CN105163756A

CN105163756A - 免疫调节

Info

Publication number: CN105163756A
Application number: CN201480024524.2A
Authority: CN
Inventors: P·M·豪利
Original assignee: Segmentis Ltd
Current assignee: Segmentis Ltd
Priority date: 2013-03-15
Filing date: 2014-03-17
Publication date: 2015-12-16
Also published as: EP3685853A1; JP2016513963A; US11173206B2; WO2014138824A1; DK2968528T3; KR20160002771A; JP2019134707A; AU2014231734B2; IL241596B; NZ630642A; KR102125594B1; US20220088189A1; JP6549042B2; KR102212253B1; RU2015144308A; SG11201507657QA; RU2662927C2; CA2906735A1; RU2709771C2; CN109517842A

Abstract

本发明涉及含有编码融合蛋白的核酸序列的痘病毒载体，所述融合蛋白包含：(i)选自arah1、arah2、arah3、arah4、arah5、arah6、arah7、arah8、arah9、arah1O和arahII的至少两种花生变应原的花生变应原或与其具有至少70％的序列同一性的其衍生物或部分，以及(ii)增强所述融合蛋白的细胞内降解的蛋白酶体降解标签。还公开了脱敏花生变应原或诱导对花生变应原耐受和/或抑制对花生变应原的过敏反应的方法。

Description

免疫调节

技术领域

本发明一般地涉及预防性或治疗性疫苗领域。具体地，本发明涉及通过抑制对花生过敏的变态反应来治疗花生过敏的疫苗。

背景技术

原理上，过敏疾病是与T_H1和T_H2淋巴细胞亚群失调相关的免疫系统病症(deVriesetal.1999,Parronchietal.1999,Singhetal.1999)。据推测，由于接种疫苗、使用抗生素和其他公共卫生实施导致感染性疾病的发病率下降，T_H1免疫激发的主要来源已经失去，结果是针对环境变应原的T_H2偏向的免疫应答增加[Holgate1999,Shaheenetal.1996]。

影响普通人群的各种过敏性疾病中，花生诱导的过敏反应是特别严重的并代表急诊入院治疗的过敏反应的最常见因素。

对花生的过敏源自针对其他无害环境抗原的异常免疫应答。花生过敏和变态反应都围绕2型免疫应答，其特征在于产生T_H2T细胞和分泌IgE抗体的B细胞。与此相反，1型免疫应答特征在于IgG(在小鼠中为IgG2a同种型)为主的抗体、NK细胞和吞噬细胞的活化、以及细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的进展。1型和2型应答都由辅助T细胞进行协调，辅助T细胞分化为几个功能上不同的亚群，包括T_H1和T_H2淋巴细胞。这些亚群通过其细胞因子分泌谱进行表征[Mosmann等人，1989]，其中T_H1细胞产生IFN-γ以及T_H2细胞通常分泌IL-4、IL-5和IL-13。

口服摄入花生变应原首先遇到肠道粘膜免疫系统。微褶(M)细胞是专门的滤泡相关细胞，其排列在胃肠道的上皮并位于非常靠近淋巴集结处。它们负责诱导致耐受(tolerising)和/或保护性肠道相关的免疫应答。当M细胞摄取外源食物抗原然后递呈到巨噬细胞和树突细胞(DC)时，对食物变应原的过敏发生[DeLongetal.2011]。一旦抗原被巨噬细胞和DC内在化，所述抗原被内吞，然后变性和降解为约12-20氨基酸长的肽。这些小肽段的小部分随后被输送至细胞内并递呈在细胞表面MHCII类分子上以与CD4⁺T细胞特异性相互作用。这些活化的CD4⁺T细胞随后在数量上扩增并释放T_H2细胞因子。T_H2细胞、IL-4和IL-5促进B细胞分化，其承载(bear)与表面免疫球蛋白(Ig)受体结合的变应原，进入分泌变应原特异的IgE抗体的细胞[Turcanu等，2010]。这些产生IgE的B细胞然后在数量上扩增并成为持续分泌变应原特异的IgE抗体的浆细胞。暴露至花生环境导致花生变应原与在肥大细胞和嗜碱性粒细胞上包衣(coating)的特异IgE结合。随后，Fc受体交联提供了导致嗜碱细胞和肥大细胞脱粒的有力活化刺激，其迅速释放多种预制的促炎性和血管活性化合物，例如前列腺素、白三烯、丝氨酸蛋白酶、组胺和细胞因子进入细胞外液以产生炎性应答[Sichereretal.2010]，所有这些最终导致急性过敏反应的临床表现[Long2002]。

花生过敏的局部症状包括腹痛、呕吐、腹部绞痛和腹泻，甚至轻度花生过敏的情况下也很常见。这种急性非危及生命的反应引起肠通透性的短暂增加，其随后允许大分子如整个花生变应原全身分布，这加剧针对随后暴露至花生变应原的过敏反应，会导致危及生命的过敏反应[Sandersonetal.1993]。

与针对草花粉、尘螨和蜜蜂螫毒液的过敏反应的传统免疫治疗不同，皮下脱敏注射花生提取物具有不可接受的风险收益[Oppenheimeretal.1992]。因此，目前避免花生为预防进一步反应的唯一可行方法。然而，严格避免对许多个体而言通常是不现实的策略，特别是考虑到意外暴露到花生，这经常发生于摄入与含有花生的地方相同的地点(例如，饭店、学校、食品店和工作食堂)所制备的加工食物或食物。因此，仍然需要一种有效的治疗性策略治疗和预防花生过敏。

发明内容

在本发明的一方面，提供含有编码融合蛋白的核酸序列的痘病毒载体，所述融合蛋白包含(i)选自arah1、arah2、arah3、arah4、arah5、arah6和arah7以及与其具有至少70％的序列同一性的其衍生物或部分的至少两个花生变应原，以及(ii)增强融合蛋白的细胞内降解的蛋白酶体降解标签。

在本发明的一个方面，提供含有编码融合蛋白的核酸序列的痘病毒载体，所述融合蛋白包含(i)选自arah1、arah2、arah3、arah4、arah5、arah6、arah7、arah8、arah9、arah10和arah11以及与其具有至少70％的序列同一性的其衍生物或部分的至少两个花生变应原，以及(ii)增强融合蛋白的细胞内降解的蛋白酶体降解标签。

在本发明的又一方面，提供含有编码融合蛋白的核酸序列的痘病毒载体，所述融合蛋白包含(i)选自arah1、arah2、arah3、arah4、arah5、arah6和arah7以及与其具有至少70％的序列同一性的其衍生物或部分的至少三个花生变应原，以及(ii)增强融合蛋白的细胞内降解的蛋白酶体降解标签。

在本发明的再一方面，提供含有编码融合蛋白的核酸序列的痘病毒载体，所述融合蛋白包含(i)选自arah1、arah2、arah3、arah4、arah5、arah6、arah7、arah8、arah9、arah10和arah11以及与其具有至少70％序列同一性的其衍生物或部分的至少三个花生变应原，以及(ii)增强融合蛋白的细胞内降解的蛋白酶体降解标签。

在本发明的另一方面，提供了本文公开的痘病毒载体在治疗花生过敏症中的用途、或在制备用于治疗花生过敏症的药物中的用途。

在本发明的又一个方面，提供诱导受试者或患者中耐受或抑制受试者或患者中过敏反应的方法，所述方法包括持续一段时间并且在足以引发抑制/耐受的条件下，向受试者或患者施用有效量的本文所公开的痘病毒载体。

在本发明的另一方面，提供向受试者接种疫苗以诱导对花生变应原耐受的方法，包括施用本文所公开的痘病毒载体。

在本发明的另一方面，提供包含本文所公开的痘病毒载体的试剂盒。

以上概述不是或不应以任何方式视为穷举本发明的所有实施方式。

附图说明

图1显示根据本发明的实施方式的包括蛋白酶体降解标签和多个花生变应原的PHAV抗原排列(arrangement)(图1A和B)，以及根据本发明的实施方式没有蛋白酶体降解标签的PHAV抗原排列(图1C)。

图2显示UBc.PHAV表达盒的核酸序列。

图3显示没有泛素序列的PHAVag构建体表达盒的核酸序列。

图4是PHAV表达盒通过同源重组插入到牛痘病毒哥本哈根(Copenhagen)株A39RORF的示意图。

图5列出在图4中示意表示的同源重组盒的特征。

图6显示UBc.PHAV同源重组盒的核酸序列。

图7显示PHAV同源重组盒的核酸序列。

图8是pTC11(UBc.PHAV)和pTC12(PHAV)的示意图。质粒示于图8。

图9是在细胞内蛋白酶体降解通路的示意图。

图10显示在使用空载体(SCV000)或UBc.PHAV载体(SCV201C)接种疫苗之前和之后(接种疫苗后17天)，花生蛋白特异性血清IgE抗体的水平(图10A)和IgG2a抗体的水平(图10B)；^*＝P<0.05。

图11显示通过从SCV000和SCV201C接种疫苗小鼠的脾脏获得的培养的淋巴细胞分泌的IFN-γ(IFN-g；T_H1细胞因子；图11A)、IL-4(T_H2细胞因子；图11B)和IL5(T_H2细胞因子；图11C)的水平。

具体实施方式

在本说明书中参考的任何现有技术不是、以及不应当视为承认或以任何形式说明这种现有技术形成任何国家中公知常识的一部分。

在整个本说明书中，除非上下文另有要求，词语“包括”、“包含”和“含有”将被理解为表示包括所述步骤或者要素(element)或者步骤或要素的组，但不排除任何其它步骤或者要素或者步骤或要素的组。因此，使用术语“包括”之类表示所列要素是必须的或强制性(mandatory)的，但其它要素是任选的并且可有可无的。“由...组成”是指包括并限于短语“由...组成”之后的。因此，短语“由......组成”表示所列要素是必须的或强制性的，并且没有任何其他要素可存在。“基本上由...组成”是指包括短语后列出的任何要素，并且限于不干扰或促进在本公开的所列要素中指定的活性或作用的其它元件。因此，“基本上由...组成”一语表示所列要素是必须的或强制性的，但其它要素是任选的，以及取决于其是否影响所列要素的活性或作用而可有可无。

除非上下文另有明确说明，本文所使用的单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数方面。因此，例如，提及“一种组合物”包括单一组合物，以及两种或两种以上的组合物；提及“一种试剂”包括一种试剂，以及两种或更多种剂；提及“本发明”包括本发明的单个或多个方面；等等。

除非另有限制，本文使用的所有技术和科学术语具有对本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同的含义。与本文所描述的那些类似或等同的任何的材料和方法可用于实践或测试本发明。

本说明书使得疫苗方法能够开发用于治疗或预防花生过敏症的治疗剂。具体地，本说明书使得试剂能够在主要花生变应原的情况下提供治疗，例如，最普遍的或麻烦的花生变应原的至少一个、至少两个、至少三个，等等。

本发明基于本发明人出人意料发现：一种DNA疫苗，其包含可操作编码融合蛋白的核酸构建体，所述融合蛋白包含连接蛋白酶体降解标签(如泛素)的花生变应原(如arah1)，该DNA疫苗能够在偏向T_H1表型的受试者中诱导免疫应答，从而导致分泌花生变应原特异的IgG抗体，而不是花生变应原特异的IgE抗体，该IgE抗体将有利于暴露至花生变应原时的过敏反应。

因此，在本发明的一方面，提供含有编码融合蛋白的核酸序列的痘病毒载体，所述融合蛋白包含(i)选自arah1、arah2、arah3、arah4、arah5、arah6和arah7、以及与其具有至少70％的序列同一性的其衍生物或部分的至少两个花生变应原，以及(ii)增强融合蛋白的细胞内降解的蛋白酶体降解标签。

在本发明的另一方面，提供含有编码融合蛋白的核酸序列的痘病毒载体，所述融合蛋白包含(i)选自arah1、arah2、arah3、arah4、arah5、arah6、arah7、arah8、arah9、arah10和arah11以及与其具有至少70％的序列同一性的其衍生物或部分的至少两个花生变应原，以及(ii)增强融合蛋白的细胞内降解的蛋白酶体降解标签。

在本发明的又一方面，提供在受试者的细胞表达融合蛋白的痘病毒载体，所述融合蛋白包括(i)选自以下的花生变应原：(a)来自arah1、arah2、arah3、arah4、arah5、arah6和arah7，或者与其具有至少70％序列同一性的其衍生物或部分的至少两个花生变应原，或者(b)来自arah1、arah2、arah3、arah4、arah5、arah6和arah7，或者与其具有至少70％序列同一性的其衍生物或部分的至少三个花生变应原；以及(ii)增强融合蛋白的细胞内降解的蛋白酶体降解标签。

在本发明的又一方面，提供在受试者的细胞表达融合蛋白的痘病毒载体，所述融合蛋白包括(i)选自以下的花生变应原：(a)来自arah1、arah2、arah3、arah4、arah5、arah6、arah7、arah8、arah9、arah10和arah11，或者与其具有至少70％序列同一性的其衍生物或部分的至少两个花生变应原，或者(b)来自arah1、arah2、arah3、arah4、arah5、arah6、arah7、arah8、arah9、arah10和arah11，或者与其具有至少70％序列同一性的其衍生物或部分的至少三个花生变应原；以及(ii)增强融合蛋白的细胞内降解的蛋白酶体降解标签。

花生变应原

花生变应原是本领域技术人员已知的，其包括花生(Arachishypogaea)物种的任何肽，受试者可能通过例如，接触、吸入、摄入、注射等暴露至所述花生(Arachishypogaea)物种。在一个实施方式中，至少两个花生变应原选自arah1、arah2、arah3、arah4、arah5、arah6和arah7。在另一个实施方式中，至少两个花生变应原选自arah1、arah2、arah3、arah4、arah5、arah6、arah7、arah8、arah9、arah10和arah11。

所述融合蛋白可以包括任何两种或更多种花生变应原arah1至arah11。例如，所述融合蛋白可包括以下花生变应原：

(ⅰ)arah1、arah2、arah3、arah4、arah5、arah6、arah7、arah8、arah9、arah10和arah11；

(ⅱ)arah1、arah2、arah3、arah4、arah5、arah6、arah7、arah8、arah9和arah10；

(iii)arah1、arah2、arah3、arah4、arah5、arah6、arah7、arah8和arah9；

(iv)arah1、arah2、arah3、arah4、arah5、arah6、arah7和arah8；

(v)arah1、arah2、arah3、arah4、arah5、arah6和arah7；

(vi)arah1、arah2、arah3、arah4、arah5和arah6；

(vii)arah1、arah2、arah3、arah4和arah5；

(viii)arah1、arah2、arah3和arah4；

(ix)arah1、arah2、arah3和arah6；

(x)arah1、arah2和arah3；

(xi)arah1和arah2；

(xii)arah1和arah3；

(xiii)arah1和arah4；

(xiv)arah1和arah5；

(xv)arah1和arah6；

(xvi)arah1和arah7；

(xvii)arah1和arah8；

(xviii)arah1和arah9；

(xix)arah1和arah10；

(xx)arah1和arah11；

(xxi)arah2和arah3；

(xxii)arah2和arah4；等等。

通过采用蛋白酶体降解标签(例如，泛素)为融合蛋白的组份，合成的融合蛋白靶向蛋白酶体降解，导致产生小肽片段，所述小肽片段进入内质网(ER)在那里其与MHCI类蛋白复合然后转运到细胞表面递呈给T淋巴细胞。结果是，具有MHCI类的蛋白片段的递呈增强。因此，本领域技术人员将明白，当核酸序列编码包含两个或更多个花生变应原的融合蛋白，所述两个或更多个花生变应原可以以任何特定顺序出现在融合蛋白中，因为所表达的融合蛋白将经蛋白酶体降解。

本领域的技术人员将理解，在花生变应原的选择可能取决于特定的治疗性和/或预防性应用。例如，当疫苗用于在对花生变应原Arah1过敏的受试者中诱导耐受时，则融合蛋白将需要包含Arah1；当疫苗用于在对花生变应原arah2过敏的受试者中诱导耐受时，则融合蛋白将需要包含arah2；当疫苗用于在对花生变应原arah1和arah2过敏的受试者中诱导耐受时，则融合蛋白将需要包含arah1和arah2；等等。

在一个实施方式中，花生变应原选自：arah1克隆P41B(GenBank登录号L34402或Swiss-Prot：P43238.1)；arah1克隆P17(GenBank登录号L38853)；arah2cDNA(GenBank登录号L7797或UniProtKB/TrEMBL：Q8GV20)；arah3cDNA(GenBank登录号AF093541或ACH91862)；arah4cDNA(GenBank登录号AF086821)；arah5cDNA(GenBank登录号AF059616)；arah6cDNA(GenBank登录号AF092846或UniProtKB/TrEMBL：Q647G9)，arah7cDNA(GenBank登录号AF091737)、arah8(GenBank登录号AY328088，EF436550)、arah9(GenBank登录号EU159429，EU161278)、arah10(AY722694，AY722695)和arah11(DQ097716)。

在一个实施方式中，融合蛋白包括至少四种花生变应原，更优选影响花生过敏个体的最常见花生变应原中的至少四种。在一个实施方式中，融合蛋白包括花生变应原arah1、arah2、arah3和arah6。

如本文所用，术语“花生变应原”，其包括特异性实例例如arah1、arah2等等，可以理解为还包括其同源物或变体。术语“同源物”，如本文所用的指本文所述的核酸序列或多肽的同源物(包括，例如，SEQIDNO:1-12中的任一项)，应理解为包括，例如，本文所述的核酸或多肽的直接同源物、间接同源物(paralog)、突变体和变体。在一些实施方式中，同源物包含与本文所述的核酸或氨基酸序列具有至少70％的序列同一性、至少75％的序列同一性、至少80％的序列同一性、至少85％的序列同一性、至少90％的序列同一性、至少95％的序列同一性、至少96％的序列同一性、至少97％的序列同一性、至少98％的序列同一性、或至少99％的序列同一性的核酸或氨基酸序列。

因此，在一个实施方式中，arah1具有SEQIDNO:4的氨基酸序列或与其具有至少70％同一性的氨基酸序列，arah2包含SEQIDNO:6的氨基酸序列或与其具有至少70％同一性的氨基酸序列，arah3包含SEQIDNO:8的氨基酸序列或与其具有至少70％同一性的氨基酸序列，以及arah6具有SEQIDNO:10的氨基酸序列或与其具有至少70％同一性的氨基酸序列。

在另一实施方式中，arah1是由SEQIDNO:3的核酸序列或与其具有至少70％同一性的核酸序列所编码，arah2是由SEQIDNO:5的核酸序列或与其具有至少70％同一性的核酸序列所编码，arah3是由SEQIDNO:7的核酸序列或与其具有至少70％同一性的核酸序列所编码，以及arah6是由SEQIDNO:9的核酸序列或与其具有至少70％同一性的核酸序列所编码。

本文所用术语“序列同一性”是指在比较窗口中核苷酸比核苷酸基础上或氨基酸比氨基酸基础上序列相同的程度。因此，“序列同一性百分比”是通过以下来计算：在比较窗口中比较两个最佳比对的序列，确定在两条序列上具有相同核酸碱基(如，A、T、C、G、I)或相同氨基酸残基(例如，Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys和Met)的位置的数目以产生匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比较窗口中位置的总数(即窗口尺寸)，再将结果乘以100的以产生序列同一性的百分比。出于本发明的目的，“序列同一性”将理解为指用适当方法计算出的“匹配百分比”。例如，序列同一性分析可以使用DNASIS计算机程序(Windows系统2.5版本；来自Hitachi软件工程有限公司，南旧金山，加利福尼亚，美国)，使用如软件所附参考手册中的标准缺省值进行计算。在一些实施方式中，所包含的花生变应原氨基酸或核苷酸序列的序列同一性提高到至少75％、或至少80％、或至少85％、或至少90％、或至少95％、或至少98％的序列同一性。

在一些实施方式时，术语“变应原”也可包括前述肽中任一个的片段。因此，核酸可包含编码前述花生变应原之一的片段的核苷酸。

在一些实施方式中，花生变应原包括修改的花生变应原，其中从天然花生变应原的序列去除8个或更多个碱基的重复序列。在一些实施方式中，融合蛋白包括2个或更多花生变应原。在一些实施方式中，融合蛋白包含两个或更多个花生变应原，其中至少一个选自arah1、arah2、arah3、arah4、arah5、arah6、arah7、arah8、arah9、arah10和arah11。在一些实施方式中，融合蛋白包括arah1、arah2、arah3和arah6，或其同源物。

在一些实施方式中，在编码花生变应原的两个序列之间去除核酸的终止密码子以便于表达单个融合蛋白。

蛋白酶体降解标签

本发明人出人意料地发现，采用蛋白酶体降解标签(如泛素)作为融合蛋白的组份能够克服非泛素化的花生变应原肽构建体在重组表达中所具有的明显毒性和/或抑制效果。使用蛋白酶体降解标签使表达的融合肽靶向蛋白酶体降解。作为泛素靶向的蛋白酶体降解的结果，融合肽的小肽片段(例如，约8-12氨基酸长的肽)进入内质网(ER)，在内质网中所述小肽片段与MHCI类蛋白复合，并随后转运至细胞表面递呈给T淋巴细胞。结果是，增强递呈具有MHCI类的融合肽片段，产生针对花生变应原的更强的T_H1免疫应答。因此，蛋白酶体降解标签出人意料地阻止完整的花生变应原肽构建体在宿主细胞中抑制重组表达，并使免疫应答偏向T_H1表型。

蛋白酶体降解标签可以是使融合蛋白靶向蛋白酶体降解的任何标签。在一些实施方式中，蛋白酶体降解标签可以包括泛素分子或泛素结合结构域。在一个实施方式中，蛋白酶体降解标签是泛素单体，其中的说明性实例是泛素C。在某些实施方式中，泛素单体包括SEQIDNO：2的氨基酸序列或与其具有至少70％的核苷酸序列同一性的氨基酸序列。

在某些实施方式中，泛素单体的C末端是丙氨酸残基。

在另一实施方式中，泛素单体由SEQIDNO：1的核苷酸序列或与其具有至少70％的核苷酸序列同一性的核苷酸序列所编码。

编码蛋白酶体降解标签的序列可被放置在编码至少一个花生变应原的序列之前或之后(即，蛋白降解标签可以是C端或N端融合蛋白)。

泛素分子可以源自任何合适物种(species)。对于用于人类治疗的疫苗而言，泛素分子可以是人类泛素分子或者是可经过密码子优化以在人类细胞中表达的来自其它动物物种的泛素分子。在一些实施方式中，泛素分子可以是一个泛素C单体。当表达时，泛素分子可以吸引并结合其它泛素分子以在融合蛋白上形成聚泛素链。泛素分子和/或聚泛素链可指导融合蛋白进行蛋白酶体降解。

在一些实施方式中，核酸构建体可操作地编码多个泛素分子或编码截短或修饰的泛素分子的一个或多个序列。如果编码多个泛素分子，则移除一个或多个起始和终止密码子以允许翻译整个融合蛋白。

在一些实施方式中，截短的泛素分子可能不包括天然泛素分子C末端最接近的赖氨酸。在一些实施方式中，修饰的泛素分子可以具有从所述序列移除或替换(例如，使用精氨酸)天然序列中的一个或多个赖氨酸。在一些实施方式中，泛素分子可以仅具有单个赖氨酸。

在一些实施方式中，泛素分子的C末端可以被修饰。例如，天然分子的C-末端甘氨酸可以被取代为丙氨酸。使用丙氨酸或其它氨基酸取代甘氨酸，可以防止蛋白酶切割来自变应原的蛋白酶体降解标签。使用丙氨酸取代甘氨酸也可以允许在蛋白酶体降解标签和变应原之间形成共价键。这种共价键可以是耐受蛋白酶切割的。

在一些实施方式中，蛋白酶体降解标签可以包括泛素结合结构域。蛋白降解标签可以是含有UbL(泛素样)-UBA(泛素相关)结构域的蛋白家族的成员。在这方面，所表达的融合蛋白可能吸引泛素分子与结合结构域的结合，导致融合蛋白进行蛋白酶体降解。

融合蛋白

在一些实施方式中，核酸序列编码为在受试者中表达已进行优化的融合蛋白。例如，针对花生变应原融合蛋白的序列可进行优化以表达在人类细胞中。类似地，在一些实施方式中，蛋白酶体降解标签进行优化以在受试者中表达和/或蛋白酶体降解标签可以是克隆自与所期望的受试者相同物种的蛋白酶体降解标签。在一些实施方式中，密码子优化涉及用编码相同氨基酸但在靶标物种中(例如，在人类中)更有效或准确翻译的不同密码子来取代密码子。

在一些实施方式中，在受试者中表达的序列的优化还包括去除重复序列。例如，在一些实施方式中，8个或更多个碱基的重复序列从花生变应原的序列去除。如果序列是通过反向(back)翻译合成构建的，这可能是特别重要的。合成的序列普遍缺乏通过进化优化密码子的益处。因此，通过改变核苷酸碱基而不改变氨基酸序列而随机扰乱存在的序列内不稳定的重复序列可改善序列的表达。

在一些实施方式中，蛋白酶体降解标签是由根据SEQIDNO：1核酸序列或其同源物编码。在一些实施方案中，融合蛋白的花生变应原由根据SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7和/或SEQIDNO:9的核酸序列、或前述任一个的同源物所编码。

在一些实施方式中，蛋白酶体降解标签包含根据SEQIDNO：2的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白的花生变应原包含根据SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8和/或SEQIDNO:10的氨基酸序列。

因为MHC-1递呈不需要构象表位并且在一些方面为防止变应原特异的IgE抗体结合而不想要构象表位，作为融合蛋白的一部分表达的变应原不需要其天然结构形式。这可以允许融合蛋白包括多个待使用的花生变应原，并提供融合蛋白设计中的灵活性。

因此，在一些实施方式中，核酸构建体可操作编码2个或更多花生变应原。例如，融合蛋白可编码2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个花生变应原。对于一些核酸而言，变应原中的至少一个可以选自以下花生变应原或其同源物：arah1、arah2、arah3、arah4、arah5、arah6、arah7、arah8、arah9、arah10或arah11。在说明性实例中，所述核酸构建体可操作地编码arah1、arah2、arah3和arah6、或其同源物。例如，核酸构建体可以包括根据SEQIDNO：11的核酸序列，或者可以编码具有根据SEQIDNO：12的氨基酸序列的蛋白。

每个变应原可以融合其自身的蛋白酶体降解标签并且可以可操作地连接到其自身的启动子(例如，多个融合蛋白可以表达)。或者，可以排列用于蛋白酶体降解标签和复数个变应原的序列，以允许包含蛋白酶体降解标签和多个变应原的融合蛋白表达。这后一种方法可防止不同变应原的差异表达和/或，如果多个表达盒与相同启动子一起使用时防止分子内重组。

为了允许翻译具有2个或更多个变应原的融合蛋白，核酸可以在编码花生变应原的两个序列之间不含终止密码子。在一些实施方式中，核酸序列可以在编码花生变应原序列的任意者之间不含终止密码子，和/或可在编码蛋白酶体降解标签的序列和编码变应原的序列之间不含终止密码子。

为了驱动翻译，编码融合蛋白的第一部分的序列可以包括在序列5'端的起始密码子。在编码余下融合蛋白的序列中可不存在起始密码子。在这方面，可最小化或防止未融合蛋白酶体降解标签的变应原的表达。这可最小化或防止完整的花生变应原从细胞分泌出来或者在细胞表面递呈，否则这可能刺激针对变应原的T_H2免疫应答。

在一个实施方式中，所述融合蛋白包含SEQIDNO：12的氨基酸序列或与其具有至少70％同一性的氨基酸序列。

在另一实施方式中，融合蛋白编码由SEQIDNO：11的核酸序列或与其具有至少70％同一性的核酸序列所编码。

在一些实施方式中，而为了方便融合蛋白作为完整蛋白的表达，以及减少各变应原的差异表达，载体包含转录控制序列(如启动子)和单一起始密码子以便于表达完整的融合蛋白。

在一些方面，本发明提供了核酸盒用于在受试者中脱敏花生变应原或诱导对花生变应原的耐受，所述盒包括：i)如本文所述的疫苗和ii)在盒的序列的每端的末端限制酶接头。在一些实施方式中，至少一个末端限制酶接头包括Pac1限制酶识别/切割序列。在一些实施方式中，所述盒是病毒载体盒。

核酸构建体可以有利地包括可操作地连接到编码融合蛋白的核酸序列的转录控制序列。

术语“转录控制序列”应理解为包含影响可操作连接的核酸的转录的任何核酸序列。合适的转录控制序列对本领域的技术人员是已知的。说明性实例包括前导、聚腺苷酸化序列、启动子、增强子或上游活化序列和转录终止子。通常地，转录控制序列至少包括启动子。如本文所用的术语“启动子”描述赋予、活化或增强核酸分子在细胞中表达的任何核酸。

在一些实施方式中，至少一个转录控制序列可操作地连接到编码融合蛋白的核酸。出于本发明的目的，当转录控制序列能够促进、抑制或除此之外调节基因或其它核苷酸序列的转录，转录控制序列被视为“可操作地连接”至给定基因或核苷酸序列。

在应答外部刺激如生理胁迫、病原体、或金属离子、或其他，或在应答一个或多个转录活化因子时，相对于可操作连接的核苷酸序列表达发生的细胞、组织、器官或发育阶段，启动子可以组成型或差异地调节可操作连接的核苷酸序列的表达。因此，按照本发明的疫苗和/或方法使用的启动子可以包括，例如，组成型启动子、诱导型启动子、组织特异启动子或可活化的启动子。本发明考虑使用在感兴趣的细胞中有活性的任何启动子。

“组织特异的启动子”包括优选或特异地表达在生物体的一种或多种特定细胞、组织或器官和/或生物体中的一个或多个发育阶段的启动子。但应当理解，组织特异的启动子也可以是组成型或诱导型的。

启动子还可以是通过一个或多个转录活化因子可活化的启动子，在此称为“可活化的启动子”。例如，可活化的启动子可包括可操作地连接到上游活化序列(UAS)(其包括，除其他外，一个或多个转录活化因子的DNA结合位点)的最小启动子。

本文所指术语“最小启动子”应理解为包括至少含有RNA聚合酶结合位点、任选地TATA盒和转录起始位点和/或一个或更多个CAAT盒的任何启动子。

如上文所述，可活化的启动子可以包括融合到上游活化序列(UAS)的最小启动子。UAS可以是可结合转录活化因子来活化最小启动子的任何序列。示例性的转录活化因子包括例如：酵母来源的转录活化因子如Gal4、Pdr1、Gcn4和Ace1；病毒来源的转录活化因子VP16；Hap1(Hachetal.,JBiolChem278:248-254,2000)；Gaf1(Hoeetal.,Gene215(2):319-328,1998)；E2F(Albanietal.,JBiolChem275:19258-19267,2000)；HAND2(Dai和Cserjesi,JBiolChem277:12604-12612,2002)；NRF-1和EWG(Herzigetal.,JCellSci113:4263-4273,2000)；P/CAF(Itohetal.,NuclAcidsRes28:4291-4298,2000)；MafA(Kataokaetal.,JBiolChem277:49903-49910,2002)；人类活化转录因子4(Liang和Hai,JBiolChem272:24088-24095,1997)；Bcl10(Liuetal.,BiochemBiophysResComm320(1):1-6,2004)；CREB-H(Omorietal.,NuclAcidsRes29:2154-2162,2001)；ARR1和ARR2(Sakaietal.,PlantJ24(6):703-711,2000)；Fos(Szuts和Bienz,ProcNatlAcadSciUSA97:5351-5356,2000)；HSF4(Tanabeetal.,JBiolChem274:27845-27856,1999)；MAML1(Wuetal.,NatGenet26:484-489,2000)。

转录控制序列还可以包括一个终止子。术语“终止子”是指在转录单元末端的发出转录终止信号的DNA序列。终止子是通常含有聚腺苷酸化信号的3'-非翻译的DNA序列，其促进添加聚腺苷酸化序列至初级转录物的3'端。如启动子序列一起，终止子可以是在其预期使用的细胞、组织或器官中可操作的任何终止子序列。在一些实施方式中，核酸序列可以包括编码融合蛋白的序列的病毒早期转录终止序列3'。

载体

在一个实施方式中，核酸构建体可操作地并入载体。

在一些实施方式中，载体可以是适于在真核细胞中表达的表达载体。如本文所使用的，“载体”可以是期望的序列可被插进的一些核酸中的任意者。载体包括，但不限于质粒、噬菌粒和病毒基因组。在一些实施方式中，表达载体还能够在宿主细胞中被复制(例如，细菌细胞)，并且还可以进一步包括一个或多个内切核酸酶限制性位点，在这些位点上载体可以以确定的方式被切割，并且期望的DNA序列可连接至该位点以使得重组载体保留其在宿主细胞中复制的能力。在质粒的情况下，随着宿主细菌内质粒拷贝数增加，期望序列的复制可发生多次，或者在宿主通过有丝分裂复制前，期望序列的复制在每个宿主中仅发生单次。在噬菌体的情况下，可以在裂解阶段期间主动发生复制，或者可以在溶解阶段期间被动发生复制。

表达载体可以含有转录控制序列以驱动靶细胞中(例如，在人细胞)插入的核酸的表达。转录控制序列包括上述那些并且包括，例如，启动子。

载体可以进一步含有一种或多种可选择标记物序列以适用于鉴别已经用或未用载体转化或转染的细胞。标记物包括，例如，编码增强或降低对抗生素或其他化合物的抗性或敏感性的蛋白的基因、编码通过由本领域中已知的标准测定法可检测活性的酶(例如，β半乳糖苷酶、萤光素酶)的基因，以及可视地影响转化或转染的细胞、宿主、菌落或嗜斑的表型的基因(例如，各种荧光蛋白，如绿色荧光蛋白，GFP)。一些载体可以是能够自主复制的，也被称为附加型载体。可选择地载体可以适于插入到染色体，即所谓的整合载体。可一起提供载体与介导细胞/组织特异性表达的转录控制序列(启动子序列)。这些启动子序列可以是细胞/组织特异性的、可诱导的或组成型的。

在一些实施方式中，载体可以是病毒载体。合适的病毒载体对本领域技术人员是已知的。病毒载体的示例性实例包括逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、或痘病毒病毒载体。痘病毒载体可包括，例如，禽痘(avipox)病毒载体(例如，鸟痘(fowlpox)或金丝雀痘)。在一些实施方式中，痘病毒的病毒载体可以是复制限制性的病毒载体，包括例如，修饰的安卡拉牛痘(MVA)病毒、禽痘的病毒或残废牛痘病毒。因为病毒载体本身可促进细胞上IL-12受体表达，使用病毒载体可有益于进一步偏向针对在MHCI类分子上表达降解的花生变应原肽片段的细胞的T_H1应答。此外，通过病毒载体活化免疫细胞可以发起细胞-细胞相互作用和细胞因子产生级联的复杂网络，其导致T_H1免疫功能以抗原依赖的方式整体加强。

在一个实施方式中，病毒载体是痘病毒的病毒载体。

在一些实施方式中，核酸序列包括编码融合蛋白的序列的病毒早期转录终止序列的3'。

为了便于克隆，所述核酸构建体可包括在核酸盒(即，表达盒)中。因此，在一些实施方式中，本发明提供用于使受试者对花生变应原脱敏的核酸盒，所述盒包括：如本文所述可操作编码融合蛋白的核酸构建体和在盒的序列的每端的末端限制酶接头。

如本文所用术语“核酸盒”是意欲表示旨在将核酸分子(例如，本文描述的核酸构建体)引入到载体或基因组中的核酸序列。

盒通常包括在盒序列的每端的末端限制酶接头。每端的末端限制酶接头可以是相同或不同的末端限制酶接头。在一些实施方式中，如果需要在细菌细胞中复制盒(并且盒包括复制起点)，则在每端具有相同的末端限制酶接头可以是有利的，因为可以通过使用合适的限制性酶消化盒然后将末端连接在一起可以将盒环化。类似地，环化的盒可通过使用单一限制性酶消化盒进行线性化。

在一些实施方式中，末端限制酶接头可以包括稀少限制酶识别/切割序列，以使得所述盒待引入的核酸或载体或基因组不会发生不想要的消化。在一些实施方式中，末端限制酶接头包括Pac1限制酶识别/切割序列。

盒可被克隆入哺乳动物表达载体、细菌表达或克隆载体、昆虫表达载体、植物表达载体或病毒载体。因此，盒可以是哺乳动物载体盒、细菌载体盒、昆虫载体盒、植物载体盒或病毒载体盒。

花生过敏的治疗和预防

本发明出人意料地发现，本发明的疫苗产生偏向抗花生蛋白的T_H1免疫应答，其超过了(dominateover)存在的变应原特异的T_H2免疫应答，并且这样做将使随后暴露至花生变应原的个体脱敏。此外，T_H1细胞因子(如IFNγ、IL-12、TGF-β、IL2等)的表达可以降低T_H2细胞因子(例如IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL10等)的表达，使针对变应原的免疫应答偏向T_H1免疫应答，其结果是抑制或改善产生IgE抗体的B细胞、肥大细胞和嗜酸性粒细胞的活化和/或招募，从而减少或防止针对后续变应原暴露的过敏反应(如，变态反应)。因此，本发明的疫苗适合用于治疗受试者的花生过敏。

本发明人还出人意料地发现，本发明的疫苗产生针对花生变应原的偏向T_H1免疫应答，其不依赖于之前存在的花生过敏。因此，本发明的疫苗适用于预防可处于花生过敏风险中的受试者的花生过敏。

因此，在另一方面中，提供本文公开的痘病毒载体诱导受试者对花生变应原耐受的用途，或者在制备用于诱导受试者对花生变应原耐受的药物中的用途。

在一个实施方式中，本文公开的痘病毒载体用作预防剂(prophylacitc)以预防或改善具有发展成花生过敏风险的受试者的花生过敏(即，可在具有发展成过敏风险的受试者中诱导对花生变应原的耐受)。处于发展成花生过敏风险的受试者可包括已患过敏，如枯草热、哮喘或其他食物过敏的人或具有过敏症家族史的人。

在另一方面，提供诱导受试者对花生变应原耐受的方法，所述方法包括向有此需要的受试者施用有效量的本文所公开的痘病毒载体一段时间，并且在足以引发抑制和/或耐受的条件下施用，例如通过诱导受试者中花生变应原特异的T_H1应答。

本文所用的术语“过敏反应”、“过敏”、“过敏性疾病”等，应理解为表示其中免疫系统对其它方面(otherwise)无害的环境物质超敏感的免疫疾病。导致过敏的这些环境物质称为“变应原”。常见的过敏包括季节性鼻结膜炎(rhinoconjuctivitis)(例如，对草和花粉如豚草、猫尾草的过敏)，对宠物皮屑如猫皮屑或狗皮屑的过敏、食物过敏如花生、牛奶和小麦过敏，毒物过敏症和哮喘。过敏疾病通常表征是产生IgE。

过敏性疾病源自针对在其它方面是无害的环境抗原的免疫应答，其特征在于产生T_H2T细胞，其产生IL-4和IL-5并促进B细胞分化成分泌IgE抗体的细胞。IgE抗体结合嗜碱性粒细胞和肥大细胞上的高亲和性受体。变应原暴露导致通过表面IgE以及受体交联的变应原分子结合，从而导致嗜碱性粒细胞和肥大细胞的活化和脱粒。后者释放各种预制的促炎症和血管活性化合物，如组胺、前列腺素、白三烯类和细胞因子，导致炎性应答。花生变应原结合至肥大细胞和嗜碱性粒细胞表面结合的IgE抗体是始发事件，其最后以过敏反应达到顶点。防止变应原结合至肥大细胞和/或嗜碱性粒细胞结合的IgE将阻止过敏反应的发病。防止暴露于花生变应原产生的变应原特异的IgE将诱导对花生的耐受。

如本文所用的术语“耐受”指抑制(部分或完全)针对花生变应原暴露的过敏反应。抑制可防止、延迟、减少、废止或以其他方式阻碍过敏反应。这种抑制可以是幅度上的抑制和/或是性质上暂时性的抑制。在具体情况下，术语“抑制”和“防止”，及其变体可互换使用。耐受可通过本领域技术人员公知的任何方法来评估。作为说明性实例，使用本文所公开的痘病毒载体治疗前和/或后，皮肤点刺测试可用于测量受试者对一种变应原或多种变应原的应答。例如，在对花生过敏的受试者中，使用一种或多种花生变应原的皮肤点刺试验会通常将产生可观察到的局部过敏反应，其特征为局部皮疹、荨麻疹和/或肿胀(swelling)。使用本文所公开的痘病毒载体治疗后，在同一个体中的耐受将通常显示为对皮肤点刺试验降低的局部过敏反应。这种降低是可以测量的，例如，通过治疗前和后局部过敏反应在尺寸(例如，直径)上的差别。

在另一说明性实例中，通过意外暴露于花生变应原之后的防止、阻滞、抑制、降低、废止或阻碍过敏反应的严重程度来评估耐受。例如，当受试者具有对花生变应原暴露的变态反应史时，可以通过随后的花生变应原暴露之后不存在变态反应(即使受试者可能会显示过敏反应的其它迹象，如皮疹)来确定作为使用根据本发明的痘病毒载体治疗结果的耐受。

在另一说明性实例中，通过确定受试者循环中的花生变应原特异性IgE抗体的水平来评估耐受。例如，具有对花生变应原暴露的过敏反应史(包括变态反应史)的受试者与，例如不具有花生过敏症的受试者相比具有更高水平的花生变应原特异的IgE抗体。在这样的个体中，可通过使用本发明的疫苗处理之后循环中花生变应原特异的IgE抗体水平的降低来确定耐受。可选择地，或此外，可通过使用本发明的痘病毒载体处理之后循环中更高水平的花生变应原特异的IgG抗体来确定耐受，其表征T_H1免疫应答并且通常表示耐受状态。

可选择地，或此外，可以通过评估获自受试者的样本(如，血液样本，包括血浆或血清样本)中的细胞因子谱来确定耐受。例如，更高水平的IFN-γ表示偏向变应原特异的T_H1应答，而更高水平的IL-4和/或IL-5表示偏向变应原特异的T_H2应答。

可选择地，或此外，如本文所公开的，可以通过从使用根据本发明的痘病毒载体处理过的受试者中获得T淋巴细胞样本、并体外测量淋巴细胞的细胞因子谱来确定耐受。例如，T淋巴细胞产生的更高水平的IFN-γ表示偏向变应原特异的T_H1应答，而T淋巴细胞产生的更高水平的IL-4和/或IL-5表示偏向变应原特异的T_H2应答。本领域技术人员公知测量花生变应原特异的IgE和/或IgG抗体以及能够区分T_H1和T_H2应答的细胞因子水平的方法。说明性实例包括放射免疫测定法(RIA)和酶联免疫吸附测定法(ELISA)。

本领域技术人员能够理解，本文所公开的痘病毒载体是以单一剂量或作为系列剂量的部分施用，其在有此需要的受试者中提供所需的治疗性或预防性效果；即，诱导对花生变应原的耐受。不想要的效果，例如副作用，有时可伴随所需治疗性和/或预防性效果出现；因此，从业者将通常以确定合适的有效量来平衡相对潜在风险的潜在收益。所需疫苗的精确量将因受试者而异，取决于受试者的物种、年龄和一般状况、给药模式等。因此，可能不能指定确切的有效量。然而，本领域普通技术人员通过使用常规技术或实验可以来确定在任何个体情况下的合适有效量。本领域的普通技术人员基于这样的因素，如受试者的尺寸和重量、受试者症状的严重性、以及施用的推荐途径将能够确定所需的量。

术语“治疗”是指在至少一些受试者中对一种或多种花生过敏症状的任何可测量的或统计学上显著的抑制或改善。

在一些实施方式中，本文公开的痘病毒载体被利用来使具有花生过敏的受试者(即，对一种或更多种花生变应原超敏感的受试者)对一种或更多种花生变应原脱敏。如本文所用术语“使受试者脱敏”在指花生变应原时，意欲指受试者对花生变应原的敏感性降低、改善或消除。在这方面，再暴露于一种或更多种花生变应原时，受试者的花生过敏症状部分或完全降低。

在一些实施方式中，可选地，或此外，核酸序列被利用来诱导受试者对一种或更多种花生变应原的耐受。在具有花生过敏的受试者中或者在可能处于发展为花生过敏风险的受试者中，进行诱导针对一种或更多种花生变应原的耐受。(即，所述核酸可以被利用为花生过敏的预防性治疗的部分)。

虽然本文所公开的痘病毒载体是利用不同的方式来使受试者对花生变应原脱敏或诱导受试者对花生变应原耐受(如本文所述)，痘病毒载体操作的一般原理是相同的。当融合肽在细胞中表达时，它是通过蛋白酶体降解标签靶向蛋白酶体降解，其防止从细胞分泌完整的融合蛋白。

在一个实施方式中，提供疫苗接种受试者以诱导针对花生变应原耐受的方法，包括施用本文公开的痘病毒载体。在一个具体实施方式中，所述方法是用于诱导针对至少两种或至少三种主要花生变应原的耐受。

本发明扩展到包含本文所公开的痘病毒载体的试剂盒。

本发明的痘病毒载体可以通过本领域中已知的方法以体内或体外递送到细胞中(例如，作为裸DNA或在载体中)。说明性实例包括病毒递送、显微注射、基因枪、穿刺转染(impalefection)、静水压力、电穿孔、超声处理、和/或脂转染。痘病毒载体也可作为药物组合物递送至细胞中。

脂质体可作为痘病毒载体的载体(carrier)。脂质体是封装了选择的治疗剂(例如，载体)的基于脂质的囊泡，其随后被引入至患者中。可以从纯的磷脂或磷脂和磷酸甘油酯的混合物制造脂质体。通常，脂质体可以以小于200纳米的直径制造，这使它们能够进行静脉内注射并能够通过肺毛细血管床。另外，脂质体的生物化学性质赋予穿过血管膜的渗透性以接近选定的组织。

痘病毒载体可以是裸露的(naked)，那就是不结合可能影响受体免疫系统的任何蛋白或其它试剂。在这种情况下，希望痘病毒载体在生理上可接受的溶液中，例如，但不限于，无菌盐水或无菌缓冲盐水。或者，疫苗可以与脂质体，如卵磷脂脂质体或本领域中已知的其他脂质体相结合。也可以使用协助细胞摄取核酸分子的试剂，例如，但不限于钙离子。

在非病毒载体的情况下，待引入到受体的核酸的量将具有非常广泛的剂量范围以及可以取决于，例如，所用的转录和翻译的启动子的强度。此外，免疫应答的幅度可取决于蛋白表达水平和表达的融合蛋白产物的免疫原性。有效剂量范围可以包括约1ng至5mg、约100ng至2.5mg、约1μg至750μg、或约10μg至300μg的核酸(例如，作为痘病毒载体的部分)。

在存在有能力促进DNA吸收或招募免疫系统细胞到接种位点的佐剂或其它物质时，可以皮下、肌内、真皮内或通过其他方式例如腹腔内、静脉内、或吸入来施用或接种痘病毒载体。给药途径的选择将取决于组合物和患者的疾病状态。相关考虑包括待活化的免疫细胞的类型、抗原暴露至免疫系统的时间和免疫计划。还考虑可以提供加强免疫(booster)处理。

如本文所述，通过在细胞表达融合蛋白，所述痘病毒载体能够使受试者脱敏(即，诱导耐受)。融合蛋白在细胞内降解，降解的花生变应原片段与MHCI类分子相结合表达在细胞表面。在一些实施方式中，在本发明的方法期间没有完整表达的花生变应原暴露到受试者的免疫系统中。这是蛋白酶体降解标签的结果，其驱动细胞内蛋白酶体降解表达的融合蛋白。

使受试者对花生变应原脱敏或诱导受试者对花生变应原耐受的方法包括向受试者施用痘病毒载体、或包含痘病毒载体的药物组合物。因此，本发明提供使受试者对花生变应原脱敏的方法，其中所述方法包括在受试者的细胞中表达融合蛋白，其中所述表达的融合蛋白的蛋白酶体降解标签使融合蛋白靶向细胞内蛋白酶体降解，然后花生变应原的降解肽与MHCI类分子相结合以促进产生针对花生变应原的T_H1应答，从而使受试者对花生变应原脱敏或诱导受试者对花生变应原耐受。

本发明还提供用于诱导受试者对花生变应原耐受的预防性治疗方法，其中所述方法包括在受试者的细胞中表达融合蛋白，其中所述表达的融合蛋白的蛋白酶体降解标签使融合蛋白靶向细胞内蛋白酶体降解，然后花生变应原的降解肽与MHCI类分子相结合以促进产生针对花生变应原的T_H1应答，从而预防受试者对花生变应原过敏。

尽管这些方法可能涉及在体内的细胞内表达融合蛋白，其他方法可包括在离体细胞中表达融合蛋白。因此，本发明还提供表达融合蛋白的细胞。在这方面，细胞可用于在体外实验、体内治疗和/或离体治疗。

受试者

术语“受试者”、“个体”和“患者”在本文可互换使用以指本公开可以适用的任何受试者，特别是脊椎动物受试者，以及甚至更特别是哺乳动物受试者。落入本发明范围内的合适的脊椎动物包括，但不限于，脊索动物亚门的任何成员，包括灵长类、啮齿类(例如、小鼠大鼠、豚鼠)、兔型目动物(例如，兔、野兔)、牛(例如，牛)、绵羊(例如，绵羊等)、山羊(caprine)(例如，山羊)、猪(如，猪)、马(例如，马)、犬科动物(例如，狗)、猫科动物(例如，猫)、禽类(例如，鸡、火鸡、鸭、鹅、伴侣鸟类如金丝雀、虎皮鹦鹉等)、海洋哺乳动物(如，海豚、鲸)、爬行动物(蛇、青蛙、蜥蜴等)、以及鱼类。在一些实施方式中，受试者是灵长类动物(例如，人类、猿、猴子、黑猩猩)。

在优选的实施方式中，受试者是人。因此，在一些实施方式中，编码融合蛋白的核酸序列是进行密码子优化以用于在人类细胞中表达。

药物组合物

根据本发明的痘病毒载体可以以包含药学上或生理学上可接受的载体和/或稀释剂的形式提供。

因此，在另一方面，提供用于使受试者对花生变应原脱敏或诱导受试者对花生变应原耐受的药物组合物，所述组合物包含本文所公开的痘病毒载体和药学上可接受的载体。

根据常规的药物配合技术方便地制备所述药物组合物。参见，例如，Remington'sPharmaceuticalSciences,第18版，Mack出版，公司，Easton，PA，USA，1990。除了活性物质之一之外，这些组合物还可包含药学上可接受的赋形剂、载体、缓冲剂、稳定剂或其它本领域中公知的材料。这样的材料应该是无毒的并且不应干扰活性成分的功效。取决于施用(例如，静脉内、口服或胃肠外)所需的制剂形式，所述载体可以采取多种形式。

在一些实施方式中，本发明提供使受试者对花生变应原脱敏或诱导受试者对花生变应原耐受的方法，所述方法包括在受试者的细胞中表达如本文所述的融合肽，其中所述表达的融合蛋白的蛋白酶体降解标签使融合蛋白靶向细胞内蛋白酶体降解，花生变应原的降解肽与MHCI类分子相结合以促进产生针对花生变应原的T_H1应答，从而使受试者对花生变应原脱敏或诱导受试者对花生变应原耐受。

在一些实施方式中，本发明提供用于诱导受试者对花生变应原耐受的预防性治疗方法，所述方法包括在受试者的细胞中表达如本文所述的融合肽，其中所述表达的融合蛋白的蛋白酶体降解标签使融合蛋白靶向细胞内蛋白酶体降解，花生变应原的降解肽与MHCI类分子相结合以促进产生针对花生变应原的T_H1应答，从而预防受试者对花生变应原过敏。

本发明人出人意料地发现，包含编码含有花生变应原和蛋白酶体降解标签的融合蛋白的核酸序列的痘病毒载体，可以经由接种疫苗产生花生特异的T_H1免疫应答，其是通过产生花生变应原特异的IgG2a抗体以及花生变应原诱导的从淋巴细胞分泌T_H1细胞因子测得的。因为这种痘病毒载体刺激花生变应原特异的T_H1免疫应答，其符合本文所公开的痘病毒载体可用于使对花生变应原过敏的受试者脱敏(即，诱导耐受)。

本发明还提供使受试者对花生变应原脱敏或诱导受试者对花生变应原耐受的核酸序列，所述核酸包括编码融合蛋白的序列，所述融合蛋白包括蛋白酶体降解标签和花生变应原。核酸可以用作基因疫苗。

如本文所述，在一些实施方式中，所述核酸包含在可施用到受试者的表达载体中(例如，病毒载体)或药物组合物中，以允许在体内细胞中表达泛素化融合蛋白。或者，核酸离体表达在可以随后施用至受试者的细胞中(例如，抗原递呈细胞)。可选择地，或另外地，转染的细胞可以用于离体刺激和扩增T_H1淋巴细胞群体，然后将T_H1淋巴细胞群体施用至受试者。

在一些实施方式中，建立T_H1对递呈的花生变应原肽的记忆可预防或降低随后暴露在花生变应原时针对花生变应原的T_H2免疫应答。在一些实施方式中，通过活化和维持花生变应原特异的CD8⁺T细胞来建立针对花生变应原的T_H1记忆。

细胞

在本发明的另一个方面，提供表达如本文所述的融合蛋白的细胞，例如，宿主细胞或抗原递呈细胞(例如，树突细胞)。然后，表达融合蛋白的转染细胞可以用来在体内或离体产生和/或扩增花生变应原反应性的T_H1淋巴细胞群。因此，在一个实施方式中，本公开使离体产生和/或扩增花生变应原反应性T_H1淋巴细胞群的方法成为可能，所述方法包括培养如本文所述的细胞(即，表达融合蛋白的转染细胞)与一种或多种T淋巴细胞。在另一个实施方式中，本公开使体内产生和/或扩增花生变应原反应性T_H1淋巴细胞群的方法成为可能，所述方法包括向有此需要的受试者施用如本文所述的转染细胞，其中施用的转染细胞活化受试者中初始T细胞成为花生变应原特异的T_H1细胞。

在一些实施方式中，本发明提供使受试者对花生变应原脱敏或诱导受试者对花生变应原耐受的方法，所述方法包括：i)从受试者收集淋巴细胞；ⅱ)将淋巴细胞与如本文所述的细胞(即，本文所公开的表达融合蛋白的转染细胞)共培养，以产生和/或扩增T_H1淋巴细胞群体，其识别与细胞上MHCI类分子相结合的蛋白酶体降解的花生变应原融合蛋白；和iii)向受试者施用来自(ii)的T_H1淋巴细胞。

在一些实施方式中，细胞可以包括原核细胞(如，细菌细胞)。原核细胞可用于复制核酸构建体(例如，以载体形式)和/或用于各种克隆步骤中。在一些实施方式中，细胞可包括真核细胞(如，哺乳动物细胞)。在这方面，本发明还包括表达可操作地编码所述融合蛋白的核酸构建体的细胞。

如本文所公开的痘病毒载体也可用于活化初始抗原递呈细胞，其然后可以被重新引入回到受试者中以活化初始T细胞成为花生变应原特异的T_H1细胞。因此，在一些实施方式中，本发明提供使受试者对花生变应原脱敏或诱导受试者对花生变应原耐受的方法，所述方法包括：ⅰ)从受试者收集抗原递呈细胞；ⅱ)将抗原递呈细胞与如本文述的细胞(即，表达本文所公开的融合蛋白的转染细胞)共同培养，以产生和/或扩增活化的T_H1抗原递呈细胞群的群体；和iii)向受试者施用来自(ii)的活化的T_H1抗原递呈细胞以活化T淋巴细胞朝向变应原特异的T_H1表型。合适的初始抗原递呈细胞对本领域的技术人员是已知的。说明性实例包括树突细胞和成纤维细胞。

表达融合蛋白的细胞类型仅限于以下细胞，所述细胞应当是表达MHCI类分子的有核细胞。在这方面，所述细胞可以是来自细胞系(例如，CHO细胞系、HEK细胞系、成纤维细胞系等)的细胞或原代细胞(例如，成纤维细胞、树突细胞)。在实施方式中，当所述细胞意欲进行离体自体治疗时，所述细胞可以是从受试者可以容易地移除的细胞(例如，在血液、淋巴、骨髓中的细胞)和/或易于从组织样本中培养的细胞(例如，成纤维细胞)。在一些实施方式中，细胞可以是专职抗原递呈细胞(例如，树突细胞、巨噬细胞、B细胞、上皮细胞等)，或者可以是非专职抗原递呈细胞(如，成纤维细胞、胸腺上皮细胞、甲状腺上皮细胞、神经胶质细胞、胰腺β细胞、血管内皮细胞等)。

在离体细胞中表达融合蛋白(例如，使用本文所公开的痘病毒载体转染的细胞)可以有利于控制表达所述核酸的细胞数量。此外，更大范围的核酸递送系统可用于离体细胞。表达融合蛋白的细胞(即，转染的细胞)随后可施用于受试者以活化受试者中初始T细胞朝向花生变应原特异的T_H1表型，然后其可以使受试者对一种或更多种花生变应原脱敏或诱导受试者对一种或更多种花生变应原耐受。可选择地，表达融合蛋白的细胞可以与淋巴细胞离体培养以产生花生变应原反应性的T_H1淋巴细胞，其然后可施用至受试者。

因此，本发明还提供离体产生和/或扩增花生变应原反应性T_H1淋巴细胞的方法，其中所述方法包括将表达所述融合蛋白的细胞与一种或更多种T淋巴细胞一起培养。T淋巴细胞可以包含在混合的淋巴细胞群中，或者可以是分离的T淋巴细胞。可以通过本领域已知方法容易地从外周血、淋巴或骨髓中获得混合的淋巴细胞群。可以通过本领域已知的方法包括，例如，尼龙羊毛分离、FACS分选、磁珠分离等从这样的混合淋巴细胞群分离T细胞。在一些实施方式中，特定的T淋巴细胞亚群可以被分离以用于与表达所述核酸的细胞一起培养。

本领域技术人员将理解，如本文所公开，当细胞经离体转染以表达融合蛋白和/或当离体产生和/或扩增T_H1淋巴细胞群时，通常希望使用自体细胞(即，细胞源自待治疗的受试者)，从而避免或最小化当同种异体细胞(即，源自不同受试者的细胞)被用于和施用给受试者时可能发生的免疫应答。

离体扩增花生变应原反应性T_H1淋巴细胞可用于产生大量的花生变应原反应性的T_H1淋巴细胞，其然后可施用给受试者作为花生过敏的预防性或治疗性治疗。在一些情况下，离体扩增与体内活化和扩增相比可加速花生变应原反应性T_H1淋巴细胞的活化和扩增。此外，离体扩增允许控制扩增出的花生变应原反应性T_H1淋巴细胞的数目和反应性。在一些实施方式中，花生变应原反应性T_H1淋巴细胞可以对受试者而言是自体。

因此，本发明还提供使受试者对花生变应原脱敏的方法，所述方法包括：(ⅰ)从受试者收集淋巴细胞；ⅱ)将淋巴细胞与表达融合蛋白的细胞共培养以产生和/或扩增T_H1淋巴细胞，其识别与细胞上的MHCI类分子相结合的蛋白酶体降解的融合蛋白肽片段；和iii)向受试者施用来自(ii)的T_H1淋巴细胞。在一些实施方式中，在施用本文所公开的痘病毒载体之前从受试者收集淋巴细胞。

在一些实施方式中，方法可以包括在施用至受试者之前从步骤(ii)分离淋巴细胞。从步骤(ii)分离淋巴细胞可以包括从表达所述核酸的细胞中分离所有淋巴细胞和/或可以包括分离一种或多种淋巴细胞类型(例如，所有T细胞淋巴细胞、所有T_H1淋巴细胞等等)。可选择地，来自(ii)的T_H1淋巴细胞可以施用到受试者而不需将淋巴细胞从表达融合蛋白的细胞中分离，在这种情况下，施用的表达融合蛋白的细胞可继续在体内活化其它T_H1淋巴细胞。用于从受试者中分离淋巴细胞的方法、用于分离T细胞和T细胞亚群的方法包括上述那些方法。

本文也能够使从根据本发明治疗的受试者获得T淋巴细胞(无论是否分离)的方法成为可能，并如本文所公开的确定所述淋巴细胞是否偏向T_H1表型(例如，离体确定细胞因子表达谱)。这种方法在确定施用痘病毒载体是否已在受试者中诱导T_H1偏向的变应原特异的免疫应答中具有额外的优势。因此，在一些实施方式中，所述方法包括在将从步骤(ii)分离的淋巴细胞施用至受试者之前确定所述淋巴细胞是否偏向T_H1表型。

在一些实施方式中，受试者对花生变应原的脱敏或诱导受试者对花生变应原的耐受可预防或降低针受试者对随后暴露至花生的超敏反应。这样，上述方法可以降低之前对花生过敏的受试者在随后所述受试者暴露至花生时对花生变态反应的风险和/或降低处于发展为花生过敏风险的受试者对花生变态反应的风险。

本发明通过下面的非限制性实例进一步描述。应理解以下说明仅是出于说明具体实施方式的目的而不意欲相对上述说明进行限制。

实施例

材料和方法

生产PHAV抗原：用于包含人类泛素C单体(Ubc)和四个花生变应原的融合蛋白(PHAV抗原)的核酸序列，设计为如下所示并在图1A中说明。

从在线蛋白序列数据库获得Ubc(NM_021009)、arah1(Swiss-Prot条目P43238)、arah2(TrEMBL条目Q8GV20)、arah3(Genbank蛋白ACH91862)和arah6(UniProtKB/TrEMBL条目Q647G9)的氨基酸序列。在将arah1、arah2、arah3和arah6蛋白序列连接形成一个连续蛋白序列(顺序为Ubc+arah1+arah2+arah3+arah6)之前，从所述序列中去除起始密码子氨基酸Met(M)。通过使用智人(HomoSapiens)密码子优选的表进行回译获得编码PHAVag蛋白的DNA序列。

使用GeneDesigner(DNA2.0公司)并采用以10％阈值进行优化设定的智人密码子将PHAVag氨基酸序列回译成核苷酸序列。8个碱基或更多的重复序列也被过滤掉。通过DNA2.0Inc进一步筛选出所得序列的具有二级结构形成潜力以及去稳定化元件。筛选PHAVag蛋白序列的最后核苷酸序列的痘病毒早期转录基序“TTTTTNT”。然而，没有被发现。

在编码PHAV抗原的核苷酸序列的末端，加入“TAA”终止密码子。还在终止密码子之后立即加入痘病毒早期转录终止序列TTTTTAT。表达盒侧翼是PacI接头。因为PacI识别位点不存在于盒内，这种盒可以通过PacI限制性内切酶消化克隆到质粒中并从质粒中整体切除。

如表1所示，在PHAV抗原中的Ubc、arah1、arah2、arah3以及arah6与天然序列相比具有大约75％的核酸序列同一性。

表1：PHAV抗原组份与天然序列的序列比较

PHAV抗原构建体及其组份的核酸和氨基酸序列的概括显示在表2中。

表2：序列总结

生产替代的PHAV抗原：制备泛素化的花生低过敏疫苗抗原(UBc.PHAVag)，其包含由下列蛋白编码序列的融合体所构成的PHAV抗原蛋白序列-泛素C单体、花生变应原arah1、花生变应原arah2、花生变应原arah3以及花生变应原arah6，痘病毒早期转录终止序列以及最后的另一PacI接头。

泛素C单体在C-末端通过使用Ala(A)来取代末端Gly(G)残基来进行修饰。一经合成，修饰的泛素C将PHAV抗原靶向宿主细胞中的蛋白酶体降解途径(参见图9)。这将确保不会递呈完整蛋白用于产生抗体，所得到的肽片段经由MHCI类途径加工，引发针对PHAV抗原的T_H1免疫应答。

PHAV表达盒的配置和表征图示在图1B中，并包括在5'和3'端的PacI限制性内切酶接头，以及在5'端的牛痘苗早/晚期启动子。

UBc、arah1、arah2、arah3和arah6的氨基酸序列获自Swit-Prot或EMBL蛋白数据库。从arah1、arah2、arah3和arah6核酸序列中去除编码Met(M)残基的起始密码子，然后将arah1、arah2、arah3和arah6核酸序列连接起来以形成编码顺序为UBc+h1+h2+h3+h6的蛋白序列的连续的核酸序列。

通过使用智人密码子优选表进行回译获得编码UBc.PHAVag的DNA序列。使用GeneDesigner(DNA2.0Inc)并采用以10％阈值进行优化设定的智人密码子将UBc.PHAVag氨基酸序列回译成核苷酸序列，并且过滤掉8个或更多碱基的重复序列。通过DNA2.0Inc进一步筛选所得序列中具有二级结构形成潜力以及去稳定化元件。筛选编码UBc.PHAVag的最后核苷酸序列中的痘病毒早期转录基序“TTTTTNT”，没有被发现。在编码UBc.PHAV的核苷酸序列的末端中，加入“TAA”终止密码子。还在终止密码子之后立即加入痘病毒早期转录终止序列TTTTTAT。表达盒侧翼是PacI接头，因为在盒中不存在PacI识别位点，这种盒可以通过PacI限制性内切酶消化克隆到质粒中和从质粒中整体切除。所述UBc.PHAV表达盒的DNA序列可见于图2中。

还构建了花生低变应原疫苗抗原，其中在5'端删去泛素单体。这种构建体与如上所述的UBc.PHAVag构建体相同，但不含有泛素序列。这种构建体被称为PHAVag，以及PHAVag的配置和表征的示意图可见于图1C，以及DNA序列见于图3中。

UBc.PHAVag和PHAVag表达盒两者都可以克隆到细菌质粒中，以使这些表达盒在克隆之后可以经PacI/SbfI消化和凝胶纯化得到回收。

可以制备其它泛素化的花生低过敏性疫苗抗原，其包括以下花生变应原：

(i)arah1、arah2、arah3、arah4、arah5、arah6、arah7、arah8、arah9、arah10和arah11；

(ii)arah1、arah2、arah3、arah4、arah5、arah6、arah7、arah8、arah9和arah10；

(iii)arah1、arah2、arah3、arah4、arah5、arah6、arah7、arah8和arah9；

(iv)arah1、arah2、arah3、arah4、arah5、arah6、arah7和arah8；

(v)arah1、arah2、arah3、arah4、arah5、arah6和arah7；

(vi)arah1、arah2、arah3、arah4、arah5和arah6；

(vii)arah1、arah2、arah3、arah4和arah5；

(viii)arah1、arah2、arah3和arah4；

(ix)arah1、arah2和arah3；

(x)arah1和arah2；

(xi)arah1；

(xii)arah2；

(xiii)arah2、arah3、arah4、arah5、arah6、arah7、arah8、arah9、arah10、和arah11；

(xiv)arah2、arah3、arah4、arah5、arah6、arah7、arah8、arah9和arah10；

(xv)arah2、arah3、arah4、arah5、arah6、arah7、arah8和arah9；

(xvi)arah2、arah3、arah4、arah5、arah6、arah7和arah8；

(xvii)arah2、arah3、arah4、arah5、arah6和arah7；

(xviii)arah2、arah3、arah4、arah5和arah6；

(xix)arah2、arah3、arah4和arah5；

(xx)arah2、arah3和arah4；

(xxi)arah2和arah3；

(xxii)arah3；

(xxiii)arah1、arah3、arah4、arah5、arah6、arah7、arah8、arah9、arah10和arah11；

(xxiv)arah1、arah3、arah4、arah5、arah6、arah7、arah8、arah9和arah10；

(xxv)arah1、arah3、arah4、arah5、arah6、arah7、arah8和arah9；

(xxvi)arah1、arah3、arah4、arah5、arah6、arah7和arah8；

(xxvii)arah1、arah3、arah4、arah5、arah6和arah7；

(xxviii)arah1、arah3、arah4、arah5和arah6；

(xxix)arah1、arah3、arah4和arah5；

(xxx)arah1、arah3和arah4；

(xxxi)arah1和arah3；

(xxxii)arah1、arah2、arah4、arah5、arah6、arah7、arah8、arah9、arah10和arah11；

(xxxiii)arah1、arah2、arah4、arah5、arah6、arah7、arah8、arah9和arah10；

(xxxiv)arah1、arah2、arah4、arah5、arah6、arah7、arah8和arah9；

(xxxv)arah1、arah2、arah4、arah5、arah6、arah7和arah8；

(xxxvi)arah1、arah2、arah4、arah5、arah6和arah7；

(xxxvii)arah1、arah2、arah4、arah5和arah6；

(xxxviii)arah1、arah3、arah4和arah5；

(xxxix)arah1、arah2和arah4；

(xl)arah1、arah4、arah5、arah6、arah7、arah8、arah9、arah10和arah11；

(xli)arah1、arah4、arah5、arah6、arah7、arah8、arah9和arah10；

(xlii)arah1、arah4、arah5、arah6、arah7、arah8和arah9；

(xliii)arah1、arah4、arah5、arah6、arah7和arah8；

(xliv)arah1、arah4、arah5、arah6和arah7；

(xlv)arah1、arah4、arah5和arah6；

(xlvi)arah1、arah4和arah5；

(xlvii)arah1和arah4；

(xlviii)arah4；等等。

arah1、h2、h3、h4、h5、h6、h7、h8、h9、h10和h11的氨基酸序列可以容易地获自Swit-Prot或EMBL蛋白数据库。从arah核酸序列中去除编码Met(M)残基的起始密码子以及终止密码子，然后将arah核酸序列连接起来以形成以任何特定顺序编码arah蛋白中的任何两个或更多个的融合蛋白的连续核酸序列。然而，在编码融合蛋白的序列的开始处需要起始密码子，以及需要终止密码子来终止编码的融合蛋白的表达。

构建牛痘苗病毒同源重组质粒：同源重组盒由下列元件组成，其中所有都由LifeTechnologies公司的GeneArt股份有限公司来合成制备：(ⅰ)位于哥本哈根(Copenhagen)株的VACV-A39RORF的上游侧翼处的500bp左侧同源重组臂；(ii)在牛痘苗早/晚期启动子控制之下的并终止于痘病毒早期转录终止序列(TTTTTNT)的EGFP表达盒；(ⅲ)在牛痘苗早/晚期启动子控制之下的并终止于痘病毒早期转录终止序列(TTTTTNT)的Ecogpt表达盒；(ⅳ)如上述的花生低变应原疫苗抗原表达盒(UBc.PHAVag或PHAVag)；(v)位于哥本哈根株的VACV-A39RORF的下游侧翼处的500bp右侧同源重组臂。这些盒的示意表示可见于图4中，以及它们的DNA序列可见于图6和7中。

在UBc.PHAV和PHAV同源重组盒两者侧翼为NotI限制性酶切位点并被克隆到质粒以形成克隆pTC11(UBc.PHAV)和pTC12(PHAV)。质粒示于图8中。因为这些盒被合成制备，与EGFP和Ecogpt蛋白编码序列一起存在的任何TTTTTNT序列，其被沉默突变破坏，而不会影响所编码的氨基酸序列。

构建表达花生低变应原疫苗抗原的牛痘苗病毒：PHAV表达盒通过同源重组插入到牛痘苗病毒哥本哈根株的A39RORF。图4显示示意A39RORF内插入位点的图。简要地说，这通过以下来进行：将以每个细胞0.01pfu的低多重感染(moi)来感染BHK21细胞45分钟，然后使用NotI线性化的pTC11或pTC12质粒载体来转染细胞。随后，当感染接近完成时，收获受感染/转染的细胞。然后对收获的细胞使用超声处理以制备病毒提取物，然后在黄嘌呤、次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶存在时，在麦考酚酸(MPA)正选择压力下使这些病毒提取物经历一轮噬斑纯化。然后，噬斑纯化的克隆在MPA正选择下顺序扩增以制备病毒的种子库。包含UBc.PHAVag表达盒的重组牛痘苗病毒被称为SCV201C，然后包含PHAVag表达盒的重组病毒称为SCV202C。

采用Ecogpt选择方法来制备重组牛痘苗病毒的详细操作规程可见于Smith1993。用于制备SCV201C和SCV202C的方法概述如下。

同源重组：对于每个病毒构建体，3个含有生长介质(RPMI-1640/10％FCS/2mMGlutamax/青霉素-链霉素)的T25烧瓶接种BHK21细胞并培养在37℃/5％CO₂中直至亚汇合。在感染当天，使用以moi0.01pfu/细胞的VACV-COP来感染两个烧瓶，其中另一个烧瓶中未被感染(未感染对照)。在室温下感染烧瓶1和2持续45分钟后，除去病毒接种物并用PBS洗涤单层细胞两次。洗涤后，将4ml的维持介质(MM：RPMI-1640/2％FCS/2mMGlutamax/青霉素-链霉素)加入到每个烧瓶中，包括也通过相同洗涤步骤的烧瓶3。

使用Effectene转染试剂(Qiagen，目录号301425)并按照制造商的说明进行转染。简言之，将16μL的增强剂(Enhancer)加入到在150μμL的EC缓冲液中的2μg线性化的pTC11或pTC12中，然后彻底混合放置在室温中停留5分钟。向其中加入25μL的Effectene转染试剂，充分混合并放置在室温下10分钟。最后，加入1ml的MM(RPMI-1640/2％FCS/2mMGlutamax/青霉素-链霉素)轻轻混合至完全混合在一起。然后，这种转染混合物加入到之前使用VACV-COP感染的烧瓶1中。

烧瓶1(同源重组)、烧瓶2(仅感染的对照)和烧瓶3(未感染的对照)在37℃/5％CO₂中孵育过夜，其中翌日使用含有以下的新鲜MM以每烧瓶5mL对每个烧瓶进行介质更换：25μg/ml霉酚酸(MPA)、250μg/mL黄嘌呤和1^xHAT(Sigma目录#H0262-10VL)，然后进一步温育在37℃/5％CO₂直到仅在烧瓶1中有可见总CPE。因为MPA处理抑制VACV-COP感染的扩散(spread)，在烧瓶2中几乎没有或没有总CPE的迹象，而烧瓶3中的单层看起来很健康。

通过将细胞刮至培养基来收获烧瓶1中的细胞，然后通过低速离心沉淀(在室温下500g持续5分钟)，随后将细胞沉淀再悬浮在1mLpH8的10mMTris-HCl中。通过多次冻融循环来制备病毒提取物，然后储存在-80℃用于嗜斑纯化阶段。病毒构建体称为SCV201C(UBc.PHAV插入)和SCV202C(PHAV插入)。

噬斑纯化过程：同源重组提取物进行连续稀释，然后各稀释液用于在MPA存在下感染在48孔板中培养的一行BHK21细胞。这样做的目的是为将病毒稀释降至每孔1pfu感染，收获前在感染持续大约30小时后寻找只含有1个荧光噬斑的孔。

BHK21细胞接种到48孔板的每个孔中，并培养在37℃/5％CO₂的生长介质中(RPMI-1640/10％FBS/2mMGlutamax/青霉素-链霉素)至100％。此后，将介质替换为含有25μg/mlMPA、250μg/mL黄嘌呤和1^xHAT(Sigma目录#H0262-10VL)的MM并进一步孵育过夜。

对于感染，将同源重组提取物(SCV201C和SCV202C)解冻并短暂超声处理以打破结块和聚集物。在1mL体积使用MM(RPMI/2％FBS/Glutamax/青霉素链霉素)进行十倍系列稀释至每个病毒提取物的10^-5。对每个稀释，在从每个孔除去生长培养基并用PBS洗涤一次之后，在48孔板中的一行接种100μL的稀释的病毒。48孔板留在室温45分钟以使病毒吸附发生。病毒吸附后，小心地从每个孔去除病毒接种物，其中残余接种物通过由500μL的PBS每孔的洗涤步骤去除。在洗涤后，在每孔加入含有25μg/mL的MPA、250μg/mL的黄嘌呤和1^xHAT(Sigma目录#H0262-10VL)的500μL的MM(RPMI/2％FBS/Glutamax/青霉素链霉素)，并然后温育在37℃/CO₂直到可以在荧光显微镜下清晰可见感染的荧光绿焦点(foci)。

对于收获而言，选择在可能的最高稀释度中仅含单个荧光焦点的孔。小心地从选择孔中去除介质，然后加入100μLpH8的10mmTrisHCl。将板冻融三次，选择的孔的内容得以回收。

然后，通过以100％汇合感染含有BHK21细胞的6孔板中的一孔以进一步扩增一个选定的克隆，所述孔使用25μg/mL的MPA、250μg/mL的黄嘌呤和1^xHAT(Sigma目录#H0262-10VL)进行预处理，从孔中去除培养介质，并加入在PBS中稀释至500μL的10μL病毒提取物。在室温45分钟之后，向孔中加入含有25μg/mL的MPA、250μg/mL的黄嘌呤和1^xHAT(Sigma目录#H0262-10VL)的2mL的MM，并进一步孵育在37℃/5％CO₂中3天，直至多数细胞在荧光显微镜下显示绿色荧光。将感染孔内的细胞刮到培养介质中，然后以500g5分钟进行沉淀。沉淀的细胞再悬浮于500μLpH8的10mMTrisHCl中，并经短暂超声处理以制备病毒提取物。

这种提取物的部分通过在MPA选择下感染BHK21的五个T175烧瓶用于进一步扩增。感染的细胞进行回收，然后以500g5分钟进行沉淀。将全部五个烧瓶的沉淀细胞再悬浮于5mLpH8的10mMTrisHCl中，并经短暂超声处理以制备病毒提取物。然后，以500g5分钟进行沉淀来去除不溶性物质。然后，使用以下所列出的方法来在BHK21细胞中滴定上清(病毒提取物)，以及通过PCR分析证实A39RORF内插入的UBc.PHAV的存在。

滴定：使用24-孔板格式进行滴定。噬斑被清晰区分为如肉眼可见的单层中的结晶紫反染色孔(噬斑)。

对每个待滴定的重组病毒而言，使用BHK21细胞接种1个24孔平板，并培养至在生长介质(RPMI/10％FBS/Glutamax/青霉素-链霉素)中汇合。在滴定当天，每个病毒储存液解冻并超声处理以打碎结块和团块。每种病毒在PBS中系列稀释至10^-8。从每个孔去除介质，并从10^-8稀释开始，将500μL的每种稀释加入到在24孔板中纵列的每个孔中(每个稀释度4个孔)，并留在室温孵育45分钟以使病毒吸附到细胞。在此之后，从每个孔去除病毒接种物，然后，其中每个孔用PBS洗涤一次。洗涤后，向每孔加入1mL的MM(RPMI/2％FBS/Glutamax/青霉素链霉素)，并将板温育在37℃/5％CO₂直到在单层中可见噬斑。对于噬斑计数染色，从每个孔中去除介质并向每个孔中加入500μL的结晶紫溶液(在20％乙醇中0.4％^w/_v)。染色反应在室温进行15-30分钟，在结晶紫染色之后从每个孔去除结晶紫染料，在计数噬斑之前使每个孔留在空气中干燥。然后，此值乘以系列稀释的倒数，随后进一步乘以2(即，2×500μL＝1mL)以产生在pfu/mL的滴度。

SCV201C在C3H/HeJ小鼠中的免疫原性测试：为了测试SCV201C的免疫原性并确定泛素化的PHAV抗原是否可在3组C3H/HeJ小鼠(每组5只小鼠)诱导花生蛋白特异的T_H1免疫应答，其中接种如下：(i)10⁶pfu的SCV201C腹腔内(IP)施用，(ⅱ)10⁶pfu的SCV000腹腔内(IP)施用，以及(iii)PBS腹腔内(IP)施用。在接种疫苗之前(出血前(prebleed))和接种疫苗后17天取血液样本。在接种疫苗后9周，收获脾用于细胞因子谱。

制备可溶性花生蛋白提取物：用于从烤无盐花生提取可溶性花生蛋白的方法来自Sachs等人(1981)和Burks(1992)等人描述的方法。烤无盐花生是从当地杂货店购买。然后，将花生在搅拌机粉碎成粉(meal)，在然后成为酱(butter)糊(paste)。通过加入脱脂剂正己烷从花生酱中去除脂类(lipid)/脂肪(fat)。要做到这一点，将n-正己烷加入到花生酱中并剧烈摇动以混合。将混合物转移到玻璃烧杯中，并放置沉降成溶剂相和固相。从固相除去溶剂相(其包含提取的脂类/脂肪)。所述固相经空气干燥成团块(cake)。此团块在4℃下溶于0.1MNH₄HCO₃(每克2mL)中36小时同时搅拌以提取可溶性蛋白。将浆液在10,000g离心15分钟以除去固体。将上清液相对5mM磷酸盐缓冲液(pH7至pH8)或者PBS使用3500MWCO膜/管进行透析。将透析溶液在4℃下以10,000g离心15分钟以澄清提取物。使用标准技术测量在可溶性提取物中的总蛋白浓度。所得的可溶性蛋白提取物(10mg/mL)保存在-20℃中储存，并在使用前解冻。

定量花生特异性的血清IgE和IgG2a：使用在PBS中的2μg/孔纯化的花生提取物来包被平底96孔EIA/RIAELISA板(Costar)，并在在37℃下孵育1小时，然后4℃过夜。在使用5％脱脂乳和PBS以及0.05％吐温(SM+PBS+TW)对板进行封闭之前，用200μl/孔的PBS洗涤板三次。在使用PBS和0.05％吐温(PBS+TW)进行三次200μl/孔洗涤之前，在37℃封闭非特异性结合至少一个小时。洗涤后，将血清样本首先在SM+PBS+TW中以1:100稀释用于IgE分析，或以1：500稀释用于IgG1和IgG2a分析。血清样本跨三个纵列进行系列稀释。各种孔未留血清作为背景对照。将板温育在37℃一小时。

将板用200μl的PBS洗涤五次，加入在SM+PBS+TW中稀释的第二抗体(1：500的山羊抗小鼠IgEHRP缀合物，AlphaDiagnostic；1：1000的HRP大鼠抗小鼠IgG2a，BDBiosciences-BDPharmingen)(100μl/孔)。将板温育一小时，然后如上洗涤五次，加入根据制造商的指示((SigmaFAST^TMOPD，Sigma-Aldrich)制备的100μl/孔的盐酸邻苯二胺(o-Phenylenediaminedihydrochloride)(OPD)底物溶液。当颜色已经开始在“空白”孔中显色时(范围从IgG1和IgG2a分析中的5分钟到IgE分析中的45分钟)，使用20μl/孔的1MHCl来停止反应。在板读取器(EL808UltraMicroplateReader，Bio-tek仪器公司)在450nm测定光密度。

使用GraphPadPrisimV5.01(GraphPadSoftware,SanDiego,CA,美国)对每个相应时间点上系列稀释液的光密度相对稀释因子在对数标度上作图。对每个时间点的端点滴度被确定作为截取曲线计算的截止(cut-off)光密度上的稀释值(出血前(prebleed)样本的三次标准误均值(SEM)的最小值，但大于所有出血前样本测得的最高光密度值)。

统计分析：统计比较使用GraphPadPrismV5.01(GraphPadSoftware,圣地亚哥，加州，美国)进行。使用Bonferroni后检验的双向方差分析(ANOVA)用于推断ELISA结果之间显著差异性。

实施例1：PHAV抗原的泛素化能够成功表达SCV201C而不是SCV202C

在将UBc.PHAVag表达盒插入牛痘苗病毒的A39R后，SCV201C的表达是成功的。同源重组之后以及在嗜斑纯化步骤期间，可以清楚地识别MPA抗性噬斑并在MPA的存在下扩增，以产生种子储存液，所述种子储存液具有足够滴度以进行下一步在小鼠中的免疫原性测试。

与此相反，SCV202C的表达难以进展至噬斑纯化步骤，因为在高稀释度范围中找不到明确可辨别的噬斑。可在低稀释度范围中找到荧光感染的细胞，并且在这些稀释度中，在受感染的孔中相对可辨别的噬斑只能看见100％的CPE。当收获这些孔并使之在MPA存在下经过进一步扩增时，获得非常少的病毒滴度，其中大部分通过PCR分析确定是由亲本病毒组成，噬斑分析显示在不存在MPA时缺乏荧光噬斑。

在感染之后PHAVag的表达对病毒传播具有抑制性或毒性作用，这通过使用SCV201C构建体来克服。不受理论或具体应用模式所限制，据推测，通过使用蛋白酶体降解标签，如泛素，使表达的PHAVag靶向至蛋白酶体降解，来克服合成的PHAVag的抑制性或毒性作用。

这种通过表达完整PHAVag对病毒增殖的抑制作用得以进一步证实，因为容易实现构建含有在A39RORF内仅插入Ecogpt和EFGP表达盒的重组牛痘苗(称为SCV000)。

实施例2：接种疫苗之后的抗原特异性的抗体应答

在图10中是在接种疫苗前和接种疫苗后(接种疫苗后17天)，花生蛋白特异性血清IgE(图10A)和IgG2a(图10B)二者抗体水平的结果。可以清楚地看出，使用SCV201C进行接种疫苗在接种疫苗后17天产生显著水平的花生蛋白特异性IgG2a。这些水平显著高于仅有载体的对照(SCV000)和PBS对照，表明SCV201C产生特异性抗花生蛋白的抗体应答。但应该指出的是，SCV201C产生与IgG2a应答相比小得多的IgE应答；也就是说，1：2500的端点稀释的IgE相比于接近1：1,000,000的端点稀释的IgG2a。此外，IgE应答并不比空载体(SCV000)或PBS对照诱导的应答大很多。

这些结果表示，SCV201C产生针对花生蛋白的IgG2a应答，但是很少的IgE应答，这表明SCV201C在针对PHAVag的应答中发起花生特异的T_H1偏向的免疫应答。

实施例3：在小鼠中SCV201C接种疫苗之后淋巴细胞的细胞因子谱

从小鼠收获脾脏并储存在完全RPMI中直至转移至60mm的组织培养皿。然后将脾脏切成三段，并分解成单细胞悬液。然后，将所述细胞过滤并用5％的RPMI洗涤(300g×5分钟)。随后将红血细胞在5mL的碱性裂解缓冲液中裂解5分钟，再用5％的RPMI稀释至20ml，并在200g离心5分钟。然后，将细胞重新悬浮和计数。同时，制备具有对照RPMI、可溶性花生-抗原(100μg/ml)、和ConA(5μg/ml)孔的96孔板。然后，以400,000细胞/孔加入淋巴细胞并孵育在37℃中96小时。

96小时阶段孵育之后，从每个中收集100μl的上清液并冷冻在-80℃中。然后通过流式细胞仪根据制造商的说明(BDBiosciences#551287)定量Th1/Th2细胞因子。然后，将样本在BDFACSCantoII流式细胞仪上运行。使用SoftFlowFCAP阵列软件确定细胞因子浓度。所有进一步的分析是在GraphPad6.0完成。

图11中呈现的结果清楚地表明，使用SCV201C进行接种疫苗产生针对花生蛋白暴露的偏向T_H1的免疫应答。这通过以下得以说明：与从SCV201C接种疫苗小鼠的脾脏获得的培养的淋巴细胞所分泌的IL4和IL5水平(T_H2细胞因子；图11B和11C)相比，IFN-γ(IFN-g；T_H1细胞因子；图11A)的水平显著更高。

结论

使用SCV201C接种疫苗的小鼠产生偏向抗花生蛋白T_H1的免疫应答。变应原特异的T_H1免疫应答将超过现存的变应原特异的T_H2免疫应答，以及在这样做时将使个体对随后暴露的变应原脱敏。本文公开的研究证明泛素化的花生低变应原疫苗抗原(UBc.PHAVag)刺激抗花生蛋白特异的T_H1型免疫应答。因此，如本文所述的含有泛素化低变应原疫苗抗原的疫苗可用于使个体对花生变应原脱敏，因此可用于治疗和/或预防由暴露至花生变应原所触发的个体中的过敏反应。

如上所述，感染之后SCV201C构建体的表达是成功的，然而非泛素化的SCV202C构建体的表达难以进展至噬斑纯化步骤。因此，感染之后的PHAVag表达似乎对病毒传播具有抑制性或毒性作用，这通过泛素化的SCV201C构建体得以克服。不受限于理论或具体应用模式，推测通过使用泛素将表达的PHAVag靶向蛋白酶体降解来克服合成的PHAVag的抑制性或毒性作用。作为PHAVag的泛素靶向蛋白酶体降解的结果，PHAVag的小肽片段进入内质网(ER)，其中它们与MHCI类蛋白复合，然后运送到细胞表面被递呈至T淋巴细胞(参见，例如，图9)。这样做的结果是，增强带有MHCI类的PHAVag片段的递呈，导致针对花生变应原更强的T_H1免疫应答。因此，蛋白酶体降解标签(例如，泛素)出人意料地阻止人造的、完整的PHAVag融合蛋白抑制病毒复制。

arah1、arah2、arah3是三个主要花生变应原，已被证明能在易感个体中导致花生特异性过敏反应。arah6已经与儿童期对花生过敏的易感性相关(Flintermanetal.2007)。在43％的花生过敏个体中识别出arah7，在85％的花生过敏个体中识别出arah8，在54％的花生过敏个体中识别出h4以及在13％的花生过敏个体中识别出arah5。

本文引用的每一个专利、专利申请和出版物通过引用其整体并入本文。

在不脱离范围本发明的范围内，许多修改对本领域技术人员将是显而易见的。

参考文献

BurksWA,WilliamsLW,ConnaughtonC,CockrellG,O'BrienTJ,HelmRM.,1992.Identificationandcharacterizationofasecondmajorpeanutallergen,ArahII,withuseoftheseraofpatientswithatopicdermatitisandpositivepeanutchallenge.J.AllergyClin.Immunol.,90:962-969.

DeLongJH,SimpsonKH,WambreE,JamesEA,RobinsonD,KwokWW.2011.Arah1-reactiveTcellsinindividualswithpeanutallergy.J.AllergyClin.Immunol.127(5):1211-1218.e3.

DudekT,KnipeDM.2006.Replication-defectivevirusesasvaccinesandvaccinevectors.Virology344(1):230-239.

FlintermanAE,vanHoffenE,denHartogJagerCF,KoppelmanS,PasmansSG,HoekstraMO,Bruijnzeel-KoomenCA,KnulstAC,KnolEF.2007.ChildrenwithpeanutallergyrecognizepredominantlyArah2andArah6,whichremainsstableovertime.ClinExpAllergy.37(8):1221-8.

HeathWR,CarboneFR.1999.CytotoxicTlymphocyteactivationbycross-priming.Curr.Opin.Immunol.11(3):314-318.

HartlA,KiesslichJ,WeissR,BernhauptA,S,ScheiblhoferS,EbnerC,FerreiraF,ThalhamerJ.1999.ImmuneresponsesafterimmunizationwithplasmidDNAencodingBetv1,themajorallergenofbirchpollen.J.AllergyClin.Immunol.103:107–13.

HartlA,HochreiterR,StepanoskaT,FerreiraF,ThalhamerJ.2004.CharacterizationoftheprotectiveandtherapeuticefficiencyofaDNAvaccineencodingthemajorbirchpollenallergenBetv1a.Allergy59:65–73.

HolgateST.1999.Theepidemicofallergyandasthma.Nature402(6760Suppl),B2-B4

HsuCH,ChuaKY,TaoMH,LaiYL,WuHD,HuangSK,HsiehKH.1996.Immunoprophylaxisofallergen-inducedimmunoglobulinEsynthesisandairwayhyperresponsivenessinvivobygeneticimmunization.Nat.Med.2(5):540-544.

JilekS,BarbeyC,SpertiniF,CorthesyB.2001.Antigen-independentsuppressionoftheallergicimmuneresponsetobeevenomphospholipaseA(2)byDNAvaccinationinCBA/Jmice.J.Immunol.166:3612–21.

KumaraguruU,RouseRJ,NairSK,BruceBD,RouseBT.2000.InvolvementofanATP-dependentpeptidechaperoneincross-presentationafterDNAimmunization.J.Immunol.165(2):750-759.

LeitnerWW,HammerlP,ThalhamerJ.2001.Nucleicacidfortreatmentofcancer:geneticvaccinesandDNAadjuvants.Curr.Pharm.Des.7(16):1641-1667.

LongA.2002.Thenutsandboltsofpeanutallergy.N.Engl.J.Med.346(17):1320-1322.

LuZ,YuanL,ZhouX,SotE,LevitskyHI,PardollDM.2000.CD4040-independentpathwaysofTcellhelpforprimingofCD8(+)cytotoxicTlymphocytes.J.Exp.Med.191(3):541-550.

MosmannTR,CoffmanRL.1989.TH1andTH2cells:differentpatternsoflymphokinesecretionleadtodifferentfunctionalproperties.Annu.Rev.Immunol.7:145-173.

OppenheimerJJ,NelsonHS,BockSA,ChristensonF,LeungDY.1992.Treatmentofpeanutallergywithrushimmunotherapy.J.AllergyClin.Immunol.90(2):256-262.

ParronchiP,MaggiE,RomagnaniS.1999.RedirectingTh2responsesinallergy.Curr.Top.Microbiol.Immunol.238:27-56.

PoloJM,DubenskyTWJr.2002.Virus-basedvectorsforhumanvaccineapplications.DrugDiscov.Today7(13):719-727.

RazE,TigheH,SatoY,CorrM,DudlerJA,RomanM,SwainSL,SpiegelbergHL,CarsonDA.1996.PreferentialinductionofaTh1immuneresponseandinhibitionofspecificIgEantibodyformationbyplasmidDNAimmunization.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.93(10):5141-5145.

RidgeJP,DiRosaF,MatzingerP.1998.AconditioneddendriticcellcanbeatemporalbridgebetweenaCD4+T-helperandaT-killercell.Nature393(6684):474-478.

RochaCD,CaetanoBC,MachadoAV,Bruna-RomeroO.2004.Recombinantvirusesastoolstoinduceprotectivecellularimmunityagainstinfectiousdiseases.Int.Microbiol.7(2):83-94.

RoyK,MaoHQ,HuangSK,LeongKW.1999.Oralgenedeliverywithchitosan–DNAnanoparticlesgeneratesimmunologicprotectioninamurinemodelofpeanutallergy.Nat.Med.1999；5:387–91.

SachsMI,JonesRT,YungingerJW.1981.Isolationandpartialcharacterizationofamajorpeanutallergen.J.AllergyClin.Immunol.,67:27-34.

SandersonIR,WalkerWA.1993.Uptakeandtransportofmacromoleculesbytheintestine:possibleroleinclinicaldisorders(anupdate).Gastroenterology104(2):622-639.

ShaheenSO,AabyP,HallAJ,BarkerDJ,HeyesCB,ShiellAW,GoudiabyA.1996.MeaslesandatopyinGuinea-Bissau.Lancet347(9018):1792-1796.

SichererSH,andLeungDY.2010.Advancesinallergicskindisease,anaphylaxis,andhypersensitivityreactionstofoods,drugs,andinsectsin2009.J.AllergyClin.Immunol.125(1),85-97.

SinghVK,MehrotraS,AgarwalSS.1999.TheparadigmofTh1andTh2cytokines:itsrelevancetoautoimmunityandallergy.Immunol.Res.20(2):147-161.

SlaterJE,Colberg-PoleyA.1997.ADNAvaccineforallergenimmunotherapyusingthelatexallergenHevb5.Arb.PaulEhrlichInt.BundesamtSeraImpfstoffeFrankf.A.M.91:230-235.

SmithGL.1993.Expressionofgenesbyvacciniavirusvectors.InMolecularVirology:Apracticalapproach.EditedbyAJDawsonandRMElliott.IRLPressatOxfordUniversityPress,OxfordUK.

SpiegelbergHL,OrozcoEM,RomanM,RazE.1997.DNAimmunization:anovelapproachtoallergen-specificimmunotherapy.Allergy52(10):964-970.

SrivastavaKD,QuC,ZhangT,GoldfarbJ,SampsonHA,LiXM.2009.Foodallergyherbalformula-2silencespeanut-inducedanaphylaxisforaprolongedposttreatmentperiodviaIFN-gamma-producingCD8⁺Tcells.J.AllergyClin.Immunol.123(2),443-451.

TodaM,SatoH,TakebeY,TaniguchiY,SaitoS,InouyeS,TakemoriT,SakaguchiM.2000.InhibitionofimmunoglobulinEresponsetoJapanesecedarpollenallergen(Cryj1)inmicebyDNAimmunization:DifferentoutcomesdependentontheplasmidDNAinoculationmethod.Immunology99:179–86.

TurcanuV,StephensAC,ChanSM,RanceF,LackG.2010.IgE-mediatedfacilitatedantigenpresentationunderlieshigherimmuneresponsesinpeanutallergy.Allergy65(10),1274-1281.

deVriesJE,CarballidoJM,AversaG.1999.ReceptorsandcytokinesinvolvedinallergicTH2cellresponses.J.AllergyClin.Immunol.103(5Pt2),S492-S496.

Claims

1.一种含有编码融合蛋白的核酸序列的痘病毒载体，所述融合蛋白包含(i)选自arah1、arah2、arah3、arah4、arah5、arah6、arah7、arah8、arah9、arah10和arah11以及与其具有至少70％的序列同一性的其衍生物或部分的至少两个花生变应原，以及(ii)增强所述融合蛋白的细胞内降解的蛋白酶体降解标签。

2.根据权利要求1所述的痘病毒载体，其中所述核酸序列编码包含下列的融合蛋白：(i)选自arah1、arah2、arah3、arah4、arah5、arah6和arah7、以及与其具有至少70％的序列同一性的其衍生物或部分的至少两个花生变应原，以及(ii)增强所述融合蛋白的细胞内降解的蛋白酶体降解标签。

3.根据权利要求1所述的痘病毒载体，其中所述核酸序列编码包含下列的融合蛋白：(i)选自arah1、arah2、arah3、arah4、arah5、arah6、arah7、arah8、arah9、arah10和arah11以及与其具有至少70％的序列同一性的其衍生物或部分的至少三个花生变应原，以及(ii)增强所述融合蛋白的细胞内降解的蛋白酶体降解标签。

4.根据权利要求3所述的痘病毒载体，其中所述核酸序列编码包含下列的融合蛋白：(i)选自arah1、arah2、arah3、arah4、arah5、arah6和arah7、以及与其具有至少70％序列同一性的其衍生物或部分的至少三个花生变应原，以及(ii)增强所述融合蛋白的细胞内降解的蛋白酶体降解标签。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的痘病毒载体，其中所述载体包含启动子和单一起始密码子以便于表达完整的融合蛋白。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的痘病毒载体，其中所述蛋白酶体降解标签含有泛素单体。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的痘病毒载体，其中所述核酸序列编码包含四个花生变应原的融合蛋白，所述四个花生变应原是arah1、arah2、arah3和arah6、或者与其具有至少70％的序列同一性的其衍生物或部分。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的痘病毒载体，其中所述融合蛋白包含SEQIDNO:12所示的氨基酸序列或者与其具有至少70％的序列同一性的其衍生物或部分。

9.根据权利要求1至7中任一项所述的痘病毒载体，其中所述痘病毒载体包含SEQIDNO:11中的一个所示的核酸序列或者与其具有至少70％的序列同一性的其衍生物或部分。

10.根据权利要求1至7中任一项所述的痘病毒载体，其中所述泛素单体包含SEQIDNO:1中的一个所示的核苷酸序列或者与其具有至少70％的核苷酸序列同一性的其衍生物。

11.根据权利要求1至7中任一项所述的痘病毒载体，其中所述蛋白酶体降解标签包含泛素C。

12.根据权利要求1至12中任一项所述的痘病毒载体，其中所述核酸序列编码包含花生变应原arah1、arah2、arah3和arah6的融合蛋白。

13.根据权利要求1至12中任一项所述的痘病毒载体，其中所述痘病毒载体是牛痘苗载体。

14.根据权利要求13所述的痘病毒载体，其中所述痘病毒载体是修饰的牛痘苗载体或禽痘载体。

15.根据权利要求1至14中任一项所述的痘病毒载体，其包括药学上或生理学上可接受的载体和/或稀释剂。

16.根据权利要求1至15中任一项所述的痘病毒载体，用于治疗受试者花生过敏。

17.根据权利要求1至14中任一项所述的痘病毒载体在治疗花生过敏中、或在制备用于治疗花生过敏的药物中的用途。

18.一种在受试者或患者中诱导对过敏反应耐受或者抑制过敏反应的方法，所述方法包括在足以引发抑制/耐受的条件下向受试者或患者施用有效量的根据权利要求1-15中任一项所述的痘病毒载体一段时间。

19.一种向受试者接种疫苗以诱导对花生变应原耐受的方法，包括施用根据权利要求1-15中任一项所述的痘病毒载体。

20.根据权利要求15所述的用途、或根据权利要求18或权利要求19所述的方法用于诱导针对至少两种或至少三种主要花生变应原的耐受。

21.一种包含根据权利要求1-15中任一项所述的痘病毒载体的试剂盒。

22.根据权利要求1-15中任一项所述的痘病毒载体用于人类受试者。

23.根据权利要求22所述的痘病毒载体，其中编码所述融合蛋白的核酸序列经密码子优化用于在人类细胞中表达。

24.一种使受试者对花生变应原脱敏或诱导受试者对花生变应原耐受的方法，所述方法包括：i)从受试者收集淋巴细胞；ⅱ)将淋巴细胞与根据权利要求1至15中任一项所述的痘病毒载体转染的细胞离体共培养，以产生和/或扩增T_H1淋巴细胞群体，其识别在细胞上与MHCI类分子相结合的蛋白酶体降解的花生变应原融合蛋白；和iii)向受试者施用来自(ii)的T_H1淋巴细胞群体。

25.一种使受试者对花生变应原脱敏或诱导受试者对花生变应原耐受的方法，所述方法包括：i)从受试者收集初始抗原递呈细胞；ⅱ)将抗原递呈细胞与根据权利要求1至15中任一项所述的痘病毒载体转染的细胞离体共培养，以产生活化的抗原递呈细胞群体，其识别在细胞上与MHCI类分子相结合的蛋白酶体降解的花生变应原融合蛋白；和iii)向受试者施用来自(ii)的活化的抗原递呈细胞群体。