CN105120858A - 以欧米茄-3脂质为基础的乳剂用于防止人类器官缺血性损伤的用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了限制由缺氧-缺血导致的细胞死亡或损伤或再灌注损伤的方法，包括在缺氧-缺血损害后，施用以欧米茄-3脂质为基础的乳剂。所述以欧米茄-3脂质为基础的乳剂优选地包括从大约10％到35％的欧米茄-6油，所述欧米茄-6油按g/100mL乳剂的重量比计算；所述欧米茄-3油包括按欧米茄-3油总重量计算的大约20％到100％的甘油三酯，并且大约20％wt.-％到100％的所述欧米茄-3甘油三酯的酰基是由DHA组成；所述欧米茄-3油包括少于10％的欧米茄-6脂肪酸；以及所述乳剂内脂质微滴的平均直径小于大约5微米。

Description

以欧米茄-3脂质为基础的乳剂用于防止人类器官缺血性损伤的用途

本申请要求享有序列号61/767248，名为“用于治疗缺氧缺血性损伤的欧米茄-3甘油三酯-DHA乳剂(Omega-3Triglyceride-DHAEmulsionsfortheTreatmentofHypoxic-ischemicInjuries)”並于2013年2月20日提交的美国临时申请的优先权，该申请的全部内容并入本文。

背景技术

脑缺氧缺血(中风)是在生命周期的所有阶段中的发病率和死亡率的主要原因，其对象包括早产婴儿，特护病房的儿童以及具有脑血管病的老人。从缺血缺氧脑病幸存的婴儿和儿童表现出终身的神经功能障碍，包括脑麻痹，神经发育迟缓，癫痫症和学习功能障碍。Vannucci，R.C.(2000)“缺氧缺血性脑病(Hypoxic-ischemicencephalopathy)”，美国围生医学期刊(AmericanJournalofPerinatology)17(3)：113-120。

脑缺氧缺血通常出现在危重患病儿童，和心肺骤停的联系最为显著。脂质乳剂普遍在儿科重症监护中使用并且是这些危重患病儿童卡路里的重要来源。商业上最易得的乳剂由具有高浓度的欧米茄-6(n-6)脂肪酸的豆油形成，富含诸如α-亚麻酸、二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)的欧米茄-3(n-3)脂肪酸的脂质乳剂来自鱼油，并且该脂质乳剂没有广泛地应用到临床上。但是欧米茄-3油已经在诸如癫痫症，抑郁和行为紊乱的神经疾病上显示有益效果。大多数研究支持一种由于膳食管理而造成改变的膜脂质组成所产生的神经保护效果。在一项研究中，在神经损伤前和/或后供给的静脉内的α-亚麻酸在两个动物模型有防护作用，动物模型为在成年斯普拉格-杜勒鼠(Sprague-Dawleyrats)使用红藻氨酸诱发癫痫和通过四次血管阻塞而导致的全心缺血。LauritzenI等人,“多元未饱和脂肪酸是有效的神经保护体(Polyunsaturatedfattyacidsarepotentneuroprotectors)，”EMBO期刊(TheEMBOJournal)，20004月17号；19(8):1784-93。但是，仍需要方法来在初期缺血损害后，防止脑和其他器官和其他组织的受损。本发明实现这种需求。中风是成人死亡最常见原因中的第三位或第四位，并且伴随着的巨大花费不仅是因为死亡方面，还有在幸存者的中风后遗症护理的方面上。

发明内容

本发明提供了限制由缺氧-缺血导致的神经损伤的方法，包括在脑缺氧缺血损害后，施用以欧米茄-3脂质为基础的乳剂，其中所述以欧米茄-3脂质为基础的乳剂包括有效提供抗神经损伤的保护的欧米茄-3油。

本发明也提供了限制由缺氧-缺血导致的细胞死亡的方法，包括在脑缺氧缺血损害后，施用以欧米茄-3脂质为基础的乳剂，其中所述以欧米茄-3脂质为基础的乳剂包括有效提供限制细胞死亡的保护的欧米茄-3油。所述以欧米茄-3脂质为基础的乳剂在肠内或肠胃外给药。

本发明的方法还包括给予常规的中风治疗或预防药物。

本发明的以欧米茄-3脂质为基础的乳剂包括以重量计的至少10％、优选地至少20％的欧米茄-3油。在特定实施例中，所述欧米茄-3油包括至少10％，优选地至少20％的欧米茄-3甘油三酯和/或欧米茄-3甘油二酯，并且所述欧米茄-3甘油三酯和/或所述欧米茄-3甘油二酯的脂肪酸包括至少40％的EPA和/或DHA。

以欧米茄-3脂质为基础的乳剂可以任何有效剂量给药，例如0.05g/kg到4g/kg的剂量，并且可在缺氧-缺血损害后的任何时间给药，例如缺血损害后的20分钟-6小时或缺氧缺血损害后的0-12小时。随后额外的给药也可预期会有，例如损害后的1-24小时后提供随后额外的给药。所述以欧米茄-3脂质为基础的乳剂应当在所述缺氧-缺血损害后尽快给药，优选地在损害后的一到两个小时内给药。

当缺血出现在选自于由脑、心脏、肾、脊髓、大肠或小肠、胰腺和肺所构成的组中的器官中时，本发明的方法有效。

本发明也提供了适用于肠内或肠胃内给药的以欧米茄-3脂质为基础的乳剂，其中所述乳剂在缺氧-缺血损害后对细胞提供抗细胞死亡的保护益处，所述乳剂包括以重量计的至少20％的欧米茄-3油，其中所述欧米茄-3油包括至少20％的欧米茄-3甘油三酯和/或欧米茄-3甘油二酯，以及其中所述欧米茄-3甘油三酯和/或所述欧米茄-3甘油二酯的脂肪酸包括至少40％的EPA和/或DHA。

本发明也提供了此处描述的以欧米茄-3脂质为基础的乳剂用于制备限制由缺氧-缺血导致的神经损伤和/或细胞死亡的药物的用途。

附图说明

在附图中通过示例而非限制性的方式对本发明进行图示说明。

图1A-1B为示出了在注射甘油三酯(TG)乳剂后血液中甘油三酯和血糖水平的图表。图1A是示出了非禁食乳鼠(p10)体内总体血浆甘油三酯浓度(mg/dL)的图表，所述非禁食乳鼠在清醒情况下向腹腔内部注射生理盐水或n-3甘油三酯乳剂(0.75gn-3甘油三酯/kg体重)。*p<0.05(n＝每组3-8)。每个数据点代表3个分开实验的平均值±标准误(mean±SEM)。附图1B是示出了非禁食乳鼠(p10)在经过缺氧-缺血(H/I)后期处理为n-3甘油三酯或n-6甘油三酯或赋形剂(生理盐水)后的体内血浆血糖浓度(mg/dL)，其相对于在H/I前或H/I后之间的时间。**p<0.001(n＝每组5-9)。

附图2是示出了H/I之后n-3甘油三酯注射和脑血流量的图表。脑血流量(Cerebralbloodflow,CBF)通过对做过颈动脉结扎术的乳鼠使用激光多普勒血流测定仪(LDF)测量得到。在与身体同侧(右侧)半球的缺氧期间，使用激光多普勒血流测定仪每2分钟测量得到相对CBF。经n-3甘油三酯处理(n＝3)和生理盐水处理(n＝5)的乳鼠中响应缺氧的CBF变化被记录，该记录维持20分钟并且以前期缺氧程度百分数来表达。

附图3A-3C是示出了H/I之后老鼠脑的TTC着色冠状面且以损伤量化的图表。附图3A是示出了分别进行生理盐水处理，n-3甘油三酯处理和n-6甘油三酯处理的老鼠脑的TTC着色冠状面显微图。上面板显示了经过切片并且TTC着色(鲜活组织为灰色以及梗死组织为白色)后的冠状老鼠脑的图像，以及下面板显示了用黑色染料追踪以量化的梗死区域。附图3B是示出了进行n-3甘油三酯乳剂(n＝28)或n-6甘油三酯乳剂(n＝10)或生理盐水控制(n＝27)处理后的前期-H/I老鼠的大脑梗死体积百分数的条形图。附图3C是示出了在H/I之后进行n-3甘油三酯乳剂(n＝18)或生理盐水控制(n＝27)处理的老鼠后期-H/I治疗方案中的大脑梗死体积百分数的条形图。

附图4A-4B是示出了在H/I之后，Tri-DHA相对Tri-EPA在大脑梗死体积上的效果的图表。附图4A是示出了老鼠受15分钟缺血损害，然后进行24小时再灌注并且接受2次2剂量(0.1gn-3甘油三酯/kg和0.375gn-3甘油三酯/kg)腹腔内部给药(紧接在缺血损害和1小时的再灌注之后)的条形图。每个条代表使用相同H/I模型进行的5-7个独立实验的平均值±标准误。附图4B是示出了分别接受生理盐水，0.1gTri-DHA，0.375gTri-DHA以及0.1gTri-EPA和0.375gTri-EPA处理的老鼠脑TTC着色的冠状面的显微图。*p<0.05和除0.1gTri-DHA/kg以外的其他群组相比。**p<0.05和除0.375gTri-DHA/kg和0.375gTri-EPA/kg以外的其他群组相比。

附图5是示出了在H/I之后大脑梗死体积延迟治疗的效果的条形图。老鼠受了15分钟缺血损害然后进行了24小时的再灌注并且在4个时间点接受2次腹腔内部给药(即时[0,1小时]，延迟1小时[1，2小时]，或2小时[2,3小时]，或4个小时[4,5小时]治疗)。每个条代表5-7独立试验的平均值±标准误。*p<0.05；**p<0.001相对生理盐水(n＝每组10-20)。

附图6是示出了在H/I之后在第8个星期Tri-DHA对脑组织死亡的长期影响的条形图。老鼠受15分钟的H/I损害并且接受2次腹腔内部0.375gTri-DHA/kg(n＝6)相对生理盐水(n＝5)的给药。H/I之后第8个星期处死老鼠，将其脑用4％多聚甲醛固定并且制作10μm厚的切片加以保存。用尼氏着色方法(Nisslstaining)鉴别神经元和脑结构。如示例6的方法中所述，计算和对侧半球相关的右脑组织损失并且用百分数表示。每个条代表平均值±标准误。*p<0.05。

附图7A-7C是示出了进行n-3甘油三酯给药后活体急性心肌梗塞降低的条形图。附图7A是示出了H/I损伤之后对老鼠心脏进行n-3甘油三酯给药(右侧)和对照(左侧)的心肌梗死面积区域的减少的条形图。附图7B是示出了进行n-3甘油三酯给药(右侧)和对照(左侧)的标记心脏细胞损伤的LDH释放减少的条形图。附图7C是示出了进行n-3甘油三酯给药(右侧)和对照(左侧)的通过缩短百分数(％)表示的n-3甘油三酯给药的心脏功能的条形图。每个条代表平均值±标准误。*p<0.01。

附图8是示出了在缺血事件后，BCL-2基因表达和心脏蛋白质表达在含氧量正常(左侧)、对照(中间)和n-3甘油三酯给药后(右侧)的增加的条形图，其中BCL-2是抗凋亡的标记。每个条代表平均值±标准误。*p<0.05。

附图9是示出了如对于幼鼠(左侧)，成年鼠(中间)和新生鼠(右侧)的量化的缺氧/缺血中急性n-3TG神经保护作用的条形图。人们测量了梗死体积％并且断定和每个条形图左侧的生理盐水治疗对照组相比，每个条形图右侧的n-3TG治疗组的损伤显著减少。

附图10是示出了在H/I之后用n-3FA治疗的大脑损伤减轻的图表。注射n-3FA后，脑的不同区域在H/I之后显著地免受中风之害。

附图11A-11B是示出了在H/I之后急性n-3TG的注射降低由脑Ca2+诱发的线粒体通透性转换体(mPTP)开放的图表。线粒体功能在H/I之后和注射n-3TG之后都得以维持。

附图12是示出了活体导航记忆评估的图表。中风后8个星期，神经元功能得以维持并且在中风后初期以纯欧米茄-3triDHA治疗的老鼠中表现更好。和triEPA相比，使用triDHA结果更好。老鼠在H/I损伤之后即刻被喂食275mgtriDHA/kg以及在H/I损伤之后1个小时之后被喂食275mgtriDHA/kg。

附图13A-13B是示出了n-3DG降低H/I新生鼠的大脑损伤和梗死体积的图表。

附图14是示出了脑线粒体中DHA含量的条形图。中风后n-3TG乳剂注射之后的第4个小时，脑线粒体中DHA含量降低并且这种降低促成DHA的有益影响。注意EPA含量没有在脑线粒体内降低(没有示出数据)。

附图15是示出了在H/I后第24小时用NS(赋形剂)或NPD1(20ng)后处理的老鼠梗死体积的条形图，NPD1是DHA的分解代谢产物。

附图16是示出了活体左冠状动脉前降支(Leftanteriordescendingcoronaryartery,LAD)阻断模型的图表。

附图17是显示n-3TG降低线粒体内的活性氧簇生成的曲线图。

在对本发明的实施例进行描述前，可理解的是本发明不限定于特定的过程，组分，或描述的方法，因为它们是可变化的。说明书中所用的术语仅为了达到描述特定变型或实施例的目的，其意不在限制本发明的范围。除非另有定义，此处所使用的所有技术和科学术语具有所属技术领域的技术人员所普遍理解的意义。虽然和此处描述的任何相似或相等的方法和材料可用于本发明的实施例的实施或测试，现在还是要对优选的方法，设备以及材料进行描述。此处所提及的所有出版物的全部内容通过引用而并入。此处没有任何被解释为本发明不具有先于这些借助在先发明的公开的资格的承认。

具体实施方式

在下述说明中，为了解释的目的，提出了大量的具体细节以提供对本发明进行全面的理解。但是对于本领域的技术人员来说，显而易见地本发明不用这些具体细节也可实施。

定义

除非另有定义，此处所使用的所有技术和科学术语具有所属技术领域的技术人员所普遍理解的意义。虽然和此处描述的任何相似或相等的方法和材料可用于本发明的实施例的实施或测试，现在还是要对优选的方法，设备以及材料进行描述。此处所提及的所有出版物的全部内容通过引用而并入以公开和描述和所引用的出版物相关的方法和/或材料。

通常，此处描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学、蛋白质、核酸化学以及杂交技术相关的术语是本领域技术人员所熟知并且普遍使用的。本发明的方法和技术一般根据本发明所熟知的并且在各种普通和更加具体的除非另有所指通过本发明引用和描述的参考文献常规方法而实施。例如，参见Sambrook等人，分子克隆(MolecularCloning)；实验室手册，第二版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，N.Y.(1989)；Ausubel等人，分子生物学实验室指南(CurrentProtocolsinMolecularBiology)，格林尼出版公司(1992,并且于2002增补)；Harlow和Lan，抗体(Antibodies)：实验室手册，冷泉港实验室出版社，冷泉港，N.Y.(1990)；神经学原理(PrinciplesofNeuralScience)，第四版，EricR.Kandel,JamesH.Schwart,ThomasM.Jessell编辑。McGraw-Hill/Appleton&Lange:纽约,N.(2000)。

如此处所用的“以欧米茄-3脂质为基础的乳剂”是包括至少10％的欧米茄-3油(可多达100％欧米茄-3油)的水包油乳剂。优选地，所述以欧米茄-3脂质为基础的乳剂包括至少20％-35％的欧米茄-3油。

如此处所用的“欧米茄-3油”意指任何欧米茄-3脂肪酸，包括游离欧米茄-3脂肪酸和欧米茄-3甘油三酯，甘油二酯和甘油单酯。

术语“欧米茄-3脂肪酸”意指其中碳碳双键之一位于所述脂肪酸的碳氢侧链末端的第三和第四个碳原子之间的多元不饱和脂肪酸。“欧米茄-3脂肪酸”的例子包括α－亚麻酸(18:3n-3；α-ALA；Δ^3,6,9)，二十碳五烯酸(20:5n-3；EPA；Δ^5,8,11,14,17)，二十二碳六烯酸(22:6n-3；DHA)以及二十二碳五烯酸(22:5n-3；DPA；Δ^{7,10,13,16,19})，其中EPA和DHA是最优选的。包括至少20个碳原子的欧米茄-3脂肪酸此处被称为“长链欧米茄-3脂肪酸”。

术语“欧米茄-3甘油三酯”或“欧米茄-3甘油二酯”或“欧米茄-3甘油单酯”分别地意指甘油三酯或甘油二酯或甘油单酯。如此处所用，术语“欧米茄-3甘油三/二酯”意指包括欧米茄-3甘油三酯和/或甘油二酯或它们的混合物的欧米茄-3脂肪酸。

在以脂质为基础的水包油乳剂中的欧米茄-3油或欧米茄-6油的量以每100mL乳剂中欧米茄-3油或欧米茄-6油以g为单位的重量比表示。

在欧米茄-3油或欧米茄-6油中甘油酯(单，二或三甘油)的量按甘油酯相对欧米茄-3油或欧米茄-6油的总重量的重量百分数表示。

诸如EPA或DHA的脂肪酸在甘油酯(单，二或三甘油)中的量按相应甘油酯的酰基的重量百分数(wt.％)表示。

如此处所用，缺氧意指体内或特定器官或组织的氧气短缺。

如此处所用，缺血意指不足以提供充足氧化反应的血流量。缺血最常见的原因是急性动脉血栓的形成，供血动脉的慢性收缩(变窄)时常是由动脉粥样硬化疾病和动脉血管痉挛引起。当流到器官的血流量减少时，氧提取率增加。当组织不能提取足够氧气时，组织内的氧气分压降低(缺氧)导致线粒体呼吸和氧化代谢的降低。并且，在许多器官缺血-缺氧的急性情况下(例如中风、心肌梗死、肠扭转等等)，患者病情过于严重以至于不能服用治疗剂和进行肠内给药，因而需要肠胃外注射，例如立即注射脂质乳化剂。

如此处所用，缺氧-缺血意指在组织或器官中同时出现缺氧和缺血。

如此处所用，再灌注损害或再灌注损伤意指在对缺氧-缺血(H/I)组织恢复血液供应时所导致的损害。再灌注损伤比初期缺血会更具有危害性。再引入血流将氧气带回组织，会导致大量损害细胞的自由基和活性氧物种的生成。它也给组织带来更多的钙离子进一步导致细胞钙超载并且导致潜在致命心肌梗死或心脏病发作，也会加速细胞自杀。恢复的血流也增加了损害组织的炎性反应，导致白细胞摧毁原本可存活的受损害细胞。参见Sims,N.R.；Muyderman,H.,中风中的线粒体、氧化代谢和细胞死亡(Mitochondria,oxidativemetabolismandcelldeathinstroke)，生物化学和生物物理学学报，2010年1月，1802(1):80-91。Epub2009年9月12号。文献服务检索系统PMID号19751827。

虽然不希望被理论所约束，人们相信器官死亡或损伤经常由缺氧-缺血促成，或和其相关的再灌注损伤、心脏梗死、器官移植、内皮功能紊乱、受损器官微量灌注、增加形成血栓的风险或异常脂肪堆积等促成。异常脂肪堆积时常出现在不专门用来堆积脂肪的器官，例如肝脏、胰腺或心脏。

通常手术后和受伤后以及像脓毒症那样严重的情况，有以下特征：由免疫系统缺陷再灌注综合征的大量刺激和形成血栓的倾向。免疫反应通过促炎性细胞因子(例如肿瘤坏死因子和白介素)的释放而激活，当促炎性细胞因子处于较高水平时会导致严重的组织损害。

在这样的临床情况下，提供比内源脂质更快水解和排出的(防止血浆甘油三酯浓度的过度增加)外源脂质尤其重要。这些脂质供给能够降低组织内细胞因子生成以及细胞因子毒性作用的欧米茄-3脂肪酸。因此，脂肪酸通过诸如甘油三酯的脂质甘油酯得以最佳给药方式。脂肪酸在体内脂质经由脂解作用代谢后释放和利用。当脂肪酸从脂质分子裂解然后并入(以游离形式或作为磷脂质的组分)细胞膜并且在细胞膜内影响膜结构和细胞功能时，用作第二信使(由此影响细胞代谢的管理)，影响细胞核转录因子的调控，以及作为二十烷类的前体。因此，希望该过程尽可能快地进行。

人类身体能够合成某些脂肪酸。但是，长链欧米茄-3和欧米茄-6指定为“必要”脂肪酸，因为它们不能被人体所生成并且必须靠其他来源获得。例如来自冷水性鱼的鱼油具有含量高的欧米茄-3多元不饱和脂肪酸，以及含量较低的欧米茄-6脂肪酸。表1由n-3Tri-DHA油的生产商费森尤斯卡比公司提供，并且表1描述了此处示例6和7所描述的一些试验使用的n-3Tri-DHA的组成。表1估计(在第2列)n-3鱼油包括1-7％范围的以gm/100mL为单位的亚麻酸(C18:2n-6)和1-4％花生四烯酸(C20:4n-6)，理论上它们一起具有的上限值为11％。但是，迄今为止，没有报道称鱼油有10％以上的欧米茄-6脂肪酸。本发明的甘油二和三酯欧米茄-3乳剂从鱼油制备而来，采用具有10％或更少的欧米茄-6脂肪酸的鱼油。大多数植物油(例如大豆和红花)具有含量高的欧米茄-6多元不饱和脂肪酸(大多数以18:2(Δ^9,12)-亚麻油的形式存在)而含量较低的欧米茄-3脂肪酸(主要是18:3(Δ^9,12,15)-α-亚麻酸)。

必要脂肪酸通过饮食或其他肠内或肠胃外给药获得。但是口服补充后，EPA和DHA欧米茄-3脂肪酸富集速率实际上在不同组织间不同并且当作为必要脂肪酸前体和α-亚麻酸供给时，其在脑和视网膜的特定区域中尤其低。而且，人类对欧米茄-3脂肪酸的消耗在过去的30年降低了，但是对欧米茄-6脂肪酸的消耗增加了，在西方人群中尤其如此。

Cao等人，“二十二碳六烯酸乙酯的慢性给药降低缺氧沙鼠的死亡率和脑水肿(Chronicadministrationofethyldocosahexaenoatedecreasesmortalityandcerebraledemainischemicgerbils)”，生命科学(LifeSci.)，2005年11月19日；74-81宣称膳食二十二碳六烯酸(DHA)摄取量能够降低细胞膜的花生四烯酸(AA)的水平，花生四烯酸(AA)在脑缺氧时释放并且和脑损害的发病原理有牵连。Cao研究了慢性二十二碳六烯酸乙酯给药对死亡率和由沙鼠短暂性脑缺血诱导的脑水肿的影响。

GB2388026,全部内容通过引用并入本文，意指使用n-3多元不饱和脂肪酸EPA和/或DHA在口服药剂的制备中，该口服药剂防止在患有供给脑的动脉粥样硬化的患者中的脑损害。

StrokinM,神经科学(Neuroscience)，2006年6月30日；140(2):547-53,全部内容通过引用并入本文，研究了脑磷脂中二十二碳六烯酸(22:6n-3)对神经元存活的作用。

WO2004/028470(PCT/US2003/030484),全部内容通过引用并入本文，意在公开阻碍和临床型炎症相关疾病的发生和发展的方法和组分。

下述美国申请如全部在本文提出的那样由此通过引用并入本文：临时申请专利号60/735862,2005年11月14日提交；临时申请专利号60/799677,2006年5月12日提交；临时申请专利号11/558568,2006年11月10日提交；PCT美国专利号06/60777,2006年11月10号提交；申请号13/336290,2011年12月23号提交；临时申请号60/845518,2006年9月19号提交；PCT美国专利号07/20364,2007年9月19号提交；申请号16/441795,2009年12月8号提交，现为美国专利号9410181；申请号13/783779,2013年3月4号提交；申请号13/953718,2013年7月29号提交；以及申请号14/102146,2003年12月10号提交。

也可参见Qi,K.(2002)“欧米茄-3甘油三酯修饰脂质乳剂的血液清除率和组织靶向通道(Omega-3triglyceridesmodifybloodclearanceandtissuetargetingpathwaysoflipidemulsions)”，生物化学(Biochemistry)，41:3119-3127,全部内容通过引用并入本文，意指公认为在许多生理和病理条件中有调控作用的富含欧米茄-3的甘油三酯。

现在人们已经确认足够时间的脑缺氧-缺血会耗尽神经细胞的高能量储存并由此在再灌注的几个小时到几天之后诱导一系列事件，最终引致大量的坏死和凋亡的死亡。这些事件包括产生活性氧簇和对细胞的氧化损害、释放炎性介质、诱导延长的炎症反应以及不断进行的持续几个星期到几个月的细胞凋亡。这个可应用到幼年、成年和老年人的器官的缺血损伤。

作为示例，人们相信缺氧/缺血后的神经元缺失至少部分地由谷氨酸酯的加速释放和兴奋性神经毒性导致。N-甲基-D-冬氨酸(NMDA)受体过量的谷氨酸盐活化作用会诱导前细胞凋亡通道并且抑制反细胞凋亡信号通道。欧米茄-3脂肪酸能够修饰多个信号通道以影响转录调控。不受理论约束，因为本发明的发明人进行的前期研究表明整个脑的脂肪酸情况在欧米茄-3甘油三酯乳剂的急性给药后没有得到改善，人们相信欧米茄-3脂肪酸通过以下方式保护神经元：调控信号通道来对抗因高度亢奋NMDA受体所造成的效果；防止生成自由基以及随后的氧化损害；维持线粒体功能并由此防止/减少后缺血炎症和炎症介质的释放。

最近研究(参考QiK,SeoT,Al-HaideriM,WorgallTS,VogelT等人，(2002)欧米茄-3甘油三酯修饰脂质乳剂的血液清除率和组织靶向通道。生物化学41:3119-3127)也表明鱼油欧米茄甘油三酯的血液清除率和组织摄取的通道和欧米茄-6豆油长链三聚甘油(LCT)非常不同。例如，欧米茄-3超长链三聚甘油(VLCT)乳剂从血液的移除和LCT乳剂相比似乎更少依赖血管内的脂解作用。虽然大量的两种乳剂以完整的甘油三酯的形式输送到组织，这个通道似乎对欧米茄-3甘油三酯微粒更加重要。欧米茄-3甘油三酯微粒，VLCT比LCT更少依赖于和“典型”脂蛋白受体相关的清除通道。由欧米茄-3甘油三酯得到的脂肪酸在参与甘油三酯和胆固醇合成的依赖固醇调控因子(SRE)基因的基因表达中似乎比LCT充当更强的抑制剂。

本发明提供了限制或防止由缺氧-缺血导致的细胞凋亡和细胞/组织损害的方法。此处所用的“限制”包括降低和/或防止。治疗缺血的效果之一就是细胞死亡降低、炎症减少、梗死面积减少、炎性因子的生成减少、活性氧簇的生成减少以及维持线粒体的完整性。本发明的方法包括在缺氧-缺血损害后，施用本发明的以欧米茄-3脂质为基础的乳剂。在缺氧-缺血损害可被预测的那些情况下，本发明也提供了限制或防止细胞凋亡和细胞/组织损害的方法，所述方法包括在缺氧-缺血损害前，施用本发明的以欧米茄-3脂质为基础的乳剂。

当脑受到缺氧-缺血损害时，本发明限制了神经细胞死亡和/或限制了神经性损害。因为缺氧-缺血损害后的缺血，随后的细胞死亡的基本原理在大多数肉体器官中是相似的，本发明也提供了在缺氧-缺血损害后，限制诸如心脏、大肠和小肠、肾和肺的其他器官的细胞死亡。例如，由于急性肠系膜动脉缺血、慢性肠系膜动脉缺血导致的结肠缺血事件或由肠系膜静脉血栓形成导致的缺血之后，本发明提供了限制肠道细胞死亡的方法。防止细胞死亡的类似方法会用于心肌梗死(参见附图7)。

前期研究表明诸如欧米茄-6亚油酸的欧米茄-6脂肪酸当在缺血事件前给药时，在神经保护作用和心肌保护方面的效果较少。这些研究涉及 (Intralipid)的给药，是包含55％如欧米茄-6亚油酸的脂肪酸以及低含量EPA和DHA(～2％)的以豆油为基础的乳剂。而且，直接注射游离脂肪酸，和甘油三酯和甘油二酯相比，会产生严重的副作用，例如脑病。

因此，本发明的一些方法包括施用以欧米茄-3脂质为基础的乳剂，该乳剂包括至少10％，优选地至少20％(高达100％)按重量计的欧米茄-3油。优选地，所述欧米茄-3油包括至少10％、优选地至少20％(高达100％)的欧米茄-3甘油三/二酯。所述欧米茄-3甘油三/二酯中的脂肪酸优选地包括至少40％(高达100％)的EPA和/或DHA。本发明乳剂中的欧米茄-3油的欧米茄-6油少于10％、优选地少于5％。

以甘油三酯DHA欧米茄-3脂质为基础的水包油乳剂

其他实施例涉及以甘油三酯DHA欧米茄-3脂质为基础的水包油乳剂(n-3Tri-DHA乳剂)以及它们在治疗H/I和包括器官移植在内的再灌注损伤的治疗用途。示例7所描述的结果显示在H/I后施用n-3Tri-DHA乳剂(表1)对脑梗死和再灌注损伤有神经保护作用。这些结果在Williams(参见WilliamsJJ,MayurasakornK,VannucciSJ,MastropietroC,BazanNG等人。(2013)富含N-3脂肪酸的甘油三酯乳剂在新生鼠脑缺氧-缺血损伤后具有神经保护作用。公共科学图书馆8(2):e56233.doi:10.1371/journal.pone.0056233)中有所描述并且在此概括。使用了包括以欧米茄-3(n-3)甘油三酯鱼油为基础的和欧米茄-6(n-6)甘油三酯在内的四种不同类型的脂质乳剂。

脑缺氧-缺血

术语“本发明的以欧米茄-3脂质为基础的乳剂”此处通常包括已经描述的n-3Tri-DHA乳剂。示例7所描述的结果表明在H/I后施用以甘油三酯DHA欧米茄-3脂质为基础的水包油乳剂(n-3Tri-DHA乳剂)(表1)对脑梗死和再灌注损伤具有神经保护作用。这些结果在WilliamsJJ,MayurasakornK,VannucciSJ,MastropietroC,BazanNG等人.。(2013)富含N-3脂肪酸的甘油三酯乳剂在新生鼠脑缺氧-缺血损伤后具有神经保护作用。PLoSONE8(2):e56233.doi:10.1371/journal.pone.0056233中有所描述并且在此概括。使用了包括以欧米茄-3(n-3)甘油三酯鱼油为基础的和以欧米茄-6(n-6)甘油三酯豆油为基础的乳剂在内的四种不同类型的脂质乳剂，所述以欧米茄-3(n-3)甘油三酯鱼油为基础的和以欧米茄-6(n-6)甘油三酯豆油为基础的乳剂是商用静脉注射的磷脂稳定乳剂。在示例6和7以及附图7-16中，欧米茄-3Tri-DHA乳剂指的是“n-3TG”乳剂并且它们包括按g/100mL乳剂的重量比计算的10％欧米茄-3鱼油(n-3)，其中欧米茄-3油按欧米茄-3油总重量计算为>90％的甘油三酯(TG)，并且其中甘油三酯的约30％以重量百分比计的酰基为DHA以及多达约28％为EPA。这些n-3TG乳剂也被称为n-3TG90-DHA30乳剂。其他包含纯(99％)DHA或纯(99％)EPA的乳剂也如前所述接受检验。

不包括DHA或EPA(表1)的n-6TG乳剂也接受检验。这些乳剂具有按g/100mL乳剂的重量比计算的20％的欧米茄-6油(n-6)、0％DHA、0％EPA以及来自亚油酸的按欧米茄-3油总重量计算约55％的甘油三酯。所述n-6TG乳剂从富集n-6FA的大豆油生产，当中约55％的总FA由亚油酸构成。

在H/I之前给药时和在H/I之后立即给药时，用n-3TG90-DHA30乳剂的治疗显著地降低了总体梗死体积。

通过腹腔内部注射n-3TG90-DHA30，在注射1.5小时后，血液TG水平相比基线提升到高于三倍；然后由于血流中的n-3TG90-DHA30代谢导致在3-5小时(附图1A)，血液TG的水平降落到基线。在H/I后，确定在用n-3TG治疗相对用n-36TG治疗以及相对生理盐水对照(附图1B)而言，血糖水平没有不同。并且和生理盐水对照组相比，没有观察到n-3TG在治疗老鼠的毛细血管出血次数中存有差异；在H/I后，n-3TG90-DHA30没有改变脑血流量。

如脑皮质层下的区域所证明的那样(附图3A)，是n-3TG90-DHA30而非n-6TG乳剂防止脑遭受H/I损伤，其中在n-3TG治疗老鼠中梗死体积极大地降低，但在n-6TG乳剂注射中，梗死体积显着增加。在H/I之后立即用n-3TG90-DHA30治疗的总梗死面积几乎减少了50％。附图3B。

在H/I之后是n-3TriDHA而非n-3TriEPA具有神经保护作用。和生理盐水对照组相比，用99％纯n-3Tri-DHA的0.1gTG/kg和0.375gTG/kg治疗的总梗死面积分别降低到为48％和55％的平均值。附图4A-4B。但是，和生理盐水处理相比，没有观察到用99％纯n-3Tri-EPA治疗的神经保护作用。给药时间也很重要。和对照组相比，在H/I后延迟4小时施用n-3TG90-DHA30时，没有看到保护效应。附图5。但是，当在H/I后0小时立即施用n-3TG90-DHA30，然后在中风后1小时，2小时再次施用n-3TG90-DHA30，和对照组相比，观察到相似的脑梗死体积的减少。

成年鼠的冠状脑部分用尼氏着色处理(附图6)以检验H/I的效果和TG90-DHA30治疗作为在H/I损害8星期后的长期结果的大脑和神经细胞损失的效果。和左侧对照组(对侧半球)相比，右侧半球收损伤面积表现出明显的神经细胞损失。附图6显示和TG90-DHA30治疗的老鼠(n＝6)相比，脑组织损失在生理盐水处理的老鼠(n＝5)的右侧半球增加了1.67倍，分别为25.0+/-2.4％对15.0+/-2.5％，(p＝0.02)。因此，人们在H/I后24小时观察到的损伤后以及注射TG90-DHA30的神经保护作用可在最初中风损害后差不多2个月后在组织结构上得以证明。

进行除了示例6和7之外的额外试验以研究施用治疗脑缺氧-缺血的n-3TG[n-3TG90-DHA30]乳剂的效果，其效果在附图9-15显示出来。如示例6般采用和处理动物。TTC着色显示在包括幼年鼠，成年鼠和新生鼠在内的三组不同啮齿动物模型中，腹腔内部注射(附图9)后脑梗死面积降低。每次注射中每个老鼠施用15mgDHA，或大约500mgDHA/Kg。

附图10显示n-3TG90-DHA30在缺氧/缺血后减弱了脑损伤。使用示例7中的方案，显示出注射n-3TG90-DHA30在缺氧/缺血后可显著地防止脑不同区域遭受中风损伤。每次注射时，给每个老鼠施用大约15mgDHA，或大约500mgDHA/Kg。其他未发表的数据显示n-3TG90-DHA30也能减少缺氧/缺血24小时后3-硝基诺氨酸蛋白质(3-nitrotyrosineprotein)氧化作用以及4-羟基壬烯酸脂质(4-hydroxynonenallipid)过氧化作用。

附图11显示在缺氧/缺血后腹腔内注射n-3TG90-DHA30会减少梗死体积，该梗死体积和保持线粒体膜的完整性相关，这通过通常出现在缺氧/缺血后未治疗的动物中的大脑Ca2+诱发的线粒体通透性转换体(mPTP)开放的减少佐证。每次注射时，给每个老鼠施用大约15mgDHA，或大约500mgDHA/Kg。

在下一个试验中，施用纯DHA或纯EPA欧米茄-3甘油三酯乳剂以测试记忆和神经功能。在老鼠被施以缺氧/缺血而引致中风后的8个星期，对老鼠进行导航记忆评估，该导航记忆作为神经菜单征。接着对老鼠施以包括100％DHA(纯DHA)的n-3甘油三酯或包括100％EPA(纯EPA)的n-3甘油三酯的治疗。在最初损伤的8个星期后，水迷宫试验(water-maze)测试周期中的第3天记录导航记忆，而在测试中移走平台。附图12A显示每个象限耗费的时间。附图12B显示老鼠在每个象限中游动的距离：a，p<0.05相对于未做任何处理；b，p<0.05相对于生理盐水。结果显示导航记忆和神经保护作用在用具有纯(99％)DHA的n-3TG治疗两次(缺氧-缺血之后立即和1小时之后)的老鼠中得以维持并且实际上显著增强。意外的是，人们发现虽然EPA似乎没有有毒影响，用具有纯DHA的n-3TG治疗比用具有EPA的n-3TG治疗的神经功能结果显著更好。在缺氧-缺血损伤之后立即和1个小时后，进行测试之前的8个星期，给老鼠施用375mgn-3TG99％DHA或99％EPA/Kg。

附图13显示n-3TG和n-3DG(甘油二酯)乳剂都能减少脑梗死面积。

附图14图示分离脑线粒体的DHA含量。这些数据显示在由缺氧-缺血引起的中风后注射n-3TG90-DHA30的4个小时后，脑线粒体的DHA含量增加了。人们推测这种增加可能促成DHA的有益影响。要注意的是脑线粒体的EPA含量没有增加(没有示出数据)。每次注射时，给每个老鼠施用大约15mgDHA，或大约500mgDHA/Kg。

附图15显示在缺氧/缺血后的第24小时，在经神经保护素D1(NPD1)(20ng)后期治疗过的老鼠中，老鼠的脑梗死面积降低，当中神经保护素D1(NPD1)是DHA的代谢产物，并且神经保护素D1(NPD1)(20ng)后期治疗与和用生理盐水赋形剂治疗的效果截然相反。另外，DHA的这种产物也能够在分离的、暴露在高浓度氧或老鼠的缺血损伤之后的线粒体中，维持接近脑线粒体的渗透性。注意虽然NPD1确实有有益效果，其效果不如用含有纯(99％)DHA的欧米茄-3甘油三酯乳剂的治疗有效。NPD1剂量是每个老鼠20纳克。

心脏缺氧/缺血

人们也研究了心脏缺氧/缺血后给动物施用n-3TG90-DHA30欧米茄-3甘油三酯乳剂的效果(示例9)。总括而言，附图7显示缺氧/缺血后急性腹腔内部注射n-3TG乳剂(表1；n-3TG90-DHA30)降低了老鼠心脏的梗死面积；作为心脏细胞损害标记的LDH释放减少，如超声波心动图更加正常所显示的，也维持了心脏功能。Bcl-2(B-细胞淋巴瘤2),通过BCL2基因在人体内编码，是调控细胞死亡(细胞凋亡)调控蛋白质的Bcl-2家系的创建成员并且它尤其被认为是重要的抗凋亡蛋白质，因而可被分类为致癌基因。附图9显示在未经治疗动物的心肌梗死后Bcl-2升高了，但在人们在用n-3TG治疗的动物中的含氧量正常条件下观察到的Bcl-2水平增加得更快(高达约3.5倍)。

本发明的包含n-3Tri-DHA的乳剂和治疗H/I的方法的实施例

根据显示脑和心脏缺氧-缺血以及再灌注损伤的有效治疗的这些观察，特定实施例涉及以n-3Tri-DHA脂质为基础的水包油乳剂，其中：(a)所述乳剂包括按g/100mL乳剂的重量比计算的至少7％到大约35％欧米茄-3油和少于10％的欧米茄-6油；(b)所述欧米茄-3油包括按欧米茄-3油总重量计算的至少20％到100％甘油三酯，和至少20％wt.-％到100％的欧米茄-3甘油三酯的酰基是由DHA组成；(c)所述欧米茄-3油包括少于10％的欧米茄-6脂肪酸；以及(d)乳剂中的脂质微滴的平均直径少于大约5微米。

在特定的实施例中，所述欧米茄-3油组分包括按g/100mL乳剂的重量比计算的10％、20％、30％或35％乳剂；本发明所述的n-3Tri-DHA油中的所述甘油三酯组按欧米茄-3油总重量计算为20-50％、50-75％、75-90％、90-95％和95％-100％；并且所述欧米茄-3甘油三酯的DHA含量是从20-50％、50-75％、75-90％、90-95％和95％-100％wt.％的TG的酰基。重要的是应该注意不必为了治疗缺氧/缺血而在这些欧米茄-3乳剂中排除EPA或甘油三酯。对于具有纯DHA的TG来说，EPA会被排除。对于n-3TG-DHA乳剂，需要具有至少20％甘油三酯的欧米茄-3油以治疗缺氧/缺血和再灌注损伤，而当中至少20％的甘油三酯为DHA。

其他实施例包括分别治疗H/I损伤和再灌注损伤的方法，当中损伤包括任何脑或心脏H/I的损伤，所述脑或心脏H/I的损伤包括中风和心肌梗死；也包括在进行移植之前或移植之后处理在器官或组织里的H/I以将细胞死亡和细胞损害降低到最小的方法。在一些实施例中，所述方法包括(a)鉴选经历过缺氧-缺血的主体，以及(b)给所述主体施用药物组合物以降低由缺氧-缺血引起的再灌注损伤，所述药物组合物包括本发明所描述的n-3Tri-DHA油的有效治疗量。在一些实施例中，所述脑缺氧-缺血导致包括中风的缺氧-缺血症状，并且所述的n-3Tri-DHA乳剂在缺氧-缺血后尽快给药，例如20分钟内，或在H/I后少于1个小时、少于2小时、少于3小时和少于4小时以及在一些实施例中少于6个小时。在一些实施例中，所述缺氧-缺血发生在心脏并且会导致心肌梗死。相同的，心脏缺氧-缺血诊断后尽快治疗为最佳的，以减少再灌注损伤。在一些实施例中，施用所述的n-3Tri-DHA乳剂以便在组织或器官进行器官移植后或包括选自于由脑、心脏、肾、脊髓、大肠或小肠、胰腺和肺所构成组的器官的器官中缺氧-缺血之前降低细胞损害或细胞死亡。

在一些实施例中，有效治疗量为从大约为每次0.2g/kg给药到大约每次4g/kg给药，但如果在危机时刻，则可施用更高剂量，因为所述乳剂为非毒性的。在一些情况下，本发明的包括n-3DG和n-3TG乳剂的欧米茄-3乳剂可在H/I后的一段时间内连续施用。

其他的实施例包括一种方法，所述方法包括：(a)鉴选有脑缺氧-缺血风险的主体，以及(b)给所述主体施用药物组合物，所述药物组合物包括所述n-3Tri-DHA乳剂的有效治疗量，从而降低主体发展成再灌注损伤的风险，所述再灌注损伤由缺氧-缺血导致。具有发展脑H/I和心脏H/I风险的主体在其发展成H/I之前经常能够被鉴定出来；这样的主体在本发明的治疗范围之内。另一种方法包括：(a)鉴选具有器官炎症的主体，以及(b)给所述主体施用药物组合物，所述药物组合物包括所述n-3Tri-DHA乳剂的有效治疗量，从而减轻主体的炎症。另一种方法包括给主体施用一定量的药物组合物，所述药物组合物包括所述的n-3Tri-DHA乳剂以降低主体血液内或器官内的活性氧簇或炎症影响因子的生成。

欧米茄-3脂肪酸的来源可为诸如来自鱼油、其他油或可合成的油的任何合适的来源。虽然EPA和DHA是优选的欧米茄-3脂肪酸，也可用其他欧米茄-3脂肪酸。合适的典型鱼油包括来自诸如大马哈鱼、沙丁鱼、马鲛鱼、青鱼、凤尾鱼、香鱼和箭鱼的冷水性鱼的油。鱼油通常包括链长为12到22个碳的脂肪酸的甘油酯。根据由气相色谱分析(面积分数)确定的所述鱼油浓缩液的脂肪酸甲酯，获得的诸如来自沙丁鱼、大马哈鱼、青鱼和/或马鲛鱼的油的高纯鱼油浓缩物的二十碳五烯酸(EPA)含量为从大约20到40wt.-％，优选为至少为25wt.-％,以及二十二碳六烯酸(DHA)大于10％,优选为至少12％。美国专利号6,159,523，其全部内容通过引用并入本文，公开了制备鱼油浓缩物的方法。通常，自然鱼油里的欧米茄-6系列(诸如亚油酸)的多元不饱和脂肪酸的量较低，例如少于10％，优选地少于5％。在本发明的实施例中所采用的所述n-3Tri-DHA乳剂中，欧米茄-6油的量少于10％，优选地少于5％。欧米茄-6油在鱼油中的量也少于10％。为了制备具有多于大约25wt.％的高重量百分数DHA的n-3TG，所述油通常是合成的。

本发明优选的方法包括通过包括肠内(例如，口胃和鼻间的)或肠胃外(例如皮下、静脉、肌肉或腹膜内)在内的任何适合的路径施用包括本发明的欧米茄-3乳剂，其包括所述n-3Tri-DHA乳剂。最优选的,所述乳剂为静脉注射施用。

本发明的以欧米茄-3脂质为基础的乳剂优选为以能够提供保护效益的剂量施用。所属领域的技术人员根据此处陈述的试验数据可决定适合的剂量。但是，例如对人类来说，适合的有效并且可承受的剂量为大约0.05g/kg到大约4g/kg。必要时会给予更高剂量。给药可能是连续的或是每天一个或几个剂量的形式。所属领域的技术人员根据将要治疗的特定主体和条件可理解给药的合适剂量和路径。

本发明的以欧米茄-3脂质为基础的乳剂优选为在缺血损害后尽快(或在一些实施例中，在可预期的损害之前)在肠胃外和/或肠内给药。在缺氧-缺血后，施用所述乳剂以防止/降低源于再灌注损伤的组织损害和细胞死亡，所述再灌注损伤源自在包括脑、心脏、肾、脊髓、大肠或小肠、胰腺和肺的任何器官中的器官移植。例如，在优选实施例中，在损害后的0-20分钟到2个小时之内施用以欧米茄-3脂质为基础的乳剂。在一些实施例中，在损害后的1小时、2-3小时和3-4小时以及少于6个小时内施用所述乳剂。本发明也提供了同一天内多次施用以欧米茄-3脂质为基础的乳剂或甚至连续的给药，因为这些乳剂是无毒的。常规的试验会决定对所述损伤的最佳剂量。例如，所述乳剂可在所述损害的20分钟内首次给药，然后在所述损害的1-24小时后第二次给药。对脑H/I，所述n-3Tri-DHA乳剂给药最佳为4个小时内。

本发明的另一个实施例中，限制或防止由缺氧-缺血导致的细胞死亡和细胞/组织损害的方法还包括施用包括本发明的以欧米茄-3脂质为基础的乳剂，其包括所述n-3Tri-DHA乳剂，连同标准可用的治疗方法(例如手术和血管成形术)和/或防止或治疗缺氧-缺血的药物。例如，经常施用下述药物以防止或治疗中风：诸如阿司匹林(aspirin)、克拉匹多(clopidogrel)、潘生丁(dipyridamole)和噻氯匹定(ticlopidine)的抗血小板药物；诸如肝磷脂(heparin)和杀鼠灵(warfarin)的抗凝剂；以及诸如组织纤溶酶原激活物(tissueplasminogenactivator)的血栓溶解剂。

制备以脂质为基础的适合静脉注射的乳剂是本领域的技术人员所熟知的。根据本发明的以欧米茄-3脂质为基础的乳剂可为水包油(o/w)乳剂，其中外部连续相由为肠胃外施用目的纯化过或杀菌过的蒸馏水组成。这种水包油乳剂可通过标准方法获得，例如通过混合油性组分然后进行乳化和杀菌。所述脂质乳剂的pH值可调节为生理可接受的值，优选为从大约6.0到大约9.0的pH，更优选为从大约6.5到大约8.5。辅助剂和添加剂可在乳化和杀菌之前加入到所述油性混合物。所述欧米茄-3乳剂优选为等渗的。制备乳剂的方法为本领域所熟知的并且例如在Kirk-Othmer,化学技术百科全书(EncyclopediaofChemicalTechnology),第三版,v.8,pp.900-933(1979)的示例中有所描述。也参见专利号为2977283；3169094；4101673；4563354；4784845；4816247的美国专利，它们所有的全部内容通过引用并入本文。

根据本发明的以欧米茄-3脂质为基础的乳剂可使用具有惰化程序的熟知的标准程序来制备。通常，首先混合脂质、乳化剂以及其他辅助剂和添加剂，然后通过分散用水填满。水可任选的包含额外的水溶性组分(例如甘油)。本发明的欧米茄-3乳剂含有直径小于5微米的脂质微滴。优选地，本发明的以欧米茄-3脂质为基础的乳剂包含直径大约在100-400纳米的脂质微滴，平均尺寸为300纳米。对肠胃外给药，中等的脂质微滴尺寸可少于约1微米并且优选在大约100-500纳米的范围内，更优选在大约100到约400纳米的范围内，最优选在大约200纳米到大约350纳米的范围内。对其他给药，例如经皮给药，脂质微滴的平均直径可更大，例如，从约1微米到5微米。

本发明也提供了适合于肠内或肠胃外给药的以欧米茄-3脂质为基础的乳剂，以在缺氧-缺血损害后提供细胞对抗细胞死亡的防护效应。本发明的以欧米茄-3脂质为基础的乳剂包括至少10％，优选地至少20％(高达100％)的以重量计的欧米茄-3油，优选地包括按g/100mL乳剂的重量比计算的7％至约35％的欧米茄-3油。优选地，所述欧米茄-3油包括至少10％，优选的至少20％(高达100％)的欧米茄-3甘油三/二酯。所述欧米茄-3甘油三/二酯内的脂肪酸优选地包括至少40％(高达100％)EPA和/或DHA。所述以欧米茄-3脂质为基础的乳剂优选包括10％-100％的欧米茄-3甘油三/二酯。在优选的实施例中，所述欧米茄-3甘油三/二酯包括至少40％(高达100％)的为EPA和/或DHA的脂肪酸。优选地，本发明的欧米茄-3乳剂是无菌的，并且其颗粒大小的平均直径优选地在100-400纳米之间，平均尺寸为300nm。对于所述n-3Tri-DHA乳剂，所述欧米茄-3油包括按欧米茄-3油总重量计算的至少20％到高达100％的甘油三酯，而且至少20％wt.-％到100％的欧米茄-3甘油三酯的酰基由DHA组成。

药物制剂

术语“以欧米茄-3脂质为基础的乳剂”通常包括所述n-3Tri-DHA乳剂。本发明施用的以欧米茄-3脂质为基础的乳剂，包括所述n-3Tri-DHA乳剂，可肠内、肠胃外施用或经皮注射。施用所述以欧米茄-3脂质为基础的乳剂的方法还包括额外施用其他常规中风治疗或预防性药物。

本发明的所述以欧米茄-3脂质为基础的乳剂可包括大约2wt.-％到大约5wt.-％的稳定或等渗添加剂，例如以乳剂为基础的多元醇。优选的稳定或等渗添加剂包括甘油、山梨糖醇、木糖醇或葡萄糖。甘油是最优选的。

除了蒸馏水，本发明的所述以欧米茄-3脂质为基础的乳剂包括常规的辅助剂和/或添加剂，例如乳化剂、乳化助剂(共乳化剂)、稳定剂、抗氧化剂和等渗添加剂。

乳化剂可包括诸如源自动物或植物的磷脂质的生理可接受的乳化剂(表面活性剂)。磷脂质的实例包括蛋黄卵磷脂(eyeyolklecithin)、生物磷脂(biologicalphospholipid)、具有固定脂肪酰链的磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine)组合物、糖磷脂(glycophospholipid)或磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine)。特别优选的为纯化的卵磷脂，尤其是大豆卵磷脂、鸡蛋卵磷脂或它们的一部分或相应的磷脂。基于整体乳化剂，所述乳化剂的含量可在从大约0.02.wt.-％到大约2.5wt.-％之间变化，优选地从大约0.6wt.-％到大约1.5wt.-％，并且最优选地大约为1.2wt.-％。在一个实施例中，所述乳化剂是1.2mg蛋黄卵磷脂/100ml乳剂。

碱金属盐，优选为钠盐，也可使用其C16到C28的长链脂肪酸作为乳化助剂(共乳化剂)。基于整体乳化剂，所述共乳化剂所使用的浓度在从大约0.005wt.-％到大约0.1wt.-％之间，优选在大约0.02wt.-％到大约0.04wt.-％之间。并且，基于整体乳化剂，单独胆固醇或胆固醇酯或和其他共乳化剂的组合可被用作浓度在从大约0.005wt.-％到大约0.1wt.-％之间，优选在从大约0.02wt.-％到大约0.04wt.-％之间的乳化助剂。

本发明的所述以欧米茄-3脂质为基础的乳剂还包括有效量的抗氧化剂，例如，维他命E，特别是α-生育酚(α-tocopherol)(人体中活性最高的维他命E同分异构体)以及β-和γ-生育酚，和/或作为抗氧化剂抗坏血酸棕榈酸酯(ascorbylpalmitate)，由此防止形成氧化反应。α-生育酚的总量可高达5000mg/L。在优选的实施例中，基于100g脂质，所述抗氧化剂的总量在从大约10mg到大约2000mg之间，更优选地在从大约25mg到大约1000mg之间，最优选地在从大约100mg到500mg之间。

本发明的所述以欧米茄-3脂质为基础的乳剂可以口服、肠内给药、肠道外给药、经皮注射、血管内给药、静脉注射、肌肉注射、腹腔内给药或经粘膜注射给药并且优选通过静脉注射给药。本发明也涉及此处描述的欧米茄-3甘油二酯乳剂的药物组合物，优选为注射到人体或动物体内。

本发明的药物组合物还包括各种药物活性组分。特别地，所述药物活性组分可与本发明的乳剂组合被输送到人体的特定组织(药物靶标)。所述以欧米茄-3脂质为基础的乳剂可包括这种靶标组织治疗的载体。合适的载体可为，例如，和乳剂微滴相连的高分子，包括大豆油以及卵磷脂或鱼油的脂质微球。美国公开号2002/0155161，其全部内容通过引用并入本文，公开了乳剂的组织标靶输送。

所述药物组合物可按配方制造为固体或液体剂量形式。固体剂量形式包括但不限于，药片、药丸、粉末、颗粒、胶囊、栓剂以及相似物。液体剂量形式包括但不限于液体、悬浮液、乳液、注入剂型(溶液和悬浮液)以及相似物。剂量的选择形式取决于患者诸如年龄、性别以及症状。

所述药物组合物可任选包括其他形式的欧米茄-3Tri-DHA或甘油二酯乳剂和/或额外的活性成分。存在于所述药物组合物中的所述欧米茄-3Tri-DHA/甘油二酯乳剂或其他活性成分应该足够治疗、减轻，或复原靶标情况。

药理上可接受的赋形剂可为本领域技术人员所熟知的任何普通的适用于药物组合物的赋形剂。可接受的赋形剂包括但不限于稀释剂、载体、填料、膨化剂、粘结剂、崩解剂、崩解抑制剂、吸收加速剂、润湿剂、润滑剂、助流剂、表面活性剂、调味剂以及相似物。

药物组合物使用的载体包括但不限于乳糖、白糖、食盐、葡萄糖、尿素、淀粉、碳酸钙、高岭土、结晶纤维素或硅酸。

吸收加速剂包括但不限于季铵碱、月桂硫酸钠以及相似物。

润湿剂包括但不限于甘油、淀粉等。使用的吸附剂包括但不限于淀粉、乳糖、高岭土、膨润土、胶体硅酸以及相似物。

在本发明的液体药物组合物中，本发明的所述欧米茄-3乳剂和其他任何固体配方溶解或悬浮在液体载体内，例如水、植物油、乙醇、聚乙二醇、丙二醇或甘油。

液体药物组合物可包括乳化剂以在组合物中均匀分散活性配方或其他在液体载体中不溶的赋形剂。可用于本发明中的液体组合物的乳化剂包括，例如明胶、蛋黄、酪蛋白、胆固醇、阿拉伯树胶(acacia)、黄芪胶(tragacanth),陨石球粒(chondrus)、果胶、甲基纤维素、高分子胶、鲸蜡硬脂醇(cetostearylalcohol)以及鲸蜡醇(cetylalcohol)。

本发明的液体药物组合物也可包括粘度增强剂以提升产品的口感和/或覆盖肠胃管的外层。这样的试剂包括例如阿拉伯树胶、海藻酸膨润土(alginicacidbentonite)、高分子胶、羧甲基纤维素钙或羧甲基纤维素钠,鲸蜡硬脂醇、甲基纤维素、乙基纤维素、胶瓜尔胶(gelatinguargum)、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、麦芽糊精、聚乙烯醇、聚维酮、碳酸丙烯酯,丙二醇海藻酸、海藻酸钠、羧甲淀粉钠、淀粉、黄芪胶和黄原胶。

可加入诸如山梨糖醇、糖精、糖精钠、蔗糖、阿斯巴甜(aspartame)、果糖、甘露醇和转化糖的食品甜味剂以改善口味。可加入安全剂量的诸如酒精、苯甲酸钠、叔丁基羟基甲苯、叔丁基羟基茴香醚和乙二胺四乙酸的防腐剂和螯合剂以改善储存稳定性。

根据本发明的液体组合物也可包括诸如葡萄糖酸、乳酸、柠檬酸、醋酸葡萄酸钠、乳酸钠、柠檬酸钠或乙酸钠的缓冲剂。

赋形剂的挑选和使用的剂量可容易由经验丰富的制剂研究员根据所述领域标准程序和工具书决定。

当制备可注射药物组合物时，溶液和悬浮液是无菌的并且可优先的渗透进入血液。注射剂型可使用所属领域普遍所知的载体。例如，注射剂型的载体包括但不限于水、乙醇、丙二醇、乙氧基酒精水溶液,聚草酸酯异硬脂酸酯醇(polyoxylatedisostearylalcohol),以及聚氧乙烯山梨醇酐的脂肪酸酯。所属领域的普通技术人员能够少量或不用试验就轻易决定制备注射剂型所必需的氯化钠、葡萄糖，或甘油的分量。额外的配方可加入，例如溶解剂、缓冲剂以及止痛剂。如果需要，着色剂、防腐剂、香料、调味品、甜味剂以及其他药物可加入到所需的制剂中。

本发明的药物组合物还包括各种药物活性组分。特别地，所述药物活性组分可与本发明的微乳剂组合被输送到人体的特定组织(药物靶标)。所述以欧米茄-3脂质为基础的乳剂可包括这种靶标组织治疗的载体。合适的载体可为，例如，和乳剂微滴相连的高分子，包括大豆油以及卵磷脂或鱼油的脂质微球。美国出版号2002/0155161，其全部内容通过引用并入本文，公开了乳剂的组织标靶输送。

本发明的欧米茄-3组合物使得欧米茄-3脂肪酸，包括EPA和DHA，快速和有效地摄入到器官和组织的细胞膜内。相应的，提供了通过施用本发明的欧米茄-3乳剂以输送欧米茄-3Tri-DHA或富含DPA和DHA的甘油二酯到细胞和器官的方法。

本发明的脂质乳剂促进游离欧米茄-3脂肪酸和甘油单酯释放进入血流或细胞。游离脂肪酸可运输到线粒体内作为能量来源，或可并入到细胞膜内。使细胞膜和磷脂质富集欧米茄-3长链多元不饱和脂肪酸(PUPA)可有助于促进或回复欧米茄-3和欧米茄-6脂肪酸之间的充分平衡。EPA和DHA的并入也增加了细胞膜流动性和柔韧性。

示例

示例1：缺氧-缺血60分钟

两种性别出生后19-21天的维斯塔鼠(Wistarrats)接受单侧(右侧)颈动脉结扎手术。参见Rice,J.E.,3rd,R.C.Vannucci,等人，(1981),“未充分成长对老鼠缺氧-缺血脑损害的影响(Theinfluenceofimmaturityonhypoxic-ischemicbraindamageintherat”，AnnNeurol9(2):131-41andVannucci,S.J.,L.B.Seaman,等人(1996),“缺氧-缺血对未充分成长老鼠葡萄糖转运蛋白GLUT1和GLUT3的影响(Effectsofhypoxia-ischemiaonGlut1andGLUT3glucosetransportersinimmatureratbrain)”，《脑血流和脑代谢》杂志(JournalofCerebralBloodFlow&Metabolism)16(1):77-81。

结扎后，6个老鼠经由口胃饲管立即施用50mg20％以欧米茄-3脂质为基础的乳剂(0.25cc)(20％的以长链欧米茄-3甘油三酯为基础的配方，其具有>45％的为二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)的总体欧米茄-3的脂肪酸)，以及6个老鼠对照组施用0.25cc水，以上两个试验组都是肠内给药。将20gm的欧米茄-3甘油三酯放入100ml水中制备所述20％的以欧米茄-3脂质为基础乳剂，并且用1.2gm的蛋黄卵磷脂乳化。老鼠在2个小时内恢复并且它们在恒定温度下接受60分钟的8％氧气的缺氧-缺血。6个在先处理的老鼠在缺氧-缺血后立即施用另一个剂量的50mg的以欧米茄-3脂质为基础的乳剂并且对照组的老鼠施用0.25cc水。所有老鼠在72小时的再灌注损伤下安乐死。移除脑并且将其切成2mm的切片，再用2,3,5三苯基-2H-氯化四唑(TTC)着色。TTC是将具有呼吸线粒体的细胞染成红色的至关重要的染色剂。死亡(梗死)组织表现为白色。切片得分记录如下：

·0–没有出现水肿或细胞死亡

·1–出现水肿但没有细胞死亡

·2–出现水肿也有极小细胞死亡

·3–出现水肿和显著的细胞死亡

所有老鼠在缺氧-缺血下存活60分钟。对照组6个老鼠的6个出现水肿和/或细胞死亡，平均分为2+/-0.83(标准偏差)，但治疗组6个老鼠的2个出现损害，平均分为0.42+/-0.62(p<0.005)。

示例2：缺氧-缺血65分钟

两种性别出生后19-21天的维斯塔鼠接受单侧(右侧)颈动脉结扎手术。结扎后，6个老鼠经由口胃饲管立即施用50mg20％的以欧米茄-3脂质为基础的乳剂(0.25cc)(20％的以欧米茄-3甘油三酯为基础的配方，其具有≥40％的为EPA和DHA的总体欧米茄-3脂肪酸)，6个老鼠对照组施用0.25cc水，以上两个试验组都是肠内给药。如示例1所述制备所述乳剂。老鼠在2个小时内恢复，并且然后它们在恒定温度下接受65分钟8％氧气的缺氧-缺血。6个在先处理的老鼠在缺氧-缺血后立即施用另一个剂量的50mg的以欧米茄-3脂质为基础的乳剂并且对照组的老鼠施用0.25cc水。所有老鼠在72小时的再灌注下安乐死。移除脑并且将其切成2mm的切片用2,3,5三苯基-2H-氯化四唑(TTC)着色。切片得分记录如下：

·0–没有出现水肿或细胞死亡

·1–出现水肿但没有细胞死亡

·2–出现水肿也有极小细胞死亡

·3–出现水肿和显著的细胞死亡

65分钟的缺氧-缺血对所有老鼠产生损害。对照组6个老鼠中的4个存活，平均分为2.75+/-0.50，但治疗组中6个老鼠中的5个存活，平均分为1.70+/＝0.76(p<0.05)。

示例3：在60分钟缺氧之前对老鼠施用欧米茄-3甘油三酯脂质乳剂

两种性别出生后19-21天的维斯塔鼠接受单侧(右侧)颈动脉结扎手术。结扎后，6个老鼠经由口胃饲管立即施用50mg20％的以欧米茄-3脂质为基础的乳剂(0.25cc)，以及6个老鼠对照组施用0.25cc水，以上两个试验组都是肠内给药。如示例1所述制备所述乳剂。老鼠在2个小时内恢复并且然后它们在恒定温度下接受60分钟8％氧气的缺氧-缺血。6个在先处理的老鼠在缺氧-缺血后立即施用另一个剂量的50mg的以欧米茄-3甘油三酯脂质为基础的乳剂并且对照组的老鼠施用0.25cc水。所有老鼠在72小时的再灌注损伤下安乐死。移除脑并且将其切成2mm的切片用2,3,5三苯基-2H-氯化四唑(TTC)着色。然后在每个动物中的损害从0(没有损害)到4打分(>60％同侧半球损害)。所有赋形剂治疗的动物遭受脑损害，平均损害分数为2.00+0.89；用所述欧米茄-3甘油三酯脂质乳剂治疗的老鼠明显更少受损，平均分为0.33+0.52,p<0.05。脑梗死面积由TTC着色决定。

这些结果显示当在缺氧-缺血之前和/或之后立即施用欧米茄-3甘油三酯，它们会表现出显著的神经保护作用。当欧米茄-3甘油三酯胃肠外注射时，可获得非常相似的结果。

示例4：缺氧-缺血后的治疗

根据之前描述的方案，两种性别出生后19-21天的新生大鼠接受单侧(右侧)颈动脉结扎手术并且接受60分钟的缺氧-缺血。在四个分开的场合，老鼠在损害后立即通过注射以欧米茄-3脂质为基础的乳剂(100mg)而治疗，并且在损害後第4个小时再次进行相同的治疗。所述乳剂在示例1中描述。脑损害通过72小时再灌注的TTC着色而评估。在每个实例下，施用所述以欧米茄-3脂质为基础的乳剂提供了大于50％的保护，即降低组织损害。

附图4显示了这些试验的结果。附图4代表了全部14个对照主体(生理盐水治疗)和21个被施用治疗的主体(以欧米茄-3脂质为基础的乳剂治疗)。平均损害分数是：1.93±0.22(SEM),对照组,0.78±0.16乳剂治疗(two-tailedtest)；通过双尾试验p<0.0001。因此，除了对于整体保护的意义之外，可以看到的是40％得到治疗的老鼠得到100％保护(和1/14未治疗的相比，几乎没有损害；和1/14中度损害未治疗动物相比，40％仅遭受中度损害)。这些结果显示缺氧-缺血后的治疗提供了组织损害降低显示的神经保护效益。

成年鼠中实施的初期试验显示出和由缺氧-缺血损害的神经保护作用可相比较的水平。

缺氧-缺血后脑脂质的脂肪酰基组合物分析(通过气液色谱分析法)显示在梗死脑组织相对无梗死脑组织之间没有相对差异，所述相对差异表明急性施用欧米茄-3乳剂的效果不仅仅取决于脑细胞膜的脂肪酸组分变化。但是，在梗死区域，所有脂肪酸的绝对浓度以约15％(μg脂肪酸/g脑水肿)下降到相似的程度，所述程度表明脑水肿的出现。施用欧米茄-3乳剂不会出现这种降低，这就表明这些欧米茄-3脂肪酸预防脑水肿和梗死。

示例5：欧米茄-3甘油三酯治疗细胞靶标的效果量化

进行了关于欧米茄-3甘油三酯治疗在活性氧簇(ROS)生成的和氧化损害的标记方面的效果的试验以及在缺氧-缺血损害2、4、8和24小时后炎症指数的试验。初期缺氧-缺血后第8个星期脑组织病理证实了存在持久的保护作用。脑切片用抗体着色(包括涉及半球和未涉及半球)，所述抗体识别已知参与神经元细胞凋亡(半胱天冬酶3，氨基末端激酶)，神经元存活(活化Akt磷酸化的BAD,FKHR)或调控NMDA-R信号效果(CAMKII,和蛋白激酶C异构体,尤其是PKCγ和PKCζ)的活性蛋白。切片用识别神经特异性蛋白(Tau),星型胶质细胞(GFAP)或小神经胶质的抗体一起着色。这些分析使得欧米茄-3甘油三酯对缺氧-缺血导致神经元的凋亡对抗凋亡信号的效果进行量化以及获得星型细胞或小神经胶质的增益指数。而且，制备涉及和未涉及半球的全部脑提取物以量化半胱天冬酶以及通过免疫印迹法活化的JNK和Akt的含量。

示例6：用于研究脑缺氧-缺血的材料和方法

伦理学论述

所有调查研究根据哥伦比亚大学制度性动物保护和使用委员会(IACUC)批准的协议并且依照适于实验室动物保护指南评估和鉴定的协会执行。

材料

从Nu-ChekPrep有限公司(Elysian,MN)购买Tri-DHA和Tri-EPA。从AvantiPolar-Lipids有限公司(阿尔巴尼亚，阿拉巴马)取得蛋黄卵磷脂。

脂质乳剂

使用四种不同类型的乳剂。以欧米茄-3(n-3)甘油三酯鱼油为基础和以欧米茄-6(n-6)豆油为基础的乳剂为商用制备的静脉内磷脂-稳定的乳剂。所述欧米茄-3甘油三酯包括所述的高浓度n-3脂肪酸(FA)。^1,2参见表1。这些欧米茄-3甘油三酯乳剂在附图7-16中称为“n-3TG”，它们包括10％欧米茄-3鱼油(n-3)，该欧米茄-3鱼油具有按g/100mL乳剂的重量比计算的少于10％的欧米茄-6油，其中所述欧米茄-3油按欧米茄-3油总重量计算是>90％的甘油三酯(TG)，并且其中高达约30％wt.-％的酰基为DHA和高达约28％wt.-％是EPA。所述n-3TG乳剂也被称为n-3TG90-DHA30。其他具有纯(99％)DHA或纯(99％)EPA的乳剂也如所描述的那样接受测试。对于注射的n-3TG乳剂的剂量，对所述量进行计算以获得包括50％为DHA和EPA的TG–FA的给药(表1)。因而，1gm的TG乳剂表达为0.5gm的n-3TG。

表1描述和附图显示的n-6TG乳剂包括按g/100mL乳剂的重量比计算的20％的欧米茄-6(n-6)、0％DHA、0％EPA和55％源自亚油酸的TG(表1)。所述欧米茄-6TG乳剂由富含n-6FA的大豆油生产得到：亚油酸构成大约55％的总FA。

表1.脂质乳剂的脂肪酸组合物¹

¹数据由FreseniusKabiAG；FA,脂肪酸提供。

纯Tri-DHA(99％DHA)和Tri-EPA(99％EPA)乳剂尺寸为VLDL并且利用所属领域的技术人员所熟知的声波法和离心分离过程用TG油和蛋黄卵磷脂在实验室制备。^3,4简略的，以5:1的重量比混合200mgTri-DHA(Tri-DHAoil>99％)或Tri-EPA(Tri-EPAoil>99％)和蛋黄卵磷脂(40mg)。所述混合物在氮气下完全蒸发并且在4℃过夜进一步真空干燥。干燥脂质于60℃用添加的蔗糖(100mg/1mLLPB)在1mL无脂蛋白缓冲剂(LPB)(150mmol/LNaCl,0.5mlof0.1％甘油和0.24mmol/LEDTA,pH8.4,密度为1.006g/mL)中再悬浮以除去过量磷脂脂质体。所述脂质乳剂随后于50℃，使用布兰森超声破碎模型450(BransonSonifiermodel450)(纽约，梅尔维尔，布兰森科技)产生的140W氮气流下，进行1个小时的超声波处理。超声波处理后，溶液在4℃在LPB中透析24小时以移除蔗糖。包括尺寸为VLDL的微粒的最终乳剂通过使用GPO-HMMPS的酶催化过程、甘油消隐方法(弗吉尼亚，里士满，美国和光化学股份有限公司)以及胆碱氧化酶-DAOS方法(弗吉尼亚，里士满，美国和光化学股份有限公司)进行TG和PL的分析。所述TG：磷脂的质量比例为5.0±1.0:1，和尺寸为VLDL的微粒的质量比例相似。随后所述乳剂在4℃下储存并且在制备2个星期内使用。

单侧脑H/I诱导

从杰克森实验室(缅因州，巴哈伯)购买两种性别的出生3天的C57BL/6J新生鼠以及它们的老鼠妈妈。使用H/I的Rice-Vannucci模型并且修改为p10新生鼠。⁵简略地，出生10后天通过右侧颈总动脉的结扎诱导，在异氟烷麻醉下进一步灼烧和切割。研究者在手术之中和之后对脂质乳剂治疗进行盲试。每个老鼠的整个手术过程5分钟内完成。幼崽随后和它们的妈妈在一起恢复1.5个小时。实验过程中的环境温度维持在28℃。老鼠随后在早产婴儿保育箱的低氧舱(潮湿的8％氧气/氮气，纽约白原市，TechAirInc.)中被暴露在系统缺氧下15分钟。⁵在缺氧过程中所述低氧舱内部的环境温度稳定在37±0.3℃。为了将大脑损害程度的和温度相关的变异性最小化，再灌注的初始15分钟，将老鼠关在室温32℃的保育箱内。

脑梗死的量化

再灌注24小时后，将动物断头处死并且立即取其脑组织。使用脑切片模型切出1-mm冠状切片。切片随后于37℃在包含2％三苯基-氯化四唑(TTC)的PBS溶液中浸渍25分钟。TTC摄取进入到活体线粒体内，将其转换为红色。⁶因此，活体组织着色为红砖色，并且不能存活的(梗死的)组织可通过着色(白色)的缺失鉴别。使用AdobePhotoshop和NIHImageJ图像应用程序，一系列切片梗死的平面区域加和以得到梗死组织的体积(mm³)，其被颈动脉结扎术同侧的半球的全部(梗死+未梗死)体积所划分，并且以总体积的百分数表示。

试验组

在不同动物组诱发H/I脑损伤，这些动物在H/I损伤之前或之后接受特定的治疗。这些动物服从不同治疗方案的处理。

方案1：前期-H/I治疗n-3TG(包含DHA和EPA)或n-6TG的乳剂。

给非禁食啮齿动物施用两个剂量的n-3TG或n-6TG的乳剂或赋形剂(生理盐水，相等体积/Kg)，所述剂量固定为每次注射每个老鼠3mg的n-3或n-6TG-FA(相当于1.5g总TG/kg的最大值，这些试验中p10老鼠体重4-6克)。第一个剂量在手术后立即腹腔内部注射，第二剂量在缺氧阶段最后15分钟后立即腹腔内部注射。注射TG乳剂和生理盐水的体积一直相等。

因为n-3乳剂包括低浓度的作为抗氧化剂的α-生育酚，在分开的试验中，通过5mgα-生育酚/Kg体重的剂量腹腔内部注射α-生育酚(Vital先灵葆雅，英特威)给新生鼠施用和n-3乳剂含量匹配的当量剂量的纯α-生育酚，所述剂量为每次注射n-3TG乳剂的剂量。

方案2：n-3TG(包含DHA和EPA两者)的后期-H/I治疗

市场上可买到的两个剂量的n-3TG乳剂或生理盐水以每个剂量0.75g的n-3TG/kg体重(相当于1.5g的总TG/kg)在腹腔内部注射到非禁食的啮齿动物。第一个剂量在缺氧15分钟后立即施用，第二个剂量在再灌注阶段开始1个小时后施用。

方案3：n-3TG的剂量反应，时间和特异性

根据混合n-3TG乳剂的DHA和EPA的剂量，给非禁食啮齿动物施用两次包含Tri-DHA或Tri-EPA(每个剂量为0.1gn-3TG/kg或0.375gn-3TG/kg体重)两种类型的n-3的脂质乳剂。参见表1。第一个剂量在初期缺氧15分钟后立即施用，第二个剂量在再灌注1个小时后立即施用。然后在试验的不同组，Tri-DHA乳剂的功效通过4次初期注射(H/I之后0小时,1-小时,2-小时或4-小时)而决定。对于立即治疗的0小时，第一个剂量在初期缺氧15分钟后立即施用，第二个剂量在再灌注1个小时后立即施用。而在“延迟“的治疗中，在再灌注后第1或第2或第4小时施用第一剂量，第1剂量后1个小时施用第二个剂量。

测量血液TG和血糖水平

在单独分离的出生10天的非禁食的老鼠组别取血液样本，该血液样本在老鼠吸入异氟醚情况下直接在其左心室取出以用于测定血液TG。样本在单次腹腔内部注射0.75gn-3TG/kg市场上可购买的n-3富集TG(DHA和EPA)乳剂或生理盐水后5个小时后取出样品。总血浆TG通过GPO-HMMPS、甘油消隐方法(弗吉尼亚，里士满，美国和光化学股份有限公司)酶促性地测量。对于血糖水平，血糖样品从单独分离的出生10天的非禁食的老鼠组别得到的鼠尾采得血样。每个老鼠在两个时间点采样。第一个样品在手术和TG注射之前的0时间采集，以及第二个样品在H/I和TG注射(在上述单侧脑H/I方案中描述的手术后大约100分钟)后约10分钟采集。血糖水平通过血糖仪以mg/dL为单位电化学测量得到(加利福尼亚，苗比达市，LifeScan,有限责任公司，稳豪血糖仪)。

通过激光多普勒血流测定法(LDF)测量脑血流(CBF)

在接受颈动脉结扎手术并且进行如上述描述的恢复的新生C57BL/6J老鼠的组别中，使用激光多普勒流量计(Periflux5000)在单侧(右侧)半球缺氧过程中测量相对CBF。在这些老鼠中，为了准备测量CBF，在异氟烷麻醉下切开头皮并且使用光纤扩展将多普勒探针依附于所述头盖骨(2mm后部和前囟外侧2mm)。只有局部麻醉(1％利多卡因)在术后使用。老鼠随后放入低氧舱(8％O2/92％N2)。记录20分钟的相应缺氧的CBF变化并且以n-3治疗和生理盐水治疗的新生鼠的前期缺氧水平的百分数表示。

n-3注射后测量出血时间

在被切断3-mm片段鼠尾的老鼠测量出血时间。⁷施用两个剂量的生理盐水对在如原方案的相似时间框架内施用n-3TG：初次注射后2个小时进行第二次注射。第二次剂量后45分钟后测量出血时间。被切断的尾巴于37℃浸渍在0.9％等渗生理盐水中，并且血流停止需要的时间定义为出血时间。如果10分钟内没有出现停止出血，尾巴就会灼烧并且将600秒作为出血时间而记录。

脑组织死亡的长期评估

在新生H/I损害后的第8个星期进行脑损伤的长期评估。这个组别的p10老鼠接受单侧H/I然后在H/I后期注射0.375gTri-DHA/kg(n＝6)或如上述的生理盐水(n＝5)。H/I后的第8个星期，老鼠斩首处死。大脑被移除，并且嵌入TissueTck-OTC包埋剂(加利福尼亚，托伦斯，樱花Finteck)后在干燥冷冻异戊烷(-30℃)中快速冷冻，在-80℃保存。对于分析，冠状切面(每500μm10μm)在莱卡低温恒温器中连续切割并且安装在急速冷冻玻片上(伊利诺伊斯，赛默飞世尔科技)。切片通过尼氏着色使用甲酚紫(密苏鲁市，奥德里奇)处理切片。使用AdobePhotoshop和NIHImage图片应用程序，每个左侧和右侧半球的脑组织的9个切片用来描摹脑组织区域。如前所述⁸每个动物的左侧对照或没有受损伤对侧半球的区域给与一个100％的数值。右侧受损身体同侧的半球剩余的脑区和左侧半球对照，对每个动物来说，差异看作是右侧半球组织损失的百分数。

数据分析

数据表示为平均值±标准误。腹腔注射n-3TG乳剂后，每个时间点对照血浆TG水平。使用2组群比较进行學生t测试(Student’sttest)。单向方差分析用来比较贯穿冠状切片梗死区域的乳剂之间的差异，随后进行的邦弗朗尼程序(Bonferroniprocedure)用于事后分析以更正多重比较的结果。统计数据，使用SPSS软件16.0(伊利诺伊州，芝加哥，SPSS有限公司)以p<0.05决定。

示例7：在新生鼠脑缺氧-缺血损伤之后，富含TG乳剂的n-3脂肪酸具有神经保护作用

N-3TG对血液甘油三酯和血糖水平以及出血时间的效果

为了确定来自n-3TG乳剂的TG是否已经被全身吸收，在腹腔内部注射后5个小时检测血液TG水平。在n-3TG注射后，在1.5小时处血液TG水平和基线相比大幅提升到高于三倍(p<0.05)，然后在3到5个小时降到基线水平。参见附图1A。这就表明n-3TG进入血流并且被代谢掉。对照之下，注射生理盐水的老鼠的TG水平在5小时的期间内保持不变，反映新生鼠正常血液TG水平。

H/I之后，血糖水平可影响梗死面积。⁹因此，在手术之前和在注射TG或生理盐水后进行H/I的15分钟后测量每个组(n-3TG相对n-6TG相对生理盐水)的血糖水平。参见附图1B。当在相同时间点下比较时，人们没有观察到群组之间血糖水平存有差异。而且，在H/I损害后，所有群组血糖水平都同样地降低大约30％或更多(p<0.05)。

和生理盐水对照组(418±90秒)相比，N-3治疗老鼠的毛细管出血时间(437±82秒)没有差异。

H/I之后n-3TG剂量没有改变脑血流量

和生理盐水治疗的动物相比，对n-3治疗的新生鼠在同侧半球的CBF没有显示效果。右颈总动脉结扎手术之后立即开始8％氧气的缺氧，在对照组和n-3治疗组的同侧半球的CBF大约都为25％的初始水平(H/I之前)，并且这在缺氧的期间一直保持。在对侧(未结扎)半球血流在两个群组没有改变。在不管在这个模型中，新生H/I损害老鼠是生理盐水治疗还是n-3治疗，新生H/I损害老鼠维持了非常相似的血流水平。参见附图2.

是n-3TG而非n-6TG防止H/I损伤

冠状脑组织切片用TTC着色以量化H/I后期脑损伤和n-3TG注射效果的程度。参见附图3。附图3A显示了分别进行了生理盐水治疗、n-6TG乳剂治疗和n-3TG乳剂治疗的新生鼠大脑的代表图像。在所有的H/I损伤的动物中，组织死亡定位在如附图3A的上面板的白色区域图示的右半球。下面板的图像，附图3A显示了使用NIHImageJ量化梗死体积的梗死区域的描摹。生理盐水治疗的脑组织显示出涉及和结扎同侧的皮质和皮质下区域有同样的坏死灶。大多数动物中，n-3TG注射后的神经保护作用大部分在皮质下区域被标记，但是生理盐水治疗的老鼠具有大的皮质和皮质下的梗死。参见附图3A。

和生理盐水治疗的同窝幼畜(对照组)(n＝27)相比，n-3TG治疗的老鼠(n＝28)的梗死体积大幅度减少，分别是19.9±4.4％相对35.1±5.1％。参见附图3B。和生理盐水对照组(p＝0.03)和n-3TG群组(p<0.01)相比，注射n-6TG乳剂群组的梗死体积显著增多。

因为α-生育酚是TG乳剂的成分(以低浓度存在以防止FA氧化反应)。使用TTC着色以比较α-生育酚治疗和生理盐水治疗的新生鼠的大脑H/I损害程度。和生理盐水治疗的老鼠相比，注射α-生育酚的老鼠的大脑的梗死体积没有显著的差异(没有示出数据)。

人们随后确定如果只在H/I之后注射(没有在H/I之前注射)n-3TG是否有效。参见附图3C。相似地，和n-3TG关联更小的损伤主要是皮质下的(没有示出数据)。和H/I后立即用生理盐水治疗的对照组相比，H/I后n-3TG治疗组总梗死面积降低了大约50％。

是DHA而非EPA在H/I后具有神经保护作用

为了确定EPA相对DHA可能存在的差异，使用两个剂量(0.1gTG/kg对0.375gTG/kg)采用Tri-DHA相对Tri-EPA的H/I后期治疗方案研究H/I脑损伤程度。人们没有观察到在0.1gTG/kg和0.375gTG/kgTri-DHA治疗族群之间的脑梗死体积的统计差异。但是，和生理盐水对照组相比，通过使用0.1g和0.375gTG/kgTri-DHA治疗，总梗死面积分别减少了48％和55％的平均值。参见附图4。和生理盐水治疗相比，通过两个剂量中任何一个注射Tri-EPA，人们没有观察到神经保护作用。

为了更好地粗略估计人类中风后神经保护作用的实际时间线，人们进行了延迟治疗方案试图研究Tri-DHA乳剂的治疗时间窗(therapeuticwindow)。注意与生理盐水组相比，延迟4个小时用Tri-DHA治疗没有保护效果。但是，和生理盐水治疗的动物相比，H/I后0小时施用Tri-DHA，然后中风后延迟给药1个小时和2个小时显示相似的减少脑梗死体积(～50％)。参见附图5。这种显著保护作用主要出现在和上述发现相似的皮质下区域。

长期神经保护作用

对成年鼠的冠状脑切片进行尼氏着色(附图6)以检查H/I的影响和H/I损害后第8个星期进行Tri-DHA治疗对大脑和神经细胞损失的长期影响。和左边对照组(对侧半球)相比，右侧半球的损伤区域显示出明显的神经细胞损失。如附图6所示，脑组织损失在生理盐水处理的老鼠(n＝5)的右侧半球增加了1.67倍，分别为25.0±2.4％相对15.0±2.5％，(p＝0.02)。因而，在H/I24小时后的损伤和Tri-DHA的神经保护作用，在初次中风损害后差不多2个月后在组织结构上得以证明。

示例6和7引用的参考文献

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示例8：心脏缺氧-缺血中的欧米茄-3甘油三酯DHA乳剂

材料和方法

动物护理

所有研究根据哥伦比亚大学制度性动物保护和使用委员会(IACUC)批准的协议并且依照由美国国立卫生研究院出版(NIH，出版号85-23,1996)的实验室动物保护指南执行。C57BL6老鼠(重量在25-30g之间并且为12-14星期大)从杰克逊实验室获得用作我们的研究。在研究之前的一个星期之前老鼠关在动物护理设备中。所有老鼠正常喂食(Teklad全球意识，哈伦实验室)。

试剂

使用的第一抗体为Bcl-2,Beclin-1,PPAR-γ,p-AKT,总-AKT,p-GSK-3β,总-GSK-3β(美国，细胞信号传导(CellingSignaling))；以及β-actin(美国BDBiosciencesPharmingen公司)。使用的第二抗体为抗兔IRdye800，抗鼠IRdye700(1:50,000稀释)。从美国里德奥奇公司购买SB216763(3μM)和罗格列酮(Rosiglitazone)(6mg/kg体重)。从Calbiochem公司购买磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/AKT抑制剂LY-294002(10μM)。这项研究所使用的抑制剂和兴奋剂是基于文献出版物。¹以n-3鱼油为基础的乳剂(10gofTG/100mL)是商业制备的静脉注射的磷脂-稳定乳剂，并且如前述^2,3包含高浓度的n-3FA。n-3TG乳剂富含EPA(高达28％)和DHA(高达30％)。

活体左侧冠状动脉前降支(LeftAnteriorDescendingCoronaryArtery,LAD)闭塞

活体缺血-再灌注损伤的活体小鼠模型：在手术之前，老鼠吸入异氟醚麻醉(4％诱导然后1-2.5％保养)。麻醉之后，从老鼠口中插入聚乙烯-60(PE-60)管，并且该管和老鼠呼吸机相连(MiniVentType845,Hugo-SachsElektronik)以提供呼吸容量为240μL，速率为每分钟110次，并且补充氧气。体温维持在37℃。实施正中胸骨切开术,将最接近的左冠状动脉(LAD)可视化并且用7-0缝合丝线以及锥形油针(BV-1,爱惜康公司)结扎。缺血后30分钟，剪断所述聚丙烯丝线随后恢复LAD血流。然后立即进行腹膜内(IP)注射n-3TG乳剂(1.5g/kg体重)并且第二次注射在再灌注60分钟后进行。对照组老鼠按照相同的时间进行IP注射生理盐水。关闭胸壁，随后对老鼠施用丁丙诺啡(buprenorphine)并且在温度受控的区域恢复。

超声波心动图

使用可视超音速Vevo2100超声波活组织镜检查系统进行活体经胸壁超声心动图测量。这种高频率(40MHz)超声诊断仪具有～30-40微米的纵向分辨率以及>100Hz的时间分辨率。获得心肌缺血之前的基线超声心动图以及再灌注48小时后获得时缺血后图像。老鼠用异氟烷(1.5-2.0L/min)在100％氧气中轻度麻醉并且在活体内使用MS-40038-MHz显微扫描传感器得到左心室(LV)的经胸壁超声心动图用来获得高分辨率二维模型图像。如早期出版的^4,5，图像用于测量LV舒张末期内径(LVEDD)，LV收缩末期内径(LVESD),LV射血分数(EF)以及LV缩短分数(FS)。

测量梗死面积

确定心肌梗死面积：再灌注48小时后，老鼠麻醉，插管并且用小鼠呼吸机换气。导管(PE-10管)放置在颈总动脉以允许注射伊文思蓝(Evansbluedye)。进行正中胸骨切开术并且LAD在相同位置再次像之前结扎。伊文思蓝(1.25ml7.0％溶液)经由颈动脉导管注射到心脏以描摹缺血区域中的非缺血区域。心脏随后迅速切除并且固定在1.5％琼脂糖中。凝胶固化后，使用切片机将心脏垂直于纵轴切成1-mm切片。所述1-mm切片放置于6孔细胞培养皿的单个孔中并且于37℃下用1％TTC进行4分钟的对比染色以区分不能存活的心肌。每个1mm厚的心肌切片进行成像并且称重。使用和电脑相连的Q-Capture数码照相机捕获图像。用带有NIHImage1.63软件的计算机辅助测面法分析图像以测量梗死面积以及全部危险区域。^4,5

活体外缺血和再灌注(I/R)

在老鼠心脏中进行和改进试验以便使用。^4,5体重25-30g，12-14星期大的C57BL6老鼠通过注射克他命/甲苯噻嗪混合物(ketamine/xylazinecokctail)[分别是80mg/kg和10mg/kg]加以麻醉。通过朗根多夫灌流(Langendrofftechnique,LT)，采用灌注重碳酸氢盐缓冲液，使用等容灌流系统将快速从主动脉切割的心脏在非再循环模式中进行逆行灌注。所述灌注重碳酸氢盐缓冲液(单位是mM)包含如下成分：118NaCl,4.7KCl,2.5CaCl₂,1.2MgCl₂,25NaHCO₃,5葡萄糖,0.4棕榈酸酯,0.4BSA以及70mU/l胰岛素。氧合作用舱维持灌注pO₂>600mmHg。

使用位于左心室并且和压力传感器(加利福尼亚，帕萨迪纳市，古尔德实验室)相连的乳胶气球持续监测左心室形成的压力(LVDP)。在2-通道ADI记录器上记录心脏功能测量值。试验计划包括30分钟常氧灌注然后30分钟全0流量缺血以及60分钟再灌注的平衡基线阶段。流速为2.5ml/min。灌注装置的温度严格控制以在所有条件下将心脏的温度维持在37±0.1℃。将灌注重碳酸氢盐缓冲液加入对照组心脏。我们将封装于甘油三酯(TG)的n-3脂肪酸的乳剂加入标准缓冲液；我们最终使用的剂量是300mg/100ml。

化验乳酸脱氢酶(LDH)

通过测量从体外I/R系统流出物和体内LAD系统的血样释放的乳酸脱氢酶(LDH)评估心肌损伤，使用可从市场上购买的酶法试剂盒(美国，缅因州，PointeScientific有限责任公司)进行评估。

蛋白质印迹分析(Westernblotanalysis)

使用DC蛋白质定量套组(美国伯乐)确定组织和细胞蛋白质浓度。等量蛋白质通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酸酰胺凝聚电泳(SDS-PAGE)(4-12％梯度的凝胶)而分离并且装载于硝酸纤维膜(Invitrogen)上。在使用奥德赛遮盖液(Odysseyblockingbuffer,Li-CorBiosciences公司)将非特异性结合遮盖之后，根据制造说明书使用标靶第一抗体(1:1000稀释)将细胞膜在4℃过夜培养。紧接着，细胞膜在室温下用红外线标记的第二抗体培养1个小时。使用奥德赛双色红外荧光扫描成像系统(内布拉斯加，林肯州，Li-CorBiosciences公司)将络合物成像。使用奥德赛应用软件，版本1.2(Li-Cor)分析图像以获得积分强度。

数据分析

数据以平均值±标准偏差(SD)表示。为了评估数值之间的差异，使用学生t方法(Student’sttest)。p<0.05的数值被认为是统计上有意义的。

在LAD模型中n-3TG给药降低梗死面积并且增强心脏功能

为了测试心肌缺血损伤的急性n-3TG给药的效果，老鼠接受30分钟由LAD闭塞诱导的缺血；随后回复冠脉血血流并且评估了再灌注过程中心肌衰弱功能的恢复。再灌注开始和60分钟后出现缺血之后立即腹腔内注射n-3TG乳剂。48小时再灌注的最后，心脏切片用TTC着色以量化两个群组的I/R损害的程度。附图1A显示，和n-3TG治疗组相比，接受生理盐水治疗的老鼠心脏的梗死面积的量。n-3TG治疗组的老鼠(相对生理盐水治疗老鼠)的心肌梗死面积显著减少(p<0.05)。处于危险中的总面积在两个组是相似的。血浆LDH释放，作为心肌损伤的重要标记，在n-3TG治疗的老鼠中显著减少(附图1B)。这些数据表明再灌注过程中n-3TG的急性治疗可显著地降低老鼠的心肌梗死的损伤。

超声波心动描记术评估显示对照组和n-3TG治疗组之间缩短分数(％FS)的明显差异。人们在n-3TG治疗组相对生理盐水治疗对照组观察到FS的显著恢复(p<0.01)(附图1C)。这些数据和梗死面积变化以及LDH水平降低揭示急性n-3TG治疗防止老鼠遭受心肌缺血再灌注损伤并且能够改善心脏功能。

活体外模型中n-3TG使得心肌免受I/R损伤

为了进一步研究I/R后n-3TG乳剂的急性干预效果，我们也使用了活体外灌注心脏(I/R模型)。我们的试验显示,和对照组心脏相比，活体外模型中的再灌注过程施用n-3TG乳剂在I/R后显著地提高了LVDP恢复(附图2A)。使用KREB’S缓冲剂+n-3TG对心脏进行再灌注维持了正常心率并且LVDP几乎恢复到和缺血之前100％相似。

在再灌注过程中，收集心脏灌注液以探测作为心肌损伤标记的LDH释放。LDH释放在n-3TG治疗和对照心脏之间有显著差异，表明急性n-3TG治疗起了保护作用(附图2B)。

n-3TG调控和I/R损伤联系的重要信号通道

为了确定n-3TG通过调控和I/R损伤联系的重要信号通道的变化而保护心脏，通过蛋白免疫印迹法(Westernblotanalysis)在心肌组织探测p-AKT,p-GSK-3β和Bcl-2。n-3TG乳剂显著增加了AKT和GSK3β的磷酸化作用(附图3)以及Bcl-2蛋白质表达(附图4)，表明n-3TG可能通过活化PI3K-AKT-GSK3β信号通道和抗凋亡蛋白Bcl-2减少凋亡。由于Bcl-2和Beclin-1^6,7相互作用并且影响自体吞噬，如附图4所示，Beclin-1的表达在缺血/再灌注后增加了；n-3TG治疗心脏显示Beclin-1蛋白表达有了显著的降低，如我们以上描述的，Bcl-2蛋白表达伴随产生。在I/R损伤中，为了建立n-3TG和PI3K/AKT以及GSK3β通道之间的联系，心脏用GSK-3β抑制剂SB216763(3μM)或磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/AKT抑制剂LY-294002(10μM)处理；它们中的每一个在基线期间开始加入并且在缺血和再灌注自始至终持续的添加。这项研究使用的抑制剂的剂量基于文献出版物¹。LDH释放被n-3TG降低并且n-3TG提供的保护作用消除了PI3K/AKT抑制剂，LY-294002(附图6)。和I/R对照心脏相比，SB-21676外加n-3TG乳剂的治疗显著抑制了LDH释放(附图6)。

下一步，研究缺氧诱导因子1(HIF-1)，其是在缺氧中降低的氧利用率相应的适应性响应的重要媒介物。HIF-1α蛋白表达(附图5)在缺血后迅速增加。在再灌注过程中，n-3TG给药显著地抑制了HIF-1α蛋白表达。在我们的实验室中，以往研究表明n-3脂肪酸，和饱和脂肪酸相比，能够降低巨噬细胞和动脉内皮脂肪酶以及炎症标志物，这些效果和PPAR-γ相关⁸。因此，在I/R条件下PPAR-γ和n-3TG急性治疗的潜在联系得以检测。蛋白质印迹分析显示，和对照组心脏相比，n-3TG治疗的PPAR-γ心脏蛋白表达显著降低(附图5)。

为了建立PPAR-γ和n-3TG效果之间的联系，老鼠在I/R损伤前于离体的再灌注心脏中用PPAR-γ常见的兴奋剂罗格列酮处理(6mg/kg体重，腹腔内部注射)。在再灌注过程中，这些心脏用灌注重碳酸盐缓冲液添加或不添加n-3TG乳剂灌注。和罗格列酮处理心脏相比，LDH释放在罗格列酮外加n-3TG处理心脏显著更高(附图6)。这些数据表明在I/R过程中，PPAR-γ的减少和由n-3TG提供的心肌保护作用相关。

总之，这些结果表明PI3K/AKT,GSK-3β和PPAR-γ都是调控n-3TG心肌保护作用的关键通道。

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Claims (39)

1.一种以甘油三酯欧米茄-3脂质为基础的水包油乳剂，所述乳剂适用于对患者给药，其特征在于：

(a)所述乳剂包括至少7％到35％的欧米茄-3油和少于10％的欧米茄-6油，所述欧米茄-3油和欧米茄-6油按g/100mL乳剂的重量比计算；

(b)所述欧米茄-3油包括按欧米茄-3油总重量计算的至少20％的甘油三酯，而且至少20％wt.-％的欧米茄-3甘油三酯的酰基是由DHA组成；

(c)所述欧米茄-3油包括少于10％的欧米茄-6脂肪酸；以及

(d)所述乳剂内的脂质微滴的平均直径少于大约5微米。

2.根据权利要求1所述的以甘油三酯欧米茄-3脂质为基础的水包油乳剂，其特征在于，所述欧米茄-3油为鱼油，合成的欧米茄-3油或它们的组合。

3.根据权利要求1所述的以甘油三酯欧米茄-3脂质为基础的水包油乳剂，其特征在于，从20wt.-％到50wt.-％的欧米茄-3甘油三酯的酰基是由DHA组成。

4.根据权利要求1所述的以甘油三酯欧米茄-3脂质为基础的水包油乳剂，其特征在于，从50wt.-％到75wt.-％的欧米茄-3甘油三酯的酰基是由DHA组成。

5.根据权利要求1所述的以甘油三酯欧米茄-3脂质为基础的水包油乳剂，其特征在于，从75wt.-％到90wt.-％的欧米茄-3甘油三酯的酰基是由DHA组成。

6.根据权利要求1所述的以甘油三酯欧米茄-3脂质为基础的水包油乳剂，其特征在于，从90wt.-％到95wt.-％的欧米茄-3甘油三酯的酰基是由DHA组成。

7.根据权利要求1所述的以甘油三酯欧米茄-3脂质为基础的水包油乳剂，其特征在于，从95wt.-％到100wt.-％的欧米茄-3甘油三酯的酰基是由DHA组成。

8.根据权利要求1所述的以甘油三酯欧米茄-3脂质为基础的水包油乳剂，其特征在于，所述脂质微滴的直径小于大约1微米。

9.根据权利要求1所述的以甘油三酯欧米茄-3脂质为基础的水包油乳剂，其特征在于，所述脂质微滴的直径为从大约100到大约500纳米。

10.一种方法，包括：

(a)鉴选经历过缺氧-缺血的主体；以及

(b)给所述主体施用药物组合物以降低由缺氧-缺血引起的再灌注损伤，所述药物组合物包括根据权利要求1所述的以甘油三酯欧米茄-3脂质为基础的水包油乳剂的有效治疗量。

11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述缺氧-缺血导致脑缺氧-缺血，以及在由所述缺氧-缺血导致的所述脑缺氧-缺血到再灌注损伤后的20分钟到2小时内，施用所述根据权利要求1所述的以甘油三酯欧米茄-3脂质为基础的水包油乳剂的有效治疗量。

12.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述缺氧-缺血导致脑缺氧-缺血，以及在由所述缺氧-缺血导致的所述脑缺氧-缺血到所述再灌注损伤后的2到4小时内或4到6小时内，施用所述根据权利要求1所述的以甘油三酯欧米茄-3脂质为基础的水包油乳剂的有效治疗量。

13.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述脑缺氧-缺血导致中风。

14.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述有效治疗量为从大约每次0.2g/kg给药到大约每次4g/kg给药。

15.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述缺氧-缺血和所述缺氧-缺血导致的所述再灌注损伤出现在器官内，所述器官选自于由脑、心脏、肾、脊髓、大肠或小肠、胰腺和肺所构成的组。

16.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述缺氧-缺血和所述缺氧-缺血导致的再灌注损伤导致心肌梗死或脑梗死。

17.一种减少由缺氧-缺血或因缺氧-缺血造成的再灌注损伤所导致的器官或组织内的细胞死亡或细胞损伤的方法，所述方法包括向有这种需求的患者施用药物组合物，所述药物组合物包括根据权利要求1所述的以甘油三酯欧米茄-3脂质为基础的水包油乳剂的有效治疗量。

18.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，所述缺氧-缺血或由所述缺氧-缺血导致的所述再灌注损伤由器官移植导致。

19.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，所述细胞死亡或细胞损伤出现在器官内，所述器官选自于由脑、心脏、肾、脊髓、大肠或小肠、肺、肝脏和胰腺所构成的组。

20.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，所述缺氧-缺血导致中风。

21.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，所述缺氧-缺血导致心肌梗死。

22.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，所述有效治疗量为大约每次0.2g/kg给药到大约每次4g/kg给药。

23.一种方法，包括：

(a)鉴选有脑缺氧-缺血风险的主体；以及

(b)给所述主体施用药物组合物，所述药物组合物包括根据权利要求1所述的以甘油三酯欧米茄-3脂质为基础的水包油乳剂的有效治疗量，从而降低主体发展成再灌注损伤的风险，所述再灌注损伤由所述缺氧-缺血导致。

24.一种方法，包括：

(a)鉴选具有器官炎症的主体；以及

(b)给所述主体施用药物组合物，所述药物组合物包括根据权利要求1所述的以甘油三酯欧米茄-3脂质为基础的水包油乳剂的有效治疗量，从而减少主体的炎症。

25.一种方法，包括向主体施用一定量的药物组合物，所述药物组合物包括根据权利要求1所述的以甘油三酯欧米茄-3脂质为基础的水包油乳剂，以减少主体血液内或器官内的活性氧簇的生成。

26.根据权利要求25的方法，其特征在于，所述器官选自于由脑、心脏、肾、脊髓、大肠或小肠、肺、肝脏和胰腺所构成的组。

27.一种减少主体内有害细胞活素生成的方法，包括向有这种需求的患者施用药物组合物的有效治疗量，所述药物组合物包括根据权利要求1所述的以甘油三酯欧米茄-3脂质为基础的水包油乳剂。

28.根据权利要求1所述的乳剂，其特征在于，所述乳剂包括至少20％到30％的欧米茄-3油，所述欧米茄-3油按g/100mL乳剂的重量比计算。

29.根据权利要求1所述的乳剂，其特征在于，所述乳剂包括至少30％到35％的欧米茄-3油，所述欧米茄-3油按g/100mL乳剂的重量比计算。

30.根据权利要求1所述的乳剂，其特征在于，所述乳剂包括至少30％到40％的甘油三酯，所述甘油三酯按欧米茄-3油的总重量的重量比计算。

31.根据权利要求1所述的乳剂，其特征在于，所述欧米茄-3油包括至少40％到50％的甘油三酯，所述甘油三酯按欧米茄-3油的总重量的重量比计算。

32.根据权利要求1所述的乳剂，其特征在于，所述欧米茄-3油包括至少50％到75％的甘油三酯，所述甘油三酯按欧米茄-3油的总重量的重量比计算。

33.根据权利要求1所述的乳剂，其特征在于，所述欧米茄-3油包括至少75％到100％的甘油三酯，所述甘油三酯按欧米茄-3油的总重量的重量比计算。

34.根据权利要求1所述的以甘油三酯欧米茄-3脂质为基础的水包油乳剂，其特征在于，所述乳剂包括少于5％的欧米茄-6脂肪酸。

35.根据权利要求1所述的以甘油三酯欧米茄-3脂质为基础的水包油乳剂，其特征在于，所述乳剂包括少于1％的欧米茄-6脂肪酸。

36.根据权利要求1所述的以甘油三酯欧米茄-3脂质为基础的水包油乳剂，其特征在于，所述乳剂包括按g/100mL乳剂的重量比计算的至少35％的欧米茄-3油以及少于3％的欧米茄-6油。

37.一种方法，包括：

(a)鉴选具有器官或组织内炎症的主体；以及

(b)给所述主体施用药物组合物，所述药物组合物包括根据权利要求1所述的以甘油三酯欧米茄-3脂质为基础的水包油乳剂的有效治疗量，从而减少主体的炎症。

38.一种减少器官或组织内的细胞死亡或损伤或缺氧/缺血的方法，包括在从器官捐献者得到器官或组织前，给所述器官捐献者施用药物组合物，所述药物混合物包括根据权利要求1所述的以甘油三酯欧米茄-3脂质为基础的水包油乳剂的有效治疗量。

39.一种减少器官或组织内的细胞死亡或损伤或缺氧/缺血的方法，所述器官或组织将被移植到器官接受者或组织接受者，所述方法包括在向所述接受者手术移植所述器官或组织前，向所述接受者施用药物组合物，所述药物组合物包括根据权利要求1所述的以甘油三酯欧米茄-3脂质为基础的水包油乳剂的有效治疗量。