CN105200159B

CN105200159B - 骨性关节炎诊疗试剂及其应用

Info

Publication number: CN105200159B
Application number: CN201510753619.4A
Authority: CN
Inventors: 叶伟亮
Original assignee: Beijing Zhicheng Biomedical Technology Co Ltd
Current assignee: BEIJING ZHICHENG BIOMEDICAL TECHNOLOGY Co.,Ltd.
Priority date: 2015-11-06
Filing date: 2015-11-06
Publication date: 2018-06-15
Anticipated expiration: 2035-11-06
Also published as: CN105200159A

Abstract

本发明涉及骨性关节炎诊疗试剂及其应用，具体的涉及SLC38A1甲基化检测试剂及其在骨性关节炎诊断中的应用。发明人发现SLC38A1在骨性关节炎患者膝关节软骨组织中低表达，并且该基因甲基化程度较高，蛋白检测结果表明SLC38A1蛋白表达和基因甲基化呈负显著相关性，表明SLC38A1基因检测可用于诊治骨性关节炎，进一步还可以检测SLC38A1基因的甲基化。本发明为临床骨性关节炎检测提供了新的靶点。

Description

骨性关节炎诊疗试剂及其应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及骨性关节炎诊疗试剂及其应用，更具体的涉及SLC38A1甲基化检测试剂及其在骨性关节炎诊断中的应用。

背景技术

骨性关节炎(Osteoarthritis，OA)是一种以关节软骨的变性、破坏及骨质增生为特征的慢性疾病，又名退行性关节病，增生性骨关节炎。本病的发生率随年龄的增高而增多，是一个常见的老年人的关节病。目前骨性关节炎的病因尚未阐明，它的发生发展是一个长期、慢性和逐步渐进的过程，涉及全身和局部的许多因素，可能是综合因素所致。目前临床上缺乏有效的防治手段，严重影响患者的生活质量。目前骨性关节炎的病因尚未阐明。

在基因组中，除了DNA和RNA序列以外，还有许多调控基因的信息，它们虽然本身不改变基因的序列，但是可以通过对基因DNA和组蛋白的化学修饰、RNA干扰、蛋白质与蛋白质、DNA和其他分子的相互作用，而影响和调节基因的功能和特性，并且能够通过细胞分裂和增殖周期遗传给后代，这就是表观遗传学。表观遗传学机制主要涉及DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质重塑、非编码RNA调控等。DNA的甲基化是发现最早的、最基本的，也是研究最多的。启动子的DNA甲基化对基因的表达有抑制作用,而基因本体的DNA甲基化与基因的表达关系因物种或细胞类型不同而异。增强子的DNA甲基化状态与基因活性呈反比关系，沉默子则相反呈正相关。后基因组时代不仅揭示基于疾病与基因的关系，进一步阐述影响基因表达的原因。

发明通过对6例骨性关节炎病人及3例对照的膝关节软骨组织进行高通量甲基化测序分析及转录组测序分析，筛选出在病例组中呈高甲基化且基因表达下调的候选基因SLC38A1及其甲基化位点。进一步的分子生物实验验证了高通量测序结果。本发明提供了一种新的骨性关节炎诊治靶点，具有重要的临床应用价值。

发明内容

本发明的目的在于提供一种骨性关节炎诊疗试剂，所述诊疗试剂组分中的一种或几种用于检测或降低序列表中SEQ ID NO.3的CpG岛甲基化程度。

进一步，所述诊疗试剂组分中的一种或几种用于检测或降低序列表中SEQ IDNO.3的第116bp处和/或150bp处CpG岛甲基化程度。

优选的，采用BSP测序法对SEQ ID NO.3的甲基化程度进行检测，更优选的，采用引物序列为序列表SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5进行BSP测序检测。

优选的，采用甲基化特异性PCR法对甲基化程度进行检测，甲基化特异性PCR法包括一对甲基化检测引物和一对非甲基化检测引物。优选的，甲基化特异性PCR法对序列表中SEQ ID NO.3的第116bp处和/或150bp处CpG岛甲基化程度进行检测。

优选的，采用引物序列为序列表SEQ ID NO.6到SEQ ID NO.9进行甲基化特异性PCR法对甲基化程度进行检测。

进一步，采用下列方法中任意一种或几种的组合对甲基化程度进行检测：甲基化敏感的限制性内切酶方法、NaHSO₃法、芯片技术方法；所述NaHSO₃法包括BSP测序法、联合NaHSO₃限制性分析法、甲基化特异性PCR、荧光定量法；所述芯片技术方法包括甲基化高密度芯片、差异甲基化杂交、甲基化特异性寡核苷酸芯片。

甲基化敏感的限制性内切酶方法是经典的甲基化分析方法，主要根据一些限制性内切酶不能切开甲基化的DNA序列。由于在真核DNA或者哺乳动物DNA中，只有CG相连的胞嘧啶能够被甲基化，因此，在酶切位点内包含CG序列的限制性内切酶就会遇到问题。这种方法所使用的两个经典酶对是HPa II-Msp I(CCGG)和SmaI-Xma I(CCCGGG)。由于第二对限制酶识别序列非常罕见，所以一般都用HPa II-Msp I(CCGG)。两个酶都识别CCGG序列，而当其中的胞嘧啶甲基化时，HPaII不能够将其切开，利用Hpa II-Msp工的这种属性处理DNA，这就使得HPa II-Msp I能够作为快速甲基化分析的工具，随后进行Southern或PCR扩增分离立物，明确甲基化状态。

NaHSO₃可将非甲基化的C转化为U，后者经PCR扩增变成T而产生T：A配对，但甲基化的C则能抵抗NaHSO₃的修饰，这样DNA包含的甲基化信息就可转化为DNA序列的差异。由此发展了多种CpG岛甲基化检测方法，如BSP测序、PCR(COBRA，MSP，Methelight等)、芯片杂交技术(microarray)，此类方法适应于检测己知基因中一个或多个CpG岛的几个CpG位点的甲基化，属位点特异性DNA甲基化检测技术。

芯片技术的发展为高通量研究DNA甲基化提供了新的方法。它的方法原理大致可分为3种:(1)基于亚硫酸氢盐处理后C/T转变的原理，(2)基于甲基化敏感性内切酶或者甲基化依赖性内切酶的方法，(3)基于5-甲基胞嘧啶抗体或者MBD的免疫扑获方法富集甲基化的DNA片段。

本发明的目的在于提供上述诊疗试剂在制备骨性关节炎诊疗工具中的应用。

本发明的目的在于提供一种检测SLC38A1基因的试剂在制备诊断骨性关节炎诊断制剂中的应用。

进一步，所述诊断制剂中含有检测SLC38A1基因表达量和/或检测SLC38A1基因甲基化程度的试剂。

优选的，采用下列方式中的一种或几种检测SLC38A1基因表达量：荧光定量PCR试剂盒、基因芯片、ELISA法和/或胶体金法，更优选的，采用引物序列为序列表SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2进行SLC38A1基因表达量检测。

优选的，采用引物序列为序列表SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5检测SLC38A1基因甲基化程度；采用引物序列为序列表SEQ ID NO.6到SEQ ID NO.9检测SLC38A1基因甲基化程度。

基因芯片又称为DNA微阵列(DNA microarray)，可分为三种主要类型：1)固定在聚合物基片(尼龙膜，硝酸纤维膜等)表面上的核酸探针或cDNA片段，通常用同位素标记的靶基因与其杂交，通过放射显影技术进行检测。2)用点样法固定在玻璃板上的DNA探针阵列，通过与荧光标记的靶基因杂交进行检测。3)在玻璃等硬质表面上直接合成的寡核苷酸探针阵列，与荧光标记的靶基因杂交进行检测。基因芯片作为一种先进的、大规模、高通量检测技术，应用于疾病的诊断，其优点有以下几个方面：一是高度的灵敏性和准确性；二是快速简便；三是可同时检测多种疾病。

酶联免疫吸附实验(ELISA)即将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行的技术。该技术可用于检测大分子抗原和特异性抗体等，具有快速、灵敏、简便、载体易于标准化等优点。ELISA检测试剂盒根据检测目的和操作步骤可分为间接法、双抗夹心法、竞争法、双位点一步法、捕获法测IgM抗体、应用亲和素和生物素的ELISA。ELISA检测试剂盒中生色底物可选择辣根过氧化物酶(HRP)或者碱性磷酸酶(AP)。

常用的免疫胶体金检测技术：(1)免疫胶体金光镜染色法细胞悬液涂片或组织切片，可用胶体金标记的抗体进行染色，也可在胶体金标记的基础上，以银显影液增强标记，使被还原的银原子沉积于已标记的金颗粒表面，可明显增强胶体金标记的敏感性。(2)免疫胶体金电镜染色法可用胶体金标记的抗体或抗抗体与负染病毒样本或组织超薄切片结合，然后进行负染。可用于病毒形态的观察和病毒检测。(3)斑点免疫金渗滤法应用微孔滤膜作载体，先将抗原或抗体点于膜上，封闭后加待检样本，洗涤后用胶体金标记的抗体检测相应的抗原或抗体。(4)胶体金免疫层析法将特异性的抗原或抗体以条带状固定在膜上，胶体金标记试剂(抗体或单克隆抗体)吸附在结合垫上，当待检样本加到试纸条一端的样本垫上后，通过毛细作用向前移动，溶解结合垫上的胶体金标记试剂后相互反应，当移动至固定的抗原或抗体的区域时，待检物与金标试剂的结合物又与之发生特异性结合而被截留，聚集在检测带上，可通过肉眼观察到显色结果。该法现已发展成为诊断试纸条，使用十分方便。

本发明的目的在于提供一种治疗骨性关节炎的制剂，所述制剂中含有促进SLC38A1基因的转录或表达的试剂或化合物。

一种促进SLC38A1基因的转录或表达的试剂或化合物在制备治疗骨性关节炎制剂中的应用

本领域人员熟知促进基因及其表达产物的表达通常可以采用下述方法中的一种和/或几种：激活SLC38A1基因的启动子、激活SLC38A1基因表达的蛋白或因子、导入促进SLC38A1基因转录或表达的载体。

本发明的目的在于提供一种检测骨性关节炎的基因检测试剂盒，所述试剂盒检测基因SLC38A1。

本发明目的是提供了一种骨性关节炎蛋白检测试剂盒，所述的检测试剂盒检测SLC38A1蛋白。进一步的，所述的试剂盒还包括其他检测试剂。

本发明目的是提供了一种检测骨性关节炎的基因芯片，所述的基因芯片包括与SLC38A1基因的核酸序列杂交的探针。

附图说明

图1骨性关节炎组和对照组中SLC38A1基因甲基化情况

图2骨性关节炎患者组内SLC38A1蛋白表达和基因甲基化相关性分析图

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。

实施例1样本的采集及测序

对照组：收集2012-2014年因交通事故在医院进行半月板损伤及交叉韧带损伤进行关节镜手术治疗的患者，取膝关节软骨组织速存于液氮罐。

骨性关节炎患者组：收集2012-2014年在医院就诊，根据1995年美国风湿协会骨性关节炎的诊断标准，诊断为重度骨性关节炎，有膝关节置换指征的患者病例。

其中，临床诊断标准依据1995年美国风湿病协会所制定的标准：

(1)1个月内大多数时间有膝痛；

(2)关节活动时响声；

(3)晨僵不大于30分钟；

(4)年龄不小于40岁；

(5)膝关节骨性肿胀伴弹响；

(6)膝关节骨性肿胀不伴有弹响。

最少存在((1)、(2)、(3)、(4)或(1)、(2)、(3)、(5)或(1)、(6)即可诊断OA。

样品采集后，选择6例患者组3例对照组送往美吉生物公司进行转录组测序和全基因组甲基化测序，并提供初步的分析结果。测序结果显示候选基因SLC38A1在骨性关节炎患者膝关节软骨组织中低表达，同时该基因在患者膝关节软骨组织中甲基化程度明显高于正常组。

实施例2骨性关节炎患者及对照滑膜组织SLC38A1基因表达情况

1.实验材料

选取42例骨性关节炎患者滑膜组织及12例对照的滑膜组织，对其进行分组及编号。病例组均符合膝关节OA诊断标准，进行膝关节置换手术患者；对照组为半月板损伤及交叉韧带损伤进行关节镜手术治疗的患者。

2.实验方法

2.1骨性关节炎患者及对照的滑膜组织总RNA的提取

采用康为世纪动物组织/细胞RNA提取试剂盒(DNase I)(货号CW0560)进行样本RNA提取，实验操作如下：

1.样品处理：将组织在液氮中磨碎。每20-30mg组织加600μl Buffer RL(使用前检查是否加入β-巯基乙醇)，组织样本少于20mg加350μl Buffer RL。样品体积不超过BufferRL体积的十分之一。

2.样品充分裂解后，室温放置5分钟，使蛋白核酸复合物完全分离。

3.12000rpm离心2-5min，取上清进行以下操作。

4.向步骤3中得到的溶液中加入1倍体积(600μl或350μl)的70％乙醇(无RNase水配制)，混匀。

5.将上步所得溶液全部加入到吸附柱(Spin Column RM)中(吸附柱已装入收集管Collection Tube中)，若一次不能将全部溶液加入吸附柱中，请分两次转入，12,000rpm离心1分钟，弃废液。将吸附柱放回收集管中。

6.向吸附柱中加入350μl Buffer RW1，10,000rpm离心1分钟，弃废液，将吸附柱重新放回收集管中。

7.配制DNase I混合液：取52μl RNase-Free Water，向其中加入8μl 10×Reaction Buffer和20μl DNase I(1U/μl)，混匀，配制成终体积为80μl的反应液。

8.向吸附柱中直接加入80μl DNase I混合液，20-30℃孵育15分钟。

9.向吸附柱中加入350μl Buffer RW1，10,000rpm离心1分钟，弃废液，将吸附柱重新放回收集管中。

10.向吸附柱中加入500μl Buffer RW2(使用前检查是否加入无水乙醇)，12,000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。

11.重复步骤10。

12.12,000rpm离心2分钟，倒掉收集管中的废液。将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干。

13.将吸附柱转入新的RNase-Free的1.5ml收集管中，向吸附膜中间位置加入30-50μl RNase-Free Water，室温放置1分钟，12,000rpm离心1分钟，收集RNA溶液，-70℃保存RNA，防止降解。

2.2 Real-Time PCR

引物设计

采用在线引物设计软件，基因序列参照NCBI:NM_030674.3(SLC38A1)，内参选GAPDH，引物设计后由公司合成。具体引物序列如下：

SLC38A1的Real-Time PCR引物：

上游引物：TGTTGTTGACTGAATATAATAGAC(SEQ ID NO.1)；

下游引物：TCCATAGCACTTGACTGT(SEQ ID NO.2)；

扩增长度为189bp。

一步法RT-PCR：

反应体系：2×One Step RT-PCR Buffe 12.5μl；10uM上下游引物各1μl；SuperRTOneStep RT-PCR EnzymeMix 0.5μl；提取的RNA模板适量(终浓度为1pg–1μg)；灭菌蒸馏水补平至25μl。

进行扩增，实验操作按产品说明书进行。扩增程序为：反转录45℃30min；95℃2min预变性，进行30-40个循环(94℃30s，55℃30s，72℃30s)的扩增反应；终延伸5min。

3.实验结果

样本扩增产物溶解曲线都是单峰，说明扩增产物只有一条，为特异性扩增；根据qRT-PCR的相对定量公式，比较SLC38A1基因在骨性关节炎组和对照组中的表达水平：SLC38A1基因在骨性关节炎组中的表达水平仅为对照组织的约0.22倍，qRT-PCR扩增结果稳定。

实施例3 DNA的提取及甲基化修饰

1.DNA提取

1)材料处理：取约25mg滑膜组织样本进行液氮研磨或切成小块后置于1.5ml离心管中，加入180μl Buffer GTL，将不同样品做好标记。

2)加入20μl Proteinase K，涡旋震荡使样品彻底混匀。56℃水浴，直至组织完全裂解，孵育过程中可每隔一段时间颠倒或震荡离心管使样品分散。

3)加入4μl的浓度为100mg/ml的RNase A溶液(货号：CW0601)，涡旋15秒，室温放置5-10分钟。

4)加入200μl Buffer GL，涡旋震荡充分混匀，70℃水浴10分钟。短暂离心后加入200μl无水乙醇，涡旋震荡充分混匀。

5)短暂离心，将上一步所得溶液全部加入到已装入收集管(Collection Tube)的吸附柱(Spin Column DM)中，若一次不能加完溶液，可分多次转入。12,000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

6)向吸附柱中加入500μl Buffer GW1(使用前检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

7)向吸附柱中加入500μl Buffer GW2(使用前检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。注意：如需进一步提高DNA纯度，可重复步骤7。

8)12,000rpm离心2分钟，倒掉收集管中废液。将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干。

9)将吸附柱置于一个新的离心管(自备)中，向吸附柱的中间部位悬空加入50-200μlBuffer GE或灭菌水，室温放置2-5分钟，12,000rpm离心1分钟，收集DNA溶液，-20℃保存DNA。

2.DNA样品的修饰及纯化：

DNA甲基化的修饰是采用EZ DNA Methylation^TM Kit(ZYMO RESEARCH，货号D5002)进行，原理和经典的亚硫酸氢钠修饰基本相似。经试剂盒处理后，甲基化的胞嘧啶未发生变化，而未发生甲基化的胞嘧啶(C)都将变成尿嘧啶(U)。再设计分别针对甲基化和非甲基化序列的特定引物，进行PCR的扩增，通过琼脂糖凝胶电泳分析的方法来确定DNA的甲基化状态变化。具体操作参见说明书。

实施例4 SLC38A1基因甲基化CpG位点的研究

选择实施例3中的10个骨性关节炎组提取的DNA和8个对照组提取的DNA(均已经进行了样品的修饰及纯化，即甲基化的胞嘧啶未发生变化，而未发生甲基化的胞嘧啶(C)都将变成尿嘧啶(U))。以相应的BSP引物扩增SEQ ID NO.3(序列长206bp)，所用引物见表3，用凝胶电泳验证引物设计及是否成功，结果显示均得到目的扩增片段，其大小与预期的大小一致。

TGAACCAGAAGGATTTGCTGAGCACCGAGAAAGCACCGGCCTAGGCGCAAAGAGCCGGGGGCCAGCTCTTGGAGGGCCTGGAGACCCCACGTGGTCCCGACCGAAGGACCTGGTGCGTCCAGGTTAACGGAGCTGGGGCGCTCCAAGTCCGGGGGACGAGGGAGCGGCATGGAGGGGAGCAGGGGCAACTGGGCCTGGTTCCCTTT(SEQ ID NO.3)

BSP引物：

上游引物：TGAATTAGAAGGATTTGTTGAGTAT(SEQ ID NO.4)；

下游引物：AAAAAAAACCAAACCCAATTACC(SEQ ID NO.5)；

扩增长度为206bp。

将回收纯化的PCR产物分别与pUC18-T载体连接以构建BSP-PCR产物重组质粒，然后进行连接产物转化制备感受态细胞，选择在IPTG/X-gal平板上生长的白色菌落。用凝胶电泳对目的片段克隆的菌落进行PCR鉴定以排除假阳性克隆，筛选正确的克隆进行后续的测序分析。

为提高对克隆甲基化测序结果的有效性，每个实验组选取5个鉴定正确的克隆进行测序分析。在材料方法中已经阐述，待测序列位置一共有13个CpG位点。利用SeqMan软件对无明显干扰信号的测序结果进行序列比对，得到每个克隆中待检测13个CpG位点的甲基化状态。分析结果表明亚硫酸盐转化效率均达到98％或以上，符合亚硫酸盐转化实验要求，表明BSP分析结果可靠。结果显示在第11个CpG的位点(150bp)和第8个CpG的位点(116bp)发生了甲基化，对照组未甲基化，说明上述2个位点的甲基化可能是SLC38A1基因低表达及骨性关节炎致病相关的原因之一。

实施例5甲基化特异性PCR(MSP)

1.SLC38A1基因甲基化及非甲基化引物设计与合成

MSP引物：

甲基化检测引物：

上游引物：GTATCGGTTTAGGCGTAAAGAGTC(SEQ ID NO.6)；

下游引物：GTCCCCCGAACTTAAAACG(SEQ ID NO.7)；

扩增长度为125bp。

非甲基化检测引物：

上游引物：AAGTATTGGTTTAGGTGTAAAGAGTTG(SEQ ID NO.8)；

下游引物：CATCCCCCAAACTTAAAACAC(SEQ ID NO.9)；

扩增长度为128bp。

引物设计后送公司合成。

2.MSP反应体系及反应条件

MSP反应体系：2×HS PCR Mix 12.5μl；M/U上游引物(10μM)和M/U下游引物(10μM)各1μl；模板1μl；灭菌水补平至25μl。

反应条件：预反应：94℃5min；反应35个循环(94℃30秒，60℃30秒，72℃30秒)；延伸72℃5min，反应结束后取出进行琼脂糖凝胶电泳分析。

3.实验结果

非甲基化特异性引物的扩增产物存在，甲基化特异性引物的扩增产物不存在即为非甲基化；非甲基化特异性引物的扩增产物不存在，甲基化特异性引物的扩增产物存在即为甲基化。电泳结果显示：42例骨性关节炎患者滑膜组织中，甲基化阳性的有29例，基因甲基化率为69.05％，12例对照滑膜组织中甲基化阳性的仅有3例，基因甲基化率为25％(见表1，图1)。

表1 骨性关节炎组和对照组SLC38A1基因甲基化情况

实施例6 WB方法检测骨性关节炎滑膜中SLC38A1的表达

一、蛋白质样品制备及定量

1.RIPA裂解液(Beyotime)进行蛋白质样品制备，操作步骤如下:

将滑膜组织自冰箱取出，用滤纸擦拭组织上的PBS溶液，称取重量，并将滑膜组织置于机械组织匀浆器中，1:10组织比裂解液的重量体积比例加入相应体积的裂解液进行匀浆，10000-14000g离心3-5分钟，取上清液，按1:1加入样品缓冲液强力混匀后置于100度的水浴箱水浴加热3-5分钟，10000g离心10分钟，取上清液，将其转入另一洁净的试管中。

2.利用BCA蛋白浓度测定试剂盒进行总蛋白定量

采用康为世纪微量BCA蛋白定量试剂盒(货号：CW2011)，具体步骤见其说明书。

二、SDS-聚丙烯酞胺凝胶电泳(SDS-PAGE)

1.蛋白质样品变性:

a)根据BCA蛋白质浓度测定结果，每个凝胶加样孔中加入相同质量的总蛋白提取物。按照每1微升蛋白样品加入0.25微升蛋白上样缓冲液的比例，混合蛋白样品和蛋白上样缓冲液(5×)。

b)100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白。

c)冷却到室温后，直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可。

2.胶板制备:

采用Bio-Rad公司的微型垂直板电泳装置制备0.75mm厚的凝胶，照说明书安装好玻璃板后，先在小烧杯中配制5ml 10％的分离胶，配方如下：

分离胶配方：30％丙烯酰胺溶液1.7ml；Tris-HCl(1.5M，pH8.8)1.3ml；10％SDS0.05ml；10％AP 0.05ml；TEMED 0.002ml；灭菌水补充至5ml；

混匀后立即灌胶，然后加lml蒸馏水覆盖，室温下放置约30min待胶聚合后，用蒸馏水洗2-3次，再用滤纸吸干。然后制备2m15％的浓缩胶，配方如下：

浓缩胶配方：30％丙烯酰胺溶液0.33ml；Tris-HCl(1.0M，pH6.8)0.25ml；10％SDS0.02ml；10％AP 0.02ml；TEMED 0.002ml；灭菌水补充至2ml；

混匀后立即灌胶，插入样品梳，避免产生气泡，待胶凝固后，取出样品梳，后用蒸馏水和1×蛋白电泳缓冲液先后冲洗样品孔。

三、上样及电泳

将凝胶板装在电泳装置上，内槽中加满l×蛋白电泳缓冲液，外槽中l×蛋白电泳缓冲液应超过铂丝，按顺序上样。在末端泳道中加入蛋白质质量标准蛋白梯度。电泳时蓝色染料到达胶的底端处附近即可停止电泳。

四、蛋白质印迹

1.按照上述方法先进行SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白。

2.预先用转印缓冲液浸泡NC膜、滤纸、海棉垫。SDS-PAGE结束后取出凝胶，去除浓缩胶，在Tris/甘氨酸缓冲液中漂洗数秒，然后置于转印缓冲液中浸泡15-30min。打开电转印夹，每侧垫上一块专用的用转印缓冲液浸泡透的海棉垫，再各放一块转印液浸透的滤纸，滤纸与海面垫大小相同或与NC膜，凝胶大小相同均可，将凝胶平放在阴极侧滤纸上，最后将NC膜平放在凝胶上，去除气泡，夹好电转印夹。在电泳槽加满电转印液，插入电转印夹，将电泳槽放入冰箱内(电转印液之前要放入冰箱内预冷)，连接好电极，接通电流，转印夹的NC膜应对电泳槽的正极。

3.封闭：用1×TBS漂洗一次。加入含5％的无脂奶粉TBS封闭缓冲液，置于振荡培养箱中进行封闭；

4.一抗杂交：弃封闭液，加入用一抗稀释液稀释的一抗(Anti-SLC38A1 antibody(ab59721))杂交溶液，置于4℃杂交过夜，第二天在振荡培养箱中进行杂交；

5.回收一抗杂交液，用TBST洗膜3次；

6.弃TBST，加入用封闭缓冲液稀释的二抗(Goat Anti-Rabbit IgG,HRPConjugated(CW0103))杂交溶液，置于振荡培养箱中进行杂交；

7.弃二抗溶液，用TBST洗膜3次；

8.ECL化学发光及图像采集和分析：按照高灵敏度化学发光检测试剂盒(康为世纪货号CW0049B)，具体步骤参照说明书。

9.以β-Actin作为内参进行数据标准化，以对照组滑膜组织中SLC38A1作为参照样本，计算实验组中SLC38A1蛋白的相对表达水平。

五、实验结果

结果显示，42例骨性关节炎患者组中有15例阳性，27例阴性，12例对照组中有9例阳性，SLC38A1蛋白阳性率分别是35.71％和75％，两组差异具有统计学意义。进一步对骨性关节炎患者组内SLC38A1蛋白表达和基因甲基化状态做相关性分析，结果见图2和表2，29例SLC38A1蛋白表达阴性的患者里有24例都出现甲基化阳性，表明SLC38A1蛋白表达和基因甲基化呈负显著相关性。

表2 骨性关节炎患者组内SLC38A1蛋白表达和基因甲基化相关性分析

Claims

1.一种骨性关节炎诊断试剂，其特征在于，所述诊断试剂组分中的一种或几种用于检测序列表中SEQ ID NO.3的第116bp处和/或150bp处CpG岛甲基化程度。

2.根据权利要求1所述的诊断试剂，其特征在于，采用BSP测序法对SEQ ID NO.3的第116bp处和/或150bp处CpG岛甲基化程度进行检测。

3.根据权利要求2所述的诊断试剂，其特征在于，采用序列表SEQ ID NO.4和SEQ IDNO.5的引物序列进行BSP测序检测。

4.根据权利要求1所述的诊断试剂，其特征在于，采用甲基化特异性PCR法对序列表中SEQ ID NO.3的第116bp处和/或150bp处CpG岛甲基化程度进行检测。

5.根据权利要求4所述的诊断试剂，其特征在于，采用序列表SEQ ID NO.6到SEQ IDNO.9的引物序列进行甲基化特异性PCR法对甲基化程度进行检测。

6.根据权利要求1所述的诊断试剂，其特征在于，采用下列方法中任意一种或几种的组合对序列表中SEQ ID NO.3的第116bp处和/或150bp处CpG岛甲基化程度进行检测：甲基化敏感的限制性内切酶方法、NaHSO₃法、芯片技术方法；所述NaHSO₃法包括BSP测序法、联合NaHSO₃限制性分析法、甲基化特异性PCR、荧光定量法；所述芯片技术方法包括甲基化高密度芯片、差异甲基化杂交、甲基化特异性寡核苷酸芯片。

7.权利要1-6任意一项所述的诊断试剂在制备骨性关节炎诊断工具中的应用。

8.一种检测SLC38A1基因序列表中SEQ ID NO.3的第116bp处和/或150bp处CpG岛甲基化程度的试剂在制备诊断骨性关节炎诊断制剂中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，诊断制剂中含有检测SLC38A1基因表达量和/或检测SLC38A1基因甲基化程度的试剂。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，采用序列表SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的引物序列进行SLC38A1基因表达量检测；采用序列表SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5的引物序列检测SLC38A1基因甲基化程度；采用序列表SEQ ID NO.6到SEQ ID NO.9的引物序列检测SLC38A1基因甲基化程度。