋钻是隔热的，螺旋钻内部温度保持在50℃。使用螺旋输送机将固相移动通过混合螺旋钻，并将其泵送到下一个螺旋钻，即4个糖化螺旋钻中的第一个(见图19)。在糖化螺旋钻中，使用位于或靠近螺旋钻起点但在入口之后的网筛将螺旋钻液相与螺旋钻固体分离开。使用螺旋输送机将螺旋钻固相移动通过各糖化螺旋钻，并将其泵送到下一个螺旋钻。

将离开第四糖化螺旋钻末端的固体在添加来自混合螺旋钻的材料的部位处再循环回第一糖化螺旋钻的起始部。为了有助于从糖化螺旋钻去除螺旋钻液体，这些螺旋钻以从起始部到末端具有3°倾斜的方式操作。在通过螺旋钻筛后，使液体流过具有25μm或43μm筛的振动筛(Sweco，Florence，KY)。将没有通过筛的固体再循环回到螺旋钻系统中。随后将液体送到TFF系统，该系统由包含150kDa聚醚砜(PES)膜的9.8m²模块(SmartFlowTechnologies，Apex，NC)构成。将来自TFF的保留物周期性地再循环回糖化螺旋钻，而将包含额外的糖的渗出液从系统移除。

在连续螺旋钻糖化工艺中的关键点处测定内切葡聚糖酶(Endo)、外切纤维素酶(Exo)和β-葡糖苷酶(BG)的活性以证实酶的再循环。分别使用azo-CM-纤维素测定内切葡聚糖酶的活性、使用对-硝基苯基-β-D-吡喃乳糖苷测定外切葡聚糖酶的活性、使用对-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷测定β-葡糖苷酶(BG)的活性。首先使用分散剂将吸附到生物质固体上的酶解吸，并将所得溶液渗滤(diafiltered)。按原样将液体样品渗滤。分别基于这两部分的体积计算两部分的总纤维素酶活性。

样品点包括酶添加点(图19中的点1)、固体和液体进料至Sweco振动筛(图19中的点2)以及切向流过滤器(TFF)系统产生浓缩物和渗出液(图19中的点3和点4)。将活性测定与再循环材料的体积结合，以计算各种上述活性的总再循环活性。然后将分析标准化至初始酶浓度以确定经由筛再循环流或TFF再循环流返回到螺旋钻系统的各酶的比例。

此分析计算了来自于振动筛和来自于TFF渗出液的在更高浓度固体流中再循环的酶的活性(表2)。送至振动筛的进料包含1.20×的总内切葡聚糖酶活性、0.60×的总外切葡聚糖酶活性和0.84×的总BG活性。由于在螺旋钻糖化工艺中的条件下组成酶的活性随时间的损失不同，使得到达振动筛的残留活性在不同酶活性之间差异很大。由于内切葡聚糖酶的活性降低最小并因此在螺旋钻糖化中测定的相对残留活性最高，它还具有对于振动筛的相对最高进料。事实上，进料至振动筛的内切葡聚糖酶比进料至系统中的总内切葡聚糖酶更高，明确表明在采样之前的运行过程中，内切葡聚糖酶高程度地再循环。

振动筛从溶解固体中分离出大固体(约大于50μm)。如上文所述技术所测量的，固体部分每克材料具有的酶活性相较于液体部分高约8-12倍。振动筛非常有效地收集固体和酶并将它们再循环回糖化系统。在所有三种酶的情况下，约70％的进料至振动筛中的酶被再循环回糖化系统。

在振动筛之后，利用TFF对通过50μm网孔的包含溶解固体和不溶解颗粒的材料进行加工。在TFF中，当糖通过膜时，酶和葡聚糖被浓缩。使来自TFF的浓缩物再循环回糖化系统。此再循环流包含0.16×的总内切葡聚糖酶活性、0.08×的总外切葡聚糖酶活性和0.08×的总BG活性。因为在行进至TFF系统之前，振动筛已经移除了约2/3的酶活性单位，由TFF系统再循环的酶活性单位的总量比从振动筛再循环的要低得多。此外，运行结束时，浓缩罐中残留了酶活性。因此，在连续运行中，此活性还将被再循环回糖化系统中。

表2-使用连续螺旋钻工艺的甘蔗渣糖化过程中存在于不同工艺流中的相对酶活性。

应当理解的是，本文所述的实施例和实施方式仅用于说明目的，并且，基于它们进行的各种修改或改变将是本领域技术人员所能够预见的、并将包含在本申请的精神和范畴以及所附权利要求书的范围内。出于所有目的，将本文所引用的所有公开出版物、专利和专利申请的全部内容以引用的方式并入本文。

Claims (42)

1.一种用于从生物质生产糖的方法，所述方法包含：

(a)在高剪切搅拌条件下使所述生物质与催化剂接触，以将所述生物质的组分水解成糖，从而产生包含糖的固液混合物；

(b)将所述混合物分离成包含糖的液体流和包含固体的固体流；

(c)在适于将所述固体的组分水解成糖的条件下孵育所述固体流，从而生产额外的糖。

2.如权利要求1所述的方法，其中，所述生物质包含葡聚糖，且所述生物质中至少80％的葡聚糖在约6小时至约24小时内被水解成葡萄糖。

3.如权利要求1所述的方法，其中，所述生物质为木质纤维素生物质。

4.如权利要求1所述的方法，其中，在接触步骤之前，所述生物质包含至少约10w/w％的固体。

5.如权利要求1所述的方法，其中，所述生物质为预处理的生物质。

6.如权利要求1所述的方法，其中，所述催化剂包括酶和/或非酶催化剂。

7.如权利要求1所述的方法，其中，步骤(a)中的条件产生如下生物质粒径：其中，至少约80％的颗粒具有约2微米至约200微米的粒径。

8.如权利要求1所述的方法，其中，使用机械设备、过滤器、膜或切向流过滤设备将所述混合物分离。

9.如权利要求8所述的方法，其中，所述机械设备为离心机、压力机或筛。

10.如权利要求1所述的方法，其中，在接触步骤约2小时至约4小时后进行分离步骤。

11.如权利要求1所述的方法，其中，在接触步骤约4小时至约6小时后进行分离步骤。

12.如权利要求2所述的方法，其中，当约30％至约60％的葡聚糖被转化时，进行分离步骤。

13.如权利要求1所述的方法，其中，孵育步骤进行约8小时至约20小时。

14.如权利要求2所述的方法，其中，相较于不含分离步骤的方法的葡聚糖转化量，该方法的葡聚糖转化量至少提高10％。

15.如权利要求1所述的方法，该方法进一步包含在间歇、半间歇或连续工艺中使来自步骤(c)的所述固体与额外的生物质接触。

16.如权利要求15所述的方法，其中，所述额外的生物质包含催化剂。

17.如权利要求1所述的方法，其中，在高剪切搅拌条件下进行孵育步骤。

18.如权利要求1所述的方法，其中，将来自步骤(b)的所述液体流的糖和/或来自步骤(c)的所述额外的糖加工成乙醇、生物燃料、生化制品或其它化学产品。

19.如权利要求1所述的方法，其中，相较于未在步骤(a)的条件下进行处理的生物质，来自步骤(c)的水解组分包含降低浓度的污染物。

20.如权利要求1所述的方法，其中，在施用高剪切之后，使所述生物质与适于将所述生物质的组分水解成糖的催化剂接触。

21.如权利要求1或20所述的方法，其中，所述高剪切搅拌条件包含使用高剪切/磨碎混合设备对所述生物质进行处理，所述高剪切/磨碎混合设备包含转子和定子，其中，所述转子和所述定子之间的间隙设置为0.1毫米至2.2毫米。

22.如权利要求1所述的方法，该方法进一步包含：

(d)将在(b)中产生的所述液体流分离成包含糖的第二液体流和包含固体的第二固体流；以及

(e)在适于将所述固体的组分水解成糖的条件下孵育所述第二固体流，从而生产额外的糖。

23.一种用于从生物质生产糖的方法，所述方法包含：

(a)使用包含转子和定子的高剪切/磨碎混合设备对所述生物质进行预处理，其中，所述高剪切/磨碎混合设备在所述转子和所述定子之间具有0.1毫米至2.2毫米的间隙设置，从而减小所述生物质中生物质颗粒的粒径；

(b)使所述生物质与催化剂接触以将所述生物质的组分水解成糖，从而产生包含糖的固液混合物；

(c)将所述混合物分离成包含糖的液体流和包含固体的固体流；

(d)在适于将所述固体的组分水解成糖的条件下孵育所述固体流，从而生产额外的糖。

24.如权利要求23所述的方法，其中，在预处理步骤(a)之前，将所述生物质与水混合以提供生物质/水混合物。

25.如权利要求23所述的方法，其中，所述生物质包含葡聚糖，且所述生物质中至少80％的葡聚糖在约6小时至约24小时内被水解成葡萄糖。

26.如权利要求23所述的方法，其中，所述生物质为木质纤维素生物质。

27.如权利要求23所述的方法，其中，在接触步骤之前，所述生物质包含至少约10w/w％的固体。

28.如权利要求23所述的方法，其中，所述生物质为预处理的生物质。

29.如权利要求23所述的方法，其中，所述催化剂包括酶和/或非酶催化剂。

30.如权利要求23所述的方法，其中，步骤(a)中的条件产生如下生物质粒径：其中，至少约80％的颗粒具有约2微米至约200微米的粒径。

31.如权利要求23所述的方法，其中，使用机械设备、过滤器、膜或切向流过滤设备将所述混合物分离。

32.如权利要求31所述的方法，其中，所述机械设备为离心机、压力机或筛。

33.如权利要求23所述的方法，其中，在接触步骤约2小时至约4小时后，进行分离步骤。

34.如权利要求23所述的方法，其中，在接触步骤约4小时至约6小时后，进行分离步骤。

35.如权利要求25所述的方法，其中，当约30％至约60％的葡聚糖被转化时，进行分离步骤。

36.如权利要求23所述的方法，其中，孵育步骤进行约8小时至约20小时。

37.如权利要求25所述的方法，其中，相较于不含分离步骤的方法的葡聚糖转化量，该方法的葡聚糖转化量至少提高10％。

38.如权利要求23所述的方法，该方法进一步包含在间歇、半间歇或连续工艺中使来自步骤(c)的所述固体与额外的生物质接触。

39.如权利要求38所述的方法，其中，所述额外的生物质包含催化剂。

40.如权利要求23所述的方法，其中，在高剪切搅拌条件下进行孵育步骤。

41.如权利要求23所述的方法，其中，将来自步骤(b)的所述液体流的糖和/或来自步骤(c)的所述额外的糖加工成乙醇、生物燃料、生化制品或其它化学产品。

42.如权利要求23所述的方法，该方法进一步包含：

(e)将在(c)中产生的所述液体流分离成包含糖的第二液体流和包含固体的第二固体流；以及

(f)在适于将所述固体的组分水解成糖的条件下孵育所述第二固体流，从而生产额外的糖。