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CN105200095A - 生物质水解方法 - Google Patents

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CN105200095A
CN105200095A CN201510623738.8A CN201510623738A CN105200095A CN 105200095 A CN105200095 A CN 105200095A CN 201510623738 A CN201510623738 A CN 201510623738A CN 105200095 A CN105200095 A CN 105200095A
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lignocellulose
acid
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CN201510623738.8A
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任海彧
黄鸿志
王云
D.希金斯
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Novozymes North America Inc
Original Assignee
Novo Nordisk AS
Novozymes North America Inc
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Abstract

本发明涉及生物质水解方法，具体地涉及生物质工艺，包括从再循环的洗涤溶液去除和/或失活酶抑制剂。

Description

生物质水解方法
本发明申请是基于申请日为2010年06月30日、申请号为201080029210.3(国际申请号为PCT/US2010/040518)、名称为“生物质水解方法”的发明专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及方法，所述方法包括再循环用于含木素纤维素材料预处理的洗涤溶液。
背景技术
由于化石燃料的有限储备和对排放温室气体的忧虑，人们越来越着眼于使用可再生的能源，例如，发酵产物如生物乙醇。从含木素纤维素材料产生乙醇在本领域是已知的，并常规地包括所述含木素纤维素材料的预处理、水解和发酵。预处理导致从所述含木素纤维素材料释放降解产物，其可不可逆地结合并抑制在水解和发酵过程中添加的酶。
在经预处理的含木素纤维素材料中这些抑制剂的浓度可通过水解之前的洗涤来减少。然而，所述抑制剂常常具有低溶解度，且由于抑制剂的积聚(build-up)洗涤水的再循环仅可限于非常有限的程度。因此，洗涤需要大量水。
因此，亟需提供将经预处理的含木素纤维素材料加工为适于水解和发酵的底物的改进方法。
发明内容
本发明涉及方法，所述方法包括通过洗涤从经预处理的含木素纤维素材料去除和/或失活抑制剂，并再循环用过的洗涤溶液。所述用过的洗涤溶液是通过去除和/或失活酶抑制剂来再生的，由此改善水解步骤的效率。本发明还涉及从含木素纤维素材料产生水解物和发酵产物的方法。
因此，本发明涉及将含木素纤维素材料转化为水解物的方法，包括下述步骤：(a)对含木素纤维素材料进行预处理，(b)在洗涤溶液中洗涤经预处理的含木素纤维素材料，(c)将用过的洗涤溶液分离以获得经预处理和洗涤的含木素纤维素材料，(d)对经预处理的和洗涤的含木素纤维素材料进行处理，导致纤维素和/或半纤维素的至少部分水解，以获得水解物，和(e)在将步骤(c)的用过的洗涤溶液再循环至步骤(b)之前，用木聚糖酶处理该用过的洗涤溶液。
所述方法的优点包括因为可再循环洗涤溶液而减少水消耗，从预处理产生的可溶性糖(例如，木糖、寡糖)可浓缩于洗涤溶液，和增加水解的效率。
具体地，本发明涉及如下各项：
1.一种将含木素纤维素材料转化为水解物的方法，包括下述步骤：
(a)对含木素纤维素材料进行预处理，
(b)在洗涤溶液中洗涤经预处理的含木素纤维素材料，
(c)将用过的洗涤溶液分离以获得经预处理和洗涤的含木素纤维素材料，
(d)对经预处理的和洗涤的含木素纤维素材料进行处理，导致纤维素和/或半纤维素的至少部分水解，以获得水解物，和
(e)在将步骤(c)的用过的洗涤溶液再循环至步骤(b)之前，用木聚糖酶处理该用过的洗涤溶液。
2.项1的方法，还包括将步骤(d)的水解物与发酵生物相接触以产生发酵产物。
3.项2的方法，包括同时水解和发酵。
4.项2或3的方法，还包括回收发酵产物。
5.前述任一项项的方法，其中所述木聚糖酶是GH10木聚糖酶。
6.前述任一项项的方法，其中所述木聚糖酶经固定化。
7.前述任一项项的方法，其中所述含木素纤维素材料来源于选自下组的材料：玉米秸杆、玉米纤维、硬木如杨木和桦木、软木、谷物秆如麦秆、柳枝稷、稻壳、城市固体废物、工业有机废物、办公室用纸或其混合物。
8.前述任一项项的方法，其中步骤(a)中的含木素纤维素材料经化学和/或机械预处理。
9.前述任一项项的方法，其中对步骤(a)中的含木素纤维素材料使用酸进行化学预处理。
10.前述任一项项的方法，其中步骤(a)中的预处理是使用有机酸，优选硫酸、乙酸、柠檬酸、酒石酸、琥珀酸和/或其混合物进行的酸预处理。
11.前述任一项项的方法，其中步骤(a)中的含木素纤维素材料是用0.1至2.0wt.％酸，优选硫酸进行的酸预处理。
12.前述任一项项的方法，其中对步骤(a)中的含木素纤维素材料在高温和/或高压进行机械预处理。
13.前述任一项项的方法，其中对步骤(a)中的含木素纤维素材料通过蒸汽爆炸、稀酸蒸汽爆炸和/或湿氧化来预处理。
14.前述任一项项的方法，其中步骤(b)的洗涤溶液包含水、有机溶剂或水和有机溶剂的混合物。
15.前述任一项项的方法，其中将在再循环的洗涤水溶液中蓄积的溶解糖(i)导入发酵步骤(d)并用C5发酵生物发酵，或(ii)分离出来，并用C5发酵生物发酵。
发明详述
含木素纤维素材料
术语“含木素纤维素材料”用于本文中指主要由纤维素、半纤维素和木质素组成的材料。含木素纤维素材料常常被称作“生物质”。
木素纤维素的结构使酶水解无法直接进行。因此，必须预处理木素纤维素例如通过在足够的压力、湿度和温度条件下进行酸水解以打破木质素的密封，并破坏纤维素的晶体结构。这导致半纤维素级分的溶解和糖化。然后可将纤维素级分用酶水解，例如通过纤维素酶酶水解，来将糖聚合物转化为单糖或寡糖，其可发酵为所需发酵产物，如乙醇。任选地，所述发酵产物通过例如蒸馏来回收。
涵盖了根据本发明的任何含木素纤维素材料。含木素纤维素材料可为任何含有木素纤维素的材料。在一个优选实施方案中，所述含木素纤维素材料含有至少30wt.％，优选至少50wt.％，更优选至少70wt.％，甚至更优选至少90wt.％木素纤维素。应理解的是，所述含木素纤维素材料还可包含其它成分如纤维素材料(包括纤维素和半纤维素)，并还可包含其他成分如蛋白质材料、淀粉、糖如可发酵的糖和/或不可发酵的糖。
含木素纤维素材料通常见于例如植物的茎、叶、壳/荚(hull)、壳/皮/荚/苞(husk)和穗轴或树的叶、枝和木材。含木素纤维素材料可为，但不仅限于草本材料、农业残余物、林业残余物、城市固体废物、废纸和纸浆及造纸厂残余物。在本文中应理解的是，含木素纤维素材料可为在混合的基质中含有木质素、纤维素和半纤维素的植物细胞壁材料的形式。
所述含木素纤维素材料可包括玉米秸杆、硬木如杨木和桦木、软木如松木、柳枝稷、谷物秸秆和/或壳如来自稻、小麦、大麦和黑麦等的秆、城市固体废物(MSW)、工业有机废物、办公室用纸、刨花、甘蔗渣、纸和纸浆加工废物或其混合物。
在一个优选实施方案中，所述含木素纤维素材料是玉米秸杆。在另一个优选的方面，所述含木素纤维素材料是玉米纤维。
预处理
所述含木素纤维素材料可用任何合适的方式进行预处理。预处理在水解和/或发酵之前进行。预处理的目标是分离和/或释放纤维素、半纤维素和/或木质素，这样增加水解速率。预处理方法(如湿法氧化和碱性预处理)靶向木质素，而稀酸和自水解(auto-hydrolysis)靶向半纤维素。蒸汽爆炸是靶向纤维素的预处理方法的实例。
根据本发明，预处理步骤(a)可为使用本领域中公知技术的常规预处理步骤。在一个优选实施方案中，预处理在水性浆料中进行。在预处理过程中含木素纤维素材料可以10-80wt.％的量，优选20-70wt.％的量，特别是30-60wt.％的量，如约50wt.％的量存在。
所述预处理在水解和/或发酵之前进行。
术语“化学预处理”指促进纤维素、半纤维素和/或木质素的分离和/或释放的任何化学预处理。合适的化学预处理的实例包括用例如稀酸、石灰、碱、有机溶剂、氨、二氧化硫、二氧化碳进行处理。此外，湿法氧化和控制pH的水热解(hydrothermolysis)亦视为化学预处理。
在一个优选实施方案中，所述化学预处理为酸处理，更优选地，为连续的稀酸和/或弱酸(mildacid)处理，例如，用硫酸，或用其它有机酸，如乙酸、柠檬酸、酒石酸、琥珀酸、盐酸或其混合物处理。也可使用其它酸。弱酸处理意为处理的pH在pH1-5，优选在pH1-3的范围内。在一个具体实施方案中，所述酸浓度在0.1到2.0wt％酸的范围内，优选为硫酸。该酸可与所述含木素纤维素材料相接触，且混合物可保持在160-220℃，如165-195℃范围内的温度，处理时间为例如，1-60分钟，如2-30分钟或3-12分钟。可添加强酸(如硫酸)来移除半纤维素。这增强了纤维素的可消化性。
亦涵盖了其它技术。已经显示纤维素溶剂处理将约90％的纤维素转化为葡萄糖。也显示了当木素纤维素结构被破坏时，能够极大地增强酶水解。碱、H2O2、臭氧、有机溶剂(使用含水醇中的路易斯酸，FeCl3，(Al)2SO4)、甘油、二烷，苯酚或乙二醇属于已知破坏纤维素结构并促进水解的溶剂(Mosier等,2005,BioresourceTechnology96:673-686)。
本发明也涵盖了使用碱，例如NaOH，Na2CO3和/或氨等的碱化学预处理。使用氨的预处理方法描述于例如WO2006/110891、WO2006/110899、WO2006/110900、WO2006/110901(将它们通过提述并入本文)。
湿氧化技术涉及使用氧化剂，如基于亚硫酸盐的氧化剂等。溶剂预处理的实例包括用DMSO(二甲亚砜)等的处理。化学预处理通常进行1到60分钟，如5到30分钟，但可依赖于待进行预处理的材料进行更短或更长的时间。
其它合适的预处理方法的实例描述于Schell等,2003,Appl.BiochemandBiotechn.105-108:69-85；Mosier等,2005,BioresourceTechnology96:673-686；Ahring等,WO2006/032282和WO2001/060752，Foody等，WO2006/034590；以及Ballesteros等，美国公开2002/0164730号，这些参考文献均在此通过提述并入本文。
术语“机械预处理”指任何机械的(或物理的)处理，其促进纤维素、半纤维素和/或木质素自含木素纤维素材料的分离和/或释放。例如，机械预处理包括多种类型的磨制、辐射、汽蒸/蒸汽爆炸(steamexplosion)，湿氧化以及其他水热解处理。
机械预处理包括粉碎(机械减小大小)。粉碎包括干磨、湿磨和振动球磨(vibratoryballmilling)。机械预处理可涉及高压和/或高温(蒸汽爆炸)。在本发明的一个实施方案中，高压意指压力在300到600psi，优选400到500psi，例如约450psi的范围内。在本发明的一个实施方案中，高温意指温度在约100到300℃，优选约140到235℃的范围内。在一个优选实施方案中，机械预处理是分批工艺的蒸汽枪水解器系统，其使用如上定义的高压和高温。也可为此使用SundsHydrolyzer(可由SundsDefibratorAB(Sweden)得到)。
在一个优选实施方案中，进行了化学和机械预处理两者。例如，所述预处理步骤可涉及稀酸或弱酸处理以及高温和/或高压处理。所述化学和机械预处理可根据需要顺序或同时进行。
因此，在一个优选实施方案中，对含木素纤维素材料进行化学和机械两种预处理以促进纤维素、半纤维素和/或木质素的分离和/或释放。
在一个优选实施方案中，机械预处理在蒸汽爆炸预处理之前进行。
在一个优选实施方案中，所述预处理作为稀酸和/或弱酸蒸汽爆炸步骤进行。在另一个优选实施方案中，预处理作为氨纤维爆炸(ammoniafiberexplosion)步骤(或AFEX预处理步骤)进行。
术语“生物预处理”如用于本发明是指促进自含木素纤维素材料分离和/或释放纤维素、半纤维素和/或木质素的任何生物预处理。生物预处理技术可涉及应用溶解木质素的微生物(参见，例如，Hsu,T.-A.,1996,Pretreatmentofbiomass,于HandbookonBioethanol:ProductionandUtilization,Wyman,C.E.编,Taylor&Francis,Washington,DC,179-212；Ghosh,P.和Singh,A.,1993,Physicochemicalandbiologicaltreatmentsforenzymatic/microbialconversionoflignocellulosicbiomass,Adv.Appl.Microbiol.39:295-333；McMillan,J.D.,1994,Pretreatinglignocellulosicbiomass:areview,于EnzymaticConversionofBiomassforFuelsProduction,Himmel,M.E.,Baker,J.O.和Overend,R.P.编,ACSSymposiumSeries566,AmericanChemicalSociety,Washington,DC,第15章；Gong,C.S.,Cao,N.J.,Du,J.和Tsao,G.T.,1999,Ethanolproductionfromrenewableresources,于AdvancesinBiochemicalEngineering/Biotechnology,Scheper,T.编,Springer-VerlagBerlinHeidelberg,Germany,65:207-241；Olsson,L.和Hahn-Hagerdal,B.,1996,Fermentationoflignocellulosichydrolysatesforethanolproduction,Enz.Microb.Tech.18:312-331；以及Vallander,L.和Eriksson,K.-E.L.,1990,Productionofethanolfromlignocellulosicmaterials:Stateoftheart,Adv.Biochem.Eng./Biotechnol.42:63-95)。
洗涤经预处理的含木素纤维素材料
当预处理含木素纤维素材料时，产生了抑制酶的降解产物。这些化合物严重地降低了水解率。
为了去除酶抑制剂的对经预处理的含木素纤维素材料的洗涤会改善酶水解。
所述抑制剂为木素纤维素降解产物，其包括木质素降解产物，纤维素降解产物和半纤维素降解产物。木质素降解产物本质上可为酚类。半纤维素降解产物包括来自糖(如己糖和/或戊糖)的呋喃，所述糖包括甘露糖、半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖和木糖，包括寡糖。认为抑制酶的化合物包括木寡糖(xylooligosaccharide,XOO)或XOO和可溶性木质素的复合物，其存在于PCS液中。根据本发明，抑制酶的可溶化合物是通过用洗涤溶液从经预处理的含木素纤维素材料中去除的。所述洗涤溶液优选为水性洗涤溶液。所述洗涤溶液可为基本上纯的水，或具有显著量的添加剂的水的溶液，例如，如去污剂和/或有机溶剂，以改进抑制酶的化合物的提取和/或溶解性。合适的有机溶剂是乙醇或甲醇。
所述洗涤溶液优选地以5至70℃，优选10至65℃，且更优选20至60℃，例如，在30至55℃的温度施用。
当用过的洗涤溶液与经洗涤的PCS分离时，洗涤步骤结束。用过的洗涤溶液的分离可通过任何合适的方法来完成，所述方法包括但不限于排液(draining)、过滤、离心和挤压(pressing)。
根据本发明，所述用过的洗涤溶液在再循环至洗涤步骤之前经处理以去除和/或失活酶抑制剂。所述处理再生了用过的洗涤溶液以构建可用的洗涤溶液。所述处理包括将用过的洗涤溶液与木聚糖酶，且更优选固定化的木聚糖酶相接触。不拘于理论，认为本发明的方法的作用是通过对PCS液中存在的可溶性组分，特别是对木寡糖(XOO)或XOO和可溶性木质素的复合物的木聚糖酶活性造成的。
在一个实施方案中，还对所述用过的洗涤溶液通过将其与树脂或树脂的组合相接触来进行处理。树脂的组合可作为两种或更多种树脂的混合物施用和/或可为两种或更多种树脂顺次施用。所述树脂可为具有极性、弱极性或非极性官能团的树脂。所述树脂可为强酸性阳离子交换剂、弱酸性阳离子交换剂，强碱性阴离子交换剂或弱碱性阴离子交换剂。优选的官能团包括-SO3、-COOH、-N+(CH3)3、-N(CH3)2和-NH2。所述树脂亦可为木炭树脂(charcoalresin)。在一个实施方案中，通过将所述用过的洗涤溶液与活性炭接触对其进行处理。
在一个实施方案中，将所述用过的洗涤溶液经过包含所述树脂和/或活性炭的柱。
水解
在发酵之前和/或同时，将经预处理和洗涤的含木素纤维素材料水解以将纤维素和半纤维素降解为糖和/或寡糖。
水解过程中的干固体含量可为5-50wt.％，优选10-40wt.％，更优选20-35wt.％的范围。在一个优选实施方案中，水解可作为补料分批工艺进行，其中将经预处理的含木素纤维素材料(底物)逐渐加料于例如含有酶的水解溶液。经预处理的含木素纤维素材料可以以一个或多个不同批次，作为一个或多个不同的连续流或作为一个或多个不同批次和一个或多个不同的连续流的组合而供予含酶的水解溶液。
水解是用酶法进行的。根据本发明，可用一种或多种水解酶(根据酶命名法为EC3类)，优选一种或多种选自纤维素酶、半纤维素酶、α-淀粉酶、葡糖淀粉酶、酯酶如脂肪酶或蛋白酶的糖酶来水解经预处理的含木素纤维素材料。α-淀粉酶和/或葡糖淀粉酶可存在于水解和/或发酵过程中，因为含木素纤维素材料可含有一些淀粉。
用于水解的酶能够直接或间接地将经洗涤的经预处理的含木素纤维素材料转化为可发酵的糖，所述糖可发酵为所需的发酵产物如乙醇。
合适的酶描述于下文“酶”部分。
半纤维素聚合物可由半纤维素酶和/或酸水解降解以释放其五碳和六碳糖组分。所述六碳糖(己糖)，如葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖和甘露糖，可方便地由包括酵母的合适发酵生物发酵为例如乙醇、丙酮、丁醇、甘油、柠檬酸、延胡索酸等。
在一个优选实施方案中，所述经预处理的含木素纤维素材料是使用半纤维素酶，优选木聚糖酶、酯酶、纤维二糖酶或其组合来水解的。
酶水解可在合适的水性环境中在本领域技术人员可容易地确定的条件下实施。在一个优选实施方案中，水解在对所述酶合适的，优选为最佳的条件下进行。
合适的工艺时间、温度和pH条件可容易地由本领域技术人员确定。优选地，水解在25-70℃，优选40-60℃，特别是约50℃的温度进行。所述工艺优选在pH3-8，优选pH4-6，特别是约pH5的pH范围中进行。优选地，水解实施12至144小时，优选16至120小时，更优选24至96小时，如32至72小时。
根据本发明，步骤(c)中的水解和步骤(d)中的发酵可同时进行(SHHF方法)或顺次进行(SHF方法)。
发酵
根据本发明，所述经预处理的(和经水解的)含木素纤维素材料由至少一种能够发酵可发酵的糖如葡萄糖、木糖、甘露糖和半乳糖的发酵生物直接或间接地发酵为所需发酵产物。
所述发酵优选持续进行8至96小时，优选12至72小时，更优选24至48小时。在一个实施方案中，所述发酵是在20至40℃，优选26至34℃，特别是32℃左右的温度进行的。在一个实施方案中，pH为pH3至6，优选大约pH4至5。
对于乙醇发酵优选为酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)种的酵母，优选地为对高水平乙醇即高至例如约10、12或15体积％乙醇或更高如20体积％乙醇具有抗性的株。
根据本发明涵盖了同时水解和发酵(SHF)。在一个实施方案中，对于水解无单独的维持阶段，意味着水解酶和发酵生物是一同添加的。当发酵与水解同时进行时，温度优选为26℃至35℃，更优选30℃至34℃，如大约32℃。可根据本发明施用包含至少两个在不同温度的维持阶段的温度程序。
在所述经预处理的含木素纤维素材料的洗涤过程中，溶解糖可在经再循环的洗涤水溶液中蓄积。所述溶解糖会包含来自半纤维素降解的C5糖，如木糖。这些糖可用合适的能够将C5糖转化为所需发酵产物的发酵生物发酵。该C5发酵可单独进行，或可将蓄积于再循环的洗涤水溶液中的溶解糖添加至经水解的含木素纤维素材料以供合并的C6和C5发酵。此种发酵优选用至少一种能够发酵C6糖(例如葡萄糖)和C5糖(例如木糖)两者的生物来进行。或者，发酵可用至少两种不同的生物来进行，其中将每种针对利用C6或C5糖之一优化，且所述发酵或者是在一个发酵步骤中在允许两种生物都发酵的条件下进行，或者作为至少两个发酵步骤，每个均在允许所述生物之一发酵的条件下进行。
本发明的方法可作为分批、批次补料或连续方法进行。优选地，所述发酵步骤是作为连续发酵进行。
回收
在发酵之后，可自发酵液中分离发酵产物。可蒸馏发酵液以提取发酵产物，或可自发酵液中通过微滤或膜过滤技术提取发酵产物。或者，可通过汽提(stripping)回收发酵产物。回收方法在本领域为众所周知的。
发酵产物
本发明的方法可用于产生任何发酵产物。具体涵盖的发酵产物包括醇(例如，乙醇、甲醇、丁醇)；有机酸(例如，柠檬酸、乙酸、衣康酸、乳酸、葡糖酸)；酮(例如，丙酮)；氨基酸(例如，谷氨酸)；气体(例如，H2和CO2)；抗生素(例如，青霉素和四环素)；酶；维生素(例如，核黄素、B12、β-胡萝卜素)；以及激素。
还涵盖的产物包括消费醇类工业产物，例如，啤酒和葡萄酒；乳制品工业产物，例如，发酵的乳制品；皮革工业产物和烟草工业产物。在一个优选实施方案中，所述发酵产物是醇，特别是乙醇。根据本发明获得的发酵产物(如乙醇)可优选为燃料醇/乙醇。然而，对于乙醇，其亦可用作饮用乙醇。
发酵生物
术语“发酵生物”指任何适于产生所需的发酵产物的生物，包括细菌和真菌生物。本发明特别合适的发酵生物能够将糖如葡萄糖直接或间接发酵(即转化)为所需的发酵产物。亦合适的是能够将C5糖如木糖发酵为所需发酵产物的发酵生物。发酵生物的实例包括真菌生物，特别是酵母。优选的酵母包括酵母属种(Saccharomycesspp.)，特别是酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)或葡萄汁酵母(Saccharomycesuvarum)的菌株，毕赤酵母属(Pichia)的菌株，特别是树干毕赤酵母(Pichiastipitis)的菌株如树干毕赤酵母CBS5773；假丝酵母属(Candida)的菌株，特别是产朊假丝酵母(Candidautilis)，迪丹氏假丝酵母(Candidadiddensii)或博伊丁氏假丝酵母(Candidaboidinii)的菌株。其它涵盖的酵母包括发酵单胞菌属(Zymomonas)的菌株；汉逊酵母属(Hansenula)的菌株，特别是异常汉逊酵母(H.anomala)的菌株；克鲁维酵母属(Kluyveromyces)的菌株，特别是脆壁克鲁维酵母(Kluyveromycesfragilis)；和裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)的菌株，特别是粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)。
商业上可得到的酵母包括，例如，ETHANOLREDTM酵母(可由Fermentis/Lesaffre,USA得到)，FALI(可由Fleischmann’sYeast,USA得到)，SUPERSTART和THERMOSACCTM新鲜酵母(可由EthanolTechnology,WI,USA得到)，BIOFERMAFT和XR(可由NABC-NorthAmericanBioproductsCorporation,GA,USA得到)，GERTSTRAND(可由GertStrandAB,Sweden得到)，以及FERMIOL(可由DSMSpecialties得到)。ANQIYEAST(可由Anqiyeast(CHIFENG)CO.,LTD,China得到)。
酶
在本发明的方法的上下文中，即使未特别提及，也可理解的是酶(以及其它化合物)是以“有效量”使用的。
纤维素酶：本文所使用的术语“纤维素酶”应理解为包括纤维二糖水解酶(EC3.2.1.91)，例如，纤维二糖水解酶I和纤维二糖水解酶II，以及内切葡聚糖酶(EC3.2.1.4)和β-葡糖苷酶(EC3.2.1.21)。纤维素酶在水解步骤(d)中施用。
为了有效地消化纤维素和半纤维素，需要几种类型的酶协同作用。需要至少三种类型的酶将纤维素转化为可发酵的糖：内切葡聚糖酶(EC3.2.1.4)，其随机切割纤维素链；纤维二糖水解酶(EC3.2.1.91)，其从纤维素链末端切割纤维二糖基单元，和β-葡糖苷酶(EC3.2.1.21)，其将纤维二糖和可溶性纤维糊精转化为葡萄糖。在这三种类型的涉及纤维素生物降解的酶中，纤维二糖水解酶是用于天然晶质纤维素降解的关键酶。在本文中术语“纤维二糖水解酶I”定义为如酶分类EC3.2.1.91中定义的纤维素1,4-β-纤维二糖苷酶(亦称作外切葡聚糖酶、外切纤维二糖水解酶或1,4-β-纤维二糖水解酶)活性，其通过从链的非还原端释放纤维二糖来催化纤维素和纤维四糖中1,4-β-D-葡糖苷键的水解。术语“纤维二糖水解酶II活性”的定义是相同的，但纤维二糖水解酶II从链的还原端攻击。
内切葡聚糖酶(EC3.2.1.4号)催化纤维素、纤维素衍生物(如羧甲基纤维素和羟乙基纤维素)、地衣淀粉中的1,4-β-D-葡糖苷键，混合β-1,3葡聚糖如谷类β-D-葡聚糖或木葡聚糖和其他包含纤维素部分的植物材料中的β-1,4-键的内水解。正式名称为内切-1,4-β-D-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶，但缩写形式内切葡聚糖酶在本说明书中使用。
在优选的实施方案中，所述纤维素酶活性可来源于真菌来源，如木霉属(Trichoderma)的菌株，优选里氏木霉(Trichodermareesei)的菌株；腐质霉属(Humicola)的菌株，如特异腐质霉(Humicolainsolens)的菌株；或金孢子菌属(Chrysosporium)的菌株，优选Chrysosporiumlucknowense的菌株。
在一个优选实施方案中，所述纤维素酶制备物包含具有纤维素分解增强活性(GH61A)的多肽，优选WO2005/074656中公开的多肽。所述纤维素酶制备物还可包括β-葡糖苷酶，如美国临时申请60/832,511号中公开的融合蛋白。在一个实施方案中所述纤维素酶制备物还包含CBHII，优选土生梭孢霉(Thielaviaterrestris)纤维二糖水解酶IICEL6A。在一个实施方案中，所述纤维素酶制备物还包含来源于里氏木霉的纤维素酶制备物。在一个优选实施方案中，所述纤维素酶制备物是用于实施例1并在WO2008/151079中公开的纤维素酶制备物A(CellulasepreparationA)。
在一个实施方案中，所述纤维素酶是商业上可获得的产品1.5L或CELLUZYMETM(NovozymesA/S，Denmark)。
所述纤维素酶可在0.1-100FPU每克干固体(DS)，优选0.5-50FPU每克DS，特别是1-20FPU每克DS的范围给药。
所述纤维素酶可在0.1-10000mg酶蛋白(EP)/kg干固体(DS)，优选0.5-5000mgEP/kgDS，特别是1-2500mgEP/kgDS的范围给药。
半纤维素酶：半纤维素可由半纤维素酶和/或酸水解降解来释放其五碳和六碳糖成分。
可使用任何适用于水解半纤维素的半纤维素酶。优选的半纤维素酶包括木聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、葡糖醛酸糖苷酶、内切半乳聚糖酶、甘露聚糖酶、内切或外切阿拉伯聚糖酶、内切或外切半乳聚糖酶及其两种或更多种的混合物。优选地，用于本发明的半纤维素酶是外切作用的半纤维素酶，且更优选地，所述半纤维素酶是外切作用的半纤维素酶，其在低于pH7，优选pH3-7的酸性条件下具有水解半纤维素的能力。适用于本发明的半纤维素组合物的实例包括VISCOZYMETM和ULTRAFLOTM(可从NovozymesA/S，Denmark获得)。
用于本发明的木聚糖酶(EC3.2.1.8)优选为内切-1,4-β-木聚糖酶，并优选为糖苷水解酶家族10或11(GH10或GH11)。GH10或GH11定义于Cantarel等,2008,NucleicAcidsRes.37:D233-D238和互联网上(cazy.org)。
所述木聚糖酶可为任何来源，包括哺乳动物、植物或动物来源；然而，优选所述木聚糖酶是微生物来源。具体而言，所述木聚糖酶可为可来源于丝状真菌或酵母的木聚糖酶。优选地，所述木聚糖酶来源于丝状真菌如来自曲霉属种(Aspergillussp.)、芽孢杆菌属种(Bacillussp.)、腐质霉属种(Humicolasp.)、毁丝霉属种(Myceliophotorasp.)、Poitrasiasp.、根毛霉属种(Rhizomucorsp.)或木霉属(Trichoderma)。所述木聚糖酶优选为GH10木聚糖酶。
最优选的是来源于棘孢曲霉(Aspergillusaculeatus)并作为木聚糖酶II公开于WO1994/021785并在该文中为SEQIDNO:1的木聚糖酶。还优选的是与本文中SEQIDNO:1中所示的氨基酸序列具有至少50％同一性，至少60％同一性，至少70％同一性，至少80％同一性，至少90％同一性，至少95％同一性或甚至至少99％同一性的木聚糖酶。
适用于本发明方法以供处理所述用过的洗涤溶液的木聚糖酶优选为固定化的木聚糖酶。若使用非固定化的木聚糖酶，其以0.001-1.0g/kgDS底物，优选0.005-0.5g/kgDS底物，且最优选0.05-0.10g/kgDS底物的量添加。
木聚糖酶亦可在本发明的水解步骤中以0.001-1.0g/kgDS底物，优选0.005-0.5g/kgDS底物，且最优选0.05-0.10g/kgDS底物的量添加。
阿魏酸酯酶(EC3.1.1.73)催化来自酯化的糖的4-羟基-3-甲氧基肉桂酰(阿魏酰)基团的水解，所述酯化的糖通常为阿拉伯木聚糖中的阿拉伯糖。合适的阿魏酸酯酶可从丝状真菌(例如木霉属、多孔菌属(Meripilus)、腐质霉属、曲霉属、镰孢属(Fusarium))或从细菌(例如芽孢杆菌属)的菌株获得，如来自黑曲霉(Aspergillusniger)，例如Faulds等1994,Microbiology,140,pp.779-787所述的FAEIII阿魏酸酯酶。
阿拉伯呋喃糖苷酶(EC3.2.1.55)催化α-L-阿拉伯糖苷中末端非还原性α-L-阿拉伯呋喃糖苷残基的水解。
半乳聚糖酶(EC3.2.1.89)，阿拉伯半乳聚糖内切-1,4-β-半乳糖苷酶，催化阿拉伯半乳聚糖中1,4-D-半乳糖苷键的内水解。
果胶酶(EC3.2.1.15)催化果胶酸和其他半乳糖醛酸聚糖(galacturonan)中1,4-α-D-半乳糖苷酸键(galactosiduroniclinkage)的水解。
木葡聚糖酶催化木葡聚糖的水解。
半纤维素酶可以以有效水解半纤维素的量，如以约0.001至0.5wt.％干固体(DS)，更优选约0.05至0.5wt.％DS的量添加。
材料和方法
酶：
包含示于SEQIDNO:1的木聚糖酶的木聚糖酶组合物。
包含来源于里氏木霉的纤维素分解酶、公开于WO2005/074656的具有纤维素分解增强活性的多肽(GH61A)和米曲霉β-葡糖苷酶(WO2008/057637中公开的融合蛋白中的)的纤维素酶制备物A。纤维素酶制备物A公开于WO2008/151079。
同一性的确定
两种氨基酸序列或两种核苷酸序列之间的关系是通过参数“同一性”描述的。
两种氨基酸序列之间的同一性程度可通过Clustal方法(Higgins,1989,CABIOS5:151-153)使用LASERGENETMMEGALIGNTM软件(DNASTAR,Inc.,Madison,WI)用同一性表和下述多重比对参数来确定：缺口罚分为10和缺口长度罚分为10。逐对比对参数(Pairwisealignmentparameter)为Ktuple＝1、缺口罚分(gappenalty)＝3、窗口(windows)＝5和对角线(diagonals)＝5。
两种核苷酸序列之间的同一性程度可通过Wilbur-Lipman方法(Wilbur和Lipman,1983,ProceedingsoftheNationalAcademyofScienceUSA80:726-730)使用LASERGENETMMEGALIGNTM软件(DNASTAR,Inc.,Madison,WI)用同一性表和下述多重比对参数来确定：缺口罚分为10和缺口长度罚分为10。逐对比对参数为Ktuple＝3、缺口罚分(gappenalty)＝3和窗口(windows)＝20。
实施例
实施例1
使用蒸汽爆炸在195℃预处理玉米秸秆5.4分钟。将具有53.10％干固体含量(DS)的250g经预处理的玉米秸秆(PCS)与1L洗涤水溶液(水对PCS重量比为4:1)混合，并伴随搅拌在室温温育30分钟。将来自PCS的用过的洗涤溶液通过8层干酪筛网布(cheesecloth)挤出，并通过32层干酪筛网布过滤。收集经洗涤的PCS，并获得了约880g用过的洗涤溶液。将所述用过的洗涤溶液用8.8ml木聚糖酶(176mg酶蛋白)在50℃处理90分钟，接着在90℃进行30分钟以使酶失活。将880g的用过的洗涤溶液与220g未洗涤的PCS混合，并伴随搅拌在室温温育30分钟。将来自PCS的用过的洗涤溶液通过8层干酪筛网布挤出，并通过32层干酪筛网布过滤。收集经洗涤的PCS，并获得了约770g用过的洗涤溶液。将所述用过的洗涤溶液用7.7ml木聚糖酶(154mg酶蛋白)在50℃处理90分钟，接着在90℃进行30分钟以使酶失活。将770g的用过的洗涤溶液与192.5g未洗涤的PCS混合，并伴随搅拌在室温温育30分钟。将来自PCS的用过的洗涤溶液通过8层干酪筛网布挤出，并通过32层干酪筛网布过滤。收集经洗涤的PCS。获得了三批经洗涤的PCS。将经洗涤的PCS分为6％初始DS和20g重量的样品。添加青霉素以供控制细菌污染。以6mgEP/g纤维素的浓度添加纤维素酶组合物A，并在50℃和pH5.0进行水解72小时。
作为对照，如上所述洗涤所述未洗涤的PCS，但用水代替木聚糖酶溶液。获得了三批经洗涤的PCS。
在水解之后，通过HPLC量化可溶性C6糖。结果示于表1。
在本实施例中进行的在90℃的30分钟温育对木聚糖酶的失活仅为说明木聚糖酶的作用是由于针对洗涤溶液中可溶性底物的活性，而非针对PCS的固体底物的活性。

Claims (19)

1.一种将含木素纤维素材料转化为水解物的方法，包括下述步骤：
(a)对含木素纤维素材料进行预处理，
(b)在水性洗涤溶液中洗涤经预处理的含木素纤维素材料，
(c)将用过的水性洗涤溶液分离以获得经预处理和洗涤的含木素纤维素材料，
(d)对经预处理的和洗涤的含木素纤维素材料进行处理，导致纤维素和/或半纤维素的至少部分水解，以获得水解物，
(e)在将步骤(c)的用过的水性洗涤溶液再循环至步骤(b)之前，用木聚糖酶处理该用过的水性洗涤溶液，和
(f)将步骤(e)中经木聚糖酶处理过的水性洗涤溶液再循环至步骤(b)。
2.权利要求1的方法，还包括将步骤(d)的水解物与发酵生物相接触以产生发酵产物。
3.权利要求2的方法，包括同时水解和发酵。
4.权利要求2或3的方法，还包括回收发酵产物。
5.前述任一项权利要求的方法，其中所述木聚糖酶是GH10木聚糖酶。
6.前述任一项权利要求的方法，其中所述木聚糖酶经固定化。
7.前述任一项权利要求的方法，其中所述含木素纤维素材料来源于选自下组的材料：玉米秸杆、玉米纤维、硬木、软木、谷物秆、柳枝稷、稻壳、城市固体废物、工业有机废物、办公室用纸或其混合物。
8.权利要求7的方法，其中所述硬木选自杨木和桦木。
9.权利要求7的方法，其中所述谷物秆为麦秆。
10.前述任一项权利要求的方法，其中步骤(a)中的含木素纤维素材料经化学和/或机械预处理。
11.前述任一项权利要求的方法，其中对步骤(a)中的含木素纤维素材料使用酸进行化学预处理。
12.前述任一项权利要求的方法，其中步骤(a)中的预处理是使用有机酸进行的酸预处理。
13.权利要求12的方法，其中有机酸选自硫酸、乙酸、柠檬酸、酒石酸、琥珀酸和/或其混合物。
14.前述任一项权利要求的方法，其中步骤(a)中的含木素纤维素材料是用0.1至2.0wt.％酸进行的酸预处理。
15.权利要求14的方法，其中所述酸为硫酸。
16.前述任一项权利要求的方法，其中对步骤(a)中的含木素纤维素材料在高温和/或高压进行机械预处理。
17.前述任一项权利要求的方法，其中对步骤(a)中的含木素纤维素材料通过蒸汽爆炸、稀酸蒸汽爆炸和/或湿氧化来预处理。
18.前述任一项权利要求的方法，其中步骤(b)的水性洗涤溶液包含水、有机溶剂或水和有机溶剂的混合物。
19.前述任一项权利要求的方法，其中将在再循环的水性洗涤水溶液中蓄积的溶解糖(i)导入进一步的发酵步骤并用C5发酵生物发酵，或(ii)分离出来，并用C5发酵生物发酵。
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