CN105165847A - 一种抑制苜蓿细菌性萎蔫病菌生长的化合物 - Google Patents
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Abstract
本发明发现对苜蓿细菌性萎蔫病菌具有抑菌和杀菌活性的化合物。其苜蓿细菌性萎蔫病菌的最小抑菌浓度MIC值为64μg/mL，最小杀菌浓度MBC值为128μg/mL。
Description
技术领域
本发明涉及化合物的新用途，阐明药物化学结构与细菌的生物活性之间的关系，更具体的说，是探索化合物对苜蓿细菌性萎蔫病菌的抑菌和杀菌活性。
背景技术
苜蓿（Medicagosativa）是最重要的多年生豆科牧草，在我国用作农作物的耕作历史已有两千多年。苜蓿产量高，具有保持水土和改善土壤结构的功能，是北半球温带地区最主要的牧草和草品产业化、草田轮作的首选豆科牧草，在农牧业生产中有着不可替代的作用。病害（真菌、细菌、病毒、线虫和寄生性种子植物）是苜蓿生产的主要限制因素之一。目前关于苜蓿病害的研究工作多集中于苜蓿真菌性病害，而对于苜蓿细菌性病害的研究则较少。据美国植物病理学会2010年统计结果，苜蓿真菌性病害国际报道37种，病毒性病害12种，线虫病害12种，而苜蓿细菌性病害只有7种。国外关于苜蓿细菌性病害的研究主要包括苜蓿细菌性萎蔫病、细菌性茎疫病、细菌性芽腐烂病、细菌性叶斑病、根癌土壤杆菌、冠腐和根腐综合病和矮化病。
自1925年Jones报道的苜蓿细菌性萎蔫病害，之后世界不同国家陆续在不同苜蓿种植区发现细菌性萎蔫病。据报道，苜蓿细菌性萎蔫病可在所有苜蓿种植区发生。随着苜蓿种植在世界范围越来越普及的同时，各个国家对苜蓿细菌性萎蔫病保持高度警惕，并且苜蓿上其他细菌性病害也逐渐受到植物病理学工作者的重视。目前尤其是国内对苜蓿细菌性病害的认识还不是很深入，对病害种类及其特征、防治方法等方面也需要全面的总结以往的工作，同时，开展包括防治方法在内的新的内容。
苜蓿细菌性萎蔫病明显的症状是植株矮化，丛枝，颇似由病毒引致的“鬼帚病”。但在水肥等条件不良，牧草普遍长势欠佳时，该症状就不明显。发病植株叶绿素含量下降，故色泽浅淡，多呈浅绿，黄色，天气炎热时或呈淡褐色。病株叶片细小，卷缩。天气干热时，株顶萎垂、干枯，甚至全株枯萎。刈割后再生草的矮化尤其显著。每刈之后，植株愈益纤弱。病株常在越冬时死亡。以致草地逐年稀疏，牧草甚或绝迹。病株的根部和茎部的维管束发生病变。主根和侧根的木质部变为黄色，橙色，褐色，有时还杂以深色斑点。病变在横切面上极为明显。此病所引致的木质部变色，不限于根颈和主根上部，可一直延伸到根梢。与冻害引致的木质部变色有所区别。病根表面有时出现棕红色或褐色溃疡状病斑。由于根、茎维管束系统破坏，病株地上部分常部分或全部凋萎。
菌体杆状，末端圆形，单生或成对，但不成链状。大小为（0.4～0.5）μｍ×（0.7～1.0）μｍ。无鞭毛，不运动。不产芽孢。琼脂培养基上的菌落圆形，扁平或稍隆起，光滑，具光泽，粘稠。在马铃薯上或马铃薯蔗糖琼脂培养基上渐变为蓝色或淡紫色。可发酵葡萄糖、蔗糖、乳糖和半乳糖，但不产气。不产生H2S和氨。不能还原硝酸盐，缓慢水解淀粉。最适生长温度23℃，致死温度51~52℃。此菌有很多菌系，毒力差异很大。可在种子和植物残体中长期存活并传播。密执安棍状杆菌存在多个亚种，可致使多种农作物萎蔫病。
发明内容
本发明采用体外抗菌试验，研究化合物对苜蓿细菌性萎蔫病菌的生物活性。
本发明的具体技术方案如下：
本发明的创新点是发现化合物对苜蓿细菌性萎蔫病菌有良好的抑菌和杀菌活性，并测量得到其最小抑菌浓度MIC值和最小杀菌浓度MBC值，属于首次公开。
所述化合物结构特征如下式所示：
具体实施方式
下面结合具体实施实例，进一步详细地说明本发明。应理解下面实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明范围。
实施实例1
测量最小抑菌浓度MIC值。
（1）营养肉汤的配制：取营养肉汤30g加1000mL蒸馏水即得。使用前121℃高压蒸汽灭菌20min待用。
（2）营养琼脂固体培养基的配制：取营养琼脂45g加1000mL蒸馏水即得。使用前121℃高压蒸汽灭菌20min待用。
（3）菌株的培养：操作于超净工作台上进行。吸取已灭菌的液体培养基l0mL，放在已灭菌的试管中，然后用接菌环挑取一个菌落，加到液体培养基中，放于培养箱内培养，细菌培养24h，培养温度为28℃。
（4）菌液配制及计数：将培养后的菌液，釆用10倍稀释法用液体培养基稀释，并用血球计数板在显微镜上初步观察计数，然后将菌液用液体培养基稀释，作为加入供试品中的菌液。细菌采用平板计数法进行计数，将以上菌液用无菌生理盐水再稀释100倍，取50μL，均匀涂于已铺有固体培养基的平皿中，培养24h，培养温度为28℃。培养后，单个活细菌生长形成一个菌落，统计菌落数目，即可计算出样品中的含菌数。
计算公式为：菌液浓度=n×20×100cfu/mL
（5）药品溶液的配制：称取化合物，加入灭菌生理盐水，摇勾，得均匀溶液，备用。存放于4℃冰箱保存待用。
（6）最小抑菌浓度（MIC）与最小杀菌浓度（MBC）的测定：采用微量肉汤稀释法测定最小抑菌浓度MIC（MinimalInhibitoryConcentration）。MIC为最小抑菌浓度，即药物与一定浓度的菌液作用后，能够抑制可见菌生长的最低浓度。
采用二倍稀释法将药液用无菌生理盐水将药液稀释系列浓度，0.5、1、2、4、8、16、32、64、128和256μg/mL，在96孔板上1~10行，每孔加100μL不同浓度的药液和100μL菌液，使最终菌液浓度为1~5×105cfu/mL，第11行以无菌生理盐水加菌液作为阳性对照，第12行以不加菌液的无菌生理盐水为阴性对照，混匀后于28℃培养24h，以肉眼观察药物最低浓度管中无细菌生长者为该试验药物的MIC，每个实验重复三次。
测得最小抑菌浓度MIC值为64μg/mL。
实施实例2
测量最小杀菌浓度MBC值。
（1）营养肉汤的配制：取营养肉汤30g加1000mL蒸馏水即得。使用前121℃高压蒸汽灭菌20min待用。
（2）营养琼脂固体培养基的配制：取营养琼脂45g加1000mL蒸馏水即得。使用前121℃高压蒸汽灭菌20min待用。
（3）菌株的培养：操作于超净工作台上进行。吸取已灭菌的液体培养基l0mL，放在已灭菌的试管中，然后用接菌环挑取一个菌落，加到液体培养基中，放于培养箱内培养，细菌培养24h，培养温度为28℃。
（4）菌液配制及计数：将培养后的菌液，釆用10倍稀释法用液体培养基稀释，并用血球计数板在显微镜上初步观察计数，然后将菌液用液体培养基稀释，作为加入供试品中的菌液。细菌采用平板计数法进行计数，将以上菌液用无菌生理盐水再稀释100倍，取50μL，均匀涂于已铺有固体培养基的平皿中，培养24h，培养温度为28℃。培养后，单个活细菌生长形成一个菌落，统计菌落数目，即可计算出样品中的含菌数；计算公式为：菌液浓度=n×20×100cfu/mL。
（5）药品溶液的配制：称取化合物，加入灭菌生理盐水，摇勾，得均匀溶液，备用。存放于4℃冰箱保存待用。
（6）最小抑菌浓度（MIC）与最小杀菌浓度（MBC）的测定：采用微量肉汤稀释法测定最小杀菌浓度MBC（MinimalBactericidalConcentration）。在MIC基础上，从每管吸取10μL溶液，点于固体培养基上，继续按MIC培养条件下培养，以完全杀灭细菌的最低浓度为最小杀菌浓度（菌落数小于等于5）。
采用二倍稀释法将药液用无菌生理盐水将药液稀释系列浓度，0.5、1、2、4、8、16、32、64、128和256μg/mL，在96孔板上1~10行，每孔加100μL不同浓度的药液和100μL菌液，使最终菌液浓度为1~5×105cfu/mL，第11行以无菌生理盐水加菌液作为阳性对照，第12行以不加菌液的无菌生理盐水为阴性对照，混匀后于28℃培养24h，以肉眼观察药物最低浓度管中无细菌生长者为该试验药物的MIC。将上述未见生长细菌的各孔中的肉汤取10μL接种于营养琼脂平板上，做好标记，于28℃培养24h，以仍无细菌生长的管内药物浓度记为该药的MBC，每个实验重复三次。
测得最小杀菌浓度MBC值为128μg/mL。
Claims (1)
1.一种抑制苜蓿细菌性萎蔫病菌生长的化合物，其特征在于：
（1）结构特征如下式所示：
（2）其可作为苜蓿细菌性萎蔫病菌的抑制剂和杀菌剂；
（3）其对苜蓿细菌性萎蔫病菌的最小抑菌浓度MIC值为64μg/mL；
（4）其对苜蓿细菌性萎蔫病菌的最小杀菌浓度MBC值为128μg/mL。
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| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20151223 |