[go: up one dir, main page]

CN105132429A - 靶向人KPNB1基因的siRNA及其应用 - Google Patents

靶向人KPNB1基因的siRNA及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN105132429A
CN105132429A CN201510651096.2A CN201510651096A CN105132429A CN 105132429 A CN105132429 A CN 105132429A CN 201510651096 A CN201510651096 A CN 201510651096A CN 105132429 A CN105132429 A CN 105132429A
Authority
CN
China
Prior art keywords
kpnb1
shrna
sirna
dna
seqidno
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201510651096.2A
Other languages
English (en)
Inventor
朱志川
章雪妮
杨艳红
刘永杰
周艳婷
祖勇
刘霁玮
郑静
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
East China University of Science and Technology
Original Assignee
East China University of Science and Technology
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by East China University of Science and Technology filed Critical East China University of Science and Technology
Priority to CN201510651096.2A priority Critical patent/CN105132429A/zh
Publication of CN105132429A publication Critical patent/CN105132429A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Landscapes

  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本发明涉及生物医药与基因治疗领域，本发明提供了一种可以特异性抑制KPNB1基因表达的siRNA或shRNA，并且提供了siRNA或shRNA在制备KPNB1基因表达抑制剂中的应用，以及在制备预防或治疗胶质瘤药物中的应用。

Description

靶向人KPNB1基因的siRNA及其应用
技术领域
本发明涉及生物医药及基因治疗领域，具体涉及一种靶向人KPNB1基因的siRNA及其在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术
KPNB1全称是Karyopherin(importin)beta1，即转运受体蛋白β1(输入蛋白β1)。核质转运受体蛋白importinβ家族成员在核蛋白的输入过程中起到了重要的作用外，还具有其它重要的生物学功能，如在沿微管的运动中起到了潜在的马达调节蛋白的作用，参与纺锤体的装配、中心体的动力学、核膜的装配、核孔的装配以及将损伤信号从受损轴突到细胞体的转导等过程。(WANGShan等，IdentificationofInteractionbetweenMARVELD1andlmportinβ1ChineseJournalofBiochemistryandMolecularBiolog,2009May；25(8)：735～739)。
人KPNB1基因位于17号染色体，mRNA(GenebankAccession：NM_002265.5)。当前研究表KNPB1能把多种蛋白质运入核，一个是死亡受体DR5(DeathReceptor)，从而抑制DR5/TRAIL引起的凋亡。(KojimaY.etc；Importinβ1Proteinmediatednuclearlocalizationofdeathreceptor5(DR5)limitsDR5tumornecrosisfactor(TNF)-relatedapoptosis-inducingligand(TRAIL)-inducedcelldeathofhumantumorcells；JBiolChem,2011Dec16；286(50):43383-93.)；一个是ErbB2(ReceptortyrosineproteinkinaseerbB-2)，而ErbB2与多种肿瘤包括胶质瘤相关(DipakK,Giri.EndosomalTransportofErbB-2:MechanismforNuclearEntryoftheCellSurfaceReceptor.MOLECULARANDCELLULARBIOLOGY；Dec.2005,p.11005–11018)；KNPB1受E2F调节，与细胞周期调控相关(VanderWattPJetc.OverexpressionofKpnβ1andKpnα2importinproteinsincancerderivesfromderegulatedE2Factivity.PlosOne.2011；6(11)e27723)；还有EzH2-miR-30d-KPNB1通路对恶性外周神经鞘瘤(MPNSTs)的作用(PingyuZhang.etc,EZH2–miR-30d–KPNB1pathwayregulatesmalignantperipheralnervesheathtumourcellsurvivalandtumourigenesis.JournalofPathology.2014；232:308–318)。
肿瘤是威胁人类健康的疾病之一，至今缺少理想的治疗手段和药物，开发新的药物迫在眉睫。基因治疗是非常有前景的，在不久的将来或许会成为肿瘤治疗的一个有效手段。RNA干扰技术是一种沉默基因表达的技术，两名美国科学家AndrewZ.Fire和CraigC.Mello因对此项技术的贡献于2006年被授予诺贝尔生理学奖。RNA干扰技术的原理是较长双链RNA被特异核酸酶Dicer切割加工成21-23nt的由正义和反义链组成的小干扰RNA。小干扰RNA随后形成沉默复合体(RNA-inducedsilencingcomplex，RISC)解旋成单链。反义链引导该沉默复合体通过碱基配对特异性结合到目标mRNA上，使mRNA分解。
发夹RNA(shorthairpinRNA，shRNA)是一种形成急转弯结构的RNA序列，可以经由RNA干扰使基因沉默。
胶质瘤是一种发生于脑或脊髓的肿瘤，最常发生部位为脑，因其来源神经胶质细胞而被称为胶质瘤。胶质瘤占脑和中枢神经系统肿瘤的30％、占脑恶性脑肿瘤的80％，是人类健康的严重威胁。脑胶质瘤的治疗通常采用手术，放疗和化疗相结合。胶质瘤常发生于脑，手术需要开颅，手术时间长。胶质瘤和正常神经组织交错生长，边界不清，瘤组织不易清理干净，胶质瘤易复发。对于化疗，由于血脑屏障的存在，使普通的抗肿瘤药物疗效不佳。对于放疗，也存在定位困难和对神经损伤的担心。目前胶质瘤仍是医学界的一个难题。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种靶向人KPNB1基因的siRNA，本发明的另一目的在于提供该siRNA在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明人经实验证明恶性程度较高的胶质瘤，KPNB1的表达量也较高，调节KPNB1的表达能影响胶质瘤细胞的增殖。
本发明结合KPNB1分子在瘤细胞中的功能，利用RNA干扰技术开发新的治疗药物。
本发明设计靶向KPNB1基因的siRNA，特异性抑制KPNB1基因的表达，从而抑制胶质瘤的增殖。进一步地本发明提供了包含该siRNA的shRNA分子，也具有抑制KPNB1的表达的作用，可能成为治疗胶质瘤的药物。
本发明的第一方面，是提供一种靶向人KPNB1基因，并特异性抑制KPNB1基因表达的siRNA或shRNA。
本发明提供了三种靶向人KPNB1基因并特异性抑制KPNB1基因表达的siRNA，包括正义链和反义链，siRNA的序列如下：
siRNA-1：
正义链:5’-GCUUGCUAUUGAUGCUAAUGC-3’(SEQIDNO.1)
反义链:5’-CGAACGAUAACUACGAUUACG-3’(SEQIDNO.2)
siRNA-2:
正义链:5’-GGAAGUGUUGGGUGGUGAAUU-3’(SEQIDNO.3)
反义链:5’-CCUUCACAACCCACCACUUAA-3’(SEQIDNO.4)
siRNA-3：
正义链:5’-GGUGGACAAGUCAGACUAUGA-3’(SEQIDNO.5)
反义链:5’-CCACCUGUUCAGUCUGAUACU-3’(SEQIDNO.6)
本发明经实验发现，siRNA-2、siRNA-3的干扰效果最好。
本发明提供了一种上述的siRNA序列的shRNA序列，包括正义链和反义链，shRNA序列为：
shRNA-1：
正义链：
5’-
CCGGGCUUGCUAUUGAUGCUAAUGCCUCGAGGCAUUAGCAUCAAUAGCAAGCUUUUUUG-3’(SEQIDNO.7)
反义链：
5’-
AAUUCAAAAAAGCUUGCUAUUGAUGCUAAUGCCUCGAGGCAUUAGCAUCAAUAGCAAGC-3’(SEQIDNO.8)
shRNA-2：
正义链：
5’-
CCGGGGAAGUGUUGGGUGGUGAAUUCUCGAGAAUUCACCACCCAACACUUCCUUUUUUG-3’(SEQIDNO.9)
反义链：
5’-
AAUUCAAAAAAGGAAGUGUUGGGUGGUGAAUUCUCGAGAAUUCACCACCCAACACUUCC-3’(SEQIDNO.10)
ShRNA-3：
正义链：
5’-
CCGGGGUGGACAAGUCAGACUAUGACUCGAGUCAUAGUCUGACUUGUCCACCUUUUUUG-3’(SEQIDNO.11)
反义链：
5’-
AAUUCAAAAAAGGUGGACAAGUCAGACUAUGACUCGAGUCAUAGUCUGACUUGUCCACC-3’(SEQIDNO.12)
本发明经实验发现，shRNA-2、shRNA-3的干扰效果最好。
进一步地，本发明提供了一种转录上述的shRNA的DNA序列，DNA序列为：
ShRNA-1：
转录正义链的DNA：
5’-
CCGGGCTTGCTATTGATGCTAATGCCTCGAGGCATTAGCATCAATAGCAAGCTTTTTTG-3’(SEQIDNO.13)
转录反义链的DNA：
5’-
AATTCAAAAAAGCTTGCTATTGATGCTAATGCCTCGAGGCATTAGCATCAATAGCAAGC-3’(SEQIDNO.14)
ShRNA-2:
转录正义链的DNA：
5’-
CCGGGGAAGTGTTGGGTGGTGAATTCTCGAGAATTCACCACCCAACACTTCCTTTTTTG-3’(SEQIDNO.15)
转录反义链的DNA：
5’-
AATTCAAAAAAGGAAGTGTTGGGTGGTGAATTCTCGAGAATTCACCACCCAACACTTCC-3’(SEQIDNO.16)
ShRNA-3:
转录正义链的DNA：
5’-CCGGGGTGGACAAGTCAGACTATGACTCGAGTCATAGTCTGACTT
GTCCACCTTTTTTG-3’(SEQIDNO.17)
转录反义链的DNA：
5’-
AATTCAAAAAAGGTGGACAAGTCAGACTATGACTCGAGTCATAGT
CTGACTTGTCCACC-3’(SEQIDNO.18)
本发明经实验发现，ShRNA-2、ShRNA-3的干扰效果最好。
本发明的第二方面，提供了一种重组载体，含有如上所述的靶向人KPNB1基因的siRNA或如上所述的靶向人KPNB1基因的shRNA。
所述的重组载体，载体可选自质粒、慢病毒载体、腺病毒载体等，优选为质粒pLKD-CMV-GFP-U6。
本发明的第三方面，是提供上述的siRNA、shRNA，或DNA序列在制备KPNB1基因表达抑制剂中的应用。
进一步地，本发明还提供了上述的siRNA、shRNA，或DNA序列在制备抗肿瘤药物中的应用。
所述的肿瘤为胶质瘤。
本发明主要技术方案是：
1.siRNA的设计和干扰载体的制备；
搜索并下载KPNB1的cDNA序列，使用Lifetechnologies公司的BLOCK-iTRNADesigner软件在线设计与KNPB1cDNA互补的siRNA序列。选取得分最高的siRNA序列，与人的转录序列比对，排除偏靶效应。按“AgeI酶切位点粘性末端-正义链-茎环-反义链-编码终止序列-EcoRI酶切位点粘性末端”的顺序人工设计shRNA。
2.干扰慢病毒颗粒的包装；
用Lipofectamine2000将pLKD-CMV-GFP-U6-shRNA质粒(或不含shRNA的空载体质粒)、病毒外壳质粒psPAX2、包装质粒pMD2.G的混合物添加到293T细胞培养基中进行转染，4-6小时后更换为正常的培养基。收集24和48小时后培养基，过滤后超速离心得到病毒沉积块。用培养基重悬收集得到慢病毒。
3.干扰效率在蛋白水平的验证；
4.MTT法检测干扰KPNB1后细胞系增殖的影响；
5.克隆形成检测干扰KPNB1后对细胞系增殖的影响。
本发明涉及的干扰RNA能在信使RNA水平和蛋白水平有效抑制人KPNB1基因的表达，从而抑制胶质瘤细胞系U87和U251的增殖，为胶质瘤的治疗提供了新的途径。
附图说明
图1为WesternBlot法检测干扰KPNB1引起U87和U251细胞系的KPNB1蛋白水平下降的胶片扫描图；
图2为MTT法检测干扰KPNB1抑制U87和U251细胞系生长的折线图；纵坐标均为490nm处的吸光值；
图3为克隆形成法检测干扰KPNB1抑制U87和U251形成克隆的照片图；
图1～图3中含有空载体的病毒(control)和干扰KPNB1的病毒(shKPNB1)。
具体实施方式
下面结合附图对本发明进一步说明。以下实施方式只是较佳的实施方式中的一种，并非对本发明的限制。其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。未作特殊说明的实验试剂和方法，均指常规试剂和方法。
本发明所用试剂和原料均市售可得或可按文献方法制备。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人《分子克隆：实验室指南》(NewYork：ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989)中所述的条件，或按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1：构建KNPB1干扰质粒
在Ensemble网站(http://www.ensembl.org/index.html)搜索并下载KPNB1的cDNA序列，使用Lifetechnologies公司的BLOCK-iTRNADesigner软件(http://rnaidesigner.lifetechnologies.com/rnaexpress/)在线设计与KNPB1cDNA互补的siRNA序列。选取得分最高的siRNA序列，如下：
siRNA-1：
正义链:5’-GCUUGCUAUUGAUGCUAAUGC-3’(SEQIDNO.1)
反义链:5’-CGAACGAUAACUACGAUUACG-3’(SEQIDNO.2)
siRNA-2:
正义链:5’-GGAAGUGUUGGGUGGUGAAUU-3’(SEQIDNO.3)
反义链:5’-CCUUCACAACCCACCACUUAA-3’(SEQIDNO.4)
siRNA-3：
正义链:5’-GGUGGACAAGUCAGACUAUGA-3’(SEQIDNO.5)
反义链:5’-CCACCUGUUCAGUCUGAUACU-3’(SEQIDNO.6)
输入到NCBI网站的StandardNuceotideBLAST界面，与人的转录序列比对，确认目的基因与除KPNB1以外的转录本无高度同源性(16个碱基以上)，排除偏靶效应。然后按照“AgeI酶切位点粘性末端-正义链-茎环-反义链-编码终止序列-EcoRI酶切位点粘性末端”的顺序，将siRNA组装入shRNAd正义链和反义链。
ShRNA-1：
转录正义链的DNA：
5’-
CCGGGCTTGCTATTGATGCTAATGCCTCGAGGCATTAGCATCAATAGCAAGCTTTTTTG-3’(SEQIDNO.13)
转录反义链的DNA：
5’-
AATTCAAAAAAGCTTGCTATTGATGCTAATGCCTCGAGGCATTAGCATCAATAGCAAGC-3’(SEQIDNO.14)
ShRNA-2:
转录正义链的DNA：
5’-
CCGGGGAAGTGTTGGGTGGTGAATTCTCGAGAATTCACCACCCAACACTTCCTTTTTTG-3’(SEQIDNO.15)
转录反义链的DNA：
5’-
AATTCAAAAAAGGAAGTGTTGGGTGGTGAATTCTCGAGAATTCACCACCCAACACTTCC-3’(SEQIDNO.16)
ShRNA-3:
转录正义链的DNA：
5’-CCGGGGTGGACAAGTCAGACTATGACTCGAGTCATAGTCTGACTT
GTCCACCTTTTTTG-3’(SEQIDNO.17)
转录反义链的DNA：
5’-
AATTCAAAAAAGGTGGACAAGTCAGACTATGACTCGAGTCATAGT
CTGACTTGTCCACC-3’(SEQIDNO.18)
把以上信息交invitrogen公司合成得到DNAOligo。
DNAOligo加入ddH2O溶解，浓度10mM。各别取的DNAOligo与的10×退火缓冲液(成分为100mMTris-HCl(pH7.5)，10mMEDTA，1mMNaCl)混合，95℃水浴12min后拿出，在室温下冷却至室温。
25℃下，用T4连接酶(日本TAKARA公司生产)将互补双链与AgeI、EcoRI酶切的载体连接30min，体系按说明书配制(DNA4μl,载体2μl,PEG40002μl,10×T4buffer2μl,T4连接酶1μl,ddH2O9μl)。取连接产物加入装有大肠杆菌DH5α感受态细胞的1.5ml规格离心管使其混合，置于冰上30分钟，然后放入42℃水浴90秒，再放回冰上2分钟后加入800μl不含抗生素的培养基，置37℃细菌培养箱中摇1小时。4500转/分离心收集得到的细菌后涂固体LB培养基平板，37℃细菌培养箱过夜培养至长出菌落。
挑取菌落溶于含20μl抗性培养基的离心管中，进行菌落PCR鉴定，鉴定所用的引物为：
PLKD-F：CCTATTTCCCATGATTCCTTCATA(SEQIDNO.19)
PLKD-R：GAAATACGGTTATCCACGCG(SEQIDNO.20)
转化成功的取样送测序(华大基因有限公司提供测序服务),测序使用的引物是：PLKD-F：CCTATTTCCCATGATTCCTTCATA(SEQIDNO.19)。
测序结果比对正确后，应将菌液加入含15ml氨苄青霉素LB培养基的50ml离心管中。将离心管放入37℃摇床培养20小时。用质粒小提中量试剂盒(天根公司)抽取质粒，测定DNA浓度后备用。获得pLKD-CMV-GFP-U6-shRNA1、2、3质粒.
将293T细胞种于6孔培养板中，待汇合度达到40％时用脂质体转染法将shRNA质粒导入细胞。步骤为：转染前0.5小时更换新鲜培养基。在2个离心管中各加入125μl的Opti-MEM培养基(Gibco公司)，其中一个管中加入9μlLipofectamine2000(Invitrogen公司)，另一管加入6μgshRNA质粒。各混匀后放置5分钟。再将两管中的液体混匀，放置20分钟。最后将液体加入培养孔板。37℃培养6小时后吸去转染液体，更换新鲜培养基。转染72小时后裂解细胞，提取蛋白，蛋白免疫印迹法检测人KPNB1的表达。
经实验发现：siRNA-2、siRNA-3的干扰效果最好。shRNA-2、shRNA-3的干扰效果最好。
上述的siRNA序列的shRNA序列，包括正义链和反义链，shRNA序列为：
shRNA-1：
正义链：
5’-
CCGGGCUUGCUAUUGAUGCUAAUGCCUCGAGGCAUUAGCAUCAAUAGCAAGCUUUUUUG-3’(SEQIDNO.7)
反义链：
5’-
AAUUCAAAAAAGCUUGCUAUUGAUGCUAAUGCCUCGAGGCAUUAGCAUCAAUAGCAAGC-3’(SEQIDNO.8)
shRNA-2：
正义链：
5’-
CCGGGGAAGUGUUGGGUGGUGAAUUCUCGAGAAUUCACCACCCAACACUUCCUUUUUUG-3’(SEQIDNO.9)
反义链：
5’-
AAUUCAAAAAAGGAAGUGUUGGGUGGUGAAUUCUCGAGAAUUCACCACCCAACACUUCC-3’(SEQIDNO.10)
ShRNA-3：
正义链：
5’-
CCGGGGUGGACAAGUCAGACUAUGACUCGAGUCAUAGUCUGACUUGUCCACCUUUUUUG-3’(SEQIDNO.11)
反义链：
5’-
AAUUCAAAAAAGGUGGACAAGUCAGACUAUGACUCGAGUCAUAGUCUGACUUGUCCACC-3’(SEQIDNO.12)
本发明经实验发现，shRNA-2、shRNA-3的干扰效果最好。
实施例2：干扰慢病毒颗粒的包装
在37℃5％CO2的细胞培养箱中培养HEK293T细胞(下简称293T,购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库)，培养基使用添加了10％胎牛血清(美国纽约Gibco公司生产)的DMEM(美国纽约Gibco公司生产)培养基.传代培养293T细胞于直径为10cm的培养皿中，当细胞长到汇合度为50％左右，用无血清的培养基培养4小时。
按Lipofectamine2000(美国Invitrogen公司生产)说明书操作，准备好22.5g上面得到的pLKD-CMV-GFP-U6-shRNA质粒(或不含shRNA的空载体质粒)、7.9g病毒外壳质粒psPAX2(中国上海纽恩生物科技有限公司提供)、14.6g包装质粒pMD2.G(中国上海纽恩生物科技有限公司提供)的转染混合物。
把混合物添加到已经饥饿培养过的细胞中进行转染，4-6小时后更换为正常的培养基。分别在换液培养24和48小时后收集培养基，经0.22μm孔径的膜过滤后，再用CP80MX离心机(日本日立公司生产)经4℃、100000g超速离心2小时，得到病毒沉积块。用OPTI-MEM(美国纽约Gibco公司生产)培养基重悬收集得到慢病毒。
通过以上方法包装得到含有空载体的病毒(control)和干扰KPNB1的病毒(shKPNB1-1、shKPNB1-2、shKPNB1-3)。慢病毒的滴度测定采用稀释计数法,把293T细胞铺96孔板，每孔约5000个细胞，过夜培养。准备好用培养基10倍梯度稀释的病毒共10份，即最低、最高浓度分别为原液的1/10- 10、1/10-1,每份100μl换掉对应孔的培养基培养过夜后更换正常培养基。换掉新鲜培养基再培养两天后，置荧光显微镜下观察最后两个有荧光的孔的荧光细胞的克隆数，用以下公式计算病毒滴度：滴度(TU/ml)＝(X+Y*10)*10/(2*Z)其中X是指倒数第二个有荧光的孔的荧光细胞克隆数，Y是指倒数第一个有荧光的孔的荧光细胞克隆数，Z是指X对应孔所加病毒的稀释率。
实施例3：干扰效率在蛋白水平的验证
蛋白样品的制备：
在直径6cm培养皿中培养细胞至大约30％汇合度，分别加入对照慢病毒感染颗粒和干扰KPNB1的病毒感染颗粒(感染复数为10)，继续培养细胞4天。收细胞时先转移培养基至空的15ml规格离心管，用PBS漂洗两次细胞，每次用PBS3ml，然后用2ml0.25％胰蛋白酶消化细胞，待细胞都变圆漂浮后把之前吸走的培养基倒回培养皿。把消化下来的细胞随培养基转移到15ml规格离心管中，1200转/分离心5分钟收集细胞。弃掉上清，加入含有1×PMSF(中国南通碧云天公司生产)和1×蛋白酶抑制剂cocktail(美国ThermoScientific公司生产)的RIPA细胞裂解液(中国南通碧云天公司生产)。吹打混匀细胞和裂解液，放于冰上裂解1小时，每20分钟用漩涡混合器振荡混匀。最后离心，离心机设置为：4℃、13000转/分、15分钟。吸取离心后的上清液至洁净的离心管中即为提得的蛋白样品。把蛋白样品和等体积的2×蛋白上样缓冲液(二硫苏糖醇(DTT)：0.1572g,溴酚蓝；0.01g,Tris-HCl(1MpH6.8)：0.5ml,10％SDS：2ml,甘油：1ml,H2O：定容至10ml)混合煮沸5分钟，完成样品制备。
Tris(1MpH6.8)缓冲液的配制方法：称取TrisBase24.228g溶于约160ml超纯水，充分搅拌溶解，用盐酸调节pH至6.8，同时用超纯水定容至200ml。
WesternBlot方法检测蛋白表达：
准备好配制凝胶需要的试剂：
30％acrylamidemix的配制方法：称取丙烯酰胺29.2g，甲叉双丙烯酰胺0.8g，用超纯水溶解并定容至100ml。
Tris(1.5MpH8.8)配制方法：称取TrisBase36.342g溶于约160ml超纯水，充分搅拌溶解，用盐酸调节pH至8.8，同时用超纯水定容至200ml。
Tris(0.5MpH6.8)缓冲液的配制方法：称取TrisBase12.114g溶于约160ml超纯水，充分搅拌溶解，用盐酸调节pH至6.8，同时用超纯水定容至200ml。
10％SDS的配制方法：称取5g十二烷基硫酸钠(sodiumdodecylsulfate，SDS)，溶于超纯水至50ml。
10％APS的配制方法：称取5g过硫酸铵(Ammoniumpersulfate，APS)，溶于超纯水至50ml。
TEMED是指N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine，中文名N,N,N',N'-四甲基二乙胺。
准备好电泳装置(中国上海天能科技有限公司生产的VE-180型垂直电泳槽)和配制1.5mm厚凝胶的玻璃板(中国上海天能科技有限公司生产)。把玻璃板用洗洁精、清水洗涤干净，再用去离子水冲洗一遍，放入电热鼓风干燥箱中烘干。待玻璃板全干后组装好配胶装置，配制10％分离胶(ddH2O：4.0ml,30％acrylamidemix：3.3ml,Tris(PH8.81.5M)：2.5ml,10％SDS：100μl,10％APS：100μl,TEMED：4μl)，将其注入至玻璃板，加入后用300μl超纯水封住上表面。
室温放置30分钟以上，待水和凝固的分离胶两相界面变清晰，准备好5％浓缩胶(ddH2O：2.7ml,30％acrylamidemix：0.67ml,Tris(PH6.80.5M)：0.5ml,10％SDS：40μl,10％APS：40μl,TEMED：4μl)，倒掉玻璃板中的水，注入浓缩胶，插上梳子，室温放置20分钟待其凝固后即可使用。
电泳：
配制10×电泳液(Tris：30.3g,甘氨酸：144.0g,SDS：10.0g,去离子水：定容至1000ml)，将50ml10×电泳液与450mlH2O2混合即得到500ml1×电泳液。
安装好电泳装置并用清水冲洗干净，拔掉梳子。倒上500ml电泳液，保持电泳槽内槽充满电泳液，样品在6000转/分条件下离心1s收集后加入泳道，邻近样品放的其中一个空白孔加入预染marker(加拿大Fermentas公司生产，货号SM0671)。电泳时电源限定条件：恒流15-20mA。待指示剂显示样品接近凝胶下边界时停止电泳。
转膜：
配制10×转膜液(Tris：30.3g,甘氨酸：144.0g,H2O：定容至：1000ml)。
接下来配制好1×转膜液(10×转膜液：80ml,甲醇：160ml,H2O：定容至800ml)。准备好转膜装置，两组9×8cm规格滤纸，每组三张。把PVDF膜先浸泡在甲醇中约20秒待其浸透无白点，再放入转膜液中平衡后，转移至装有转膜液的小盒中备用。然后用塑料片轻轻切去浓缩胶，再切割分离胶两端和与玻璃接触的面。用塑料片蘸少许转膜液，塞入分离胶下使其松动，然后将其倒扣至装有转膜液的塑料盆中轻轻摇晃，分离胶即从玻璃上脱离到转膜液中。
打开转膜用的塑料板，浸没到转膜液中，在转膜液中按如下顺序组装：负极板(黑)放上海绵→一组滤纸(三张)→分离胶→PVDF膜→一组滤纸(三张)→海绵→正极板。然后夹持好装置，倒上转膜液，确保转膜的三明治样结构完全浸没在转膜液中，盖上带有电源线的盖子，整个电泳装置置于塑料盆中，电泳盒外围加上冰水混合物即可开始转膜。转膜时电源限定条件：U＝100V；I＝350mA；t＝75min。
封闭：
配制好10×TBS缓冲液(1L含Tris24.23g、NaCl80.06g，HCl调pH至7.6)，然后用去离子水稀释10倍得到1×TBS，再加入0.5％(v/v)的吐温-20配制成TBST。准备好5％脱脂奶，将5g脱脂牛奶(中国内蒙古伊利实业集团股份有限公司)溶于100mlTBST溶液中。转膜完毕后，取出PVDF膜装入自封袋，倒入20ml的5％脱脂牛奶，用封口机封牢，置于脱色摇床上摇20分钟，再转至4℃冰箱过夜存放。
一抗孵育：
从冰箱取出PVDF膜后，先用1×TBST洗涤3次，每次5分钟。按1：1000稀释率取用抗体KPNB1(英国Abcam公司生产，ab22453)及1：8000稀释率取用抗体HRP偶联的GAPDH(上海康成公司生产，KC-5G5)，加入到5mlTBST中，摇匀即得到抗体工作液。把洗涤后的膜装入自封袋，倒入配好的抗体工作液，中速运转的脱色摇床上孵育120分钟。一抗孵育完后，若一抗上已经有辣根过氧化物酶标记(如内参蛋白GAPDH的抗体)，则直接跳至显影步骤，若没有，则需要二抗孵育。
二抗孵育：
先用1×TBST洗涤3次，每次5分钟。吸取辣根过氧化物酶标记的兔免疫球蛋白抗体(即二抗，美国CellSignalingTechnology公司生产，稀释率为1:2000)，加入到5ml1×TBST中摇匀。把洗涤后的膜装入自封袋，倒入配好的二抗工作液，封口机封住，摇床上摇120分钟。
显影：
二抗孵育结束后，用1×TBST洗涤6次，前3次每次10分钟，后3次每次5分钟。在此期间准备好显影液、定影液、自来水、胶片、显影暗匣，剪刀，卫生纸。以下操作在显影暗室中红光灯辅助下完成。分别吸取400μl显影底物A和B(中国天根生化科技有限公司生产)混匀，平衡至室温。把PVDF膜放在洁净的剪开的自封袋内表面上。迅速加上显影底物，孵育1-5分钟,若肉眼可见明显条带，则终止孵育。弃掉显影底物液体，把膜转移至三面剪开的自封袋中，合上自封袋，用卫生纸小心吸掉多余的液体，放入显影暗匣，用绝缘胶带固定。放上胶片，胶片曝光一定时间(5～30秒)后，依次放入显影液、定影液各20秒，然后把胶片放在清水中。最后在自来水下洗净胶片，晾干，扫描至计算机，得到检测结果。
显影后的膜用1×TBST洗10分钟后，可放入有抗体洗脱缓冲液的自封袋中，密封后放入50～60℃的水浴锅中孵育30分钟。再用1×TBST洗2次，每次10分钟。洗完后用脱脂奶封闭即可重复上面的步骤检测其它蛋白如内参蛋白GAPDH。
WesternBlot的结果如图1所示，表明本发明用到的干扰RNA能显著降低KPNB1的蛋白水平。
实施例4：MTT法检测干扰KPNB1后对U87及U251细胞系增殖的影响
胶质瘤U87细胞系，购自中科院细胞所。
在直径6cm培养皿中培养细胞至大约30％汇合度，分别加入对照慢病毒感染颗粒和干扰KPNB1的病毒感染颗粒(感染复数为10)，继续培养细胞4天。后用96孔板(美国Corning公司生产)培养，每孔约1500个细胞，每孔培养基150μl。分别在如图3所示的时间点，每孔加入15μl浓度为5mg/ml的MTT(上海生工生物工程公司生产)继续孵育4小时。然后吸掉培养物，每孔加入150μlDMSO，在酶标仪(美国Bio-Rad公司生产，iMark168-1130型)的490nm波长下测定吸光度。
结果如图2所示，表明干扰KPNB1能明显抑制U87及U251的生长。
实施例5：克隆形成法检测干扰KPNB1后对U87及U251细胞系增殖的影响
在直径6cm培养皿中培养细胞至大约30％汇合度，分别加入对照慢病毒感染颗粒和干扰KPNB1的病毒感染颗粒(感染复数为10)，继续培养细胞4天。后吹散为单个细胞，用6孔板培养(美国Corning公司生产)，每孔约500个细胞。培养14天，中途按需要换培养基。之后弃掉培养基，用乙醇固定30分钟，后用0.5％的结晶紫染色。
克隆形成实验结果如图3所示，表明干扰KPNB1能明显抑制U87及U251细胞克隆的形成。敲减效果最好的是shKPNB1-2、shKPNB1-3。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式不受上述实施例的限制。其他任何不脱离本发明之精神和原理下所作的变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (12)

1.一种靶向人KPNB1基因并特异性抑制KPNB1基因表达的siRNA，所述siRNA选自siRNA-2或siRNA-3，siRNA的序列如下：
siRNA-2:
正义链:5’-GGAAGUGUUGGGUGGUGAAUU-3’(SEQIDNO.3)
反义链:5’-CCUUCACAACCCACCACUUAA-3’(SEQIDNO.4)；
siRNA-3：
正义链:5’-GGUGGACAAGUCAGACUAUGA-3’(SEQIDNO.5)
反义链:5’-CCACCUGUUCAGUCUGAUACU-3’(SEQIDNO.6)。
2.一种靶向人KPNB1基因并特异性抑制KPNB1基因表达的shRNA序列，所述shRNA序列选自shRNA-2或ShRNA-3，shRNA序列如下：
shRNA-2：
正义链：
5’-
CCGGGGAAGUGUUGGGUGGUGAAUUCUCGAGAAUUCACCACCCAACACUUCCUUUUUUG-3’(SEQIDNO.9)
反义链：
5’-
AAUUCAAAAAAGGAAGUGUUGGGUGGUGAAUUCUCGAGAAUUCACCACCCAACACUUCC-3’(SEQIDNO.10)；
ShRNA-3：
正义链：
5’-
CCGGGGUGGACAAGUCAGACUAUGACUCGAGUCAUAGUCUGACUUGUCCACCUUUUUUG-3’(SEQIDNO.11)
反义链：
5’-
AAUUCAAAAAAGGUGGACAAGUCAGACUAUGACUCGAGUCAUAGUCUGACUUGUCCACC-3’(SEQIDNO.12)。
3.一种转录权利要求2所述shRNA的DNA序列，所述DNA序列选自shRNA-2的DNA或ShRNA-3的DNA：
shRNA-2转录正义链的DNA：
5’-
CCGGGGAAGTGTTGGGTGGTGAATTCTCGAGAATTCACCACCCAACACTTCCTTTTTTG-3’(SEQIDNO.15)
shRNA-2转录反义链的DNA：
5’-
AATTCAAAAAAGGAAGTGTTGGGTGGTGAATTCTCGAGAATTCACCACCCAACACTTCC-3’(SEQIDNO.16)；
ShRNA-3转录正义链的DNA：
5’-CCGGGGTGGACAAGTCAGACTATGACTCGAGTCATAGTCTGACTT
GTCCACCTTTTTTG-3’(SEQIDNO.17)
ShRNA-3转录反义链的DNA：
5’-
AATTCAAAAAAGGTGGACAAGTCAGACTATGACTCGAGTCATAGT
CTGACTTGTCCACC-3’(SEQIDNO.18)。
4.一种靶向人KPNB1基因并特异性抑制KPNB1基因表达的重组载体，含有如权利要求1所述的靶向人KPNB1基因的siRNA，或如权利要求2所述的靶向人KPNB1基因的shRNA。
5.如权利要求4所述靶向人KPNB1基因并特异性抑制KPNB1基因表达的的重组载体，载体选自质粒、慢病毒载体或腺病毒载体。
6.如权利要求5所述靶向人KPNB1基因并特异性抑制KPNB1基因表达的的重组载体，载体为质粒pLKD-CMV-GFP-U6。
7.一种如权利要求1所述的siRNA在制备KPNB1基因表达抑制剂中的应用。
8.一种如权利要求2所述的shRNA在制备KPNB1基因表达抑制剂中的应用。
9.一种如权利要求3所述的DNA序列在制备KPNB1基因表达抑制剂中的应用。
10.一种如权利要求1所述的siRNA在制备抗肿瘤药物中的应用。
11.一种如权利要求2所述的shRNA在制备抗肿瘤药物中的应用。
12.一种如权利要求3所述的DNA序列在制备抗肿瘤药物中的应用。
CN201510651096.2A 2015-10-10 2015-10-10 靶向人KPNB1基因的siRNA及其应用 Pending CN105132429A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510651096.2A CN105132429A (zh) 2015-10-10 2015-10-10 靶向人KPNB1基因的siRNA及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510651096.2A CN105132429A (zh) 2015-10-10 2015-10-10 靶向人KPNB1基因的siRNA及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN105132429A true CN105132429A (zh) 2015-12-09

Family

ID=54717998

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510651096.2A Pending CN105132429A (zh) 2015-10-10 2015-10-10 靶向人KPNB1基因的siRNA及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105132429A (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108096579A (zh) * 2017-12-18 2018-06-01 深圳先进技术研究院 以c-Rel基因为靶点在制备治疗类风湿性关节炎的药物中的应用
CN109718377A (zh) * 2017-10-31 2019-05-07 中国科学院上海生命科学研究院 KPNB1抑制剂和Bcl-xL抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用
CN109718378A (zh) * 2017-10-31 2019-05-07 中国科学院上海生命科学研究院 Kpnb1抑制剂和蛋白降解途径抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007072225A2 (en) * 2005-12-01 2007-06-28 Medical Prognosis Institute Methods and devices for identifying biomarkers of treatment response and use thereof to predict treatment efficacy
WO2010145796A2 (en) * 2009-06-19 2010-12-23 Merck Patent Gmbh Biomarkers and methods for determining efficacy of anti-egfr antibodies in cancer therapy
CN103124795A (zh) * 2010-07-23 2013-05-29 哈佛大学校长及研究员协会 利用吞噬细胞检测疾病或病症的方法
CN104603289A (zh) * 2012-06-15 2015-05-06 哈里·斯泰利 检测疾病或病状的方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007072225A2 (en) * 2005-12-01 2007-06-28 Medical Prognosis Institute Methods and devices for identifying biomarkers of treatment response and use thereof to predict treatment efficacy
CN101365806A (zh) * 2005-12-01 2009-02-11 医学预后研究所 用于鉴定治疗反应的生物标记的方法和装置及其预测疗效的用途
WO2010145796A2 (en) * 2009-06-19 2010-12-23 Merck Patent Gmbh Biomarkers and methods for determining efficacy of anti-egfr antibodies in cancer therapy
CN103124795A (zh) * 2010-07-23 2013-05-29 哈佛大学校长及研究员协会 利用吞噬细胞检测疾病或病症的方法
CN104603289A (zh) * 2012-06-15 2015-05-06 哈里·斯泰利 检测疾病或病状的方法

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
PEIZHOU LIANG ET AL.: "KPNB1, XPO7 and IPO8 Mediate the Translocation of NF-κB/p65 into the Nucleus.", 《TRAFFIC》 *
PINGYU ZHANG ET AL.: "EZH2–miR-30d–KPNB1 pathway regulates malignant peripheral nerve sheath tumour cell survival and tumourigenesis.", 《THE JOURNAL OF PATHOLOGY》 *
成捷等: "miＲNA，lncＲNA 与心血管疾病", 《中国生物化学分子生物学报》 *
曹木水等: "基于人类信号转导网络研究卵巢癌病变", 《生物物理学报》 *
王楠等: "长非编码ＲNA(lncＲNA)与心血管疾病", 《生理科学进展》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109718377A (zh) * 2017-10-31 2019-05-07 中国科学院上海生命科学研究院 KPNB1抑制剂和Bcl-xL抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用
CN109718378A (zh) * 2017-10-31 2019-05-07 中国科学院上海生命科学研究院 Kpnb1抑制剂和蛋白降解途径抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用
CN109718377B (zh) * 2017-10-31 2021-03-26 中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心 KPNB1抑制剂和Bcl-xL抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用
CN108096579A (zh) * 2017-12-18 2018-06-01 深圳先进技术研究院 以c-Rel基因为靶点在制备治疗类风湿性关节炎的药物中的应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Tsapara et al. The RhoA activator GEF-H1/Lfc is a transforming growth factor-β target gene and effector that regulates α-smooth muscle actin expression and cell migration
Han et al. YAP1 is required for the angiogenesis in retinal microvascular endothelial cells via the inhibition of MALAT1‐mediated miR‐200b‐3p in high glucose‐induced diabetic retinopathy
Li et al. The long non‐coding RNA HCG18 promotes the growth and invasion of colorectal cancer cells through sponging miR‐1271 and upregulating MTDH/Wnt/β‐catenin
Han et al. MiR-101 inhibits the proliferation and metastasis of lung cancer by targeting zinc finger E-box binding homeobox 1
Ou et al. RNA interference suppressing PLCE1 gene expression decreases invasive power of human bladder cancer T24 cell line
Lin et al. Long non‐coding RNA MEG3 promotes autophagy and apoptosis of nasopharyngeal carcinoma cells via PTEN up‐regulation by binding to microRNA‐21
Briston et al. VHL-mediated regulation of CHCHD4 and mitochondrial function
CN109985243A (zh) 靶向PCSK9的microRNA在治疗LDLC相关代谢性疾病中的应用
CN104531700B (zh) 抑制小鼠MACF1基因表达的shRNA序列及其应用
CN105132429A (zh) 靶向人KPNB1基因的siRNA及其应用
CN104328122A (zh) 一种针对人膜联蛋白A2受体基因的siRNA及其应用
CN117517657B (zh) Lnx1基因或蛋白在调控禽类先天免疫应答反应中的应用
Wu et al. A novel DNA binding protein encoded by circZNF131 inhibits the growth of gastric cancer by suppressing CTBP2 transcription
CN103740726B (zh) 靶向人CDKL5基因的siRNA及其应用
CN103695423B (zh) 调控yap和/或tead和/或rhamm表达水平物质的新用途
CN109172597B (zh) 调节rDNA基因染色质组蛋白甲基化水平的物质及其应用
WO2011061194A1 (en) Inhibitors of centrosomal clustering
CN106467914A (zh) 靶向人TSPAN8基因的siRNA及其应用
CN115501340B (zh) CircPIAS1作为靶点在制备肝癌诊断试剂或治疗药物中的用途
CN103695427B (zh) 用于敲低vps11的小分子干扰rna、重组载体及其应用
CN116059237A (zh) 信号通路在chd药物开发中的应用
CN119700976B (zh) Cfap52抑制剂及其在制备治疗和/或预防食管鳞状细胞癌中药物的用途
CN104906125B (zh) microRNA‑326的抑制剂在制备治疗白内障的药物中的应用
CN105288660B (zh) MiRNA-22在制备MMP14和Snail表达抑制剂中的应用
CN103421792A (zh) 真核生物翻译起始因子4H（eIF4H）基因沉默抑制肿瘤细胞生长的方法及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20151209

WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication