CN105200061A - 一种人重组Irisin蛋白及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种人Irisin重组蛋白的DNA序列。本发明还公开了一种人Irisin重组蛋白。本发明还公开了人Irisin重组蛋白的DNA序列的重组表达载体、转基因细胞系统或转基因重组菌。本发明还公开一种转基因重组菌。本发明还公开了一种人Irisin重组蛋白的制备方法。本发明还公开了一种人Irisin重组蛋白在制备代谢性疾病药物的应用。本发明所提供的方法步骤简便，生产成本低，生产周期短，通过本发明所提供的方法，可得到纯度较高的目的蛋白。

Description

一种人重组Irisin蛋白及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域中重组基因的可溶性表达和纯化方法，特别涉及人Irisin蛋白的原核表达和纯化方法。

背景技术

Irisin是2012年年初由Spiegelman实验室在《自然》杂志上报道的一种新的肌肉因子，是蛋白水解酶剪切Ⅲ型纤连蛋白组件包含蛋白5(fibronectintypeⅢdomain-containingprotein5，FNDC5)后形成的可分泌多肽片段。人FNDC5的N-端有一个信号序列，中间为Ⅲ型纤连蛋白结构域(FND)，紧接其后的为疏水氨基酸区和C-末端。Irisin是FNDC5中纤连蛋白结构域的主要部分，是由112个氨基酸残基组成的N-糖基化蛋白质激素，其序列在种属间高度保守，人和小鼠的Irisin氨基酸序列同源性为100％。

发现者用希腊神话中信使女神Iris的名字为Irisin命名，暗喻其像Iris一样，作为骨骼肌的使者，传递骨骼肌的信号，并连接骨骼肌与外周组织的关系。Irisin最重要的生物学功能是通过内分泌、旁分泌和自分泌的方式作用于白色脂肪细胞，使后者转变为具有分解代谢脂肪特征的棕色脂肪细胞，以产热的方式消除白色脂肪，从而起到减肥作用。研究表明，鸢尾素水平主要反映了肌肉质量，且在年轻的男性运动员中其量高于老年女性；另有研究表明，II型糖尿病患者的血清Irisin水平是降低的，并且与新发II型糖尿病的发病率呈反比，表明Irisin可能在糖耐量和II型糖尿病中发挥关键作用；此外，有关报道还指出Irisin与非酒精性脂肪肝、心率衰竭等病理现象存在一定的相关性。

可以看出Irisin必将是一个很有前景的活性因子，并成为代谢性疾病及其并发症防治的新靶点，有非常大的潜在价值。因此，开发Irisin蛋白的可大规模生产并便于纯化的方法，具有非常大的价值。

发明内容

发明目的：本发明的第一个目的是提供一种人Irisin重组蛋白的DNA序列。

本发明的另一个目的在于提供一种人Irisin重组蛋白。

本发明的又一个目的是提供含有所述的人Irisin重组蛋白的DNA序列的重组表达载体、转基因细胞系统或转基因重组菌。

本发明的又一个目的是提供一种转基因重组菌。

本发明的又一个目的是提供一种人Irisin重组蛋白的制备方法。

本发明的又一个目的是提供一种人Irisin重组蛋白在制备代谢性疾病药物的应用。

技术方案：为了解决上述问题，本发明的技术方案是提供一种人Irisin重组蛋白的DNA序列，其碱基序列如SEQIDNO：1所示。

一种人Irisin重组蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。

含有所述的人Irisin重组蛋白的DNA序列的重组表达载体、转基因细胞系统或转基因重组菌。

将所述的DNA序列插入到大肠杆菌表达载体中得到的表达人Irisin重组蛋白的DNA的重组表达载体。

其中，所述大肠杆菌表达载体为pET-30a(+)。

一种转基因重组菌，所述重组菌是将所述的重组表达载体导入大肠杆菌中，筛选得到转基因重组菌。

所述的DNA序列、重组表达载体、转基因细胞系统或转基因重组菌在生产人Irisin重组蛋白中的应用。

一种人Irisin重组蛋白的制备方法，包括以下步骤：

1)从人肌肉组织中提取总RNA并做反转录PCR得到其cDNA，以cDNA为模板，PCR得到人Irisin的基因片段，其碱基序列如SEQIDNO：1所示；

2)构建pET30a-Irisin原核表达载体；

3)构建Rosetta-pET-30a-Irisin原核表达菌株；

4)人Irisin重组蛋白的诱导表达、纯化及鉴定。

一种所述的人Irisin重组蛋白在制备代谢性疾病药物的应用。

有益效果：本发明相对于现有技术，具有以下优点：本发明所提供的方法步骤简便，生产成本低，生产周期短，通过本发明所提供的方法，可得到纯度较高的特异性目的蛋白。其最主要优势在于：本发明首次以原核表达体系实现了人Irisin蛋白的可溶性表达，并且，在用镍柱纯化蛋白的过程中通过咪唑梯度洗脱及pH梯度洗脱，确定了目的蛋白的最佳洗脱条件，可得到高纯度的目的蛋白。

附图说明

图1：pET-30a-Irisin载体酶切检验琼脂糖电泳分析图(M为DL5000DNAMaker；1为经NdeI、XhoI双酶切的pET-30a-Irisin载体；2为未经酶切的pET30a-Irisin载体。可初步判断pET-30a-Irisin载体成功构建。)

图2：Rosetta-pET-30a-Irisin菌株IPTG梯度诱导SDS-PAGE电泳分析图(M为PremixedProteinMarker；图中1所用IPTG诱导剂浓度为0mM；2所用IPTG诱导剂浓度为0.1mM；3所用IPTG诱导剂浓度为0.2mM；4所用IPTG诱导剂浓度为0.4mM；5所用IPTG诱导剂浓度为0.6mM；6所用IPTG诱导剂浓度为0.8mM；7所用IPTG诱导剂浓度为1.0mM；可看出14KDa左右位置有明显差异，初步判断目的蛋白有表达)

图3：Rosetta-pET-30a-Irisin菌株低温诱导镍柱纯化SDS-PAGE电泳分析图(M为PremixedProteinMarker；图中1为诱导菌体；2为诱导菌体裂解上清；3为过柱液；4为洗涤液I；5为洗涤液II；6为洗脱液；6泳道为纯化目的蛋白，其条带单一且与预测结果一致，这表明本发明通过纯化得到了较高纯度的目的蛋白)

图4：人Irisin蛋白原核表达Westernblot分析图(图中为14KDa位置特异性条带，其中，1为未经IPTG诱导的Rosetta-pET-30a-Irisin菌体；2为经IPTG诱导的Rosetta-pET-30a-Irisin菌体；3为经IPTG诱导的Rosetta-pET-30a-Irisin菌体裂解上清；4为经镍柱纯化的人Irisin原核表达蛋白。结果表明，目的蛋白成功表达。)

图5：BCA蛋白浓度测定标准曲线。

具体实施方式

实施例1：构建人Irisin蛋白的原核表达质粒和菌株

1.从人肌肉组织中的到Irisin的目的基因

从人肌肉组织中提取总RNA并做反转录PCR得到其cDNA。根据相关文献报道及NCBI网上公布Irisin基因序列(NM_153756)设计引物，以上述得到的cDNA为模板，做PCR得到人Irisin的基因片段。把上述人Irisin基因插入到pMD19-T载体中。命名为pMD19-T-Irisin，并测序确定正确获取目的基因。

2.构建pET30a-Irisin原核表达载体

跟据人Irisin基因序列设计引物，其中上游带有NdeI酶切位点，下游带有XhoI酶切位点：

上游引物：5’—TACATATGGACAGTCCCTCAGCCCCA—3’

下游引物：5’—CACTCGAGCTCTTTCATGGTTACCTCA—3’

以步骤1中pMD19-T-Irisin载体为模板，用上述的一对引物进行PCR扩增。

PCR体系：

反应条件为：95℃预变性2min；95℃变性30sec，62℃退火30sec，72℃延伸40sec，30个循环；72℃延伸10min；16℃结束。

把PCR产物经NdeI、XhoI双酶切后，连接至经NdeI、XhoI双酶切的pET-30a(+)载体，并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。转化后的DH5α涂含有卡那霉素的LB平板进行筛选，37℃培养12h，挑取单菌落接种至3mL含有卡那霉素的LB液体培养基，37℃摇床培养12h，做菌液PCR鉴定后，抽取质粒用NdeI、XhoI双酶切鉴定，并进行测序以确定正确构建载体，测序正确的载体命名为pET-30a-Irisin。

3.构建Rosetta-pET-30a-Irisin原核表达菌株

由于人Irisin的基因序列中含有大肠杆菌的稀有密码子，所以选取“万能”菌株Rosetta(DE3)pLysS为表达菌株，该菌株通过一个相容性氯霉素抗性质粒补充密码子AUA、AGG、AGA、CUA、CCC和GGA的tRNAs，从而增强带有大肠杆菌稀有密码子的真核蛋白的表达。

把步骤2中构建好的pET-30a-Irisin载体转化进Rosetta(DE3)pLysS感受态细胞，涂含有氯霉素和卡那霉素的LB平板进行筛选，37℃培养12h，挑取单菌落接种至3mL含有氯霉素和卡那霉素的LB液体培养基，37℃摇床培养12h，做菌液PCR鉴定后，抽取质粒，并且用NdeI、XhoI进行双酶切鉴定，鉴定后的菌株命名为Rosetta-pET-30a-Irisin。

表1人Irisin基因序列稀有密码子预测图

实施例2：目的蛋白的诱导表达、纯化及鉴定

1.用IPTG诱导表达目的蛋白

(1)梯度诱导：把构建好的Rosetta-pET-30a-Irisin菌株划线纯化，挑取单克隆接种至3mL含有氯霉素和卡那霉素的LB液体培养基中，37℃摇床培养过夜，菌液PCR鉴定之后，按1％量接种至3mL含有氯霉素和卡那霉素的LB液体培养基中，37℃摇床培养2～3h至OD600到0.4～1，分别加入IPTG浓度至0mM、0.1mM、0.2mM、0.6mM、0.4mM、0.8mM、1.0mM，37℃摇床诱导培养5h后收集菌体，经SDS-PAGE电泳鉴定，可初步判断目的蛋白诱导表达。

(2)低温诱导：把构建好的Rosetta-pET-30a-Irisin菌株划线纯化，挑取单克隆接种至3mL含有氯霉素和卡那霉素的LB液体培养基中，37℃摇床培养过夜，菌液PCR鉴定之后，按1％量接种至50mL含有氯霉素和卡那霉素的LB液体培养基中，37℃摇床培养2～3h至OD600到0.4～1，放入18℃摇床培养0.5h，加入IPTG浓度至0.1mM，8℃摇床诱导培养18h，收集菌体，进行蛋白纯化和鉴定(低温诱导可提高目的蛋白的可溶性表达，诱导菌体可继续纯化或保存在-80℃冰箱)。

2.用镍柱纯化目的蛋白

取100mL低温诱导的Rosetta-pET-30a-Irisin菌液，用冷冻离心机4℃，5000g离心10分钟收集菌体，加入含有溶菌酶的10mL镍柱结合液，冰上放置30分钟，超声破碎15分钟，使菌体彻底破碎，4℃，12000g离心10分钟去除残留细胞和细胞碎片，收集上清，用镍柱纯化可溶性蛋白，经SDS-PAGE电泳鉴定，纯化蛋白条带非常单一且与预测大小一致，表明得到了较高纯度的目的蛋白。

3.用Westernblot方法鉴定目的蛋白

分别取未经IPTG诱导的Rosetta-pET-30a-Irisin菌体、经IPTG诱导的Rosetta-pET-30a-Irisin菌体、经IPTG诱导的Rosetta-pET-30a-Irisin菌体裂解上清、镍柱纯化得到的人Irisin原核表达蛋白进行Westernblot鉴定，可以确定本发明成功构建了人Irisin蛋白的原核表达菌株，得到了一种人Irisin蛋白的原核可溶性表达和纯化方法。

4.用BCA法测定目的蛋白回收率

用镍柱洗脱液将25mg/mL的BSA标准蛋白稀释成0.5mg/mL的标准品，将标准品按0，1，2，4，8，12，16，20μL加到96孔板的标准品孔中，加镍柱洗脱液补足到20μL，将镍柱纯化的目的蛋白加入到96孔板的待测样品孔中，每孔各加入加入200μLBCA工作液，37℃放置30分钟，用酶标仪测量吸光度(A_562nm)，用标准品吸光度绘制标准曲线(y＝1.02107x-0.12591，R²＝0.99815，其中y为蛋白浓度mg/mL，x为吸光度)，计算出样品浓度为0.225mg/mL，最后得出本发明的人Irisin蛋白回收率约为5-10毫克每升培养物。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种人Irisin重组蛋白的DNA序列，其碱基序列如SEQIDNO：1所示。

2.一种人Irisin重组蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。

3.含有权利要求1所述的人Irisin重组蛋白的DNA序列的重组表达载体、转基因细胞系统或转基因重组菌。

4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于，将权利要求1所述的DNA序列插入到大肠杆菌表达载体中得到的表达人Irisin重组蛋白的DNA的重组表达载体。

5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于，所述大肠杆菌表达载体为pET-30a(+)。

6.一种转基因重组菌，其特征在于，所述重组菌是将权利要求4或5所述的重组表达载体导入大肠杆菌中，筛选得到转基因重组菌。

7.权利要求1所述的DNA序列、权利要求3所述的重组表达载体、转基因细胞系统或转基因重组菌在生产人Irisin重组蛋白中的应用。

8.一种人Irisin重组蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）从人肌肉组织中提取总RNA并做反转录PCR得到其cDNA，以cDNA为模板，PCR得到人Irisin的基因片段，其碱基序列如SEQIDNO：1所示；

2）构建pET30a-Irisin原核表达载体；

3）构建Rosetta-pET-30a-Irisin原核表达菌株；

4）人Irisin重组蛋白的诱导表达、纯化及鉴定。

9.一种权利要求2所述的人Irisin重组蛋白在制备代谢性疾病药物的应用。